本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及乙醛脫氫酶2基因的新用途。

背景技術(shù)：

胃癌是全球范圍內(nèi)的第四大癌癥，第二大致死性疾病，東亞地區(qū)的病例占總體的一半以上，中國發(fā)病率占全球43％；死亡率占全球45％。而且中國胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)臨床分期較晚，進(jìn)展期胃癌比例約占70％，是關(guān)注度最高的一類人群。因?yàn)槲赴┑漠愘|(zhì)性很強(qiáng)，胃癌部位、病例類型、年齡、性別等不同，預(yù)后與治療轉(zhuǎn)歸都有不同。

胃癌的分型經(jīng)歷了大體形態(tài)分型，組織學(xué)分型，基于環(huán)境、遺傳分型，分子分型。

腫瘤分子分型(molecular classification)由美國國立癌癥研究所首次提出，通過分子分析技術(shù)為腫瘤進(jìn)行分類，使腫瘤分類從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)轉(zhuǎn)向以分子特征為基礎(chǔ)的分子分型。早在2003年Kim B等人應(yīng)用14K cDNA芯片將胃癌分為高度炎癥浸潤型和低度炎癥浸潤型，后者再分為3個(gè)亞型，即彌漫型及具有不同惡性特征的2個(gè)腸型。同期Tay ST等聯(lián)合應(yīng)用微衛(wèi)星不穩(wěn)定分析等技術(shù)根據(jù)基因表達(dá)差異將胃癌氛圍3種亞型：腫瘤發(fā)生癌(tumorigenic)、反應(yīng)性癌(reactive)和胃樣癌(gastric-like)，其中胃樣癌患者具有更好的總體生存率。2011年Tan等用基因芯體技術(shù)分析了37個(gè)胃癌細(xì)胞系基因表達(dá)譜的差異，將胃癌分為腸型(G-INT)和彌漫型基因亞型(G-DIF)。2013年Lei等通過基因芯片研究胃腺癌基因表達(dá)譜，將胃癌分為間充質(zhì)型、增值型和代謝型。

2014年7月23日癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)在《Nature》在線發(fā)表的一篇論文提出了一種胃癌分子分型，將其分為四個(gè)亞型：1.EBV(Epstein-Barr,EBV)病毒陽型，其特征包括PIK3CA頻發(fā)突變、DNA超甲基化和JAK2、CD274和PDCD1LG2擴(kuò)增；2.微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)型，其特征是高突變率，包括編碼癌基因信號通路蛋白的激活性基因突變；3.基因組穩(wěn)定(GS)型，該型多發(fā)生于組織學(xué)彌漫型中，由RHOA突變或THO家族GTP酶活化蛋白基因融合現(xiàn)象；4.染色體不穩(wěn)定(CIN)型，其具有標(biāo)志性的異倍染色體和受體絡(luò)氨酸激酶原位擴(kuò)增。

隨著胃癌分子分型體系的不斷完善，從Tan的基因組分型(基因組腸型和彌漫型)、Lei的分子分型(增值型、代謝型及間充質(zhì)型)、到2014年TCGA基因分型(EB病毒感染型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、基因穩(wěn)定型和染色體不穩(wěn)定型)。

目前，進(jìn)展期胃癌的治療主要是以化療聯(lián)合靶向治療為主的綜合治療，常用的藥物和方案有：鉑類(DDP、OXA等)聯(lián)合氟尿嘧啶類(F-FU、XELODA、S-1等)，紫杉醇聯(lián)合卡培他濱；化療聯(lián)合曲妥珠單抗常應(yīng)用于HER2陽性患者；還有VEGF2、PD-1/PD-L1等其它在研靶向藥物。

從當(dāng)前現(xiàn)狀來看，可選化療藥物少(僅三大類)，靶向治療滯后(曲妥珠單抗僅適用于約15％患者)，胃癌異質(zhì)性高，這三項(xiàng)是進(jìn)展期胃癌的主要治療瓶頸。因此，基于臨床特點(diǎn)，病理分型，分子分型的個(gè)體化療對進(jìn)展期胃癌非常重要。從分子生物學(xué)創(chuàng)立引起腫瘤治療模式的變化，從分子水平重新認(rèn)識疾病，未來的腫瘤治療模式應(yīng)該是分子分型指導(dǎo)的個(gè)體化治療。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種胃癌分子分型的新檢測指標(biāo)，以便于為今后的胃癌個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。

為此，本發(fā)明公開了乙醛脫氫酶2基因作為胃癌分子分型的檢測指標(biāo)的用途。更優(yōu)選為乙醛脫氫酶2基因作為蒽環(huán)類藥物敏感型胃癌的分子分型指標(biāo)的用途。

另一方面，本發(fā)明還公開了蒽環(huán)類藥物在制備乙醛脫氫酶2基因突變或缺失類型胃癌治療藥物中的用途；

進(jìn)一步地，所述蒽環(huán)類藥物為阿霉素、表阿霉素、吡柔比星、去甲氧柔紅霉素或米托蒽醌。

另一方面，本發(fā)明還公開了蒽環(huán)類藥物和乙醛脫氫酶2抑制劑在制備胃癌治療藥物中的用途。

另一方面，本發(fā)明還公開了蒽環(huán)類藥物在治療乙醛脫氫酶2基因突變或缺失類型胃癌方法，其包含給予乙醛脫氫酶2基因突變或缺失類型胃癌患者有效劑量的蒽環(huán)類藥物；

另一方面，本發(fā)明還公開了蒽環(huán)類藥物和乙醛脫氫酶2抑制劑治療乙醛脫氫酶2基因突變或缺失類型胃癌的方法，其包含給予胃癌患者有效劑量的蒽環(huán)類藥物和乙醛脫氫酶2抑制劑或它們的復(fù)合制劑。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)ALDH2基因缺失或突變導(dǎo)致胃癌細(xì)胞對腫瘤化療藥物表現(xiàn)出不同的敏感性，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，提供了胃癌分子分型的新檢測指標(biāo)，同時(shí)還公開了蒽環(huán)類藥物在制備乙醛脫氫酶2基因突變或缺失類型胃癌治療藥物中的用途，為胃癌個(gè)體化治療提供新的選擇。

附圖說明

圖1小干擾RNA對SGC-7901細(xì)胞ALDH2基因的敲低效果。

圖2 ALDH2敲低SGC-7901細(xì)胞的對化療藥物的敏感性影響。

圖3 LDH2敲低SGC-7901細(xì)胞的的克隆形成能力影響。

圖4敲低ALDH2表達(dá)胃癌細(xì)胞DOX處理后的細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀分析。

圖5裸鼠移植瘤的ALDH2敲低SGC-7901細(xì)胞化療敏感性分析。

具體實(shí)施方式

乙醛脫氫酶2(ALDH2)是NAD+依賴的乙醛脫氫酶超家族成員之一，目前已發(fā)現(xiàn)有19個(gè)乙醛脫氫酶家族成員，乙醛脫氫酶2是定位在線粒體內(nèi)一種重要的醛類氧化酶，能將乙醇代謝中間產(chǎn)物乙醛氧化成乙酸。同時(shí)乙醛脫氫酶2可分解乙醛代謝產(chǎn)物4-羥壬烯醛,減輕乙醛及其代謝產(chǎn)物對細(xì)胞的氧化損傷。它是一個(gè)四聚體酶，大量表達(dá)在肝、腎和肺等組織，在線粒體功能活躍的心、腦組織等也有表達(dá)。近期有研究表明，該酶的激活對于心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細(xì)胞死亡有顯著的保護(hù)作用。乙醛脫氫酶2基因具有多態(tài)性，其表達(dá)產(chǎn)物的487位氨基酸殘基可以是谷氨酸(Glu487)或賴氨酸(Lys487)，因此該基因可以有Glu487純合子(乙醛脫氫酶2*1/1)、Glu487/Lys487雜合子(乙醛脫氫酶2*1/2)和Lys504純合子(乙醛脫氫酶2*2/2)等幾種等位基因。其中，乙醛脫氫酶2*1/2活性為正常的10％～45％，乙醛脫氫酶2*2/2活性為正常的1％～5％。東方亞洲人群中該基因突變率為40％以上。目前關(guān)于乙醛脫氫酶2與癌癥關(guān)系方面的研究很少，基本都集中在統(tǒng)計(jì)學(xué)方面，有多項(xiàng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，攜帶ALDH2突變基因型者大量飲酒將顯著增加患多種癌的危險(xiǎn)性，包括肝癌，食道癌等。

乙醛脫氫酶2基因多態(tài)性的主要檢測方法：限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、PCR-ASO探針法、PCR-SSO法、PCR-SSP法、PCR-熒光法、PCR指紋圖法、基因芯片法、AFLP(Amplication Fragment Length Polymorphism)法：DGGE(denaturing gradinent electrophoresis)法、RAPD(Random amplified polymorphic DNA)法，包括但不限于如CN105177159A、CN102758008A、CN103184268A、CN104120180A所示方法和檢測試劑盒。

蒽環(huán)類藥物是一種抗瘤譜廣且高效的抗腫瘤藥，對乳腺癌、惡性淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、軟組織腫瘤、肝癌均具有很強(qiáng)的抗癌活性。蒽環(huán)類藥物包括阿霉素、表阿霉素、吡柔比星、去甲氧柔紅霉素和米托蒽醌等，屬周期非特異性藥，其主要毒副反應(yīng)為骨髓抑制和心臟毒性。

蒽環(huán)類藥物敏感型胃癌是蒽環(huán)類藥物有治療效果的胃癌，優(yōu)選為ALDH2基因缺失或突變的胃癌，如乙醛脫氫酶2*1/2基因型胃癌、乙醛脫氫酶2*2/2基因型胃癌。

乙醛脫氫酶2抑制劑是指能特異性抑制乙醛脫氫酶2活性或下調(diào)乙醛脫氫酶2表達(dá)的物質(zhì)，包括但不限于如daidzin。

藥物或藥物組合物

用于本發(fā)明或者含有本發(fā)明所述蒽環(huán)類藥物的藥物組合物。通常，當(dāng)本發(fā)明藥物組合物用于上述用途時(shí)，所述蒽環(huán)類藥物可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥途徑的藥物劑型，如片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末、栓劑等。

“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)?！八帉W(xué)上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的融合體蛋白傳送給動物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。

本發(fā)明的蒽環(huán)類藥物可經(jīng)過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。

上述劑型中可經(jīng)口服給藥的劑型為：片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、醑劑。固態(tài)載體包括：淀粉、乳糖、磷酸氫鈣、微晶纖維素、蔗糖、白陶土、微粉硅膠、滑石粉、低取代羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉、聚乙烯吡咯烷酮。而液態(tài)載體包括：無菌水、乙醇、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制備藥物組合物的過程中通常使用的佐劑包括：調(diào)味劑、著色劑、防腐劑(如羥苯烷基丁酯、苯甲酸鈉、山梨酸)和抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉和二丁基羥基甲苯)。

上述劑型中可用于注射途徑給藥的劑型包括：注射劑、注射用無菌粉末，它們是將藥物與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合制成以供注射給藥的形式。溶劑包括：無菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，還需加入抑菌劑(如苯甲醇、羥苯丁酯、硫柳汞)、等滲調(diào)節(jié)劑(如氯化鈉、葡萄糖)、助懸劑(如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素)、增溶劑(吐溫-80、卵磷酯)、抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉)和填充劑(如乳糖、甘露醇)。

從易于制備和給藥的立場看，優(yōu)選的藥物組合物是液態(tài)組合物。

本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)熟知的及公認(rèn)的制藥生產(chǎn)要求的方法制備。藥物組合物適宜包含本發(fā)明的蒽環(huán)類藥物以及藥學(xué)上可接受的載體，并適宜為單位劑量形式。

用途

公開了所述蒽環(huán)類藥物或蒽環(huán)類藥物和乙醛脫氫酶2抑制劑可用于治療胃癌，優(yōu)選為治療乙醛脫氫酶2基因突變或缺失類型胃癌。

所用的活性成分的有效劑量可隨給藥模式和待治療疾病的嚴(yán)重程度而變化。對大部分大型哺乳動物而言，每天施以有效成分的總劑量約為0.01-1000mg。通常，成人臨床給藥量的范圍為0.01-200mg/日，優(yōu)選為0.05-100mg/日。

通常，當(dāng)本發(fā)明組合物用于上述用途時(shí)，它們可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥途徑的藥物劑型，如片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末、栓劑等。

“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)?！八帉W(xué)上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的或蒽環(huán)類藥物和乙醛脫氫酶2抑制劑傳送給動物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。

本發(fā)明的化合物可經(jīng)過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。

本文提及的所有公開物中的公開內(nèi)容，包括專利和專利申請說明書，通過引用并入本發(fā)明，達(dá)到明文記載所有這些公開物的程度。

以下通過下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但是，這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍。

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI 1640培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液(Thermo Fisher公司，美國)；小牛血清(Gibco，美國)；Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen，美國)；5×Lane Marker Reducing Sample Buffer(Pierce，美國)；RIPA Buffer(Beyotime，中國)；胰酶消化液(Beyotime，中國)；BamH I限制性核酸內(nèi)切酶(Takara，日本)；EcoR I限制性核酸內(nèi)切酶(Takara，日本)；瓊脂糖(Sigma，美國)；QIAGENPlasmid Mini Kit(QIAGEN，德國)；EndoFree Plasmid Maxi Kit(QIAGEN，德國)；Dako REAL^TMEnVision^TMDetection System，Peroxidase/DAB+，Rabbit/Mous(Dako，德國)；T4DNA連接酶(TaKaRa，日本)；DH-5α感受態(tài)細(xì)菌(上海博彩生物科技有限公司，中國)；ACS級無水乙醇(阿拉丁試劑有限公司，中國)；甲醇(上海振興化工一廠，中國)；異丙醇(上海振興化工一廠，中國)；牛血清白蛋白(鼎國公司，中國)；嘌呤霉素(Sigma，美國)；DOX(Sigma，美國)；5-Fu(Sigma，美國)；順鉑(Sigma，美國)；4-HNE(Cayman，美國)；PBS粉劑(上海博光生物科技有限公司，中國)；結(jié)晶紫染色液(Beyotime，中國)；DAPI染色液(Vector公司，日本)；離心柱型大量DNA凝膠回收試劑盒(TIANGEN，中國)；In Situ Cell Death Detection Kit(Roche，瑞士)；CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑盒(Dojindo，日本)；PageRuler^TMPrestained Protein Ladder(Fermentas，美國)；Alexa Fluor-555Donkey anti-mouse Ab熒光二抗(Invitrogen，美國)；鼠抗人ALDH2單克隆抗體(ABGENT，美國)；鼠抗人p53單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)；鼠抗人PARP單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology，美國)；

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的具體實(shí)施方式做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1：ALDH2敲低表達(dá)的胃癌細(xì)胞株的建立

人胃癌細(xì)胞SGC-7901購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫，胚胎腎細(xì)胞293T為本所自存。細(xì)胞培養(yǎng)條件：SGC-7901用含10％小牛血清的RPMI-l640細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃和5％CO2條件下培養(yǎng)，以處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

ALDH2敲低表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建，逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝方法步驟同前所述，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染SGC-7901細(xì)胞48h，利用終濃度1μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選得到穩(wěn)定敲低表達(dá)細(xì)胞株，分別利用qRT-PCR、Western Blot和免疫熒光的方法對敲低效果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，小干擾RNA可以明顯敲低ALDH2在SGC-7901細(xì)胞中的表達(dá),qRT-PCR結(jié)果顯示，ALDH2-shRNA1和ALDH2-shRNA2組的ALDH2mRNA表達(dá)明顯低于對照組(2.47±1.36vs75.00±6.10，P<0.001；5.95±2.71vs 75.00±6.10，P<0.001))(圖1)。

圖1.A.Western Blot方法檢測ALDH2-shRNA1、ALDH2-shRNA2細(xì)胞ALDH2表達(dá)低于對照組；B.qRT-PCR方法檢測ALDH2-shRNA1、ALDH2-shRNA2細(xì)胞ALDH2表達(dá)低于對照組(***P<0.001)；C.免疫熒光方法檢測ALDH2-shRNA1、ALDH2-shRNA2小干擾RNA均可以明顯敲低細(xì)胞內(nèi)的ALDH2表達(dá)。

實(shí)施例2：ALDH2敲低表達(dá)的胃癌細(xì)胞對藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

比較了胃癌細(xì)胞敲低ALDH2基因?qū)熕幬?-Fu、順鉑和DOX的敏感性差異。我們利用梯度濃度(0μM，0.01μM，0.1μM，1μM，10μM和100μM濃度)的幾種化療藥物分別處理來自實(shí)施例1的ALDH2敲低表達(dá)胃癌細(xì)胞SGC-7901(ALDH2shRNA1和shRNA2細(xì)胞)與對照組胃癌細(xì)胞SGC-7901(shRNA空載體)，比較各組細(xì)胞的相對存活率。

研究顯示，利用DOX處理胃癌細(xì)胞24h，ALDH2shRNA1和shRNA2細(xì)胞相對存活率降低明顯低于shRNA空載體組(P＝0.0014，P＝0.0082)，提示ALDH2敲低的細(xì)胞對DOX處理的敏感性升高。用順鉑處理胃癌細(xì)胞24h，ALDH2-shRNA1和ALDH2-shRNA2細(xì)胞與shRNA空載體組相比，細(xì)胞對藥物處理的敏感性無明顯差異(P＝0.9593，P＝0.8200)。用5-Fu處理胃癌細(xì)胞24h，ALDH2-shRNA1和ALDH2-shRNA2細(xì)胞與shRNA空載體組相比，細(xì)胞對藥物處理的敏感性無明顯差異(P＝0.9940，P＝0.9907)(圖2)。遂后，我們檢測了DOX處理ALDH2-shRNA1和ALDH2-shRNA2以及shRNA空載體組的IC50，ALDH2-shRNA1和ALDH2-shRNA2實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的DOX藥物處理的IC50明顯低于shRNA空載體組(2.17±0.40vs.3.97±0.45，P<0.01；2.70±0.36vs.3.97±0.45，P<0.05)，表明ALDH2基因表達(dá)缺失的胃癌細(xì)胞對于DOX藥物的敏感性增加。

圖2.A.5-Fu處理后各組細(xì)胞對藥物敏感性無明顯差異；B.順鉑處理后各組細(xì)胞對藥物敏感性無明顯差異；C.DOX處理后可見敲低ALDH2組對DOX藥物敏感性明顯高于空載體組(**P<0.01)。

此外，對于敲低ALDH2表達(dá)的SGC-7901細(xì)胞，我們進(jìn)行了DOX處理后的胃癌細(xì)胞克隆形成能力檢測。如圖3所示，DOX終濃度為1μM處理胃癌細(xì)胞48小時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)14天后拍照觀察，ALDH2-shRNA1和ALDH2-shRNA2胃癌細(xì)胞的克隆形成能力均明顯低于shRNA空載體組(4.47±1.29％vs.16.23±1.53％，P<0.01；7.87±0.75％vs.16.23±1.53％，P<0.01)。當(dāng)DOX終濃度為2μM時(shí)處理胃癌細(xì)胞48小時(shí)，連續(xù)培養(yǎng)14天后拍照觀察，ALDH2-shRNA1和ALDH2-shRNA2胃癌細(xì)胞的克隆形成能力明顯低于shRNA空載體組(1.10±0.26％vs.5.37±1.00％，P<0.01；3.60±0.46％vs.5.37±1.00％，P<0.05)。

圖3.A.1μM、2μM的DOX處理ALDH2-shRNA1和ALDH2-shRNA2以及shRNA空載體組48h，連續(xù)培養(yǎng)14天，觀察克隆形成情況；B.克隆形成的統(tǒng)計(jì)結(jié)果(*P<0.05；**P<0.01)。

同時(shí)，我們利用終濃度為2μM的DOX處理ALDH2-shRNA1、ALDH2-shRNA2和shRNA空載體組24h，對照組細(xì)胞利用相同體積的DMSO溶劑處理24h，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。DMSO處理胃癌細(xì)胞24h，ALDH2-shRNA1、ALDH2-shRNA2和shRNA空載體組之間凋亡無明顯差異(5.22±0.69％，5.44±0.94％vs.5.19±0.67％)；利用DOX處理胃癌細(xì)胞24h，ALDH2-shRNA1和ALDH2-shRNA2細(xì)胞凋亡率明顯高于shRNA空載體組(18.01±1.52％vs.8.31±1.09％，P<0.01；14.79±1.32％vs.8.31±1.09％，P<0.01)(圖4)。

圖4.A.2μM的DOX處理ALDH2-shRNA1、ALDH2-shRNA2和shRNA空載體細(xì)胞24h，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果代表性圖片；B.流式檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果(**P<0.01)

實(shí)施例3：敲低ALDH2基因胃癌細(xì)胞接種于裸鼠體內(nèi)的移植瘤藥物敏感性研究

為了評估ALDH2基因缺失胃癌細(xì)胞在活體內(nèi)的藥物敏感性差異，我們利用免疫缺陷裸鼠進(jìn)行了移植瘤接種以及試驗(yàn)性治療研究。我們總共采用14只4周齡BALB/C裸鼠，于裸鼠左右大腿皮下分別接種3×106ALDH2-shRNA1和shRNA空載體SGC-7901細(xì)胞，待移植瘤生長到150mm³，對實(shí)驗(yàn)組與對照組各7只分別給與2mg/Kg體重的DOX以及DMSO腹腔注射，每周注射2次，每次注射藥物之前測量腫瘤大小，連續(xù)3周處理，末次注射藥物后3天測量腫瘤大小并且處死小鼠，研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2-shRNA1處理組給予DOX用藥后皮下移植瘤腫瘤重量小于對照組(0.82g±0.56vs.1.38g±0.35，P<0.05)，ALDH2-shRNA1組移植瘤的增殖速度明顯低于對照組(P<0.05)；而在DMSO溶解劑處理組，ALDH2-shRNA1組移植瘤重量也明顯高與對照組(2.72g±0.63vs.1.74g±0.17，P<0.01)，且移植瘤的增殖速度明顯高于對照組(P<0.001)。同時(shí)，我們也對10只4周齡BALB/C裸鼠，分別于左右大腿皮下接種3×106ALDH2-shRNA1和shRNA空載體SGC-7901細(xì)胞，待移植瘤生長到150mm3。對實(shí)驗(yàn)組與對照組各5只分別給予40mg/Kg體重5-Fu以及PBS溶解劑腹腔注射后的腫瘤生長狀況。每周注射2次，每次注射藥物之前測量腫瘤大小，連續(xù)3周處理，末次注射藥物后3天測量腫瘤大小并且處死小鼠。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBS處理組，ALDH2-shRNA1組移植瘤重量明顯高于對照組(3.43g±0.53vs.1.88g±0.64，P<0.01)。而5-Fu處理組，ALDH2-shRNA1組移植瘤重量明顯低于對照組(2.08g±0.53vs.0.65g±0.40，P<0.01)(圖5)。以上發(fā)現(xiàn)表明，DMSO與PBS溶解劑處理組，在ALDH2-shRNA1組的生長速度均明顯高于對照組，提示了ALDH2基因在胃癌生長中的抑癌基因作用。而在未進(jìn)行ALDH2基因干預(yù)的shRNA空載體組，利用DOX和5-Fu藥物處理后，5-Fu處理組的腫瘤重量明顯低于DOX處理組(0.65g±0.40vs.1.38g±0.35，P<0.01)，該結(jié)果提示：當(dāng)ALDH2基因?yàn)橐吧蜁r(shí)，胃癌細(xì)胞對于5-Fu藥物的敏感性優(yōu)于DOX藥物。而在對ALDH2基因的干預(yù)組(ALDH2-shRNA1SGC-7901細(xì)胞)分別給與DOX和5-Fu藥物治療后，DOX用藥組的腫瘤重量明顯低于5-Fu處理組(0.82g±0.56vs.2.08g±0.53，P<0.01)。上述結(jié)果提示：ALDH2基因功能缺失胃癌細(xì)胞對于DOX藥物的敏感性優(yōu)于化療效果優(yōu)于5-Fu(圖5)。

圖5.中A，B.2mg/kg DOX腹腔注射裸鼠，ALDH2-shRNA1組SGC-7901細(xì)胞皮下瘤重量低于shRNA空載體組；C.2mg/kg DOX腹腔注射裸鼠，ALDH2-shRNA1組SGC-7901細(xì)胞組皮下瘤增殖速度低于shRNA空載體組；D，E.40mg/kg 5-Fu腹腔注射裸鼠，ALDH2-shRNA1組SGC-7901細(xì)胞皮下瘤重量高于shRNA空載體組。由圖A與圖D的裸鼠瘤體積變化可知，當(dāng)ALDH2基因處于野生型時(shí)，5-Fu處理的效果明顯優(yōu)于DOX處理效果。但當(dāng)ALDH2基因缺陷后，則DOX抑制腫瘤效果優(yōu)于5-Fu。

化療是針對中晚期胃癌采取的主要治療手段之一，5-Fu、順鉑和DOX均屬于傳統(tǒng)的腫瘤化療藥物，且5-Fu和順鉑被推薦為晚期胃癌患者的一線化療藥物。

我們首次發(fā)現(xiàn)，敲低ALDH2基因的胃癌細(xì)胞在DOX藥物處理后細(xì)胞凋亡明顯增加，這種生物學(xué)效應(yīng)是通過DNA損傷增加進(jìn)而誘導(dǎo)的。而平行開展的5-Fu與順鉑藥物處理的ALDH2敲低胃癌細(xì)胞，與對照組相比并未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與DNA損傷發(fā)生顯著性變化。

本研究的另外一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，當(dāng)我們分別采用DOX和5-Fu對裸鼠移植瘤給予治療處理后顯示，當(dāng)ALDH2處于野生型時(shí)，裸鼠皮下移植瘤對于5-Fu藥物的反應(yīng)良好，裸鼠皮下移植瘤的體積與重量均較DOX處理組有明顯下降；但當(dāng)ALDH2基因受到干擾功能缺失后，則5-Fu藥物對于腫瘤細(xì)胞的抑制作用遠(yuǎn)不及ALDH1野生型組。而ALDH2基因缺失組胃癌細(xì)胞對于DOX藥物處理的敏感性增加。

通過本研究我們提出，當(dāng)個(gè)體存在ALDH2基因功能缺陷時(shí)(比如“東方人變異”、基因突變或者表觀遺傳學(xué)失活)，細(xì)胞對內(nèi)源性與外源性DNA損傷的抵抗能力均明顯下降，比如，對于環(huán)境誘變劑MNU以及細(xì)菌性致癌劑幽門螺桿菌導(dǎo)致的DNA損傷抵抗能力顯著下降。其結(jié)果是攜帶ALDH2基因缺陷型個(gè)體的胃癌患病風(fēng)險(xiǎn)明顯高于野生型個(gè)體。我們進(jìn)一步分析又發(fā)現(xiàn)，ALDH2基因型缺陷個(gè)體在選擇化療藥物時(shí)應(yīng)當(dāng)注意，攜帶ALDH2基因變異的個(gè)體對于傳統(tǒng)的一線化療藥物并不敏感，但對蒽環(huán)類藥物DOX的敏感性增加，故該發(fā)現(xiàn)結(jié)合東亞人群具有較高的ALDH2基因變異這一現(xiàn)象，對于指導(dǎo)今后胃癌患者個(gè)體化精準(zhǔn)治療具有一定參考價(jià)值。