本發(fā)明涉及抗除草劑雜草檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種抗光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑馬唐的PCR檢測(cè)方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

馬唐(Digitaria sanguinalis)是我國黃淮海玉米種植區(qū)的主要惡性雜草之一。黃淮海地區(qū)玉米田的7個(gè)主要雜草群系，有6個(gè)群系以馬唐為優(yōu)勢(shì)種。目前馬唐化學(xué)防除主要選用莠去津等除草劑。但由于該類除草劑分子靶標(biāo)單一，長(zhǎng)期使用易引起雜草抗藥性。近些年來，抗性馬唐的問題在我國黃淮海等地的一些玉米田已經(jīng)非常突出，例如，在個(gè)別地域內(nèi)，以常規(guī)劑量噴施莠去津已經(jīng)無法有效防除馬唐。

雜草產(chǎn)生抗性，則這些農(nóng)田不能繼續(xù)使用該類除草劑。但在生產(chǎn)實(shí)踐中人們對(duì)雜草抗性的認(rèn)識(shí)不足，盲目增大用藥劑量，不僅增加了成本，使藥害風(fēng)險(xiǎn)加大，嚴(yán)重影響農(nóng)民收入和國家糧食安全。傳統(tǒng)的抗藥性雜草檢測(cè)通常采用室內(nèi)生物測(cè)定法，既對(duì)田間采集的疑似抗性的雜草的種子在室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在一定葉齡噴施除草劑后，調(diào)查株防效和地上部分生物量來計(jì)算抗性指數(shù)。這種方法能夠客觀地評(píng)價(jià)某種雜草對(duì)相應(yīng)除草劑的抗性情況，但也有其局限性，主要表現(xiàn)在以下兩方面：一是不能當(dāng)季、當(dāng)時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，二是占地多、時(shí)間長(zhǎng)、工作量大。因此，目前迫切需要一個(gè)簡(jiǎn)便，快速的抗藥性雜草檢測(cè)鑒定方法。

光系統(tǒng)Ⅱ（photosystemⅡ，PSⅡ）類抑制劑是現(xiàn)有除草劑中的一大類，根據(jù)不同作用模式又可將該類抑制劑分為兩大類：三嗪-脲類除草劑，如莠去津和嗪草酮等；苯酚類除草劑，如碘苯腈等。PSII復(fù)合體主要組成部分是兩個(gè)32kD多肽組成的D1、D2蛋白，這兩個(gè)蛋白在電子傳遞鏈中扮演重要角色。psbA基因是D1蛋白的編碼基因，廣泛存在與雜草葉綠體內(nèi)。PSⅡ類抑制劑其作用部位在PSⅡ的光反應(yīng)到質(zhì)體醌（PQ）的還原之間，該類抑制劑能夠競(jìng)爭(zhēng)性的與雜草內(nèi)的D1蛋白結(jié)合。這種競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合能夠改變膜蛋白的空間構(gòu)型，從而影響正常的質(zhì)體醌與D1蛋白的結(jié)合，從而使電子傳遞受阻，最終導(dǎo)致雜草的死亡。

目前研究發(fā)現(xiàn)，PSⅡ抑制劑類除草劑的抗性則與雜草psbA基因位點(diǎn)突變有關(guān)。參照擬南芥中psbA基因編碼蛋白的順序，在第219、228、264和268位氨基酸的突變會(huì)導(dǎo)致D1蛋白與除草劑的結(jié)合能力下降，從而影響除草劑的殺草效果，導(dǎo)致對(duì)PSⅡ抑制劑類除草劑抗藥雜草的產(chǎn)生。

我國抗藥性雜草的分子機(jī)制研究起步較晚，但是隨著分子生物學(xué)技術(shù)在雜草抗藥性機(jī)理研究方面的應(yīng)用，越來越多的雜草的抗藥性機(jī)理得到明確。因此，通過PCR技術(shù)快速、靈敏的檢測(cè)目標(biāo)雜草靶標(biāo)基因的突變位點(diǎn)，從而檢測(cè)目標(biāo)雜草是否產(chǎn)生抗藥性的方法已經(jīng)成為可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上技術(shù)上的不足，本發(fā)明提供了一種分子生物學(xué)檢測(cè)雜草抗性的方法。

發(fā)明的目的是提供一種抗光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑馬唐的PCR特異性引物對(duì)。

本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測(cè)抗光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑馬唐的試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供用于檢測(cè)抗光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑馬唐的特異性PCR引物對(duì)，即用于特異性擴(kuò)增馬唐psbA 基因的引物對(duì)，引物序列如下：

正向引物MT-psbA-F: 5’-GGTGTAGCTTGTTATATGGGTCGT-3’

反向引物MT-psbA-R: 5’- GCCCAAGTATTAATAACACGTCC -3’

其中，psbA 基因的GeneBank登錄號(hào)為KM453691.1。

本發(fā)明還提供含有上述引物對(duì)的用于檢測(cè)抗光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑馬唐的試劑盒。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括dNTPS、Taq DNA聚合酶、含有Mg2+的PCR反應(yīng)緩沖液。

更優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照模板。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)方法，以上述引物對(duì)或上述試劑盒進(jìn)行馬唐抗性檢測(cè)的PCR克隆方法。

所述的方法，包括以下步驟：

1. 選取田間待檢測(cè)植株或以溫室自行種植的植株為材料。

2. 提取待檢測(cè)樣品基因組DNA；

3. 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

4. 回收、分析PCR產(chǎn)物。

PCR反應(yīng)體系為25 μL:

模板DNA 1 μL(約0.1mg)

2.5 mM dNTP 1 μL

10 μM正向引物 1 μL

10 μM反向引物 1 μL

Taq DNA聚合酶 2 U

10×PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 μL

ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94℃ 4分鐘；94℃ 0.5分鐘，53℃ 0.5分鐘，72℃ 1分鐘，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10分鐘。

本發(fā)明根據(jù)馬唐的psbA基因（GeneBank登錄號(hào)：KM453691.1）序列信息設(shè)計(jì)出特異性引物MT-psbA-F/MT-psbA-R，采用該引物的PCR檢測(cè)方法具有極好的特異性和靈敏性 (圖1)能夠?qū)ⅠR唐的psbA基因擴(kuò)增出來。

本發(fā)明提供的用于檢測(cè)抗光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑馬唐的特異性引物對(duì)和檢測(cè)試劑盒是基于基因核苷酸序列的檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)能夠以當(dāng)即植株為檢測(cè)對(duì)象，整個(gè)檢測(cè)方法不僅簡(jiǎn)便快捷，而且靈敏度高、特異性好，可對(duì)田間采集的疑似抗性的馬唐進(jìn)行快速檢測(cè)。該方法效率高，操作簡(jiǎn)便，是傳統(tǒng)的室內(nèi)除草劑抗性生物測(cè)定的有效替代方法。

附圖說明

圖1為實(shí)施例3引物對(duì)MT-psbA-F/MT-psbA-R對(duì)馬唐psbA基因的擴(kuò)增結(jié)果。其中，1泳道為DNA Marker（箭頭指示為500bp）；2號(hào)泳道為馬唐psbA基因擴(kuò)增結(jié)果。

圖2以本發(fā)明試劑盒內(nèi)多提供對(duì)照基因組DNA克隆的馬唐psbA基因測(cè)序結(jié)果，采用該引物對(duì)克隆的序列長(zhǎng)度為590bp，包含有所有目前已報(bào)道的psbA基因內(nèi)與抗性相關(guān)的位點(diǎn)（黑色方框標(biāo)出），其中兩端加粗序列為引物序列，黑色方框內(nèi)黑色加粗為已驗(yàn)證抗性相關(guān)位點(diǎn)和其所編碼氨基酸，如果待檢測(cè)樣本在這些位點(diǎn)發(fā)生氨基酸水平的變化，則表示植株產(chǎn)生抗性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，以下所述實(shí)施例為本發(fā)明所采用具體實(shí)施方式，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1 用于檢測(cè)抗光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑馬唐的PCR引物的合成。

在NCBI（National Center for Biotechnology Information, 美國國立生物技術(shù)信息中心, http://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中查詢馬唐的psbA 基因（GenBank: KM453691.1）基因序列，根據(jù)查詢到的序列信息，利用引物設(shè)計(jì)軟件（Primer 5.0），設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增馬唐psbA基因的特異性引物對(duì)，引物序列如下：

MT-psbA-F:5’-GGTGTAGCTTGTTATATGGGTCGT-3’(Seq ID No.1)

MT-psbA-R:5’-GCCCAAGTATTAATAACACGTCC-3’(Seq ID No.2)

引物合成由上海生物工程股份有限公司完成。

實(shí)施例2 PCR試劑盒的制備

根據(jù)實(shí)施例中獲得特異性引物對(duì)，在試劑盒中添加PCR反應(yīng)所必須試劑：dNTPS、Taq DNA聚合酶和含有Mg2+PCR反應(yīng)緩沖液，并結(jié)合所合成引物對(duì)，制成PCR檢測(cè)試劑盒。

實(shí)施例3 抗光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑馬唐的PCR檢測(cè)方法。

馬唐植株的種植或采集：本發(fā)明所檢測(cè)植株可以是當(dāng)季田間馬唐植株，也可以是以馬唐種子進(jìn)行種植的植株為檢測(cè)材料。

馬唐DNA的制備：取馬唐新鮮葉片100-300 mg，采用CTAB法提取馬唐葉片DNA。

PCR反應(yīng)體系：采用25μL的PCR反應(yīng)體系，其中含有Mg2+的10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL，2.5 mM dNTPs 1 μL，10 μM引物各1 μL，TaqDNA聚合酶2 U，DNA模板1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至終體積為25 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性0.5 min，53℃退火0.5 min，72℃延伸1 min, 共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物的鑒定與測(cè)序：取5 μL PCR產(chǎn)物，與上樣緩沖液混合后， 1 %(重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后紫外燈下觀察，根據(jù)DNA Marker判斷所擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度；對(duì)于已經(jīng)擴(kuò)增出的馬唐PCR產(chǎn)物，測(cè)序由上海生物工程有限公司完成。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

以本發(fā)明所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)（MT-psbA-F/MT-psbA-R）能夠特異性的擴(kuò)增馬唐psbA基因（圖1）。

以本發(fā)明所提供試劑盒內(nèi)的對(duì)照材料為模板，對(duì)擴(kuò)增出來的序列進(jìn)行測(cè)序分析，并通過Blast比對(duì)分析找出序列上的抗性相關(guān)位點(diǎn)（參照擬南芥中該基因第219、228、264和268位氨基酸所對(duì)應(yīng)的本發(fā)明中氨基酸，圖2）。而依據(jù)本發(fā)明所進(jìn)行的后續(xù)檢測(cè)，如果在以上位點(diǎn)發(fā)生氨基酸的突變，將導(dǎo)致馬唐的光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗性。

因此，以馬唐psbA 基因?yàn)閷?duì)象的抗性檢測(cè)方法，能夠快速有效的檢測(cè)馬唐對(duì)光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑的抗性發(fā)生情況。

以上所述僅是本專利的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本專利技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和替換，這些改進(jìn)和替換也應(yīng)視為本專利的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 抗光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑類除草劑馬唐的PCR檢測(cè)方法及試劑盒

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtgtagctt gttatatggg tcgt 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcccaagtat taataacacg tcc 23