本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種新型羅漢果醇衍生物單體及其組合物的用途。

背景技術(shù)：

癌癥是殘害人類生命的世界第二大疾病，死亡率僅次于心腦血管疾病，是人類死亡的最主要因素之一。由世衛(wèi)組織組織下屬的的官方癌癥機(jī)構(gòu)國(guó)際癌癥研究中心(IARC)負(fù)責(zé)的最新版《世界癌癥報(bào)告》預(yù)測(cè)，全球癌癥病例將呈現(xiàn)迅猛增殖態(tài)勢(shì)，由2012年的1400萬人，逐年迅增至2025年的1900萬人，到2035年將達(dá)到2400萬人。報(bào)告還顯示，2012年全球新增癌癥病例有近一半出現(xiàn)在亞洲，其中大部分在中國(guó)，中國(guó)新增癌癥病例高居首位。2012年中國(guó)新增307萬癌癥患者并造成約220萬人死亡，分別占全球總量的21.9％和26.8％。世衛(wèi)的數(shù)據(jù)略低于中國(guó)自己的統(tǒng)計(jì)。全國(guó)腫瘤登記中心發(fā)布的2012年數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)每年新增癌癥病例約350萬，約有250萬人因此死亡。

現(xiàn)今癌癥的常用治療方法主要有三種模式：手術(shù)、放療和藥物治療，而選定哪個(gè)治療方法則取決于腫瘤的位置、惡性程度、發(fā)展程度以及病人身體狀態(tài)。三種模式中，手術(shù)的治療方法，常因?yàn)榘┘?xì)胞入侵蔓延到鄰近組織或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移而效果有限；放療的治療方法，則受限于對(duì)體內(nèi)其他正常組織造成的傷害；藥物的治療方法，對(duì)于晚期彌散性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤是最基本的治療方法。過去的幾十年里，著眼于直接殺傷腫瘤細(xì)胞的化療雖有明顯的發(fā)展和進(jìn)步，成為腫瘤藥物治療的中堅(jiān)，但這一治療模式對(duì)增殖緩慢的實(shí)體瘤效果差、藥物選擇性小、毒副反應(yīng)多且嚴(yán)重的缺陷成為臨床治療中的重要限制因素。繼手術(shù)、放療和化療之后的第四種模式是腫瘤的生物治療，其主要是通過腫瘤宿主防御機(jī)制或生物制劑的作用來調(diào)節(jié)機(jī)體自身的生物學(xué)反應(yīng)，從而抑制或消除腫瘤；生物治療雖然沒有太大毒副作用，但由于技術(shù)要求嚴(yán)、工藝復(fù)雜，因此價(jià)格高，眾多癌癥患者及家屬難以承受，影響其在癌癥治療領(lǐng)域的普及。

由于存在上述各種限制，天然抗腫瘤藥物的研發(fā)取得了越來越多的關(guān)注。天然抗癌藥物無論是在抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)整機(jī)體免疫功能、改善癥狀與特征和減輕放化療毒副作用上，還是在腫瘤的病后調(diào)理上，均具有重要作用。由此，天然植物新療法將成為繼手術(shù)、放療、化療和生物療法之后的第五種模式。

羅漢果是一種名貴藥材，屬于葫蘆科多年生藤本植物，性涼味甘。羅漢果提取物中含非糖甜味的皂苷成分，又稱羅漢果總皂苷，根據(jù)其中皂苷元連接糖基的數(shù)目以及連接位置的不同已經(jīng)在羅漢果總皂苷中分離鑒定出羅漢果二糖苷、三糖苷、四糖苷、五糖苷、六糖苷等多種皂苷單體，分別命名為羅漢果甜苷II、III、IV、V、VI(MogrosideII、III、IV、V、VI)等，其中羅漢果甜苷V–Mogroside V(1A)(如圖1所示)的甜度是蔗糖的256-344倍，羅漢果甜苷IV–Mogroside IV(1B)(如圖1所示)的甜度為蔗糖的126倍，其熱量為零，具有清熱潤(rùn)肺鎮(zhèn)咳、潤(rùn)腸通便之功效，對(duì)肥胖、便秘、糖尿病等具有防治作用。

羅漢果皂苷Mogrosides是兩條由四個(gè)以下葡萄糖單位組成的葡萄糖苷側(cè)鏈以β-糖苷鍵與皂苷元羅漢果醇Mogrol(2)(如圖2所示)的C-3、C-24相連，在側(cè)鏈葡萄糖之間的連接鍵為β-1,6和β-l,2糖苷鍵。

許多研究表明，羅漢果皂苷能提高葡萄糖和脂肪的利用，增加胰島素的敏感性，但羅漢果降血糖作用的有效成分和作用機(jī)制并不明確。中科院上海藥物研究所胡立宏課題組和沈旭課題組對(duì)羅漢果的降血糖作用進(jìn)行了研究，首先在HepG2細(xì)胞中，對(duì)羅漢果中含量最高的羅漢果甜苷V(1A)進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)它對(duì)AMPK沒有活性；而羅漢果醇Mogrol(2)及其衍生物3α-羥基-25-脫羥基-24-酮-羅漢果醇(3α-hydroxy-25-dehydroxy-24-oxomogrol)(3)(如圖3所示)卻能夠激活A(yù)MPK(Chen X.B.，et al；Bioorganic&Medicinal Chemistry 2011,19:5776)。目前，還沒有任何專利和文獻(xiàn)報(bào)道通過羅漢果醇(2)在特定條件下生成羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)(如圖4所示)，也沒有任何專利和文獻(xiàn)報(bào)道存在有羅漢果醇衍生物單體(4)以及其用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種新型羅漢果醇衍生物單體(4)的新用途，本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含有新型羅漢果醇衍生物單體(4)的組合物的新用途。

本發(fā)明提供的如下結(jié)構(gòu)

的新型羅漢果醇衍生物單體(4)，和其它多數(shù)葫蘆科植物中直接提取分離的高氧化葫蘆烷類四環(huán)三萜化合物不同，新型羅漢果醇衍生物單體(4)是低氧化的葫蘆烷類四環(huán)三萜化合物,其特點(diǎn)是C-3和C-11上連接的是-OH,而不是＝O,氧化程度大大減低，目前無法直接從羅漢果屬植物中提取、分離，難以制備。

本發(fā)明第一方面提供了如下結(jié)構(gòu)的

新型羅漢果醇衍生物單體(4)的一個(gè)用途，表現(xiàn)在制備用于治療和/或預(yù)防腫瘤和/或癌癥的藥物中的用途。

在一優(yōu)選例中，其中所述的腫瘤和/或癌癥選自：

惡性腫瘤，包括膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺癌、頭和頸癌、食管癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌和皮膚癌；

淋巴系統(tǒng)的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性成淋巴細(xì)胞白血病、B-細(xì)胞淋巴癌、T-細(xì)胞淋巴癌、霍奇金淋巴癌、非-霍奇金淋巴癌、毛細(xì)胞淋巴癌、外套細(xì)胞淋巴瘤、骨髓瘤和Burkett′s氏淋巴癌；

骨髓系統(tǒng)的造血腫瘤，包括急性和慢性髓細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征和前髓細(xì)胞性白血??；

間質(zhì)成因的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；

中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、成纖維神經(jīng)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)鞘瘤；以及

其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、外生性色素頸瘤、甲狀腺濾囊癌和卡波氏肉瘤。

本發(fā)明第二方面提供了如下結(jié)構(gòu)

的新型羅漢果醇衍生物單體(4)的另一個(gè)用途，表現(xiàn)在制備用于免疫調(diào)節(jié)和/或改善微循環(huán)和/或提高生命質(zhì)量的保健品中的用途。

本發(fā)明第三方面提供了包含上述新型羅漢果醇衍生物單體(4)的組合物的一個(gè)用途，表現(xiàn)在制備用于治療和/或預(yù)防腫瘤和/或癌癥的藥物中的用途；在一優(yōu)選例中，所述的腫瘤和/或癌癥選自：

惡性腫瘤，包括膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌)、頭和頸癌、食管癌、膽囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宮頸癌、甲狀腺癌、前列腺癌和皮膚癌(包括鱗狀細(xì)胞癌)；

淋巴系統(tǒng)的造血腫瘤，包括白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性成淋巴細(xì)胞白血病、B-細(xì)胞淋巴癌、T-細(xì)胞淋巴癌、霍奇金淋巴癌、非-霍奇金淋巴癌、毛細(xì)胞淋巴癌、外套細(xì)胞淋巴瘤、骨髓瘤和Burkett′s氏淋巴癌；

骨髓系統(tǒng)的造血腫瘤，包括急性和慢性髓細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征和前髓細(xì)胞性白血??；

間質(zhì)成因的腫瘤，包括纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤；

中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、成纖維神經(jīng)瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)鞘瘤；以及

其他腫瘤，包括黑素瘤、精原細(xì)胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、外生性色素頸瘤、甲狀腺濾囊癌和卡波氏肉瘤。

在一優(yōu)選例中，所述組合物為藥物制劑，其包含治療和/或預(yù)防有效量的所述新型羅漢果醇衍生物單體(4)以及任選的藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、輔料或媒介物。

在一優(yōu)選例中，所述藥物制劑的劑型為口服劑型、注射劑型或局部用藥劑型中的任何一種；

在一優(yōu)選例中，所述口服劑型包括片劑、粉劑、懸濁液、乳濁液、膠囊、顆粒劑、糖衣片、藥丸、液體、醑劑、糖漿或檸檬水劑；

在一優(yōu)選例中，所述注射劑型包括水劑、懸濁液或溶液；

在一優(yōu)選例中，所述局部用藥劑型包括軟膏、固體、懸濁液、水劑、醑劑、粉劑、糊劑、栓劑、氣溶膠、泥敷劑、涂抹劑、洗劑、灌腸劑或乳劑。本發(fā)明第四方面提供了包含上述新型羅漢果醇衍生物單體(4)的組合物的另一個(gè)用途，提供了包含上述新型羅漢果醇衍生物單體(4)的組合物的一個(gè)用途，

所述組合物為一種保健品，其包含治療和/或預(yù)防有效量的所述新型羅漢果醇衍生物單體(4)以及任選的保健品中可接受的載體。

本發(fā)明使用的術(shù)語具有以下定義，除非另有描述：

本文所用的術(shù)語“羅漢果醇衍生物單體(3)”意指3α-羥基-25-脫羥基-24-酮-羅漢果醇(3α-hydroxy-25-Dehydroxy-24-oxomogrol)(結(jié)構(gòu)式如圖3所示)；本文所用的術(shù)語“新型羅漢果醇衍生物單體(4)”意指3α-羥基-22、24-二烯-24、25-脫羥基-羅漢果醇(3α-hydroxy-22、24-diene-24、25-dehydroxy-mogrol)(4)(結(jié)構(gòu)式如圖4所示)。

本文所用的術(shù)語“組合物”意指包括包含指定量的各指定成分的產(chǎn)品，以及直接或間接從指定量的各指定成分的組合產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。所述局部用藥劑型包括軟膏、固體、懸濁液、水劑、醑劑、粉劑、糊劑、栓劑、氣溶膠、泥敷劑、涂抹劑、洗劑、灌腸劑或乳劑。在無菌條件下將活性化合物與藥學(xué)可接受的載體和任何所需的防腐劑、緩沖劑或推進(jìn)劑混合。眼用制劑、眼軟膏劑、散劑和溶液劑也被考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。

當(dāng)用于上述治療或其他治療時(shí)，治療和/或預(yù)防有效量的一種本發(fā)明化合物可以以純形式應(yīng)用，或者以藥學(xué)可接受的鹽、酯或前藥形式(在存在這些形式的情況下)應(yīng)用?；蛘?，所述化合物可以以含有該目的化合物與一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑的藥物組合物給藥。詞語“治療和/或預(yù)防有效量”的本發(fā)明化合物指以適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理效果/風(fēng)險(xiǎn)比治療障礙的足夠量的化合物。但應(yīng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明化合物和組合物的總?cè)沼昧宽氂芍髟\醫(yī)師在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)作出決定。對(duì)于任何具體的患者，具體的治療和/或預(yù)防有效劑量水平須根據(jù)多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴(yán)重程度；所采用的具體化合物的活性；所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食；所采用的具體化合物的給藥時(shí)間、給藥途徑和排泄率；治療持續(xù)時(shí)間；與所采用的具體化合物組合使用或同時(shí)使用的藥物；及醫(yī)療領(lǐng)域公知的類似因素。例如，本領(lǐng)域的做法是，化合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。

本發(fā)明還提供包含任選地與一種或多種無毒藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體、賦形劑、輔料或媒介物配制在一起的本發(fā)明化合物的藥物制劑。所述藥物制劑可特別專門配制成以固體或液體形式供口服給藥、供胃腸外注射或供直腸給藥。

本發(fā)明的藥物組合物可通過口服、直腸、胃腸外、池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、局部(如通過散劑、軟膏劑或滴劑)、口頰給予人類和其他哺乳動(dòng)物，或者作為口腔噴霧劑或鼻腔噴霧劑給予。本文所用術(shù)語“胃腸外”指包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸液的給藥方式。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明成分和生理可耐受稀釋劑的藥物組合物。本發(fā)明包括一種或多種上述化合物，其與一種或多種無毒生理可耐受或可接受的稀釋劑、載體、輔料或媒介物(本文將它們統(tǒng)稱為稀釋劑)一起配制成組合物，以供胃腸外注射、鼻內(nèi)傳遞、以固體或液體形式口服給藥、直腸或局部給藥等等。

適合于胃腸外注射的組合物可包括生理上可接受的無菌含水或非水溶液劑、分散劑、混懸劑或乳劑，及供重構(gòu)成無菌可注射溶液劑或分散劑的無菌散劑。合適的含水或非水載體、稀釋劑、溶劑或媒介物的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄欖油)、可注射有機(jī)酯如油酸乙酯及它們的合適混合物。

這些組合物也可含有輔料，如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑和分散劑。通過各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑，例如尼泊金酯類、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，可確保防止微生物的作用。還期望包括等滲劑，例如糖類、氯化鈉等。通過使用能延遲吸收的物質(zhì)，例如單硬脂酸鋁和明膠，可達(dá)到可注射藥物形式的延長(zhǎng)吸收。

混懸劑中除活性化合物外還可含有懸浮劑，例如乙氧基化異十八醇、聚氧乙烯山梨醇和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤(rùn)土、瓊脂和黃蓍膠或者這些物質(zhì)的混合物等。

在一些情況下，為延長(zhǎng)藥物的作用，期望減慢皮下或肌內(nèi)注射藥物的吸收。這可通過使用水溶性差的晶體或無定形物質(zhì)的液體混懸劑來實(shí)現(xiàn)。這樣，藥物的吸收速度取決于其溶解速度，而溶解速度又可取決于晶體大小和晶型?；蛘?，胃腸外給藥的藥物形式的延遲吸收通過將該藥物溶解于或懸浮于油媒介物中來實(shí)現(xiàn)。

可注射貯庫(kù)制劑形式可通過在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯(polylactide-polyglycolide)中形成藥物的微膠囊基質(zhì)來制備。可根據(jù)藥物與聚合物之比和所采用的具體聚合物的性質(zhì)，對(duì)藥物釋放速度加以控制。其他生物可降解聚合物的實(shí)例包括聚原酸酯類(poly(orthoesters))和聚酐類(poly(anhydrides))?？勺⑸滟A庫(kù)制劑也可通過將藥物包埋于能與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳中來制備。

可注射制劑可例如通過用濾菌器過濾或通過摻入無菌固體組合物形式的滅菌劑來滅菌，所述固體組合物可在臨用前溶解或分散于無菌水或其他無菌可注射介質(zhì)。

供口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在此類固體劑型中，活性化合物可與至少一種惰性的藥學(xué)可接受的賦形劑或載體如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或以下物質(zhì)混合：a)填充劑或增量劑如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合劑如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹膠；c)保濕劑如甘油；d)崩解劑如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；e)溶液阻滯劑如石蠟；f)吸收加速劑如季銨化合物；g)濕潤(rùn)劑如鯨蠟醇和甘油單硬脂酸酯；h)吸附劑如高嶺土和膨潤(rùn)土以及i)潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉和它們的混合物。在膠囊劑、片劑和丸劑的情況下，所述劑型中也可包含緩沖劑。

相似類型的固體組合物使用賦形劑例如乳糖及高分子量聚乙二醇等，也可用作軟膠囊和硬膠囊中的填充物。

片劑、糖衣丸劑(dragees)、膠囊劑、丸劑和顆粒劑的固體劑型可與包衣和殼料如腸溶衣材和醫(yī)藥制劑領(lǐng)域公知的其他衣材一起制備。這些固體劑型可任選含有遮光劑，且其組成還可使其只是或優(yōu)先地在腸道的某個(gè)部位任選以延遲方式釋放活性成分?？梢允褂玫陌窠M合物的實(shí)例包括高分子物質(zhì)和蠟類。如果適合，活性化合物也可與一種或多種上述賦形劑配成微囊形式。

供口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)可接受的乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。液體劑型除含有活性化合物外還可含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如水或其他溶劑，增溶劑和乳化劑例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油類(特別是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫糠醇(tetrahydrofurfuryl alcohol)、聚乙二醇和脫水山梨糖醇的脂肪酸酯及它們的混合物。口服組合物除包含惰性稀釋劑外還可包含輔料，例如濕潤(rùn)劑、乳化和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香味劑。

供直腸或陰道給藥的組合物優(yōu)選是栓劑。栓劑可通過將本發(fā)明化合物與合適的非刺激性賦形劑或載體例如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合來制備，它們?cè)谑覝叵聻楣腆w，但在體溫下則為液體，因此可在直腸腔或陰道腔內(nèi)熔化而釋放出活性化合物。

本發(fā)明化合物也可以脂質(zhì)體形式給藥。如本領(lǐng)域所公知，脂質(zhì)體通常用磷脂或其他脂類物質(zhì)制得。脂質(zhì)體由分散于含水介質(zhì)中的單層或多層水化液晶所形成。任何能夠形成脂質(zhì)體的無毒、生理上可接受和可代謝的脂質(zhì)均可使用。脂質(zhì)體形式的本發(fā)明組合物除含有本發(fā)明化合物外，還可含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等。優(yōu)選的脂類是天然和合成的磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，它們可單獨(dú)或者一起使用。形成脂質(zhì)體的方法是本領(lǐng)域公知的。

本文所用的術(shù)語“藥學(xué)可接受的前藥”代表本發(fā)明化合物的前藥，其在可靠的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合用于與人類和低等動(dòng)物的組織接觸而不出現(xiàn)過度的毒性、刺激、過敏反應(yīng)等，與合理的效果/風(fēng)險(xiǎn)比相稱且對(duì)其預(yù)定用途有效，在可能的情況下還代表本發(fā)明化合物的兩性離子形式。本發(fā)明的前藥可例如通過在血液中水解而在體內(nèi)快速轉(zhuǎn)化成上式的母體化合物。

本發(fā)明中的新型羅漢果醇衍生物單體(4)具有抑制人腫瘤細(xì)胞(23種已測(cè)癌細(xì)胞)及人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抗腫瘤活性，可以被制成用于治療和/或預(yù)防不同癌癥和/或腫瘤的藥物，以及用于免疫調(diào)節(jié)和/或改善微循環(huán)和/或提高生命質(zhì)量的保健品，重點(diǎn)應(yīng)用于惡性腫瘤的治療，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為羅漢果甜苷V(1A)、VI(1B)的分子結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為羅漢果醇Mogrol(2)的分子結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為羅漢果醇衍生物單體(3)的分子結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4為新型羅漢果醇衍生物單體(4)的分子結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

除非特殊說明，本發(fā)明所用術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的一般含義。

下面參考具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：從羅漢果總皂苷98％的提取物制備羅漢果醇衍生物單體(3)和(4)

將羅漢果提取物50g(羅漢果總皂苷98％，含55％羅漢果甙V，購(gòu)買于桂林萊茵生物科技股份有限公司)加入250mL的乙醇的水溶液(乙醇和水的體積比為1:1)(預(yù)先用鹽酸調(diào)節(jié)至PH值為3.0)，在反應(yīng)釜中攪拌溶解，然后升溫至120℃下加熱2小時(shí)，冷卻至室溫25℃后，反應(yīng)液用1M的NaOH堿液中和至PH值為7，在90-95℃下將乙醇盡量蒸出，剩下的濃縮液加入200mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬罄鋮s、靜置，將上面的水層分離棄去，得到咖啡色浸膏；分別用100mL、50mL、50mL乙酸乙酯萃取咖啡色浸膏3次，合并3次萃取液后，在100-120℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，把乙酸乙酯完全蒸干，即得到含羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的淺咖啡色固體18.2g；用乙醇將淺咖啡色固體載入硅膠柱，用乙腈：水(體積比20:1)梯度洗脫，按先后順序收集不同的流出液，濃縮后得到A(6.8g)、B(5.6g)兩組分；先收集得到的A(6.8g)組分再用硅膠柱分離(氯仿：乙醇/60:5洗脫)，得到羅漢果醇衍生物單體(3)4.1g(HPLC>99％)。ESIMS m/z 503(458+45)[M+HCOO^-]^-(calcd for C₃₁H₅₁O₅)；¹³C-NMR(600MHz，MeOD)δppm:29.1(C-1),

31.7(C-2),79.4(C-3),42.8(C-4),144.1(C-5),120.7(C-6),25.2(C-7),44.8(C-8),41.1(C-9),35.4(C-10),77.7(C-11),30.6(C-12),48.3(C-13),49.6(C-14),34.9(C-15),27.5(C-16),50.7(C-17),17.2(C-18),26.6(C-19),41.1(C-20),19.0(C-21),37.8(C-22),40.3(C-23),218.2(C-24),35.4(C-25),18.8(C-26),18.8(C-27),26.4(C-28),19.9(C-29),19.3(C-30)；與文獻(xiàn)報(bào)道的3a-羥基-25-脫羥基-24-羰基-羅漢果醇(3a-hydroxy-25-Dehydroxy-24-oxomogrol)碳譜數(shù)據(jù)比較，二者基本一致(Chen X.B.，et al；Bioorganic&Medicinal Chemistry 2011,19:5776)。

后收集得到的B(5.6g)組分再用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯/5:2洗脫)，得到羅漢果醇衍生物單體(4)。3.2g(HPLC>99％)。ESIMS m/z 441[M+H]⁺(calcd for C₃₀H₄₉O₂)；¹³C-NMR(600MHz，MeOD)δppm:23.5(C-1),29.5(C-2),87.8(C-3),44.2(C-4),144.1(C-5),121.8(C-6),25.5(C-7),40.9(C-8),40.8(C-9),51.3(C-10),71.9(C-11),41.5(C-12),48.2(C-13),52.2(C-14),35.3(C-15),24.9(C-16),54.3(C-17),15.2(C-18),18.6(C-19),40.2(C-20),20.3(C-21),137.4(C-22),128.8(C-23),125.4(C-24),143.3(C-25),19.7(C-26),25.7(C-27),21.7(C-28),21.7(C-29),18.6(C-30)。

實(shí)施例2：從羅漢果總皂苷95％的提取物制備羅漢果醇衍生物單體(3)和(4)

將羅漢果提取物50g(羅漢果總皂苷95％，含45％羅漢果甙V，從桂林萊茵生物科技股份有限公司購(gòu)買)加入250mL的甲醇的水溶液(甲醇和水的體積比為3:2)(預(yù)先用硫酸調(diào)節(jié)至PH值為2.8)，在反應(yīng)釜中攪拌溶解，然后升溫至120℃下加熱2小時(shí)，冷卻至室溫后，反應(yīng)液用1M的KOH堿液中和至PH值為7，在90-95℃下將甲醇盡量蒸出，剩下的濃縮液加入200mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬罄鋮s、靜置，將上面的水層分離棄去，得到咖啡色浸膏；分別用100mL、50mL、50mL乙酸乙酯萃取咖啡色浸膏3次，合并3次萃取液后，在100-120℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，把乙酸乙酯完全蒸干，即得到含羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的淺咖啡色固體15.5g；用甲醇將淺咖啡色固體載入硅膠柱，用乙腈：水(19:1)梯度洗脫，按先后順序收集不同的流出液，濃縮后得到A(6.0g)、B(5.2g)兩組分；先收集得到的A(6.0g)組分再用硅膠柱分離(氯仿：乙醇/60:5洗脫)，得到羅漢果醇衍生物單體(3)3.9g(HPLC>99％)；HPLC、¹³C-NMR、ESIMS檢測(cè)結(jié)果和實(shí)施例1中的化合物(3)一致。后收集得到的B(5.2g)組分再用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯/3:1洗脫)，得到羅漢果醇衍生物單體(4)。3.0g(HPLC>99％)；HPLC、¹³C-NMR、ESIMS檢測(cè)結(jié)果和實(shí)施例1中的羅漢果醇衍生物單體(4)一致。

實(shí)施例3：從羅漢果總皂苷90％的提取物制備羅漢果醇衍生物單體(3)和(4)

將羅漢果提取物50g(羅漢果總皂苷90％，含40％羅漢果甙V，從桂林萊茵生物科技股份有限公司購(gòu)買)加入250mL的正丙醇的水溶液(正丙醇和水的體積比為2:3)(預(yù)先用甲酸調(diào)節(jié)至PH值為3.2，在反應(yīng)釜中攪拌溶解，然后升溫至120℃下加熱2小時(shí)，冷卻至室溫后，反應(yīng)液用1M的NaOH堿液中和至PH值為7，在90-95℃下將正丙醇盡量蒸出，剩下的濃縮液加入200mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬罄鋮s、靜置，將上面的水層分離棄去，得到咖啡色浸膏；分別用100mL、50mL、50mL乙酸乙酯萃取咖啡色浸膏3次，合并3次萃取液后，在100-120℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，把乙酸乙酯完全蒸干，即得到含羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的淺咖啡色固體14.2g；用甲醇/乙醇將淺咖啡色固體載入硅膠柱，用乙腈：水(20:1)梯度洗脫，按先后順序收集不同的流出液，濃縮后得到A(5.4g)、B(4.3g)兩組分；先收集得到的A(5.4g)組分再用硅膠柱分離(氯仿：乙醇/60:5洗脫)，得到羅漢果醇衍生物單體(3)3.5g(HPLC>99％)；HPLC、¹³C-NMR、ESIMS檢測(cè)結(jié)果和實(shí)施例1中的化合物(3)一致。后收集得到的B(4.3g)組分再用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯/6:4洗脫)，得到羅漢果醇衍生物單體(4)2.8g(HPLC>99％)；HPLC、¹³C-NMR、ESIMS檢測(cè)結(jié)果和實(shí)施例1中的羅漢果醇衍生物單體(4)一致。

實(shí)施例4：從羅漢果總皂苷80％的提取物制備羅漢果醇衍生物單體(3)和(4)

將羅漢果提取物50g(羅漢果總皂苷80％，含20％羅漢果甙V，從桂林萊茵生物科技股份有限公司購(gòu)買)加入250mL的乙醇的水溶液(乙醇和水的體積比為1:1)(預(yù)先用乙二酸調(diào)節(jié)至PH值為2.6)，在反應(yīng)釜中攪拌溶解，然后升溫至120℃下加熱2小時(shí)，冷卻至室溫后，反應(yīng)液用1M的Na₂CO₃堿液中和至PH值為7，在90-95℃下將乙醇盡量蒸出，剩下的濃縮液加入200mL蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬罄鋮s、靜置，將上面的水層分離棄去，得到咖啡色浸膏；分別用100mL、50mL、50mL乙酸乙酯萃取咖啡色浸膏3次，合并3次萃取液后，在100-120℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，把乙酸乙酯完全蒸干，即得到含羅漢果醇衍生物單體(3)和羅漢果醇衍生物單體(4)的淺咖啡色固體8.8g；用甲醇/乙醇將淺咖啡色固體載入硅膠柱，用乙腈：水(95:5)梯度洗脫，按先后順序收集不同的流出液，濃縮后得到A(3.8g)、B(3.0g)兩組分；先收集得到的A(3.8g)組分再用硅膠柱分離(氯仿：乙醇/60:5洗脫)，得到羅漢果醇衍生物單體(3)2.1g(HPLC>99％)；HPLC、¹³C-NMR、ESIMS檢測(cè)結(jié)果和實(shí)施例1中的化合物(3)一致。后收集得到的B(3.0g)組分再用硅膠柱分離(石油醚：乙酸乙酯/4:1洗脫)，得到羅漢果醇衍生物單體(4)1.8g(HPLC>99％)；HPLC、¹³C-NMR、ESIMS檢測(cè)結(jié)果和實(shí)施例1中的羅漢果醇衍生物單體(4)一致。

實(shí)施例5：羅漢果醇衍生物單體(4)抑制細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)樣品：

測(cè)試藥物：實(shí)施例1制備得到的羅漢果醇衍生物單體(4)；

對(duì)照藥物：紫杉醇(SELLECK；Cat.#S1150)；人參皂苷單體Rg3(自上海源葉生物科技有限公司購(gòu)買，商品貨號(hào)為B21059)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

以24種細(xì)胞系(包括23種腫瘤細(xì)胞系和1種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系)為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞系，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(3x10⁴/mL至2.5x10⁵/mL)，以每孔100μL接種在96孔板內(nèi)，每個(gè)細(xì)胞系用一個(gè)96孔板；然后，除對(duì)照藥物紫杉醇以外，以高濃度150μM至低濃度2μM取7個(gè)對(duì)數(shù)遞減濃度(每個(gè)濃度設(shè)兩個(gè)復(fù)孔)，分別加入測(cè)試藥物溶液和對(duì)照藥物溶液500nL(測(cè)試藥物溶液或?qū)φ账幬锶芤号渲疲悍謩e采用測(cè)試藥物或?qū)φ账幬锶苡?.5％的DMSO溶液)。紫杉醇的加入濃度為由高濃度1μM至低濃度0.0014μM的7個(gè)三倍遞減濃度。經(jīng)測(cè)試/對(duì)照藥物溶液作用72小時(shí)后，用(Promega；Cat.#G7573)發(fā)光細(xì)胞活力檢測(cè)法求出各細(xì)胞系中的每種藥物的每個(gè)濃度對(duì)該系細(xì)胞的增殖抑制百分率，并繪制量效關(guān)系圖，最后根據(jù)圖中曲線測(cè)算IC₅₀和最高抑制百分率(E_max)，如表1和表2所示。

表1：羅漢果醇衍生物單體(4)以及對(duì)照藥Rg3抑制細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。

表2：羅漢果醇衍生物單體(4)以及對(duì)照藥紫杉醇、Rg3抑制細(xì)胞增殖有效性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。

使用SPSS Statistics軟件(提供者：IBM corporation,軟件版本:XL fit 21)提供統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

用假設(shè)方差不相等的獨(dú)立樣本檢驗(yàn)(independent-sample T-test)來檢測(cè)藥物組與對(duì)照組平均值的差異是否呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)顯著(P<0.05或P<0.01)。

分析結(jié)果：

1.本發(fā)明羅漢果醇衍生物單體(4)在24個(gè)細(xì)胞系中的平均IC50與對(duì)照藥物人參皂苷單體Rg3在24個(gè)細(xì)胞系中的平均IC50比較時(shí)，差異呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)顯著(P<0.05同時(shí)P<0.01)。

2.本發(fā)明羅漢果醇衍生物單體(4)在24個(gè)細(xì)胞系中的平均最高抑制百分率與對(duì)照藥物紫杉醇以及對(duì)照藥物人參皂苷單體Rg3在24個(gè)細(xì)胞系中的平均最高抑制百分率比較時(shí)，差異呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)顯著(P<0.05同時(shí)P<0.01)。

結(jié)論：

1.本發(fā)明羅漢果醇衍生物單體(4)在所有24種所測(cè)細(xì)胞系中的抑制細(xì)胞增殖活性均高于同類對(duì)照藥物人參皂苷單體Rg3(羅漢果醇衍生物單體(4)的IC₅₀小于人參皂苷單體Rg3的IC₅₀)。

2.在所有被測(cè)細(xì)胞系中，本發(fā)明羅漢果醇衍生物單體(4)在人臍血靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC中具有最高抑制細(xì)胞增殖活性(IC₅₀＝10.72μM)，表現(xiàn)出其強(qiáng)大的抗腫瘤血管生成潛力；羅漢果醇衍生物單體(3)在結(jié)直腸腺癌細(xì)胞系HCT-8中抑制細(xì)胞增殖活性排在其次(IC₅₀＝14.83μM)。

3.本發(fā)明羅漢果醇衍生物單體(4)對(duì)所有24種被測(cè)細(xì)胞系的最高抑制率(有效性)都非常接近100％；而對(duì)照藥紫杉醇和人參皂苷單體Rg3在已測(cè)的24種細(xì)胞系中，均只對(duì)2種細(xì)胞系有近100％的抑制率。這表明羅漢果醇衍生物單體(4)的有效性明顯高于對(duì)照藥物，且其高抗癌有效性適用于多類癌種。