本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的細(xì)胞色素P450酶基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

血根堿和白屈菜紅堿主要分布在血根(Sanguinaria canadensis L.)、鴉片罌粟(Papaver somniferum L.)、花菱草(Eschscholzia californica Cham.)、白屈菜(Chelidonium majus)、紫堇(Corydalis edulis Maxim)和博落回(Macleaya cordata(Willd.)R.Br.)當(dāng)中。最近二十年以來(lái)，血根堿已經(jīng)在歐洲作為替代抗生素的添加劑來(lái)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。目前博落回是全世界最主要的血根堿的來(lái)源植物，并且被歐洲食品安全局列為動(dòng)物飼用添加劑。血根堿和白屈菜紅堿的合成路徑在前期研究中已經(jīng)得到闡明。相關(guān)合成基因已經(jīng)從鴉片罌粟(Papaver somniferum L.)、花菱草(Eschscholzia californica Cham.)等植物中克隆，但是尚未有任何基因從博落回中克隆。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供博落回中參與血根堿和白屈菜紅堿合成的細(xì)胞色素P450酶基因及其應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成的細(xì)胞色素P450酶基因，包括基因Mc9485、Mc2661、Mc217、Mc11229、Mc11218，它們的基因序列分別如SEQ ID No.1-5所示。它們的氨基酸序列分別如SEQ ID No.7-11所示。

本發(fā)明提供博落回中參與血根堿與白屈菜紅堿合成時(shí)提高氧化反應(yīng)效率的輔酶基因?yàn)镃PR19967，基因序列如SEQ ID No.6所示，氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。

本發(fā)明還提供含有上述細(xì)胞色素P450酶基因的載體，以及上述細(xì)胞色素P450酶基因和如SEQ ID No.6所示的輔酶基因CPR19967序列的載體。含有上述細(xì)胞色素P450酶基因的工程菌，以及含有上述細(xì)胞色素P450酶基因和如SEQ ID No.6所示的輔酶基因CPR19967序列的工程菌。

本發(fā)明還提供上述細(xì)胞色素P450酶基因，或者它們分別與如SEQ ID No.6所示的輔酶基因CPR19967在血根堿與白屈菜紅堿合成中的應(yīng)用。以及上述細(xì)胞色素P450酶基因，或者它們分別與如SEQ ID No.6所示的輔酶基因CPR19967在血根堿與白屈菜紅堿體外合成中的應(yīng)用。

具體應(yīng)用如下：

基因Mc2661編碼博落回中催化N-甲基烏藥堿生成3，-羥基-N-甲基烏藥堿的N-甲基烏藥堿-3^，-羥化酶；

基因Mc9485編碼博落回中催化四氫非洲防己堿生成四氫小檗堿的四氫小檗堿合酶；

基因Mc217編碼博落回中催化金黃紫堇堿生成華紫堇堿的華紫堇堿合酶；

基因Mc11229和Mc11218編碼博落回中催化原阿片堿生成二氫血根堿的原阿片堿6-羥化酶；

輔酶基因CPR19967參與博落回血根堿與白屈菜紅堿合成時(shí)提高氧化反應(yīng)效率。

在之前的研究中，從去甲烏藥堿開(kāi)始的血根堿與白屈菜紅堿的合成途徑在罌粟等其它物種中已經(jīng)清晰，2個(gè)化合物共24步反應(yīng)，其中血根堿與白屈菜紅堿從去甲烏藥堿開(kāi)始均經(jīng)過(guò)12步反應(yīng)合成(包括1步不需要酶參與的自發(fā)反應(yīng))。其中第1步到第5步反應(yīng)兩者的合成酶相同以及第8到第12步反應(yīng)兩者的合成酶相同。為了找到博落回中合成血根堿與白屈菜紅堿的合成基因，我們對(duì)博落回植株進(jìn)行De Novo全基因組測(cè)序分析，同時(shí)對(duì)博落回根莖葉花果實(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先以其他物種(罌粟，花菱草)中合成血根堿和白屈菜紅堿的細(xì)胞色素P450酶基因?yàn)閰⒄栈?，在博落回基因組中進(jìn)行BLAST同源比對(duì)，找到了14個(gè)合成血根堿與白屈菜紅堿的細(xì)胞色素P450酶候選基因。由于博落回中的血根堿和白屈菜紅堿具有組織特異性，2種生物堿均在果莢中含量最高，而2種生物堿的重要前體化合物原阿片堿和別隱品堿在根部中含量最高，而在莖部組織中生物堿含量極低。因此我們推測(cè)參與合成血根堿與白屈菜紅堿的功能基因在博落回中的表達(dá)規(guī)律也應(yīng)該是根和果莢中高表達(dá)，莖中不表達(dá)或者表達(dá)量極低。根據(jù)這種組織表達(dá)特異性，我們從14個(gè)候選基因中共篩選出6個(gè)符合這種表達(dá)規(guī)律的基因。然后，我們利用酵母表達(dá)體系，在酵母中表達(dá)這些候選基因，通過(guò)分別飼喂每步的上游化合物，再用UPLC-Q-TOF儀來(lái)檢測(cè)酵母提取物。

我們通過(guò)酵母驗(yàn)證了血根堿與白屈菜紅堿中的細(xì)胞色素P450酶，在通路中共有5步反應(yīng)屬于細(xì)胞色素P450酶參與的步驟，篩選出的6個(gè)基因分別是Mc2661、Mc9485、Mc217、Mc11229、Mc11218、Mc10725。由于CPR基因是細(xì)胞色素P450基因在氧化底物中的一個(gè)輔酶基因，加入CPR有利于提高氧化反應(yīng)效率，于是我們將輔酶CPR基因分別和這6個(gè)基因構(gòu)建到酵母菌株中進(jìn)行表達(dá)。完成6個(gè)菌株的構(gòu)建后我們分別飼喂這5步反應(yīng)的前體化合物N-甲基烏藥堿、四氫非洲防己堿、金黃紫堇堿、華紫堇堿、cis-N-甲基刺罌粟堿、原阿片堿、cis-N四氫小檗堿、別隱品堿。之后我們通過(guò)UPLC-Q-TOF檢測(cè)酵母提取物發(fā)現(xiàn)在飼喂N-甲基烏藥堿的表達(dá)Mc2661的酵母提取物中檢測(cè)到了下游產(chǎn)物3，-羥基-N-甲基烏藥堿，以及在飼喂四氫非洲防己堿的Mc9485的酵母提取物中檢測(cè)到了下游產(chǎn)物四氫小檗堿，在飼喂金黃紫堇堿的Mc217的酵母提取物中檢測(cè)到了下游產(chǎn)物華紫堇堿，在飼喂原阿片堿的Mc11229、Mc11218的酵母提取物中檢測(cè)到了下游產(chǎn)物二氫血根堿，在飼喂別隱品堿的Mc11229、Mc11218的酵母提取物中檢測(cè)到了下游產(chǎn)物二氫白屈菜紅堿，而在空白酵母中未檢測(cè)到任何一步反應(yīng)的下游產(chǎn)物。然而有兩步反應(yīng)SPS和MSH未能找到正確的基因，這可能與這兩步反應(yīng)不適合酵母表達(dá)體系有關(guān)。因此我們認(rèn)為Mc2661是博落回中催化N-甲基烏藥堿生成3，-羥基-N-甲基烏藥堿的N-甲基烏藥堿-3，-羥化酶(NMCH)，Mc9485是博落回中催化四氫非洲防己堿生成四氫小檗堿的四氫小檗堿合酶(TDC)，Mc217是博落回中催化金黃紫堇堿生成華紫堇堿的華紫堇堿合酶(CFS)，Mc11229、Mc11218是博落回中催化原阿片堿生成二氫血根堿的原阿片堿6-羥化酶。同時(shí)，我們還將博落回中催化原阿片堿和別隱品堿生成血根堿和白屈菜紅堿的原阿片堿6-羥化酶(McP6H)與罌 粟和花菱草中催化這2步的二氫苯并菲啶氧化酶(PsP6H)、(EcP6H)進(jìn)行效率比較，發(fā)現(xiàn)表達(dá)Mc11229的酵母中產(chǎn)生的血根堿和白屈菜紅堿的量要大于表達(dá)Mc11218和PsP6H以及EcP6H的酵母。證明博落回中原阿片堿6-羥化酶(McP6H)具有更高的催化效率。而Mc10725表達(dá)酵母中不產(chǎn)生這幾步反應(yīng)中任何一步的底物，因此不參與合成血根堿與白屈菜紅堿。

本發(fā)明首次在博落回基因組中發(fā)現(xiàn)參與血根堿與白屈菜紅堿合成的5個(gè)細(xì)胞色素P450酶基因,包括Mc9485、Mc2661、Mc217、Mc11229、Mc11218，以及提高氧化反應(yīng)效率的輔酶基因CPR19967。利用酵母體系驗(yàn)證了血根堿和白屈菜紅堿合成中細(xì)胞色素P450酶參與的5步反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)血根堿和白屈菜紅堿的合成。本發(fā)明進(jìn)一步揭示了博落回中血根堿合成的分子機(jī)制，為高含量血根堿和白屈菜紅堿博落回育種提供了理論依據(jù)和分子輔助育種目標(biāo)，可用于大規(guī)模篩選育種材料；同時(shí)還為血根堿和白屈菜紅堿的體外人工合成提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)，本發(fā)明可替代傳統(tǒng)的從植物材料中提取血根堿的方法，實(shí)現(xiàn)體外合成血根堿。

附圖說(shuō)明

圖1為血根堿與白屈菜紅堿合成通路圖，兩個(gè)化合物有部分合成通路相同，而本發(fā)明是從中間產(chǎn)物烏藥堿開(kāi)始研究，箭頭上分別標(biāo)出細(xì)胞色素P450酶參與的步驟共5步反應(yīng)。

圖2為本發(fā)明通過(guò)分析RNA-Seq數(shù)據(jù)，從博落回基因組中發(fā)現(xiàn)與血根堿與白屈菜紅堿合成相關(guān)的細(xì)胞色素P450酶基因的候選基因；

圖3為本發(fā)明利用UPLC-Q-TOF檢測(cè)表達(dá)Mc2661酵母與空白酵母提取物中參與血根堿與白屈菜紅堿合成第3步反應(yīng)，即N-甲基烏藥堿至3-羥基-N-甲基烏藥堿的結(jié)果；

圖4為本發(fā)明利用UPLC-Q-TOF檢測(cè)表達(dá)Mc217酵母與空白酵母提取物中參與血根堿與白屈菜紅堿合成第6步反應(yīng)，即金黃紫堇堿至華紫堇堿的結(jié)果；

圖5為本發(fā)明利用UPLC-Q-TOF檢測(cè)表達(dá)Mc9485酵母與空白酵母提取物中參與白屈菜紅堿合成第6步反應(yīng)即四氫非洲防己堿至四氫小檗堿的結(jié)果；

圖6為本發(fā)明利用UPLC-Q-TOF檢測(cè)表達(dá)Mc11229、Mc11218酵母與空白酵母提取物中參與血根堿合成第10步反應(yīng)即原阿片堿至二氫血根堿的結(jié)果，以及白屈菜紅堿合成第17步反應(yīng)即原別隱品堿至二氫白屈菜紅堿的結(jié)果。同時(shí)，結(jié)果顯示表達(dá)Mc11229的酵母中產(chǎn)生的血根堿和白屈菜紅堿的量要大于表達(dá)Mc11218和PsP6H以及EcP6H的酵母。證明博落回中原阿片堿6-羥化酶(McP6H)具有更高的催化效率，而Mc10725表達(dá)酵母中不產(chǎn)生這幾步反應(yīng)中任何一步的底物，因此不參與合成血根堿與白屈菜紅堿。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1參與血根堿與白屈菜紅堿合成基因的挖掘與獲得

1基因的挖掘

由于血根堿與白屈菜紅堿在罌粟和花菱草等植物中的合成路徑已知(圖1)，相關(guān)的功能基因也已經(jīng)得到克隆。我們以其他物種(罌粟、花菱草)已公開(kāi)在NCBI的血根堿與白屈菜紅堿的細(xì)胞色素P450酶基因序列為參照基因，在博落回De Novo全基因組序列中進(jìn)行BLAST比對(duì)，共得到候選基因14條。又由于血根堿 與白屈菜紅堿在果莢中含量極高，莖中含量極低。前體化合物原阿片堿與別隱品堿在根部含量極高，莖中含量極低。以此為線索，分析博落回根莖葉花果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(RNA-Seq)從14條候選基因中篩選符合根部和果莢高表達(dá)，莖部不表達(dá)這一表達(dá)模式的基因，共得到6條(圖2),分別是Mc2661、Mc9485、Mc217、Mc11229、Mc11218、Mc10725。

根據(jù)罌粟中已報(bào)道的CPR序列在博落回De Novo全基因組序列中進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到CPR19967候選基因。CPR基因(SEQ ID No.6)是P450基因在氧化底物中的一個(gè)輔酶基因，加入CPR有利于提高氧化反應(yīng)效率。

2博落回Mc2661、Mc9485、Mc217、Mc11229、Mc11218、Mc10725、CPR19967以及用于效率比較的罌粟中PsP6H(AGC92397)和花菱草EcP6H(BAK20464)基因的獲得。

首先制備博落回根部和果莢cDNA文庫(kù)，罌粟和花菱草基因來(lái)自于人工合成(金唯智公司)，然后利用正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物序列見(jiàn)表1)。

表1引物序列(5′-3′)

PCR反應(yīng)體系以20μl計(jì)為：10-20ng/μl模板1μl，10pmol/μl正向、反向引物各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μL高保真Taq DNA聚合酶1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液2μl，余量為水。

PCR反應(yīng)條件為：94℃5分鐘；94℃20秒，55℃20秒，72℃2分30秒，35個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘。

將擴(kuò)增得到的片段與pYES2載體(Invitrogen)連接，測(cè)序確認(rèn)沒(méi)有突變。

實(shí)施例2利用酵母表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證血根堿與白屈菜紅堿合成候選基因的功能，比較博落回與罌粟和花菱草中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)化效率

將Mc2661、Mc9485、Mc217、Mc11229、Mc11218、Mc10725分別與輔酶CPR基因構(gòu)建到表達(dá)載體pYES2(Invitrogen)上，并轉(zhuǎn)化酵母菌。誘導(dǎo)酵母表達(dá)蛋白，然后進(jìn)行前體飼喂收集酵母。裂解后用甲醇抽提化合物。樣品制備好后用UPLC-Q-TOF進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果分別如圖3-圖6所示。利用酵母表達(dá)系統(tǒng)比較博落回中Mc11229、Mc11218與罌粟中PsP6H和花菱草中EcP6H的轉(zhuǎn)化效率(圖6)。

CPR19967基因(SEQ ID No.6)是P450基因在氧化底物中的一個(gè)輔酶基因，加入CPR19967有利于提高氧化反應(yīng)效率。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列說(shuō)明：

SEQ ID No.1-6分別為Mc9485、Mc2661、Mc217、Mc11229、Mc11218、CPR19967基因序列。

SEQ ID No.7-12分別為基因Mc9485、Mc2661、Mc217、Mc11229、Mc11218、CPR19967編碼的氨基酸序列。