本發(fā)明涉及一種β-谷甾醇，尤其是涉及一種銅藻β-谷甾醇化合物及其提取方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抑郁癥又稱抑郁障礙，以顯著持久的心境低落為主要臨床特征，是心境障礙的主要類型，臨床可見心境低落與其處境不相稱，情緒的消沉可以從悶悶不樂到悲痛欲絕，自卑抑郁，甚至悲觀厭世，可有自殺企圖或行為，甚至發(fā)生木僵，部分病例有明顯的焦慮和運動性激越，嚴(yán)重者出現(xiàn)幻覺、妄想等精神病癥狀。抑郁癥會對人的消化、免疫及神經(jīng)系統(tǒng)等機(jī)能產(chǎn)生影響，甚至造成損失，并且該疾病具有高發(fā)病率、難治愈和高復(fù)發(fā)率等特點。

目前臨床應(yīng)用中已有多種藥物可供抗抑郁癥使用，如阿米替平、氯米帕明、嗎氯貝胺、氟西汀、帕羅西汀、舍曲林、西酞普蘭等，盡管這些藥物都能夠在不同程度上用于治療或緩解各種抑郁癥病人的痛苦，但其存在副作用和難受性，從而限制了它們的長期使用。為了消除或降低毒副作用，改善治療效果，需要具有新的結(jié)構(gòu)特征和新的作用機(jī)理的新型化合物。

海洋是地球上資源最豐富的領(lǐng)域，海洋的特殊生態(tài)環(huán)境造就了海洋生物種類的多樣性和特殊性，使海洋生物的很多特性和所含化合物的特異性是陸生生物不具有的。海洋生物藥是指從海洋動植物中提取的藥物，海洋中豐富的海產(chǎn)動植物不僅為人類提供了大量的水產(chǎn)食品，也為人類提供了許多藥物，而且許多海洋藥物療效顯著、價格低廉、作用獨特，因此研究海洋藥物具有十分重要的意義。海藻能產(chǎn)生豐富的、結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物，戰(zhàn)一直吸引著海洋化學(xué)家和藥物學(xué)家們濃厚的研究興趣。銅藻Sargassu homed作為褐藻的一種，在我國沿海地區(qū)有著廣泛的分布，資源豐富，民間可全藻用藥。從天然植物、動物中尋找抗抑郁活性強(qiáng)、毒副作用極低的藥物已成為國內(nèi)外天然藥物開發(fā)利用研究的熱點。特別是近年來對其化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性的相關(guān)性研究越來越受重視，這對從自然界中尋找黃酮先導(dǎo)化合物和進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造或修飾，以及對創(chuàng)制新藥都具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的是為了提供一種銅藻β-谷甾醇化合物。

本發(fā)明還提供了一種銅藻β-谷甾醇化合物提取方法，工藝步驟簡單，對設(shè)備要求低，成本低。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明的一種銅藻β-谷甾醇化合物，其特征在于，所述銅藻β-谷甾醇化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下式所示：

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一種銅藻β-谷甾醇化合物提取方法，具體步驟為：取干燥的銅藻，粉碎后在95%的乙醇中浸泡2~3h，過濾；提取液減壓濃縮除鹽后得粗提物；粗提物用蒸餾水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，得石油醚部分浸膏，取其中浸，用300~400目硅膠柱層析，石油醚-丙酮梯度反復(fù)洗脫，Sephasex LH-20純化，分別得到白色固體物質(zhì)（石油醚：丙酮=15：1）， 所得化合物經(jīng)過IR， 1H-NMR， 13C-NMR， MS確定結(jié)構(gòu)，即為銅藻β-谷甾醇化合物。本發(fā)明的提取方法工藝步驟簡單，對設(shè)備要求低，成本低。

一種銅藻β-谷甾醇化合物在抗抑郁藥物組合物中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述抗抑郁藥物組合物包括作為活性組分的銅藻β-谷甾醇化合物，和至少一種藥用賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物特別指適合口服、非腸道（靜脈或皮試）和鼻內(nèi)途徑給藥的那些片劑或糖衣片劑、舌下片劑、明膠膠囊、栓劑、霜劑、軟膏劑、皮膚用凝膠劑、可注射制劑或可飲用懸浮液等，特別提及適合口服、非腸道（靜脈或皮試）和鼻內(nèi)途徑給藥的那些片劑或糖衣片劑、舌下片劑、明膠膠囊、栓劑、霜劑、軟膏劑、皮膚用凝膠劑、可注射制劑或可飲用懸浮液等。

作為優(yōu)選，所述藥用賦形劑為惰性無毒賦形劑。

因此，本發(fā)明具有如下有益效果：

（1）提供了一種銅藻β-谷甾醇化合物，其原料來源豐富、低廉，制備方法簡單，可制成各種劑型的抗抑郁藥物或者與其他藥物共同組方，制成多靶點抗抑郁的復(fù)方藥物，見效快、毒副作用?。═D50>2000mg/kg）、能夠長期使用，顯示出具有價值的作為抗抑郁的藥理性質(zhì)作用；

（2）提供了一種銅藻β-谷甾醇化合物提取方法，工藝步驟簡單，對設(shè)備要求低，成本低。

附圖說明

圖1是小鼠強(qiáng)迫游泳實驗測試結(jié)果。

圖2是小鼠懸尾實驗測試結(jié)果。

圖3是小鼠開放性實驗測試結(jié)果。

具體實施方式

下面通過具體實施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。

在本發(fā)明中，若非特指，所有百分比均為重量單位，所有設(shè)備和原料均可從市場購得或是本行業(yè)常用的，下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。

實施例1

一種銅藻β-谷甾醇化合物提取方法，具體步驟為：取干燥的銅藻，粉碎后在95%的乙醇中浸泡2.5h，過濾；提取液減壓濃縮除鹽后得粗提物；粗提物用蒸餾水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，得石油醚部分浸膏，取其中浸，用380目硅膠柱層析，石油醚-丙酮梯度反復(fù)洗脫，Sephasex LH-20純化，分別得到白色固體物質(zhì)（石油醚：丙酮=15：1），所得化合物經(jīng)過IR， 1H-NMR， 13C-NMR， MS確定結(jié)構(gòu)，熔點：Mp. 136.7-138.4 °C; IR (KBr) cm^-1: 3397, 2932, 1644, 1470, 1341, 1050; ¹H-NMR (CDCl_3, 500 MHz): δ 0.78 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, d, H-21), 1. 08 (3H, s, H-19), 1.61 (3H, t, H-29), 2. 18 (1H, m, H-25), 3.60 (1H, m, H-3), 5.41 (1H, br d, J=5.12 Hz, H-6), 10.2 (1H, s, -OH); ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 141.21, 120.97, 72.06, 58.34, 56.76, 49.98, 47.13, 44.35, 41.98, 37.43, 37.21, 36.35, 34.09, 32.12, 32.01, 31.88, 30.46, 29.89, 28.02, 27.24, 27.28, 25.90, 23.71, 22.80, 21.35, 21.07, 19.89, 18.78, 12.77; ESI-HRMS calcd for C₂₉H₅₀O⁺ ([M+H]⁺): 415.3862; found: 415.3858。

得到的化合物為銅藻β-谷甾醇化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

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實施例2

一種銅藻β-谷甾醇化合物提取方法，具體步驟為：取干燥的銅藻，粉碎后在95%的乙醇中浸泡2h，過濾；提取液減壓濃縮除鹽后得粗提物；粗提物用蒸餾水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，得石油醚部分浸膏，取其中浸，用300目硅膠柱層析，石油醚-丙酮梯度反復(fù)洗脫，Sephasex LH-20純化，分別得到白色固體物質(zhì)（石油醚：丙酮=15：1）， 所得化合物經(jīng)過IR， 1H-NMR， 13C-NMR， MS確定結(jié)構(gòu)，熔點：Mp. 136.7-138.4 °C; IR (KBr) cm^-1: 3397, 2932, 1644, 1470, 1341, 1050; ¹H-NMR (CDCl_3, 500 MHz): δ 0.78 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, d, H-21), 1. 08 (3H, s, H-19), 1.61 (3H, t, H-29), 2. 18 (1H, m, H-25), 3.60 (1H, m, H-3), 5.41 (1H, br d, J=5.12 Hz, H-6), 10.2 (1H, s, -OH); ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 141.21, 120.97, 72.06, 58.34, 56.76, 49.98, 47.13, 44.35, 41.98, 37.43, 37.21, 36.35, 34.09, 32.12, 32.01, 31.88, 30.46, 29.89, 28.02, 27.24, 27.28, 25.90, 23.71, 22.80, 21.35, 21.07, 19.89, 18.78, 12.77; ESI-HRMS calcd for C₂₉H₅₀O⁺ ([M+H]⁺): 415.3862; found: 415.3858。

得到的化合物為銅藻β-谷甾醇化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

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實施例3

一種銅藻β-谷甾醇化合物提取方法，具體步驟為：取干燥的銅藻，粉碎后在95%的乙醇中浸泡3h，過濾；提取液減壓濃縮除鹽后得粗提物；粗提物用蒸餾水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，得石油醚部分浸膏，取其中浸，用400目硅膠柱層析，石油醚-丙酮梯度反復(fù)洗脫，Sephasex LH-20純化，分別得到白色固體物質(zhì)（石油醚：丙酮=15：1），所得化合物經(jīng)過IR， 1H-NMR， 13C-NMR， MS確定結(jié)構(gòu)，熔點：Mp. 136.7-138.4 °C; IR (KBr) cm^-1: 3397, 2932, 1644, 1470, 1341, 1050; ¹H-NMR (CDCl_3, 500 MHz): δ 0.78 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, d, H-21), 1. 08 (3H, s, H-19), 1.61 (3H, t, H-29), 2. 18 (1H, m, H-25), 3.60 (1H, m, H-3), 5.41 (1H, br d, J=5.12 Hz, H-6), 10.2 (1H, s, -OH); ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ 141.21, 120.97, 72.06, 58.34, 56.76, 49.98, 47.13, 44.35, 41.98, 37.43, 37.21, 36.35, 34.09, 32.12, 32.01, 31.88, 30.46, 29.89, 28.02, 27.24, 27.28, 25.90, 23.71, 22.80, 21.35, 21.07, 19.89, 18.78, 12.77; ESI-HRMS calcd for C₂₉H₅₀O⁺ ([M+H]⁺): 415.3862; found: 415.3858。

得到的化合物為銅藻β-谷甾醇化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：

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下面通過具體的抗抑郁藥理實驗以評價本發(fā)明的抗抑郁效力和安全性：

實驗材料：健康Balb/e小鼠，雄性，體重20±2g，由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供，飼養(yǎng)于25℃條件下。實驗期間保持自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為23±1℃，濕度為55±5％，適應(yīng)性喂養(yǎng)5-7天后進(jìn)行實驗，每只動物僅使用一次。

陽性對照藥物：FLU（氟西汀），購于美國 Lilly 公司，下列試驗2.1、2.2中的藥物使用前氟西汀用生理鹽水配置成溶液，β-谷甾醇(β-sitosterol)用DMSO配成溶液用于腹腔注射。所有實驗均于下午1點至5點之間進(jìn)行。

（一）小鼠強(qiáng)迫游泳實驗

將Balb/e小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，即空白對照組、陽性藥物組 (氟西汀，10 mg/kg)、β-谷甾醇(β-sitosterol)高(30 mg/kg)、中(20 mg/kg)、低(10 mg/kg)劑量組。各組均按0.10 mL/20g體重腹腔注射給藥，空白對照組注射等量的DMSO。

腹腔注射給藥30分鐘后，將小鼠放入XSC-小鼠恒溫游泳儀內(nèi)(水深10cm、直徑34cm的桶內(nèi)，水溫23 ± 2℃)，觀察6分鐘內(nèi)小鼠游泳情況，統(tǒng)計小鼠后4分鐘內(nèi)游泳累積不動時間(不動即小鼠停止掙扎或小鼠呈漂浮狀態(tài)，小鼠四肢有輕微動作以保持頭部在水面)。

實驗結(jié)果如圖1所示，可見該新型查爾酮化合物的抗抑郁活性與陽性藥物對照FLU（氟西?。┫嗨?，而且神經(jīng)毒性很低（TD₅₀>2000mg/kg），安全性很高。β-谷甾醇(β-sitosterol)腹腔注射在30 mg/kg劑量下與空白對照組相比具有顯著性差異（p<0.001），其中腹腔注射30 mg/kg劑量時，其抑制不動時間與陽性藥物對照組相似。

（二）小鼠旋尾實驗

將 ZCR 小鼠隨機(jī)分成5組，每組8只，即空白對照組、陽性藥物組 (氟西汀，10 mg/kg)、β-谷甾醇(β-sitosterol)高(30 mg/kg)、中(20 mg/kg)、低(10 mg/kg)劑量組。各組均按0.10 mL/20g體重腹腔注射給藥，空白對照組注射等量的DMSO。

腹腔注射給藥30分鐘后，距小鼠尾尖部約2 cm處用膠布貼于懸尾箱(30 cm×30 cm×25 cm)支架上，使小鼠成倒掛狀態(tài)，其頭部離箱底約5cm，1次懸掛2只小鼠，中間用隔板隔開。懸掛時間為6分鐘，統(tǒng)計小鼠后4分鐘內(nèi)懸尾累積不動時間(不動狀態(tài)即小鼠停止掙扎不動或無任何活動)。

實驗結(jié)果如圖2所示，可見該新型查爾酮化合物在30 mg/kg劑量下與空白對照組相比具有顯著性差異（p<0.001），其中30mg/kg組誘導(dǎo)不動時間與陽性藥物相似，說明本發(fā)明的具有抗抑郁活性。

（三）小鼠開放性實驗

開放性實驗主要用于評估實驗動物的自主活動行為，本實施例中開放實驗裝置為一個不透明的塑料箱子（80cm×60cm×30cm），塑料箱底部劃分為48個10cm×10cm大小的正方形格子，將塑料箱置于安靜的房間內(nèi)，用60W燈泡給予光照，燈泡高于塑料箱中心1m左右。

取雄性小鼠20只，隨機(jī)分為2組，每組8只，分別為空白對照組和藥物組。測試前30 min，將β-谷甾醇(β-sitosterol)化合物溶于DMSO溶液中，以10 mg/kg的劑量腹腔注射0.10 mL/20g，空白對照組腹腔注射同體積的DMSO溶液。將小鼠置于塑料箱底中心方格內(nèi)，手動記錄移動次數(shù)（四肢均穿過方格）和豎立次數(shù)（用后肢站立），記錄3min。

實驗結(jié)果如圖3所示，實驗結(jié)果顯示小鼠自主活動次數(shù)與對照組相比沒有明顯的變化，說明該β-谷甾醇(β-sitosterol)不會改變小鼠的自主活動，排除了β-谷甾醇(β-sitosterol)化合物的抗抑郁假陽性。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。