本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域與疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及一種抗脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細(xì)胞株以及抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脊髓灰質(zhì)炎是由脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的嚴(yán)重危害兒童健康的急性傳染病，該病毒為嗜神經(jīng)病毒，主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)的運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞，以脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元損害為主?；颊叨酁?～6歲兒童，主要癥狀是發(fā)熱，全身不適，嚴(yán)重時肢體疼痛，發(fā)生分布不規(guī)則和輕重不等的遲緩性癱瘓，俗稱小兒麻痹癥。脊髓灰質(zhì)炎臨床表現(xiàn)多種多樣，包括程度很輕的非特異性病變，無菌性腦膜炎(非癱瘓性脊髓灰質(zhì)炎)和各種肌群的弛緩性無力(癱瘓性脊髓灰質(zhì)炎)。脊髓灰質(zhì)炎患者，由于脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元受損，與之有關(guān)的肌肉失去了神經(jīng)的調(diào)節(jié)作用而發(fā)生萎縮，同時皮下脂肪、肌腱及骨骼也萎縮，使整個機(jī)體變細(xì)。
已知脊髓灰質(zhì)炎病毒有3個血清型，這3個血清型病毒的核苷酸數(shù)目為7500個左右。雖然有71％左右的核苷酸為3個型別脊髓灰質(zhì)炎病毒所共有，但不相同的核苷酸序列卻都位于編碼區(qū)內(nèi)，因此3個型別病毒間中和試驗(yàn)無交叉反應(yīng)。用抗原抗體結(jié)合試驗(yàn)可查出病毒有兩種抗原，一種稱為D(致密)抗原，另一種稱為C(無核心)抗原。前者存在于成熟的、有感染性的病毒顆粒中，是該病毒的中和抗原，具有型特異性。C抗原存在于經(jīng)過56℃滅活、或者未成熟的空心病毒顆粒中，是一種耐熱的抗原成份。D抗原與C抗原均可與病毒的抗血清均呈抗原抗體結(jié)合陽性反應(yīng)。D抗原相對C抗原的一個優(yōu)勢是其含量可以很好地反映免疫原性效力。
口服脊灰減毒活疫苗推廣后，全球消滅脊灰行動取得了令人矚目的成績。但是實(shí)現(xiàn)全球消滅脊灰的目標(biāo)尚存在許多障礙和挑戰(zhàn)。2008年在尼日利亞脊灰死灰復(fù)燃后，蔓延到鄰近的8個國家。而在1995～1996年及1999年，我國云南和青海省發(fā)生了分別由緬甸和印度輸入的脊灰野毒株病例，經(jīng)當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制部門采取緊急措施后，才未發(fā)生二代病例。
自50年代中期以來，一直采用Salk滅活疫苗及Sabin減毒活疫苗，免疫效果良好，極大地降低了脊髓灰質(zhì)炎的發(fā)病率。Salk疫苗由3個型別病毒經(jīng)甲醛滅活后混合制成，肌肉注射，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。其優(yōu)點(diǎn)是便于保存及運(yùn)輸，無減毒株返祖現(xiàn)象，且副作用較少。Sabin疫苗是用減毒變異株制成，采用口服，方法簡便，不但可使機(jī)體產(chǎn)生抗體，還能刺激腸壁漿細(xì)胞產(chǎn)生分泌型IgA，對野毒株有消滅作用，從而切斷其在人群中的傳播，因而Sabin疫苗的免疫效果更好。
目前國際上正廣泛使用的3價(jià)疫苗為采用減毒的Sabin株經(jīng)過滅活、純化后配制而成的注射劑型疫苗，該疫苗不僅免疫保護(hù)效果好，而且避免了毒力返祖的危險(xiǎn)。Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒是WHO推薦使用的安全毒株，可用于疫苗的研究和臨床檢測。
脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體是指動物或人體抗脊髓灰質(zhì)炎各型別病毒產(chǎn)生的IgG、IgM等類型抗體的總稱，廣泛應(yīng)用于脊髓灰質(zhì)炎病毒鑒定、脊髓灰質(zhì)炎疫苗以及各型別抗原的定性和定量檢測中。
由于目前脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒抗原檢測普遍采用的多克隆抗體包被——多克隆抗體夾心的檢測體系，該體系不僅對于Ⅱ、Ⅲ型存在較大的交叉反應(yīng)，而且不能很好的區(qū)分D抗原和C抗原，尤其在用于3個型別混合疫苗Sabin IPVⅠ型抗原檢測時，由于交叉反應(yīng)導(dǎo)致檢測結(jié)果不能真實(shí)反應(yīng)Ⅰ型抗原的含量以及疫苗Ⅰ型的免疫原性，同時WHO也推薦采用多克隆抗體與單克隆抗體匹配的方式檢測三價(jià)脊灰疫苗中的各型抗原含量；目前國際上尚缺乏Sabin IPV D抗原檢測的標(biāo)準(zhǔn)化的試劑，制備特異性好，具有中和活性的單克隆抗體，可為Sabin IPV體外效力檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)化奠定基礎(chǔ)。
因此，有必要制備一種型特異的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型單克隆抗體，用于Ⅰ型脊灰抗原、抗體的檢測與病毒的鑒別。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體，用于脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒抗原含量或抗體含量的檢測。本發(fā)明的另一目的在于提供上述單克隆抗體的應(yīng)用。
因此，在第一方面，本發(fā)明首先提供一種分泌Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株JⅠ-112，該細(xì)胞株于2016年5月11日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，簡稱CGMCC，郵編100101)保藏，分類命名為脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其保藏編號為CGMCC No.12292。
在第二方面，本發(fā)明提供了第一方面的分泌Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株JⅠ-112即保藏編號為CGMCC No.12292的雜交瘤細(xì)胞在制備用于診斷脊髓灰質(zhì)炎的診斷劑中的應(yīng)用。
在第三方面，本發(fā)明提供了第一方面的分泌Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株JⅠ-112即保藏編號為CGMCC No.12292的雜交瘤細(xì)胞在制備用于預(yù)防或治療脊髓灰質(zhì)炎的藥物中的應(yīng)用。
在第四方面，本發(fā)明還提供了脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體，該抗體采用小鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備。
在一個實(shí)施方案中，所述制備可以包括以下步驟：將經(jīng)脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒原液免疫的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，分離出能夠分泌脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，將該雜交瘤細(xì)胞接種小鼠腹腔，由此制備含有特異性脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體的腹水。
在一個進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述小鼠經(jīng)純化滅活的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒原液免疫，所述純化滅活的Sabin株Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒液的制備方法為例如以下示例的方法：?、裥筒《局苽涞墓ぷ鞣N子批毒種按MOI＝10～0.05接種Vero細(xì)胞或其他原代、傳代細(xì)胞，接種病毒時細(xì)胞的濃度為0.1-10×106細(xì)胞/ml，病毒培養(yǎng)后收獲細(xì)胞上清，即為Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒收獲液，濃縮(例如通過超濾膜包)10倍以上后，進(jìn)行分子篩層析和離子交換層析以及甲醛滅活后即得純化滅活的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒原液。
在一個具體實(shí)施方案中，所述脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體由第一方面的分泌Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株JⅠ-112即保藏編號為CGMCC No.12292雜交瘤細(xì)胞株分泌獲得。
在一個實(shí)施方案中，所述脊髓灰質(zhì)炎I型病毒單克隆抗體不進(jìn)行任何標(biāo)記。
在另一個實(shí)施方案中，所述脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體經(jīng)生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記。優(yōu)選地，所述脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體經(jīng)酶標(biāo)記。優(yōu)選地，所述的酶為辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)。
在第五方面，本發(fā)明提供了第四方面的單克隆抗體在制備用于檢測脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒抗原的檢測劑中的應(yīng)用。
在第六方面，本發(fā)明提供了第四方面的單克隆抗體在制備用于檢測脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒抗體的檢測劑中的應(yīng)用。
在制備用于檢測脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒抗原或抗體的檢測劑的過程中，上述第四方面的單克隆抗體在不進(jìn)行生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記時，可以通過添加經(jīng)生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記(例如諸如辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)的酶標(biāo)記)的第二抗體來進(jìn)行，即以一個物種的抗脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體作為包被抗體，以本發(fā)明的單克隆抗體為捕獲抗體，以上述經(jīng)生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記的第二抗體作為檢測抗體，用于檢測或制備檢測試劑。
在第七方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒抗原的試劑盒，含有第四方面的單克隆抗體。
在第八方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒抗體的試劑盒，含有第四方面的單克隆抗體。
本發(fā)明提供了一種可以用于生產(chǎn)脊髓灰質(zhì)炎治療性抗體的改造的細(xì)胞株，以及包含于細(xì)胞株的保護(hù)性抗體的基因信息。
本發(fā)明提供的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體具有如下一個或多個或全部的有益效果：
1、本發(fā)明的單克隆抗體具有較高的效價(jià)即反應(yīng)性，間接法效價(jià)可達(dá)105以上。
2、本發(fā)明的單克隆抗體具有較好的中和病毒的能力，對于脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒的中和效價(jià)大于1：16384。
3、本發(fā)明的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體可以特異性地區(qū)分脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒與Ⅱ、Ⅲ型病毒，不與后者反應(yīng)，是能夠與脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒特異性結(jié)合的單克隆抗體。
4、本發(fā)明的單克隆抗體與甲肝病毒、腸道病毒71型病毒、柯薩奇A16病毒等均無交叉反應(yīng)，有較好的病毒特異性。
5、本發(fā)明提供了一種技術(shù)構(gòu)思全新的技術(shù)方案，即第四方面的單克隆抗體。
6、本發(fā)明的單克隆抗體基本上僅與作為可產(chǎn)生中和抗體的抗原D抗原反應(yīng)，因此可以作為反映疫苗保護(hù)效果的有效工具。
7、除了與Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒發(fā)生特異性反應(yīng)之外，本發(fā)明的單克隆抗體還可以與目前在國內(nèi)外市售的由野毒株Mahoney株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒制備的脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗發(fā)生反應(yīng)，因此具有相當(dāng)?shù)膹V譜性，可以廣泛應(yīng)用。
8、本發(fā)明的單克隆抗體可廣泛應(yīng)用于脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒的檢測、鑒別、篩查與對疫苗生產(chǎn)的抗原檢測以及流行病調(diào)查中；同時檢測的是Ⅰ型特異性抗原，可以更加有效地反映混合疫苗的Ⅰ型抗原含量，對疫苗的工藝研究與生產(chǎn)以及疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量控制和質(zhì)量研究具有重要意義。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；實(shí)施例中所用的試劑為市售商品。
實(shí)施例1免疫原制備與動物免疫
(1)取Vero細(xì)胞工作細(xì)胞庫復(fù)蘇后于36.5±0.5℃培養(yǎng)，至細(xì)胞濃度為0.1-10×106細(xì)胞/ml時，接種病毒。
(2)取Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒制備的工作種子批毒種按MOI＝5～0.1接種Vero細(xì)胞，置32.5±0.5℃培養(yǎng)。
(3)病毒培養(yǎng)2～4天,收獲細(xì)胞上清，即為Sabin株脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型病毒收獲液。
(4)Ⅰ型病毒收獲液澄清后用超濾膜包濃縮10倍以上。
(5)然后進(jìn)行分子篩層析和離子交換層析，監(jiān)測波長為280nm，分別收集洗脫液和流穿液，即得純化液，甲醛滅活后即得純化滅活的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎I型病毒原液。
(6)將純化滅活的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎I型病毒原液與弗氏佐劑(首次免疫為弗氏完全佐劑，后期免疫為弗氏不完全佐劑)等體積混合乳化后于第0、14、28天背部皮下多點(diǎn)免疫BALB/c小鼠，0.2ml/只。
(7)于第39天以純化滅活的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎I型病毒原液靜脈注射小鼠，3天后取小鼠脾臟，進(jìn)行細(xì)胞融合。
實(shí)施例2細(xì)胞融合及建株
(1)細(xì)胞融合前復(fù)蘇培養(yǎng)SP2/0細(xì)胞株，融合前3天擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前1天去除RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco)，重新添加培養(yǎng)液，準(zhǔn)備SP2/0細(xì)胞。
(2)處死免疫小鼠，按常規(guī)方法制備小鼠脾細(xì)胞懸液。
(3)根據(jù)脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果分別加入適量不完全I(xiàn)MDM培養(yǎng)液(Gibco)，SP2/0細(xì)胞晃動混勻，脾細(xì)胞用移液管吹打均勻。然后將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按1:2～10:1混合于50ml離心管中，混勻。
(4)加不完全I(xiàn)MDM培養(yǎng)液至50ml，離心5-10分鐘，倒凈上清。輕擊融合管底，使沉淀細(xì)胞松散均勻，離心管置37℃水浴，準(zhǔn)備融合。
(5)將37℃預(yù)熱的50％的PEG4000 1ml用滴管緩慢滴入混合細(xì)胞管，邊滴邊轉(zhuǎn)動離心管，使細(xì)胞保存在混勻狀態(tài)。
(6)靜置90秒后立即緩慢加入15ml無血清的IMDM培養(yǎng)基(Gibco)(37℃)，然后離心5-10分鐘，棄去上清。
(7)加入IMDM完全培養(yǎng)液(Gibco)，混勻，將混懸液分別加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
(8)第2天向細(xì)胞板加HAT培養(yǎng)液(IMDM含1*HAT(Sigma))100μl/孔。
(9)每2-3天換一次HAT培養(yǎng)液，觀察是否出現(xiàn)雜交瘤，兩周后換為HT培養(yǎng)基(IMDM含1*HT(Sigma))，觀察融合細(xì)胞生長狀況。
(10)細(xì)胞融合后第七天開始觀察雜交瘤細(xì)胞的生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清進(jìn)行抗體ELISA檢測。將陽性孔細(xì)胞轉(zhuǎn)入24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)，及時做亞克隆。
(11)經(jīng)3次亞克隆得到能夠穩(wěn)定分泌抗體的28個細(xì)胞系，綜合抗體效價(jià)和特異性(測試方法見下文)兩個指標(biāo)，我們選擇其中一個最好的細(xì)胞系，將其命名為JⅠ-112，凍存該細(xì)胞。將雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行保藏，保藏編號為CGMCC No.12292，分類命名為：脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，保藏時間：2016年5月11日；保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
實(shí)施例3單克隆抗體細(xì)胞株腹水制備及抗體ELISA法效價(jià)檢測
按常規(guī)方法將凍存的實(shí)施例2獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶底50％以上時即可按照常規(guī)方法腹腔接種BALB/c小鼠，定期收集腹水JⅠ-112。
將純化滅活的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒采用0.01M PBS 1:200稀釋，100μl/孔包被酶標(biāo)板，2-8℃過夜，然后100μl/孔加入1:102起始10倍梯度稀釋的陰性對照和JⅠ-112單克隆抗體腹水，37℃反應(yīng)1小時，100μl/孔加入1:4000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，37℃反應(yīng)1小時后洗板、顯色、終止，讀取OD450nm，由此檢測本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞分泌的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒腹水JⅠ-112的間接ELISA法抗體效價(jià)，抗體效價(jià)達(dá)105以上，效價(jià)較高。結(jié)果見表1。
表1抗體間接ELISA法效價(jià)檢測結(jié)果
實(shí)施例4單克隆抗體細(xì)胞株腹水中和抗體效價(jià)檢測
將JⅠ-112單克隆抗體腹水、陰性和陽性血清對照進(jìn)行2倍梯度稀釋，然后50μl/孔加入細(xì)胞板，各稀釋度平行添加2孔，然后每孔加入100CCID50/0.05ml的Ⅰ型脊灰病毒，35.0±0.5℃培養(yǎng)箱孵育后加入100μl/孔0.2-1.6×105的Vero細(xì)胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)5～7天判定結(jié)果，檢測本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞分泌的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒腹水JⅠ-112的中和抗體效價(jià)。中和抗體效價(jià)達(dá)1：16384以上，效價(jià)較高。
實(shí)施例5抗體型特異性檢測結(jié)果
將純化滅活的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅱ型和Ⅲ型病毒原液采用0.01M PBS 1:10稀釋，100μl/孔包被酶標(biāo)板，2-8℃過夜，檢測實(shí)施例3獲得的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體腹水JⅠ-112的抗體效價(jià)，同時設(shè)置陰性與陽性對照，均為陰性。結(jié)果見表2。
表2間接ELISA法抗體型特異性檢測結(jié)果
本發(fā)明中陽性對照具有較好的反應(yīng)性，陰性對照無反應(yīng)，試驗(yàn)成立。JⅠ-112細(xì)胞株分泌的單克隆抗體(JⅠ-112)不與脊髓灰質(zhì)炎Ⅱ型和Ⅲ型病毒反應(yīng)，說明本發(fā)明的單克隆抗體能夠區(qū)分開脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型與Ⅱ型、Ⅲ型病毒。本發(fā)明的JⅠ-112雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體在用于脊髓灰質(zhì)炎疫苗(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒混合的樣品)的抗原含量檢測時可以特異地識別脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型抗原，而不被其他兩型干擾，具有較好的型特異性和應(yīng)用價(jià)值。
實(shí)施例6抗體對D抗原反應(yīng)特異性的檢測結(jié)果
將Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型實(shí)心病毒(D抗原)、空心病毒(C抗原)、D抗原56℃加熱30min后病毒(熱處理C抗原)均用0.01M PBS 1:200倍稀釋后100μl/孔包被酶標(biāo)板，2-8℃過夜；將本發(fā)明中的細(xì)胞株分泌的單克隆抗體(JⅠ-112)以1:102起始10倍梯度稀釋后100μl/孔加入酶標(biāo)板，同時做陰性對照。其后試驗(yàn)步驟與實(shí)施例3相同，檢測本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞分泌的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒腹水JⅠ-112對上述抗原的效價(jià)及特異性，結(jié)果見表3。
表3抗體對D抗原反應(yīng)特異性檢測結(jié)果
結(jié)果可見，脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒腹水JⅠ-112僅對Ⅰ型實(shí)心病毒具有較強(qiáng)的反應(yīng)性，效價(jià)大約105，對于空心病毒以及熱處理病毒均不反應(yīng)。文獻(xiàn)顯示，僅實(shí)心病毒(D抗原)可以產(chǎn)生針對脊灰Ⅰ型病毒的保護(hù)性抗體。本試驗(yàn)表明，該單抗僅能檢測有效抗原即D抗原，對于無效抗原無反應(yīng)性，具有較好的有效抗原的識別能力，可以將它用于有效抗原表位與含量的檢測，意義重大。
實(shí)施例7抗體亞類測定
將純化滅活的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒原液采用0.01M PBS1:10倍稀釋后100μl/孔包被酶標(biāo)板，2-8℃過夜，然后采用Sigma公司ISO2-1KT鼠單克隆抗體分型試劑按照單克隆抗體亞類試劑說明書進(jìn)行試驗(yàn)，最后加入HRP標(biāo)記的兔抗羊二抗進(jìn)行單克隆抗體亞類鑒定。結(jié)果顯示本發(fā)明的單克隆抗體為IgG1型。
實(shí)施例8免疫印跡(Western blotting)實(shí)驗(yàn)
將純化滅活的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒原液采用BIO-RAD的電泳電轉(zhuǎn)設(shè)備使用12％的SDS-PAGE電泳膠進(jìn)行電泳，之后再電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜，然后以本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞腹水為一抗(1：2000)、AP-羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blotting鑒定。結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞JⅠ-112分泌的單克隆抗體與Sabin株脊髓灰質(zhì)炎型病毒VP1、VP2、VP3、VP4均不反應(yīng)，表明該單克隆抗體與變性后的抗原不能產(chǎn)生反應(yīng)，說明本發(fā)明雜交瘤細(xì)胞JⅠ-112分泌的單克隆抗體JⅠ-112不能識別線性表位，是構(gòu)象性單克隆抗體，識別空間結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例9親和常數(shù)測定
在本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體JⅠ-112純化后檢測蛋白質(zhì)含量。采用1:5、1:10、1:20稀釋的不同濃度的Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒橫向包被酶標(biāo)板，100μl/孔，2-8℃包被過夜。第二天洗板后37℃封閉2小時，拍干待用。將純化單克隆抗體JI-112二倍梯度稀釋，縱向加入包被后的酶標(biāo)板，采用間接ELISA法檢測抗原抗體反應(yīng)的OD值。以各抗原濃度下的曲線平坦段的OD值計(jì)為100％，計(jì)算50％OD值，考察50％OD值所對應(yīng)點(diǎn)的單克隆抗體濃度[Ab]t，再根據(jù)親和常數(shù)計(jì)算公式可以得到本發(fā)明單克隆抗體的親和常數(shù)為0.996×109M-1。
實(shí)施例10雜交瘤細(xì)胞系分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性檢測
分別在3個月和12個月后，從液氮中取出凍存的JⅠ-112雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行復(fù)蘇、擴(kuò)大培養(yǎng)后，制備腹水，進(jìn)行間接ELISA檢測抗體效價(jià)，以前期制備的腹水為對照進(jìn)行同時檢測。結(jié)果，本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體腹水效價(jià)達(dá)到105以上，與前期腹水效價(jià)無差異，表明細(xì)胞保藏后制備的腹水的效價(jià)未下降。因此本發(fā)明單克隆細(xì)胞株分泌抗體的活性沒有降低，穩(wěn)定性良好。
實(shí)施例11抗原含量檢測試劑盒的初步結(jié)果
將脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒兔多克隆抗體采用0.05M碳酸鹽緩沖液1:4000稀釋，100μl/孔包被酶標(biāo)板，2-8℃過夜。封閉液37℃封閉2小時，分別加入脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型抗原參比品和3批脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(所述脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗包含Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型滅活病毒)，37℃反應(yīng)1小時，洗板后加入1:8000的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體JⅠ-112，37℃反應(yīng)1小時，洗板后加入1:4000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃反應(yīng)1小時后洗板進(jìn)行顯色、終止、讀數(shù)，檢測脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的Ⅰ型抗原含量。結(jié)果見表4。
表4抗原含量檢測方法的應(yīng)用
采用本發(fā)明建立的抗原含量檢測方法檢測了3批脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中的Ⅰ型抗原含量，檢測值相對于理論值的回收率在103％-126％之間，滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，在酶聯(lián)免疫法允許的誤差范圍以內(nèi)，檢測方法準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明具有較好的應(yīng)用效果。
實(shí)施例12抗原含量檢測試劑盒的特異性研究
將脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒兔多抗采用0.05M碳酸鹽緩沖液1:4000稀釋，100μl/孔包被酶標(biāo)板2-8℃過夜。然后37℃封閉2小時，分別加入Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒原液、甲肝滅活疫苗原液、柯薩奇A16(CA16)滅活疫苗原液、CA16收獲液、腸道病毒71型(EV71)滅活疫苗原液、EV71收獲液，37℃反應(yīng)1小時，洗板后加入1:8000的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體JⅠ-112，37℃反應(yīng)1小時，洗板后加入1:4000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃反應(yīng)1小時后洗板進(jìn)行顯色、終止、讀數(shù)，檢測樣品的Ⅰ型抗原含量，結(jié)果見表5。
表5本發(fā)明的單克隆抗體特異性(OD值)
本發(fā)明的單克隆抗體與Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅱ和Ⅲ型病毒原液、甲肝滅活疫苗原液、CA16滅活疫苗原液、CA16收獲液、EV71滅活疫苗原液、EV71收獲液均不反應(yīng)，表明本發(fā)明的單克隆抗體可以有效地將脊髓灰質(zhì)炎I型病毒與上述病毒區(qū)分開。同時采用本發(fā)明建立的體系和培養(yǎng)基以及Vero細(xì)胞培養(yǎng)物不存在交叉反應(yīng)，因此本發(fā)明的單克隆抗體可以有效檢出脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型抗原，具有高度的特異性。由于本發(fā)明的抗體具有作為區(qū)分脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型混合疫苗中各型抗原最關(guān)鍵指標(biāo)的特異性，因此本發(fā)明的單克隆抗體可對脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型混合疫苗進(jìn)行有效區(qū)分：在檢測Ⅰ型抗原時，本發(fā)明的單克隆抗體不與Ⅱ型和Ⅲ型抗原交叉反應(yīng)，因此可以有效檢測脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型抗原含量。
實(shí)施例13抗原含量檢測試劑盒對D抗原的檢測
將脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒兔多克隆抗體采用0.05M碳酸鹽緩沖液1:4000稀釋，100μl/孔包被酶標(biāo)板，2-8℃過夜。封閉液37℃封閉2小時；將Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒(D抗原)以及脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗56℃加熱30min，然后將樣品加入酶標(biāo)板。后續(xù)試驗(yàn)同實(shí)施例12，考察檢測試劑盒對于加熱前和加熱后的樣品中D抗原的檢測效果。結(jié)果見表6。
表6本發(fā)明的單克隆抗體對Ⅰ型病毒D抗原的檢測結(jié)果
根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)中的記載以及本發(fā)明人在先的研究，脊髓灰質(zhì)炎病毒原液和滅活疫苗經(jīng)過56℃加熱30min后免疫動物，動物的免疫血清的中和效價(jià)極低，表明經(jīng)熱處理的樣品中的脊髓灰質(zhì)炎病毒不再具有免疫原性。而在本申請中，根據(jù)表6，本發(fā)明的單克隆抗體與Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒原液以及滅活疫苗具有良好的反應(yīng)，但與加熱后的上述樣品具有較差的反應(yīng)，均低于3％，這表明抗原含量的檢測結(jié)果與現(xiàn)有的動物試驗(yàn)的免疫原性具有良好的一致性。
另外，已知多克隆抗體-多克隆抗體的脊髓灰質(zhì)炎抗原含量檢測系統(tǒng)與加熱后的脊髓灰質(zhì)炎病毒依然具有較強(qiáng)的反應(yīng)，和現(xiàn)有的動物試驗(yàn)的免疫原性結(jié)果不一致。因此，本發(fā)明單克隆抗體的檢測系統(tǒng)能夠較好地檢測D抗原，更好地反映疫苗的保護(hù)效果，檢測結(jié)果更理想，更適合用于疫苗的中間產(chǎn)品和終產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
本發(fā)明的單克隆抗體在用于抗原含量檢測時，可以作為雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的包被抗體，也可對它進(jìn)行生物標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記，作為雙抗體夾心ELISA檢測試劑盒的夾心酶標(biāo)抗體；同時，也可以將它和另一物種的多克隆抗體配對使用，通過加入夾心抗體的第二酶標(biāo)抗體的方法制備抗原含量檢測試劑盒。
本發(fā)明用于抗體檢測試劑盒時，可以作為包被抗體或者酶標(biāo)競爭抗體，也可以作為競爭抗體并加入抗鼠酶標(biāo)二抗的方法進(jìn)行檢測。
實(shí)施例14抗原含量檢測試劑盒對市售各毒株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒的檢測
將脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒兔多克隆抗體采用0.05M碳酸鹽緩沖液1:4000稀釋，100μl/孔包被酶標(biāo)板，2-8℃過夜后封閉，然后加入Sabin株脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型抗原參比品及其脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗，以及Mahoney株國際標(biāo)準(zhǔn)品及其脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(所述脊髓灰質(zhì)炎參比品、標(biāo)準(zhǔn)品、滅活疫苗均包含Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型滅活病毒)，37℃反應(yīng)1小時，洗板后加1:8000的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒單克隆抗體JⅠ-112，37℃反應(yīng)1小時，洗板后加入1:4000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37℃反應(yīng)1小時后洗板進(jìn)行顯色、終止、讀數(shù)，檢測脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的Ⅰ型抗原含量。結(jié)果見表7。
表7抗原含量檢測方法的應(yīng)用
目前已在國際上廣泛銷售的上市脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗的Ⅰ型病毒包括Sabin株和Mahoney株兩種，均可有效預(yù)防由于Ⅰ型脊髓灰質(zhì)炎病毒帶來的感染。采用本發(fā)明的細(xì)胞株制備的單抗腹水JⅠ-112建立的雙抗體夾心檢測系統(tǒng)，對于Sabin株和Mahoney株兩種脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗中的Ⅰ型D抗原的檢測結(jié)果回收率在90％-110％之間，在酶聯(lián)免疫法允許的誤差范圍以內(nèi)，回收率較好，檢測方法準(zhǔn)確可靠。表明，采用該單抗可以有效檢測市售疫苗中的Ⅰ型D抗原含量，對市售疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量研究與質(zhì)量控制具有廣譜適用性。
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。