本發(fā)明涉及抗除草劑雜草檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說，涉及抗ALS抑制劑類除草劑馬唐的PCR檢測(cè)方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

馬唐(Digitaria ciliaris)是黃淮海玉米種植區(qū)的惡性雜草之一, 其在黃淮海免耕玉米田的出現(xiàn)頻率及危害率分別為99.0%和73.0%。黃淮海地區(qū)玉米田的7個(gè)主要雜草群系，有6個(gè)群系以馬唐為優(yōu)勢(shì)種。目前，對(duì)于馬唐的化學(xué)防除，主要采用ALS類除草劑，但由于該類除草劑分子靶標(biāo)單一，長(zhǎng)期使用易引起雜草抗藥性。近些年來，馬唐對(duì)ALS類除草劑抗性問題在我國(guó)黃淮海區(qū)域的一些玉米田已經(jīng)較為非常突出，以常規(guī)劑量噴施已經(jīng)無法有效防除抗性馬唐。

雜草產(chǎn)生抗性，則這些農(nóng)田不能繼續(xù)使用該類除草劑。但在生產(chǎn)實(shí)踐中人們對(duì)雜草抗性的認(rèn)識(shí)不足，盲目增大用藥劑量，不僅增加了成本，使藥害風(fēng)險(xiǎn)加大，嚴(yán)重影響農(nóng)民收入和國(guó)家糧食安全。傳統(tǒng)的抗藥性雜草檢測(cè)通常采用室內(nèi)生物測(cè)定法，既對(duì)田間采集的疑似抗性的雜草的種子在室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在一定葉齡噴施除草劑后，調(diào)查株防效和地上部分生物量來計(jì)算抗性指數(shù)。這種方法能夠客觀地評(píng)價(jià)某種雜草對(duì)相應(yīng)除草劑的抗性情況，但也有其局限性，主要表現(xiàn)在以下兩方面：一是不能當(dāng)季、當(dāng)時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，二是占地多、時(shí)間長(zhǎng)、工作量大。因此，目前迫切需要一個(gè)簡(jiǎn)便，快速的抗藥性雜草檢測(cè)鑒定方法。

乙酰乳酸合酶(Acetolactate synthase，ALS)，是植物和微生物體內(nèi)三種支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成過程中的關(guān)鍵性酶。ALS抑制劑類除草劑通過抑制生物體內(nèi)的ALS酶的合成，使蛋白質(zhì)的合成受到破壞，阻斷了雜草細(xì)胞的有絲分裂過程，最終導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受阻、直至死亡。

取決于這一特性，ALS作為一種重要的除草劑靶標(biāo)己經(jīng)被廣泛證實(shí)和應(yīng)用。ALS抑制劑類除草劑的開發(fā)及使用始于上世紀(jì)80年代初，如咪唑啉酮類(imidazolinones, IMI) 、磺酰脲類(sulfonylureas, SU)等。這些除草劑具有活性高、對(duì)人及動(dòng)物低毒和環(huán)境友好等明顯的優(yōu)勢(shì)，受到廣泛關(guān)注。

我國(guó)抗藥性雜草的分子機(jī)制研究起步較晚，但是隨著分子生物學(xué)技術(shù)在雜草抗藥性機(jī)理研究方面的應(yīng)用，越來越多的雜草的抗藥性機(jī)理得到明確。因此，通過PCR技術(shù)快速、靈敏的檢測(cè)目標(biāo)雜草靶標(biāo)基因的突變位點(diǎn)，從而檢測(cè)目標(biāo)雜草是否產(chǎn)生抗藥性的方法已經(jīng)成為可能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上技術(shù)上的不足，本發(fā)明提供了一種快速高效的分子生物學(xué)檢測(cè)雜草抗性的方法。

本發(fā)明的目的是提供一種更快速和高效的抗ALS抑制劑類除草劑馬唐的PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明的另一目的是提供一種用于檢測(cè)抗ALS抑制劑類除草劑馬唐的PCR檢測(cè)試劑盒。

我們首次克隆了馬唐的ALS基因，并與已報(bào)道的其它雜草ALS基因進(jìn)行序列比對(duì)。明確其同源性，并命名為DsALS基因。根據(jù)克隆得到的DsALS基因序列，設(shè)計(jì)一特異性引物對(duì)用于檢測(cè)抗ALS抑制劑類除草劑馬唐

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，具體采用如下的技術(shù)方案：

首先提供一對(duì)特異性引物對(duì)用于檢測(cè)抗ALS抑制劑類除草劑馬唐，引物序列如下：

用于特異性擴(kuò)增馬唐DsALS基因的引物對(duì)：

正向引物DsALS-F: 5’- GTCATCGCCAACCACCTCT-3’

反向引物DsALS-R: 5’- CATATCCTTGAAAGCGCCAC -3’

其中，DsALS基因的GeneBank登錄號(hào)為KX461957。

本發(fā)明還提供含有上述引物對(duì)的用于檢測(cè)抗ALS抑制劑類除草劑馬唐的試劑盒。

本發(fā)明所述試劑盒還包括dNTPS、Taq DNA聚合酶和含有Mg²⁺的PCR反應(yīng)緩沖液。

本發(fā)明所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)陽性模板。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)方法，以上述引物對(duì)或上述試劑盒進(jìn)行馬唐抗性檢測(cè)的PCR克隆方法。

所述PCR方法的具體步驟為：

1. 選取田間待檢測(cè)植株或以溫室自行種植的植株為材料。

2. 提取待檢測(cè)樣品基因組DNA；

3. 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

4. 回收、分析PCR產(chǎn)物。

PCR反應(yīng)體系以25 μL計(jì)為:

模板DNA 1 μL

2.5 mM dNTPs 1 μL

10 μM正向引物 1 μL

10 μM反向引物 1 μL

Taq DNA聚合酶 1.5 U

含Mg²⁺的10×PCR反應(yīng)緩沖液 2.5 μL

ddH₂O 補(bǔ)至25 μL

PCR反應(yīng)條件為：94℃ 4分鐘；94℃ 0.5分鐘，58℃ 1分鐘，72℃ 1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10分鐘。

本發(fā)明以發(fā)明人首次克隆的馬唐ALS基因序列為依據(jù)，根據(jù)其序列信息設(shè)計(jì)特異性引物DsALS-F/DsALS-R，并同時(shí)設(shè)計(jì)了含有該引物對(duì)的PCR檢測(cè)試劑盒，采用該P(yáng)CR引物對(duì)或試劑盒均能夠特性的擴(kuò)增出馬唐ALS基因序列（圖1）。該方法基于對(duì)核昔酸的檢測(cè)，當(dāng)季就可以取樣檢測(cè)，從取樣到出結(jié)果僅需1-2天，具有精確和快速的特點(diǎn)。

不同于傳統(tǒng)的生物測(cè)定方法，分子生物學(xué)手段的檢測(cè)更加快速和靈敏，已經(jīng)成為目前要求較高的一類檢測(cè)方向。在發(fā)明人成果首次克隆了馬唐ALS序列后，基于該序列克隆和分析的快速PCR檢測(cè)技術(shù)也就成為了可能。

本發(fā)明提供的檢測(cè)方法是基于基因核苷酸序列的檢測(cè)技術(shù)，該檢測(cè)能夠以當(dāng)即植株為檢測(cè)對(duì)象，整個(gè)檢測(cè)方法不僅簡(jiǎn)便快捷，而且靈敏度高、特異性好，可對(duì)田間采集的疑似抗性的馬唐進(jìn)行快速檢測(cè)。該方法效率高，操作簡(jiǎn)便，是傳統(tǒng)的室內(nèi)除草劑抗性生物測(cè)定的有效替代方法。

附圖說明

圖1 本發(fā)明實(shí)施例1中克隆得到DsALS基因序列的進(jìn)化樹分析。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中利用所設(shè)計(jì)特異性引物DsALS-F/DsALS-R對(duì)馬唐基因組DNA的PCR結(jié)果。

圖3 為以本發(fā)明試劑盒中所提供的陽性模板的PCR克隆產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果，若被檢測(cè)植株在該位點(diǎn)處發(fā)生氨基酸水平的變化則意味著被檢測(cè)植株為抗性植株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，以下所述實(shí)施例為本發(fā)明所采用具體實(shí)施方式，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1 馬唐ALS基因（DsALS）的克隆。

在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢已報(bào)道的禾本科雜草ALS基因序列，根據(jù)查詢到的序列信息設(shè)計(jì)通用引物，根據(jù)已擴(kuò)增得到的基本序列通過3’和5’端RACE技術(shù)克隆兩端序列，通過相關(guān)生物學(xué)軟件進(jìn)行拼接后獲得馬唐DsALS基因序列。

實(shí)施例2 PCR引物對(duì)的設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)本發(fā)明人所克隆得到的馬唐DsALS基因序列，通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引序列DsALS-F/DsALS-R，用于特異性擴(kuò)增目的基因，具體序列信息如下：

正向引物DsALS-F: 5’- GTCATCGCCAACCACCTCT-3’ (Seq ID No.1)

反向引物DsALS-R: 5’- CATATCCTTGAAAGCGCCAC -3’(Seq ID No.2)

引物設(shè)計(jì)完成后送上海生物工程有限公司進(jìn)行引物的合成工作。

實(shí)施例3 PCR試劑盒的制備

根據(jù)實(shí)施例中獲得特異性引物對(duì)，在試劑盒中添加PCR反應(yīng)所必須試劑：dNTPS、Taq DNA聚合酶和含有Mg²⁺PCR反應(yīng)緩沖液，并結(jié)合所合成引物對(duì)，制成PCR檢測(cè)試劑盒。

實(shí)施例4 抗ALS抑制劑類除草劑馬唐的PCR檢測(cè)

采集不同地區(qū)的田間馬唐，或以自行種植的馬唐植株為檢測(cè)材料。

取馬唐新鮮葉片約0.3g，加入液氮研磨，采用CTAB法提取馬唐基因組DNA。

PCR反應(yīng)體系，其中10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL，2.5 mM dNTPs 1 μL，10 μM引物各1 μL，TaqDNA聚合酶1.5 U，DNA模板1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至終體積為25 μL。

用于檢測(cè)馬唐DsALS基因的PCR擴(kuò)增程序：94℃ 4分鐘；94℃ 0.5分鐘，58℃ 1分鐘，72℃ 1.5分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10分鐘。

PCR產(chǎn)物的鑒定：1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所克隆PCR產(chǎn)物的特異性。將PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

發(fā)明人首次克隆了馬唐ALS基因序列（DsALS基因），基因序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列與其它雜草的ALS基因的氨基酸同源性在60%以上，進(jìn)化樹分析顯示其與稗草親緣關(guān)系較近（圖1）。以本發(fā)明所設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)DsALS-F/DsALS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析，能夠獲得特異性PCR產(chǎn)物（圖2）。

依據(jù)本發(fā)明所提供試劑盒中的模板，進(jìn)行PCR克隆反映，經(jīng)測(cè)序分析后能夠獲得DsALS基因與抗性產(chǎn)生相關(guān)位點(diǎn)的序列組成。圖3中顯示為第197為氨基酸所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列，而待檢測(cè)植株如果在此位置發(fā)生突變就意味著該植株為抗性植株。

以上所述僅是本專利的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本專利技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和替換，這些改進(jìn)和替換也應(yīng)視為本專利的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 抗ALS抑制劑類除草劑馬唐的PCR檢測(cè)方法及試劑盒

<130> 2016

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catatccttg aaagcgccac 20