本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及抗A型肉毒毒素的人源單鏈抗體E3-scFv，及其在生產(chǎn)治療A型肉毒毒素中毒藥物方面、檢測(cè)A型肉毒毒素方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肉毒毒素是一種嗜神經(jīng)蛋白毒素，能致使人及動(dòng)物毒，少至0.1~1.0μg含量可致人中毒身亡。它已被美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心指定為對(duì)人類的威脅類似于炭疽的生物武器，被列為六個(gè)最主要的生物戰(zhàn)劑之一。依據(jù)毒素進(jìn)入體內(nèi)途徑的不同分為四個(gè)類型，一、食源性中毒；二、嬰兒感染性肉毒中毒；三、創(chuàng)傷性肉毒中毒；四、吸入性中毒。

肉毒毒素是肉毒梭菌在自然狀態(tài)下或者是在培養(yǎng)基中形成，通過細(xì)菌裂解釋放到環(huán)境或培養(yǎng)液中，這種形態(tài)的毒素被稱為前體毒素，其分子量范圍在300 kDa到900 kDa。前體毒素通常以復(fù)合體的形式存在，由神經(jīng)毒素（Bont），由一個(gè)或多個(gè)能夠包圍和保護(hù)毒素的非毒性蛋白組成，包括血凝素（HA）,非毒素非血凝素（NTNH）。臨床上所說的肉毒毒素通常指具有神經(jīng)毒性作用的神經(jīng)毒素部分。

肉毒毒素根據(jù)其抗原性的不同，共存在七種血清型（A、B、C、D、E、F、G、），近年來又發(fā)現(xiàn)第八種血清型。盡管七種血清型的肉毒毒素組成成分與它的作用機(jī)制略有差別，但是它們有著相近的分子量和相似結(jié)構(gòu)。成熟肉毒毒素均由約150 kDa的單鏈多肽組成，蛋白質(zhì)成熟時(shí)通過細(xì)菌介導(dǎo)的蛋白酶將150kDa的單鏈多肽切割裂解成兩個(gè)不相等的多肽片段，兩個(gè)片段由一個(gè)二硫鍵連接，形成一個(gè)分子量為50kDa的輕鏈片段（LC）和一個(gè)分子量為100kDa的重鏈片段（HC）。其中輕鏈有一個(gè)催化功能域，重鏈由同輕鏈并列的α-螺旋轉(zhuǎn)導(dǎo)域H_N區(qū)，激發(fā)轉(zhuǎn)導(dǎo)的H_CN功能區(qū)和神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合區(qū)H_CC組成。與H_N區(qū)緊鄰是一個(gè)含有54個(gè)氨基酸肽段，即所謂的帶區(qū)，具有封閉輕鏈酶活性區(qū)，防止輕鏈折疊構(gòu)象改變。輕鏈為鋅離子肽鏈內(nèi)切酶活性功能區(qū)，由α-螺旋和β-折疊共同組成球形結(jié)構(gòu)。單獨(dú)的輕鏈和重鏈均無毒性，只有雙鏈才具有生物學(xué)毒性。

輕鏈由細(xì)胞內(nèi)毒素蛋白組成，具有鋅離子依賴內(nèi)切酶活性，可抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。肉毒毒素的活性區(qū)埋藏（~20 ?深）于輕鏈中，表面負(fù)電荷，可通過一個(gè)通道獲得。梭狀神經(jīng)毒素的活性位點(diǎn)包括一個(gè)單一的鋅原子，這個(gè)鋅原子歷來被認(rèn)為有功能，但是不起結(jié)構(gòu)性作用?？梢酝ㄟ^用金屬螯合劑去除鋅，但是通過在二級(jí)結(jié)構(gòu)上加入游離的鋅原子來重新獲得鋅，毒素與底物結(jié)合的能力幾乎不變，但輕鏈的生物學(xué)活性卻大大的降低了，只相當(dāng)于原來的30%。位于輕鏈中心有一個(gè)高度保守的鋅結(jié)合模塊HExxH （X是任意的氨基酸）序列。HExxH 序列中含有一個(gè)由3個(gè)組氨酸整合的鋅離子，并對(duì)突觸泡膜蛋白質(zhì)具有特異性蛋白水解活性，這個(gè)催化位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)表面較深的裂縫中。

在人類肉毒中毒中，A型肉毒毒素和B型肉毒毒素占據(jù)最重要的地位，其中A型肉毒毒素輕鏈上的His 222, Glu223 和His226殘基共同組成了鋅結(jié)合模塊HExxH 序列的一部分，并且在協(xié)調(diào)活性區(qū)鋅（His 222 和His226）和一個(gè)水分子（Glu223殘基）的作用機(jī)制中起了直接的作用。Glu261 是協(xié)調(diào)鋅的第三配體。甚至有人認(rèn)為A型肉毒毒素的催化機(jī)理與嗜熱菌蛋白酶是相似的，這是因?yàn)榛诮Y(jié)構(gòu)和序列相似的基礎(chǔ)上，他們的活性位點(diǎn)也是相似的。從Glu223到 Asp的突變使得活性幾乎全部失去，去除His226使A型肉毒毒素失去了催化活性。肉毒毒素中中和殘基的突變使催化速度常數(shù)明顯降低，但是不影響鋅結(jié)合和底物結(jié)合，人們提出，這些殘基在過渡態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮了作用。

另外，在LC活性中心還有一些氨基酸殘基，如Phe266、Glu350Arg363和Tyr366。它們的功能主要是維持和穩(wěn)定輕鏈活性中心的結(jié)構(gòu)和/或它與被結(jié)合底物的相對(duì)位置，以此保證輕鏈最佳的酶解能力；

LC通過二硫鍵與HC的N端連接。在二硫鍵存在的狀態(tài)下，毒素重鏈H_N結(jié)構(gòu)域形成一條loop結(jié)構(gòu)，將深陷于輕鏈表面裂縫中的Zn²⁺催化部位遮蔽住，從而不表現(xiàn)酶活性。在雙鏈毒素進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞后，二硫鍵被還原，釋放出的輕鏈才能表現(xiàn)鋅離子內(nèi)肽酶活性，催化部位能夠容納底物16個(gè)氨基酸殘基。催化部位的鋅離子除同4個(gè)組氨酸殘基的咪唑環(huán)、1個(gè)結(jié)合于保守谷氨酸的水分子形成配位鍵外，還與另一分子的谷氨酸羧基形成配位鍵，1個(gè)色氨酸分子很可能也參與鋅離子的配位。毒素輕鏈的這種獨(dú)特鋅離子配位形式、空間結(jié)構(gòu)與其他所有已知的金屬蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)都不同，應(yīng)當(dāng)屬于一個(gè)新型的金屬蛋白酶家族。

肉毒毒素的致病機(jī)理

1、靶細(xì)胞的識(shí)別與結(jié)合

前體毒素進(jìn)入胃腸道，在消化過程中，非毒素組分對(duì)神經(jīng)毒素起到保護(hù)作用，使其不會(huì)受到各種消化酶和胃酸的侵蝕。由于分子量過大，毒素分子不是以擴(kuò)散的方式，而是以“內(nèi)凹”和細(xì)胞攝入的方式通過腸粘膜上皮屏障，而不會(huì)破壞胃腸道。然后進(jìn)入小腸中，在小腸的微堿性環(huán)境下，前提毒素中的神經(jīng)毒素解離出來，進(jìn)入血液及淋巴循環(huán)，在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)和交感神經(jīng)處發(fā)揮其毒性作用。盡管神經(jīng)毒素可侵入不同的組織和器官,但不能穿透血腦屏障,其惟一的親和靶點(diǎn)是外周膽堿能神經(jīng)末梢。在膽堿能神經(jīng)末梢，毒素的輕鏈能夠抑制神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在神經(jīng)肌肉接頭處的釋放，導(dǎo)致肌肉麻痹。在這一毒性作用過程中，神經(jīng)毒素的各功能域都有參與，具體的過程可分為三個(gè)階段。

靶細(xì)胞的結(jié)合與內(nèi)化

在靶細(xì)胞的識(shí)別與結(jié)合這一過程中，肉毒毒素重鏈的結(jié)合域發(fā)揮了作用。結(jié)合域能夠識(shí)別膽堿能神經(jīng)末梢，并與其發(fā)生特異性結(jié)合。結(jié)合域結(jié)合到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)節(jié)苷脂和位于末端神經(jīng)細(xì)胞膜表面小結(jié)上的蛋白受體，特別是具有親和力的GD1b, GT1b 和GQ1b類神經(jīng)節(jié)苷脂。然后由含有唾液酸的寡糖組成的神經(jīng)節(jié)苷脂連接到神經(jīng)酰胺。通過對(duì)神經(jīng)節(jié)苷脂分布及對(duì)其親和結(jié)合力的研究，可以確定，神經(jīng)節(jié)苷脂不是唯一能促進(jìn)肉毒毒素結(jié)合的分子，而雙受體模型的提出表明，在發(fā)生內(nèi)化作用前，肉毒毒素就已經(jīng)結(jié)合到了蛋白受體上。盡管有一些證據(jù)表明，突觸結(jié)合蛋白可能參與了A、B和E型的內(nèi)化作用，但是梭菌屬家族每一個(gè)成員的受體，還沒有完全確定。每個(gè)毒素與其蛋白共受體都是特異性同源的，B型肉毒毒素與唾液酸乳糖的混合物就與肉毒毒素蛋白部分相似，表明了神經(jīng)毒素與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合的一個(gè)"鎖和鑰匙"原理。這個(gè)觀察成功說明了一個(gè)觀點(diǎn)，那就是神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合使肉毒毒素靠近蛋白受體，促進(jìn)了毒素的識(shí)別和內(nèi)化。

一旦結(jié)合到神經(jīng)元表面，母體分子裂解，重鏈和輕鏈通過鋅原子結(jié)合到達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞膜，并且被內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞囊泡，形成一個(gè)包裹著毒素分子的酸性小囊泡。即內(nèi)化過程。這一受體介導(dǎo)的內(nèi)吞過程與時(shí)間，溫度及突觸活動(dòng)均有關(guān)。

2、易位肉毒毒素的輕鏈必須從囊泡小室或者胞內(nèi)體中出來，并且在H鏈N-末端作用下的通過膜運(yùn)輸能夠成功進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)的靶蛋白，這一過程是稱為輕鏈易位；與其它梭菌毒素一樣，肉毒毒素進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的酸性小泡后，會(huì)因pH的變化而發(fā)生結(jié)構(gòu)重組。盡管進(jìn)入突觸小泡和胞內(nèi)小泡是顯而易見，但是肉毒毒素易位進(jìn)入胞內(nèi)小泡的特性尚未斷然確定。pH的降低使肉毒毒素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其在分子中有較大的疏水性，并且增加了脂雙層的滲透性。這樣毒素的重鏈和輕鏈能夠嵌入小泡的脂雙層內(nèi)，一旦嵌入，就會(huì)在磷脂雙層和PC12膜上形成離子通道。這個(gè)通道是具有選擇性的，分子量大的分子無法通過，所以目前普遍認(rèn)為毒素輕鏈可以通過離子通道從小泡腔內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)。據(jù)此有三種輕鏈跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)假說模型，即管道模型（tunnel model），裂縫模型(cleft model)和裂解模型(lysis model)。其中裂縫模型理論認(rèn)為，在低pH時(shí)，蛋白質(zhì)的分子構(gòu)想發(fā)生了改變，此時(shí)HC可形成一個(gè)親水性的裂隙，并且在輕鏈穿膜過程中將其親水表面包圍。在此模式中形成了親水性和疏水性的相互作用。輕鏈的羧基端因?yàn)槎蜴I與重鏈氨基端相連而最先進(jìn)入到胞質(zhì)。實(shí)現(xiàn)易位后，由于胞質(zhì)的pH高于酸性小泡，使輕鏈結(jié)構(gòu)重新折疊，重新回到具有催化活性。

在低pH值下，A和B型肉毒毒素的HN域發(fā)生構(gòu)象上的變化，最終跨越人工膜形成離子通道，并且在體內(nèi)pH的環(huán)境下，形成的通道的活性是最大的。C型肉毒毒素在脂膜形成的離子通道與白喉毒素形成的相似，并且也是只在低pH下形成。肉毒毒素離子通道只允許陽離子通過，但是可以在體外阻止氯喹。然而對(duì)于小孔徑離子通道的研究，我們尚未清楚肉毒毒素形成的通道是不是毒素輕鏈進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)的必經(jīng)之路。數(shù)據(jù)顯示，在低 pH下輕鏈的結(jié)構(gòu)有一個(gè)戲劇性的變化，就是可能產(chǎn)生一個(gè)選擇性的LC結(jié)構(gòu)并且更適合于易位。盡管這在體內(nèi)還沒被證實(shí)，但是通過低pH誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)變化是完全可逆的。

肉毒毒素能夠在神經(jīng)傳遞發(fā)揮作用，就必須通過蛋白水解使LC與HN接頭處暴露的表面產(chǎn)生缺口，從而使非活性的單鏈分子量為150-kDa的毒素活化。少數(shù)的細(xì)菌和組織蛋白酶能夠?qū)崿F(xiàn)這個(gè)裂解反應(yīng)，并產(chǎn)生有活性的雙鏈神經(jīng)毒素。產(chǎn)生切口后，輕鏈和重鏈仍然通過非共價(jià)鍵相互作用，并且由一個(gè)單一的二硫鍵連接。這種鏈間的二硫鍵(A型肉毒毒素中的Cys430–Cys454)的減少是輕鏈活化的第二階段，這是輕鏈自由進(jìn)入運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞質(zhì)溶膠和與底物間相互作用必不可少的階段。正如前面提到的，在低pH情況下，輕鏈有一個(gè)戲劇性的變化。這種結(jié)構(gòu)的變化有助于易位帶（如果在易位點(diǎn)HN域確實(shí)是靠近輕鏈）的重組和導(dǎo)致輕鏈的最終活化。神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以與肉毒毒素-LC活動(dòng)密切聯(lián)系在一起的。因此，輕鏈活化的完成最終可能是發(fā)生在胞質(zhì)溶膠中的，緊接著從低pH的小室中易位。

3、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放

神經(jīng)小結(jié)處有突觸小囊泡，其中包含乙酰膽堿，它是能穿過神經(jīng)肌肉接頭刺激肌肉收縮的一種神經(jīng)遞質(zhì)。該乙酰膽堿的小囊泡被一個(gè)叫做SNARE復(fù)合體的蛋白聚合物所結(jié)合。為了穿過神經(jīng)肌肉交界處實(shí)現(xiàn)信號(hào)的傳遞，突觸前神經(jīng)小結(jié)中的乙酰膽堿小囊泡必須被釋放到突觸間隙中。在這里，神經(jīng)遞質(zhì)在肌肉板上結(jié)合到特定受體上，觸發(fā)離子通道打開，從而導(dǎo)致相鄰橫紋肌的去極化和收縮。乙酰膽堿的釋放，需要有SNARE 蛋白的參與，它能夠介導(dǎo)突觸小泡與神經(jīng)元細(xì)胞膜的融合。

SNARE復(fù)合體蛋白參與突觸小泡上質(zhì)膜融合，而肉毒毒素輕鏈的作用是阻礙胞吐作用。更具體地說，就是在肌肉接頭處，神經(jīng)毒素通過切割SNARE蛋白（乙酰膽堿分子胞吐作用所必須的物質(zhì)）阻斷了囊泡內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，抑制乙酰膽堿的釋放，從而抑制神經(jīng)傳遞。據(jù)證實(shí)，單獨(dú)的SNARE蛋白裂解不會(huì)妨礙SNARE復(fù)合體形成，但是卻會(huì)導(dǎo)致非功能性復(fù)合物在Ca²⁺內(nèi)流和融合之間的耦合被破壞。毒素在抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放時(shí)，需要Ca²⁺的參與，而在突觸末梢Ca²⁺濃度增加會(huì)影響肉毒毒素的作用效果。

輕鏈作為鋅肽鏈內(nèi)切酶蛋白切割致使SNARE復(fù)合物不穩(wěn)定，成為非功能性，從而抑制乙酰膽堿釋放到突觸間隙。囊泡釋放到突觸間隙的數(shù)量越少，動(dòng)作電位傳播的概率就越低，從而引起肌肉纖維的收縮。結(jié)果導(dǎo)致肌肉自身的化學(xué)去神經(jīng)術(shù)而引起弛緩性麻痹?，F(xiàn)有研究表明SNARE復(fù)合物由VAMP、SNAP-25和syntaxin三種蛋白質(zhì)組成，下表所示為不同類型的肉毒毒素的靶蛋白及其切割位點(diǎn)。

噬菌體展示技術(shù)的基本原理是把外源DNA插入噬菌體編碼外殼蛋白pIII或pVIiI的基因中，使外源DNA片斷對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的外殼蛋白中形成融合蛋白(fusion protein)，呈現(xiàn)在噬菌體表面。噬菌體展示技術(shù)的顯著優(yōu)點(diǎn)是：建立了基因型(genotype)和表型(phenotype)之間直接的物理聯(lián)系，從而使篩選簡(jiǎn)便高效。將外源蛋白或多肽表達(dá)于噬菌體表面，就可根據(jù)其性質(zhì)利用它與其他生物或非生物物質(zhì)的親和性對(duì)含目的基因的噬菌體進(jìn)行篩選。以噬菌體抗體庫(kù)的篩選為例，將Fab(fragment antigen binding)表達(dá)在噬菌體表面，以相應(yīng)的抗原為親和性配體篩選，可以快速高效地從大量克隆中篩選表達(dá)特異性抗體的噬菌體。因此，用噬菌體展示技術(shù)制備高親和性抗體與傳統(tǒng)的雜交瘤單克隆抗體技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

噬菌體抗體在膜表面表達(dá)，是通過Fab段或ScFv 與單鏈?zhǔn)删w外殼蛋白形成融合蛋白而完成。其特點(diǎn)是“ 它既可識(shí)別相應(yīng)的抗原并與其結(jié)合，又能夠感染宿主菌進(jìn)行再擴(kuò)增”。利用其可再擴(kuò)增的特性，以靶抗原通過親和吸附-洗脫-擴(kuò)增，可篩選到靶分子的配體肽鏈。再經(jīng)突變和鏈置換方法改進(jìn)抗體親和力，最終便獲得高親和力的特異性抗體。噬菌體抗體庫(kù)的篩選包括兩個(gè)主要步驟：淘篩和鑒定。淘篩是將噬菌體抗體庫(kù)與選擇用的抗原共同孵育，通過幾輪洗脫，收集結(jié)合的噬菌體。將獲得的噬菌體感染細(xì)菌并擴(kuò)增，再進(jìn)行下一輪的淘篩。經(jīng)幾輪淘篩后，便可富集到與抗原特異性結(jié)合的噬菌體感染的多克隆菌株。鑒定過程是從噬菌體感染的多克隆菌株中挑選出單克隆菌株。即將淘篩出的噬菌體感染細(xì)菌、鋪板、挑選，即可得到高特異性單克隆菌株。

從噬菌體抗體庫(kù)中篩選表達(dá)特異性抗體的噬菌體的經(jīng)典方法主要有兩種：(1)將純抗原包被在固相介質(zhì)上，如酶標(biāo)板、免疫試管或親和層析柱，然后加入待篩選的噬菌體，洗去非親和性或低親和性的噬菌體，回收高親和性的噬菌體。(2)將抗原與生物素基團(tuán)相連，再將其固定在包被有streptavidin的順磁珠上對(duì)噬菌體進(jìn)行篩選。兩種方法中均需加脫脂牛奶(或BSA，其效果較差)封閉未被抗原占據(jù)的位點(diǎn)，以避免噬菌體非特異性的結(jié)合。對(duì)于前一方法，回收與抗原特異性結(jié)合的噬菌體可用堿性溶液(如三乙基胺，(triethy—lamine)或酸性溶液(如甘氨酸一鹽酸，glycine_HCl)洗脫，或用可溶的抗原或半抗原洗脫；對(duì)于后一方法，用二巰基蘇糖醇(dithiothret01，DTT)通過破壞抗原與生物素之間的二硫鍵來洗脫?；厥盏氖删w感染宿主菌，增殖后進(jìn)行下一輪篩選。一般經(jīng)過3—5輪這樣的篩選可得到表達(dá)高親和性的目的抗體的克隆。每一輪篩選都需要進(jìn)行檢測(cè)，以證實(shí)篩選的有效性。

英國(guó)MRC HGMP資源中心創(chuàng)建的Human Single Fold scFv Libraries I+J( Tomlinson I + J)是當(dāng)今成熟的全人源噬菌體抗體庫(kù)，其庫(kù)容超過10⁸全人源噬菌體單鏈抗體，本研究利用該噬菌體庫(kù)淘選特異性抗A型肉毒毒素單鏈抗體，并對(duì)陽性單鏈抗體進(jìn)行系統(tǒng)分析，以期創(chuàng)制A型肉毒毒素中毒治療抗體類藥物奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

本發(fā)明人通過對(duì)肉毒毒素的作用機(jī)理的了解及研究，確定肉毒毒素能夠引起人畜共患病，且主要攻擊體內(nèi)的神經(jīng)突觸系統(tǒng)，其致病機(jī)理為，肉毒毒素通過其重鏈C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合于膽堿能神經(jīng)元的突觸前膜，形成毒素受體復(fù)合物內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞囊泡，然后輕鏈鋅內(nèi)肽酶酶活性區(qū)從細(xì)胞內(nèi)的酸性空間釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。一旦從囊泡中釋放出來，輕鏈通過切割SNARE復(fù)合物蛋白來阻止乙酰膽堿的釋放，引起肌肉麻痹。因此輕鏈為主要的致病部位。目前，世界上中毒還是以A型居多，這是由于A型毒素在美容領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的增加，其中毒的風(fēng)險(xiǎn)和幾率也相應(yīng)增加。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為解決異源性血清抗體在治療A型肉毒毒素中毒，存在引起免疫反應(yīng)或傳染疾病的問題，而提供一種全人源的單鏈抗體ScFv，抗A型肉毒毒素的人源單鏈抗體E3-scFv。

抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體E3-scFv，其堿基序列如序列表SEQ ID NO.7所示；

抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體E3-scFv，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；

抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體E3-scFv在生產(chǎn)治療A型肉毒毒素酶中毒藥物方面的應(yīng)用；

抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體E3-scFv在檢測(cè)A型肉毒毒素方面的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體E3-scFv，它是利用人工合成的重組蛋白BontA輕鏈蛋白，及篩選抗A型肉毒毒素酶的人源單鏈抗體的底物GFP-HIS6-SNAP25（62）-VAMP（57）-C，人源化抗A型肉毒毒素酶抗體庫(kù)中篩選出來的，親和常數(shù)為（1.92±0.47）×10⁷L/mol，為生產(chǎn)抗A 型肉毒毒素特效救治藥物及快速檢測(cè)A型肉毒毒素奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為雙酶切重組質(zhì)粒pET-28(a)-BoNT/AL質(zhì)粒鑒定結(jié)果；1.3.5.7為pET-28(a)-BoNT/AL切前；2.4.6.8質(zhì)粒酶切后；M. DNA marker DL2000；

圖2為重組蛋白表達(dá)形式鑒定其中：1.3.5.7分別為37℃、陰性對(duì)照、25℃、30℃誘導(dǎo)上清；2、4、6、8：37 ℃、陰性對(duì)照、25 ℃、 30℃誘導(dǎo)沉淀；M：蛋白質(zhì)Marker；

圖3為重組蛋白包涵體洗滌的SDS-PAGE結(jié)果分析；其中：1-3：0.5%、1%、2%Trition洗滌上清；4-9：1mol、2mol、3mol、4mol、6mol、8molUrea洗滌上清；10-12： 4mol、 6mol、8molUrea洗滌沉淀樣品；M：蛋白質(zhì)Marker；

圖4為重組蛋白純化產(chǎn)物SDS-PAGE結(jié)果分析；1：0.1mol/LNaOH ；2：200mmol/L咪唑洗脫樣品；3-4：50 mmol/L咪唑洗脫峰2、峰1；5-6：20 mmol/L咪唑洗脫峰2、峰1；7：流川；8：原樣；M：蛋白Marker；

圖5重組蛋白復(fù)性結(jié)果分析，1：復(fù)性蛋白；M：蛋白Marker；

圖6純化后E3-scFv SDS-PAGE結(jié)果分析；1:流穿 2:55%硫酸銨原樣 3:純化后scFv。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：A型肉毒毒素輕鏈基因與PET-28a載體連接

以pGEM-BontA質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)特異性引物如下：

P1_A:5′-CATGCATATGAATAAACAATTTAATTATAAAGATC-3′

P2_A:5′- CGGAATTCTTAATTGTATCCTTTATCTAATGATT-3′

PCR合成兩端插入EcoR和Nde酶切位點(diǎn)的BontAL基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析后回收目的片段。經(jīng)測(cè)序其堿基序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

將EcoR和Nde雙酶切的載體PET-28a大片段與目的基因BontAL小片段回收，并用T4 DNA連接酶連接，得到重組質(zhì)粒PET-28a-BontAL，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，含kan抗性的瓊脂糖平板進(jìn)行初步篩選。挑選單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；用質(zhì)?；厥赵噭┖刑崛≠|(zhì)粒。

用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，并送檢測(cè)序鑒定。瓊脂糖凝膠電泳分析酶切前后條帶位置變化，并且在預(yù)期目的條帶位置處有相應(yīng)大小的片段（見圖1）。證明目的基因已連接至載體上，成功構(gòu)建PET-28a-BontAL。

實(shí)施例2：重組蛋白PET-28a-BontAL表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果分析

將重組質(zhì)粒PET-28a-BontAL轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌-大腸桿菌BL21（DE3），不同溫度條件下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE結(jié)果顯示：37℃、30℃沉淀中重組蛋白PET-28a-BontAL在50KD左右處有一明顯表達(dá)帶，大小與理論值相符；見圖2；并且絕大部分蛋白位于沉淀中，因此此目的蛋白為包涵體表達(dá)。

實(shí)施例3：包涵體蛋白BontAL的洗滌

包涵體的純化處理，首先對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌，除去部分雜質(zhì)，然后溶解打開包涵體，使聚合在一起的蛋白彼此在裂解液的條件下打開分離，然后進(jìn)一步純化目的蛋白。

用不同含量的Trition對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌，Trition變形能力弱，只能起到初步洗滌的作用。隨后逐步增加尿素濃度，漸進(jìn)的洗滌打開包涵體，SDS-PAGE分析得到，2%的Trition能夠去除部分雜質(zhì)，2M尿素也有此作用，4M尿素開始目的蛋白開始分離，8M尿素能夠完全打散包涵體，如圖3。

實(shí)施例4：包涵體蛋白BontAL的純化和復(fù)性

經(jīng)8M尿素溶解的包涵體，上清經(jīng)金屬螯合層析Cu²⁺柱，收集200mmol咪唑洗脫蛋白。SDS-PAGE分析如圖4，除去了大部分雜質(zhì)；用逐步透析復(fù)性的方法，每隔12個(gè)小時(shí)更換透析液，直至完全透析至Tris中，用金屬螯合層析Cu²⁺進(jìn)行濃縮。蛋白透析至PBS中。SDS-PAGE鑒定如圖5，復(fù)性蛋白純度以達(dá)到。

實(shí)施例5：全人源抗Bont-AL-scFv抗體的篩選

純化的重組蛋白為抗原包被于96孔酶標(biāo)板上，4℃過夜。次日棄上清，用2%的Milk-PBS 37℃封閉2h，加入噬菌體抗體庫(kù)（噬菌體庫(kù)原始來源：Source bioscience（英國(guó)），中國(guó)經(jīng)銷商：北京西美科技有限公司），滴度為1.0×10¹³，室溫下劇烈晃動(dòng)孵育60min，靜置60min。后棄去液體，用含0.1%Twenn-20的PBS洗滌10次，洗滌后將每孔中殘留的液體輕輕拍干，每孔加入50μL洗脫液（5mg/mL的胰酶-PBS），室溫下劇烈晃動(dòng)10min，洗脫噬菌體，收集4℃保存。

用洗脫下的噬菌體侵染E.coli TG1，并涂布于TYE平板上（含100μg/mLAmp和1%的葡萄糖）37℃過夜培養(yǎng)。利用輔助噬菌體KM13擴(kuò)增噬菌體庫(kù)，通過PEG/NaCl回收噬菌體。重復(fù)以上過程3次，共4輪篩選，收集篩選的噬菌體庫(kù)。

實(shí)施例6：抗Bont-AL-scFv陽性菌株鑒定

篩選后的噬菌體侵染E.coli HB2151，誘導(dǎo)表達(dá)后，利用ELISA鑒定，置酶標(biāo)儀測(cè)定OD值（波長(zhǎng)為490nm），每個(gè)樣品做雙孔測(cè)定，取OD平均值。以2%Milk-PBS為陰性對(duì)照，陽性克隆菌株確定標(biāo)準(zhǔn)為：OD值為陰性對(duì)照的3倍以上，共獲得27株陽性克隆菌株。

陽性菌株生物活性檢測(cè)，將GFP-SNAP25-VAMP（氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，其基因序列SEQ ID NO.3所示）用包被液稀釋，每孔包被30μg于檢測(cè)板（Pierce Maleimide Activated 96-well Plates,Black,15153）中，4℃過夜，用Wash buffer洗滌3次，將27株陽性菌株，誘導(dǎo)表達(dá)離心后，將100μL上清和6 μg Bont-AL混勻，加入到檢測(cè)板中，37℃作用2h，每份樣品做雙孔測(cè)定，再用Wash buffer洗滌3次，在多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)熒光強(qiáng)度，得出2株活性較好的菌株。按照Tomlinson I+J試劑盒上的pIT-2載體的基因序列，合成兩條特異性PCR引物擴(kuò)增scFv全基因片段。

P1 LMB3: 5’—CAG GAA ACA GCT ATG AC—3’

P2 pHEN: 5’ —CTA TGC GGC CCC ATT CA—3’

經(jīng)檢測(cè)2株陽性菌株，均能夠出現(xiàn)明顯867bp條帶，含有完整的scFv。

測(cè)序鑒定其序列并經(jīng)Blast數(shù)據(jù)庫(kù)分析得出：得出2株陽性菌株均為人源單鏈抗體，分析如下：

D2-scFv

M K Y L L P T A A A G L L

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實(shí)施例7：抗Bont-AL-scFv純化以及抗體親和常數(shù)KD值測(cè)定

2株強(qiáng)陽性克隆菌株在37℃培養(yǎng)，至OD600到0.9，加入誘導(dǎo)劑30℃培養(yǎng)過夜（16h），過夜培養(yǎng)物4℃，3500×g離心30min，上清為表達(dá)的scFv，大小為31000。誘導(dǎo)上清先后經(jīng)過55%飽和度硫酸銨沉淀和rProtein-A親和層析后，得到純度在90%以上的樣品；利用非競(jìng)爭(zhēng)酶免疫法測(cè)定D2和E3單鏈抗體的親和常數(shù)，分別以4 μg/mL、2μg/mL、1μg/mL和0.5 μg/mL包被Bont-AL，將單鏈抗體濃度調(diào)整到10^-6 mol/L，倍比稀釋1:2~1:512，用1:5000倍稀釋的Protein A-HRP抗體作為二抗，OPD顯色，測(cè)定OD490nm吸光值，每個(gè)樣品做雙孔測(cè)定，取OD平均值。根據(jù)抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的S形曲線圖，能夠求解出在不同抗原濃度下板書吸光值的抗體濃度，帶入到公式KA=（n-1）/2(nAb’-Ab)計(jì)算親和常數(shù)，其中Ab’和Ab表示當(dāng)抗原為Ag’和Ag時(shí)，產(chǎn)生半數(shù)吸光值的抗體濃度（mol/L），n=Ag/Ag’，當(dāng)n=2時(shí)可以得到3個(gè)KA值，n=4時(shí)可得2個(gè)KA值，n=8時(shí)得1個(gè)KA值，把六個(gè)KA值取平均數(shù)就是最終的親和常數(shù)數(shù)值。

從下表看出D2單鏈抗體的親和常數(shù)為（6.89±0.65）×10⁶L/mol，E3的親和常數(shù)為（1.92±0.47）×10⁷L/mol。

<110> 中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所

<120> 抗A型肉毒毒素的人源單鏈抗體E3-scFv及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggatcctg taaatggtgt tgatattgct tatataaaaa ttccaaatgc aggacaaatg 120

caaccagtaa aagcttttaa aattcataat aaaatatggg ttattccaga aagagataca 180

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tcatattatg attcaacata tttaagtaca gataatgaaa aagataatta tttaaaggga 300

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atagtaaggg gaataccatt ttggggtgga agtacaatag atacagaatt aaaagttatt 420

gatactaatt gtattaatgt gatacaacca gatggtagtt atagatcaga agaacttaat 480

ctagtaataa taggaccctc agctgatatt atacagtttg aatgtaaaag ctttggacat 540

gaagttttga atcttacgcg aaatggttat ggctctactc aatacattag atttagccca 600

gattttacat ttggttttga ggagtcactt gaagttgata caaatcctct tttaggtgca 660

ggcaaatttg ctacagatcc agcagtaaca ttagcacatg aacttataca tgctggacat 720

agattatatg gaatagcaat taatccaaat agggttttta aagtaaatac taatgcctat 780

tatgaaatga gtgggttaga agtaagcttt gaggaactta gaacatttgg gggacatgat 840

gcaaagttta tagatagttt acaggaaaac gaatttcgtc tatattatta taataagttt 900

aaagatatag caagtacact taataaagct aaatcaatag taggtactac tgcttcatta 960

cagtatatga aaaatgtttt taaagagaaa tatctcctat ctgaagatac atctggaaaa 1020

ttttcggtag ataaattaaa atttgataag ttatacaaaa tgttaacaga gatttacaca 1080

gaggataatt ttgttaagtt ttttaaagta cttaacagaa aaacatattt gaattttgat 1140

aaagccgtat ttaagataaa tatagtacct aaggtaaatt acacaatata tgatggattt 1200

aatttaagaa atacaaattt agcagcaaac tttaatggtc aaaatacaga aattaataat 1260

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gtaagaggga taataacttc taaaactaaa tcattagata aaggatacaa ttaa 1374

<160> 2

<210> 2

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

5 10 15

Arg Gly Ser His Met Asp Pro Val Asn Gly Val Asp Ile Ala Tyr Ile

20 25 30

Lys Ile Pro Asn Ala Gly Gln Met Gln Pro Val Lys Ala Phe Lys Ile

35 40 45

His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg Asp Thr Phe Thr Asn Pro

50 55 60

Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu Ala Lys Gln Val Pro Val

65 70 75 80

Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr Asp Asn Glu Lys Asp Asn

85 90 95

Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu Arg Ile Tyr Ser Thr Asp

100 105 110

Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val Arg Gly Ile Pro Phe Trp

115 120 125

Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys Val Ile Asp Thr Asn Cys

130 135 140

Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr Arg Ser Glu Glu Leu Asn

145 150 155 160

Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile Ile Gln Phe Glu Cys Lys

165 170 175

Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr Arg Asn Gly Tyr Gly Ser

180 185 190

Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe Thr Phe Gly Phe Glu Glu

195 200 205

Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu Gly Ala Gly Lys Phe Ala

210 215 220

Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu Leu Ile His Ala Gly His

225 230 235 240

Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn Arg Val Phe Lys Val Asn

245 250 255

Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu Val Ser Phe Glu Glu

260 265 270

Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys Phe Ile Asp Ser Leu Gln

275 280 285

Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys Phe Lys Asp Ile Ala

290 295 300

Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val Gly Thr Thr Ala Ser Leu

305 310 315 320

Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys Tyr Leu Leu Ser Glu Asp

325 330 335

Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu Lys Phe Asp Lys Leu Tyr

340 345 350

Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp Asn Phe Val Lys Phe Phe

355 360 365

Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe Asp Lys Ala Val Phe

370 375 380

Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr Thr Ile Tyr Asp Gly Phe

385 390 395 400

Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe Asn Gly Gln Asn Thr

405 410 415

Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu Lys Asn Phe Thr Gly Leu

420 425 430

Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg Gly Ile Ile Thr Ser Lys

435 440 445

Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn

450 455

<210> 3

<211> 1112

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

ccatggtgag caagggcgag gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg 60

acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct 120

acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca 180

ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga 240

agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct 300

tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc 360

tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc 420

acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga 480

acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg 540

ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc 600

actacctgag cacccagtcc gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg 660

tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagg 720

gatcccatca tcatcatcat catatggatg aaaacctaga gcaggtgagc ggcatcatcg 780

ggaacctccg tcacatggcc ctggatatgg gcaatgagat cgatacacag aatcgccaga 840

tcgacaggat catggagaag gctgattcca acaaaaccag aattgatgag gccaaccaac 900

gtgcaacaaa gatgctggga agtggtgaat tcgcccaggt ggatgaggtg gtggacatca 960

tgagggtgaa cgtggacaag gtcctggagc gagaccagaa gctgtcggag ctggacgacc 1020

gtgcagatgc actccaggcg ggggcctccc agtttgaaac aagcgcagcc aagctcaagc 1080

gcaaatactg gtggaaaaac tgctaaaagc tt 1112

<210> 4

<211> 365

<212> PRT

<213> 人工

<400> 4

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile The Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly

225 230 235 240

Ser His His His His His His Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser

245 250 255

Gly Ile Ile Gly Asn Leu Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu

260 265 270

Ile Asp Thr Gln Asn Arg Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp

275 280 285

Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met

290 295 300

Leu Gly Ser Gly Glu Phe Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met

305 310 315 320

Arg Val Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu

325 330 335

Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu

340 345 350

Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys

355 360 365

<210> 5

<211> 858

<212> DNA

<213> 人工

<400> 5

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60

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ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt ggcgggtcga cggacatcca gatgacccag 480

tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagt 540

cagagcatta gcagctattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc 600

ctgatctatc gtgcatcctc tttgcaacca tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca 660

gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa 720

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<212> PRT

<213> 人工

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Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

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Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

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Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Arg His Gly Thr Ile Thr

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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Leu Ala Thr Thr Phe Asp Tyr Trp

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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln Met Thr Gln

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Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr

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<212> PRT

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Ala

289