本發(fā)明涉及一種耶氏肺孢子蟲的檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)：

耶氏肺囊胞蟲肺炎(Pneumocystis Pneumonia,PCP)是由耶氏肺囊胞蟲(Pneumocystis Jiroveci)引起的呼吸系統(tǒng)疾病。耶氏肺囊胞蟲，又稱耶氏肺孢子蟲，病菌通常寄生在肺泡內(nèi)，成簇粘附于肺泡上皮，在健康宿主體內(nèi)并不引起癥狀，對于免疫功能低下或缺陷的患者尤其是腫瘤化療患者、接受免疫抑制治療的造血干細(xì)胞或者器官移植患者,以及艾滋病(AIDS)患者，PCP是最重要的機(jī)會性感染之一，約80％左右愛滋病人會出現(xiàn)PCP，也是愛滋病患者最重要的致死原因，早診斷、早治療可有效地降低患者病死率。

PCP現(xiàn)有的診斷技術(shù)包括以下幾種:

1、病原學(xué)診斷查獲包囊為確診依據(jù)。收集痰液或支氣管分泌物涂片染色后鏡檢，雖取材方便但檢出率很低。皮穿刺肺活檢、支氣管鏡肺活檢開胸肺活檢，雖檢出率高，但損傷大，因而不常用。此外，該方法對檢驗(yàn)人員的業(yè)務(wù)能力要求較高，人為因素影響大。常用染色方法有姬姆薩、甲苯胺藍(lán)和四胺銀染色法等。由于這種方法是一種有創(chuàng)性檢查，并不廣泛應(yīng)用。

2、免疫學(xué)診斷。常見的方法有對流免疫電泳檢測抗原，間接熒光試驗(yàn)，免疫印跡試驗(yàn)。由于大多數(shù)正常人在嬰幼兒階段都曾有過肺囊胞蟲隱性感染，血清中都有特異性抗體，但缺乏較好的敏感性和特異性，故檢測血清抗體的方法一般不用于肺囊胞蟲病的診斷。

3、X線檢查。此種檢查是非特異性的，部分患者胸部X線可正常。卡氏肺囊胞蟲肺炎典型病例的X線表現(xiàn)為兩肺先出現(xiàn)混合性肺泡及間質(zhì)性改變，以網(wǎng)狀結(jié)節(jié)狀浸潤為主，從肺門向外周擴(kuò)展，當(dāng)病情進(jìn)展時(shí)，可見肺野斑片狀實(shí)變影，其間常伴有廣泛性或局灶性肺氣腫和小段肺不張，以肺的外圍最為明顯。有的斑片狀實(shí)變影很快融合成大片狀均勻致密的浸潤影響，病變廣泛而呈向心性分布，與肺水腫相似，這一X線表現(xiàn)具有診斷特異性。但該方法不適于疾病的早期診斷，在臨床診療中意義不大。

4、PCR檢測，由于目前還沒有體外培養(yǎng)肺囊胞蟲的技術(shù)手段，PCR檢測成為臨床快速檢測肺囊胞蟲隱性感染的有效手段。為了保證檢測的靈敏度和特異性，均采用巢氏PCR對耶氏肺孢子蟲進(jìn)行檢測，同時(shí)多采用線粒體核 糖體大亞基(mtLSU-rRNA)或二氫蝶酸合成酶(DHPS)等多拷貝基因作為目的基因來檢測。由于多拷貝基因?qū)е屡R床檢驗(yàn)結(jié)果假陽性率普遍增高，一些由于樣品污染、無致病性定植菌被大量檢測出來，影響了臨床診斷的準(zhǔn)確性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的耶氏肺孢子蟲的PCR檢測試劑盒和檢測方法。

本發(fā)明提供了SEQ ID NO：1～2所示的引物對。

本發(fā)明還提供了SEQ ID NO：1～2所示的引物對在制備擴(kuò)增耶氏肺孢子蟲的基因的試劑中的用途。

本發(fā)明耶氏肺孢子蟲的檢測試劑盒，它包含序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物對。

本發(fā)明還提供了檢測耶氏肺孢子蟲的方法，包括如下步驟：

a，提取樣本DNA：提取待檢樣本中的DNA；

b，基因擴(kuò)增：用權(quán)利要求1所述的試劑盒對待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；

c，結(jié)果檢測：對DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。

本發(fā)明提供的試劑盒和方法可以有效擴(kuò)增耶氏肺孢子蟲的RTT109基因，特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短，用于快速檢測耶氏肺孢子蟲，為耶氏肺囊胞蟲肺炎患者的治療提供可靠的依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1耶氏肺囊胞蟲特定基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中M為DNA標(biāo)記物，Negative為陰性對照，Positive為陽性對照；

圖2提取的人細(xì)胞基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增人GAPDH結(jié)果。其中M為DNA標(biāo)記物，Negative為陰性對照，Genomic DNA從人SKOV3細(xì)胞提取的樣品；

圖3特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；

圖4靈敏度性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)驗(yàn)材料和儀器

1.主要試劑及試劑盒

(1)PCR擴(kuò)增引物合成(上海生工)；

(2)DH5α、Rosetta(DE3)菌株(購自北京全式金公司)；

(3)DNA Marker(購自大TAKARA公司)

(4)質(zhì)粒小抽試劑盒(購自上海生工公司)；

(5)氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素(購自上海生工公司)；

(6)PrimeSTAR PCR擴(kuò)增試劑盒(購自TaKaRa公司)；

(7)2x MasterMix PCR擴(kuò)增驗(yàn)證試劑盒(購自北京莊盟生物)；

(8)PCR反應(yīng)管(購自Axygen公司)；

2.實(shí)驗(yàn)主要儀器和設(shè)備

(1)落地式高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN)；

(2)臺式低溫高速離心機(jī)(Thermo Scientific)；

(3)瓊脂糖凝膠電泳槽及電泳儀(BIO-RAD)；

(4)MyGene thermo cycler基因擴(kuò)增儀(LongGene)；

(5)DELTA320-S pH計(jì)(Mettler Toledo)；

(6)AB265-S電子天平(Mettler Toledo)；

(7)高溫烤箱(BINDER)；

(8)雪花狀制冰機(jī)(SANYO)；

(9)核酸水平電泳系統(tǒng)(北京六一)；

(10)Nanodrop 2000(Thermo Scientific)；

(11)低速離心機(jī)Megafuge 1.0(Heraeus)；

(12)超純水儀TANKPE110(Millipore)；

(13)高壓滅菌鍋(SANYO)；

(14)恒溫微生物培養(yǎng)箱(SANYO)；

(15)超凈工作臺(蘇凈安泰)；

(16)大容量恒溫?fù)u床(上海智成)；

(17)恒溫水浴鍋DZKW-4(北京中心偉業(yè))；

(18)凝膠掃描儀GS-800(Bio-Rad)；

實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)

一、實(shí)驗(yàn)方法

1、PCR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)肺囊胞蟲特有基因RTT109，設(shè)計(jì)引物，經(jīng)Blast比對后送上海生工合成。

表1PCR引物資料

根據(jù)擴(kuò)增片段，合成陽性對照I，其核苷酸序列(SEQ ID NO：5)為：

TGGTGGGCAAAAGTGTTGGATTGTACAAAAAAAAGCCATCAACCGAAAAAATACATTTTAATACCTGGAATAGATACCCGAGAAACACTTAGTTTTACTCCAAATTATACAAATACCAGTTTAAAATGGATTTGCGGTCACCCATATCAATCTGCAAATAAACCTGCAAGAGAAATTATCCCACATTTTCCAGATGATCCTAAAACTCGACTTCTTGATCAATTAGATATTGACGGACAAGGAGAAACAATAAATGTTGACCAGTTTTGGGAATTAATGGCATTTCGTCAAGAATGTACACTTGGTAGAATTGTCGGTTTCTTAAATATAGAATTTCCTCCAAGCAAAGACCAAGAAAATAAAAAAGATTCGAGTTTAAGCAAGGATTTAAATGAAGAATGTGGTGTTCAAATGAGTGAAAGGATTTATCGAATGCATTATGAAAAGTTATTGCGTTCTGATTTTGAGACAC

2、模板制備

Ⅰ樣本預(yù)處理

痰或者支氣管肺泡灌洗液，加等量生理鹽水后混勻，室溫4000～6000轉(zhuǎn)離心10分鐘。棄去上清液，加1毫升生理鹽水重懸沉淀物，并轉(zhuǎn)至1.5毫升小離心管，14000轉(zhuǎn)室溫離心10分鐘。棄去上清液，沉淀物備用。

Ⅱ提取樣本的基因組DNA

給步驟I獲得的沉淀物中添加200微升基因組DNA提取裂解液(1～3％乙

基苯基聚乙二醇(NP-40)，5～10％聚苯乙烯基體離子交換樹脂

(Chelex-100)，1～3％吐溫20(Tween-20)，震蕩混勻后，將樣品管置于95～

100度加熱30分鐘。然后，將樣品在13000轉(zhuǎn)室溫離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)

移至新的1.5毫升小管中，此為樣品基因組DNA。

3、PCR擴(kuò)增

按樣品數(shù)量準(zhǔn)備PCR反應(yīng)管，以及PCR反應(yīng)混合液。每反應(yīng)管總體積20微升，包括0.5微升肺囊胞蟲特異性引物混合液(上游引物和下游引物的濃度分別為12.5pm/μL)，0.5微升Tag酶(濃度為1～5U/μL)，5微升PCR反應(yīng)液(PCR反應(yīng)液成分為:100mMTris-HCl pH 8.3；500mMKCl；15mM MgCl₂；0.01％明膠(gelatin)，dNTP 25mM；0.5％溴酚藍(lán))和14微升去離子水。在 渦旋器上混勻，并短暫離心后分裝至PCR反應(yīng)管。

將5微升基因組DNA樣品，陽性對照樣品I和陰性對照樣品分別加于標(biāo)記好的PCR管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

為了確認(rèn)樣品基因組DNA是否提取成功，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測時(shí)用基因組DNA對照人GAPDH特異性引物(SEQ ID NO：3:上游引物序列：5’-CGGATTTGGTCGTATTGGGC-3’；SEQ ID NO：4:下游引物序列：5’-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；引物濃度分別為12.5pm/μL)替代肺囊胞蟲特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用陽性對照樣品II(GAPDH基因，SEQ ID NO：6)為陽性對照，陰性對照樣品不變。

陽性對照樣品II的核苷酸序列：

ATGGTTTACATGTTCCAATATGATTCCACCCATGGCAAATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGAGAACGGGA

AGCTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATCTTCCAGGAGCGAGATCCCTCCAAAATCAAGTGGGGCGA

TGCTGGCGCTGAGTACGTCGTGGAGTCCACTGGCGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCATTTG

CAGGGGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTCTGCCCCCTCTGCTGATGCCCCCATGTTCGTCATGGGTGTGA

ACCATGAGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACC

CCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTTGGTATCGTGGAAGGACTCATGACCACAGTCCATGCCATCACT

GCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCTCTCCAGAACA

TCATCCCTGCCTCTACTGGCGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCAC

TGGCATGGCCTTCCGTGTCCCCACTGCCAACGTGTCAGTGGTGGACCTGACCTGCCGTCTAGAAAAACCT

GCCAAATATGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCT

ACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCACTCCTCCACCTTTGACGCTGGGGC

TGGCATTGCCCTCAACGACCACTTTGTCAAGCTCATTTCCTGGTATGACAACGAATTTGGCTACAGCAAC

AGGGTGGTGGACCTCATGGCCCACATGGCCTCCAAGGAGTAA

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，之后94℃變性45秒、55℃退火1分鐘、72℃延伸1分鐘、如此進(jìn)行35循環(huán)；再72℃延伸10分鐘。

4、結(jié)果檢測

配制1.5％的瓊脂糖凝膠，用電泳液混勻后在微波爐中加熱1分鐘，待瓊脂糖完全融化并冷卻到65℃左右，按終濃度0.5g/ml加入溴化乙錠，混勻倒入制膠模中。待膠凝固后拔出梳子，在加樣孔中分別加樣25微升，1OOV電壓下電泳30分鐘，之后在紫外燈下觀察結(jié)果。

二、結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，用SEQ ID NO：1～2所示引物對擴(kuò)增時(shí)，空白對照無擴(kuò)增條帶，而陽性樣本則能擴(kuò)增出長度為471bp的PCR產(chǎn)物。

內(nèi)參GAPDH的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，空白對照無擴(kuò)增條帶，而陽性樣本(人卵巢癌SKOV3細(xì)胞提取的樣品)則能擴(kuò)增出長度為315bp的PCR產(chǎn)物。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明SEQ ID NO：1～2所示引物對可以有效擴(kuò)增耶氏肺孢子蟲的基因，能夠準(zhǔn)確檢測帶檢樣本是是否有耶氏肺孢子蟲。

實(shí)施例2特異性試驗(yàn)

一、試驗(yàn)方法

1、PCR引物

取實(shí)施例1中的引物對1。

2、模板制備

為檢驗(yàn)本發(fā)明方法的特異性，采用不同真菌來源的Rtt109表達(dá)質(zhì)粒作為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。模版DNA包括來自包括卡氏肺孢子蟲(Pc)、耶氏肺孢子蟲(Pj)、啤酒酵母(Sc)、白色念株菌(Ca)的Rtt109編碼序列。陰性模版為人卵巢癌SKOV3細(xì)胞提取的基因組樣品。

3、PCR擴(kuò)增

同實(shí)施例1。

4、結(jié)果檢測

同實(shí)施例1。

二、結(jié)果

如附圖3所示，盡管Rtt109基因在不同屬的真菌中是相對保守的，但本發(fā)明中的Rtt109引物(本發(fā)明SEQ ID NO：1～2所示引物對)只特異性擴(kuò)增耶氏肺孢子蟲(Pj)的Rtt109基因，不能擴(kuò)增其它三種真菌包括卡氏肺孢子蟲(Pc)、啤酒酵母(Sc)和白色念株菌(Ca)來源的Rtt109基因。同時(shí)，以人卵巢癌SKOV3細(xì)胞提取的基因組DNA樣品為模版也未能擴(kuò)增出任何條帶。該結(jié)果說明，本發(fā)明中的Rtt109引物(本發(fā)明SEQ ID NO：1～2所示引物對)特異性非常高，無非特異性擴(kuò)增。

實(shí)施例3靈敏度試驗(yàn)

一、試驗(yàn)方法

1、PCR引物

取實(shí)施例1中的引物對1。

2、模板制備：

按照實(shí)施例1的方法提取樣品基因組DNA，經(jīng)檢測，樣品基因組DNA的濃度為25ng/μl，5倍梯度稀釋，得濃度分別為5.0ng/μl、1.0ng/μl、0.2ng/μl、0.04ng/μl、0.008ng/μl、0.0016ng/μl的樣品。

3、PCR擴(kuò)增

同實(shí)施例1。

4、結(jié)果檢測

如附圖4所示，本發(fā)明中的Rtt109引物(本發(fā)明SEQ ID NO：1～2所示引物對)可檢測到PjRtt109最低含量為0.04ng/μl，證實(shí)了本試劑盒具有非常高的檢測靈敏度。

實(shí)施例4本發(fā)明試劑盒的組成

本發(fā)明試劑盒中的全部組分、含量和使用方法如下：

一、試劑盒的組成

請?zhí)峁┍景l(fā)明試劑盒的組成，如50人份的各個(gè)試劑的濃度和用量，可以參照下表列出。

模板制備試劑(50人份)：

PCR擴(kuò)增試劑(50人份)：

陽性對照(50人份)：

二、試劑盒使用方法

1)DNA提取

Ⅰ樣本預(yù)處理

痰或者支氣管肺泡灌洗液，加等量生理鹽水后混勻，室溫4000～6000轉(zhuǎn)離心10分鐘。棄去上清液，加1毫升生理鹽水重懸沉淀物，并轉(zhuǎn)至1.5毫升小離心管，14000轉(zhuǎn)室溫離心10分鐘。棄去上清液，沉淀物備用。

Ⅱ提取樣本的基因組DNA

給步驟I獲得的沉淀物中添加200微升基因組DNA提取裂解液(1～3％乙 基苯基聚乙二醇(NP-40)，5～10％聚苯乙烯基體離子交換樹脂(Chelex-100)，1～3％吐溫20(Tween-20))，震蕩混勻后，將樣品管置于95～100度加熱30分鐘。然后，將樣品在13000轉(zhuǎn)室溫離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5毫升小管中，此為樣品基因組DNA。

2)PCR擴(kuò)增

按樣品數(shù)量準(zhǔn)備PCR反應(yīng)管，以及PCR反應(yīng)混合液。每反應(yīng)管總體積20微升，包括0.5微升肺囊胞蟲特異性引物混合液(上游引物和下游引物的濃度分別為12.5pm/μL)，0.5微升Tag酶(濃度為1～5U/μL)，5微升PCR反應(yīng)液(PCR反應(yīng)液成分為:100mMTris-HCl pH 8.3；500mMKCl；15mM MgCl₂；0.01％明膠(gelatin)，dNTP 25mM；0.5％溴酚藍(lán))和14微升去離子水。在渦旋器上混勻，并離心后分裝至PCR反應(yīng)管。

將5微升基因組DNA樣品，陽性對照樣品I和陰性對照樣品分別加于標(biāo)記好的PCR管中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

為了確認(rèn)樣品基因組DNA是否提取成功，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測時(shí)用基因組DNA對照人GAPDH特異性引物(上游引物序列：5’-CGGATTTGGTCGTATTGGGC-3’；下游引物序列：5’-TGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’；引物濃度分別為12.5pm/μL)替代肺囊胞蟲特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用陽性對照樣品II為陽性對照，陰性對照樣品不變。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，之后94℃變性45秒、55℃退火1分鐘、72℃延伸1分鐘、如此進(jìn)行35循環(huán)；再72℃延伸10分鐘。

3)檢測

配制1.5％的瓊脂糖凝膠，用電泳液混勻后在微波爐中加熱1分鐘，待瓊脂糖完全融化并冷卻到65℃左右，按終濃度0.5g/ml加入溴化乙錠，混勻倒入制膠模中。待膠凝固后拔出梳子，在加樣孔中分別加樣25微升，100V電壓下電泳30分鐘，之后在紫外燈下觀察結(jié)果。

綜上，本發(fā)明提供的檢測試劑盒和檢測方法可以特異擴(kuò)增耶氏肺孢子蟲的基因，特異性強(qiáng)、敏感性高、耗時(shí)短，檢測快速，具有良好的應(yīng)用前景。