本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種利用單鏈特異性核酸酶(Single-StrandSpecificNuclease，SSSN)檢測(cè)microRNA含量的方法。
背景技術(shù)：
：microRNA的超小尺寸與體液中的超低濃度使許多優(yōu)秀的檢測(cè)技術(shù)對(duì)其也“無(wú)可奈何”。近期，基于核酸雜交的microRNA芯片技術(shù)因?yàn)槠淇梢詫?shí)現(xiàn)快速、高通量microRNA檢測(cè)而得到極大發(fā)展。但是microRNA的超小尺寸使得芯片上探針與目標(biāo)microRNA雜交的嚴(yán)格性降低；且雜交過(guò)程中產(chǎn)生的堿基錯(cuò)配或部分互補(bǔ)會(huì)引起診斷結(jié)果的假陽(yáng)性率升高。SSSN酶是一類(lèi)高度選擇性切除單鏈核酸或雙鏈核酸中單鏈區(qū)域的單鏈特異性核酸酶。SSSN酶具有特異性識(shí)別并切割異源雙鏈雜交或點(diǎn)突變導(dǎo)致的堿基錯(cuò)配以及不能配對(duì)的堿基插入/缺失造成的部分互補(bǔ)的能力。這種能力使其被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的研究中，例如：測(cè)定核酸結(jié)構(gòu)，繪制突變圖譜，研究核酸與其他化學(xué)試劑相互作用的機(jī)制等；而細(xì)胞內(nèi)的一些SSSN酶則參與了基因的復(fù)制、重組、修復(fù)以及突變。由于用途廣泛，科研人員已經(jīng)從不同來(lái)源分離出了30多種SSSN酶；但是，目前僅有S1核酸酶(S1Nuclease)、綠豆芽核酸酶(MungBeanNuclease)、P1核酸酶(P1Nuclease)、BAL31核酸酶(BAL31Nuclease)、核糖核酸酶A(RibonucleaseA)等核酸酶得到了廣泛研究和商品化應(yīng)用?；赟SSN酶的獨(dú)特能力，應(yīng)用這種核酸酶進(jìn)行核酸分析檢測(cè)已成為目前科研的一個(gè)熱點(diǎn)。因此，應(yīng)用一種常用的SSSN酶，在其特殊能力的輔助下，開(kāi)發(fā)出一套靈敏且可靠的microRNA標(biāo)志物檢測(cè)新技術(shù)是切實(shí)可行的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種利用SSSN酶檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有目標(biāo)microRNA的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：1)制備目標(biāo)microRNA探針；所述目標(biāo)microRNA探針為：NH2-A-B-生物素；所述A為(CH2)n，其中，n為6-12的整數(shù)；所述B為與所述目標(biāo)microRNA反向互補(bǔ)的單鏈DNA分子；單鏈DNA分子的5’端與(CH2)n連接，單鏈DNA分子的3’端與生物素連接。2)將所述目標(biāo)microRNA探針、待測(cè)樣本、SSSN酶依次加入酶標(biāo)板各孔中，得到反應(yīng)后酶標(biāo)板；3)通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)所述反應(yīng)后酶標(biāo)板，確定待測(cè)樣本中是否含有目標(biāo)microRNA。上述方法中，所述目標(biāo)microRNA探針、待測(cè)樣本、SSSN酶依次加入酶標(biāo)板各孔中包括如下步驟：A)將所述目標(biāo)microRNA探針固定到酶標(biāo)板各孔中，得到連接探針的酶標(biāo)板；B)將所述待測(cè)樣本的RNA加入所述連接探針的酶標(biāo)板，進(jìn)行雜交反應(yīng)，得到含有雜交產(chǎn)物的酶標(biāo)板；C)將SSSN酶加入所述含有雜交產(chǎn)物的酶標(biāo)板各孔中，酶切反應(yīng)，得到反應(yīng)后酶標(biāo)板。上述方法中，在步驟A和步驟C之間，還包括封閉所述連接探針的酶標(biāo)板的步驟。上述方法中，步驟A中，所述酶標(biāo)板為馬來(lái)酸酐基團(tuán)修飾的酶標(biāo)板；所述目標(biāo)microRNA探針通過(guò)酰胺反應(yīng)固定到酶標(biāo)板。所述將所述目標(biāo)microRNA探針固定到酶標(biāo)板各孔中包括如下步驟：先活化所述酶標(biāo)板上的馬來(lái)酸酐基團(tuán)，再將所述目標(biāo)microRNA探針加入活化后酶標(biāo)板各孔中，進(jìn)行酰胺反應(yīng)，得到連接探針的酶標(biāo)板。所述酰胺反應(yīng)條件為：在溫度為25-28℃震蕩反應(yīng)1小時(shí)；步驟B中，所述雜交反應(yīng)條件為：在溫度為45℃反應(yīng)2小時(shí)；步驟C中，所述酶切反應(yīng)條件為：在溫度為37℃反應(yīng)1小時(shí)；上述方法中，所述目標(biāo)microRNA探針的加入濃度為1μM，加入量為每孔200ul；所述待測(cè)樣本的RNA的加入量為每孔200ul；所述SSSN酶的加入濃度為10U/mL，加入量為每孔200ul。上述方法中，所述確定待測(cè)樣本中是否含有目標(biāo)microRNA的方法為：若所述待測(cè)樣本所在孔有熒光信號(hào)或熒光強(qiáng)度值，則所述待測(cè)樣本中或候選含有所述目標(biāo)microRNA；若所述待測(cè)樣本所在孔沒(méi)有熒光信號(hào)或熒光強(qiáng)度值，則所述待測(cè)樣本不含有或候選不含有所述目標(biāo)microRNA。上述方法中，所述通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)所述反應(yīng)后酶標(biāo)板包括如下步驟：先將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素和化學(xué)發(fā)光試劑依次加入所述反應(yīng)后酶標(biāo)板中，得到酶促反應(yīng)后孔板，再用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)所述酶促反應(yīng)后孔板各孔的熒光信號(hào)或熒光強(qiáng)度值。本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種利用SSSN酶檢測(cè)待測(cè)樣本中目標(biāo)microRNA含量的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：1)制備目標(biāo)microRNA探針；所述目標(biāo)microRNA探針為：NH2-A-B-生物素；所述A為(CH2)n，其中，n為6-12的整數(shù)；所述B為與所述目標(biāo)microRNA反向互補(bǔ)的單鏈DNA分子；2)將所述目標(biāo)microRNA探針、不同濃度的目標(biāo)microRNA溶液、SSSN酶依次加入酶標(biāo)板各孔中，得到反應(yīng)后酶標(biāo)板；3)通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)所述反應(yīng)后酶標(biāo)板，得到不同濃度的目標(biāo)microRNA溶液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)所述不同濃度的目標(biāo)microRNA溶液的濃度及各自對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度做標(biāo)準(zhǔn)曲線；4)將所述待測(cè)樣本的RNA替換步驟2)中不同濃度的目標(biāo)microRNA溶液，重復(fù)步驟2)和3)，得到待測(cè)樣本的RNA對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度，將該熒光強(qiáng)度值代入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到待測(cè)樣本中目標(biāo)microRNA的含量。上述方法中，所述SSSN酶為S1核酸酶。上述方法中，所述(CH2)n為(CH2)6、(CH2)9、(CH2)12、(CH2)18或(CH2)24；和/或，所述目標(biāo)microRNA具體為microRNAlet-7a；和/或，所述microRNAlet-7a探針為NH2-(CH2)12-B-生物素，其中所述B為序列1所示的單鏈DNA分子；和/或，所述microRNAlet-7a的核苷酸序列具體為序列2。上述方法中，所述待測(cè)樣本為離體血漿或離體血清或RNA溶液。上述SSSN酶或S1核酸酶在檢測(cè)或輔助檢測(cè)microRNA中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述方法中的核苷酸探針也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明使用DNA探針比RNA探針?lè)€(wěn)定，不容易在未使用(保存期)降解，且合成費(fèi)用也比RNA便宜；另外，本發(fā)明使用的S1核酸酶而非昂貴的RNaseONE核酸酶，S1核酸酶價(jià)格較為便宜且反應(yīng)所需條件沒(méi)有RNaseONE核酸酶所需條件苛刻?？傊?，本發(fā)明用常用SSSN酶檢查探針(酰胺反應(yīng)連接至96孔酶標(biāo)板)與目標(biāo)microRNA(提取自血清)雜交中發(fā)生的錯(cuò)配和部分互補(bǔ)，提高整個(gè)檢測(cè)體系的靈敏度和特異性，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性；然后，利用結(jié)合到探針上的辣根過(guò)氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP)與化學(xué)發(fā)光底物(Luminol-H2O2)產(chǎn)生的酶促反應(yīng)發(fā)出強(qiáng)烈熒光，快速放大檢測(cè)信號(hào)(最低檢測(cè)濃度可達(dá)到atto-mol/L級(jí))，而無(wú)需進(jìn)行核酸擴(kuò)增，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，降低了檢測(cè)難度。檢測(cè)過(guò)程僅使用熒光酶標(biāo)儀；根據(jù)每孔中不同的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出不同孔所對(duì)應(yīng)的目標(biāo)microRNA量即可。本發(fā)明的方法準(zhǔn)確可靠，操作簡(jiǎn)便易行，能大幅度降低microRNA檢測(cè)成本，進(jìn)一步增加其應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。附圖說(shuō)明圖1為利用SSSN酶檢測(cè)microRNA的流程圖。圖2為microRNAlet-7a的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、利用SSSN酶檢測(cè)待測(cè)樣本是否含有microRNAlet-7a的方法圖1為利用SSSN酶檢測(cè)microRNA的流程圖。下面實(shí)施例采用microRNAlet-7a為待檢測(cè)microRNA，microRNAlet-7a的核苷酸序列為UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU(序列2)。一、待測(cè)樣本本發(fā)明的實(shí)施例采用的是濃度為0.5fM至1000fM的microRNAlet-7a溶液作為待測(cè)樣本；上述溶液中的溶質(zhì)為microRNAlet-7a，溶劑為pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液(8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于1000ml水中)。本發(fā)明的待測(cè)樣本也可以來(lái)源于血漿或血清，需要提取血漿或血清的RNA，具體方法如下：將血漿或血清樣本用0.05MpH7.4的Tris-HCl緩沖液稀釋至原體積的20倍，加入5U/mL蛋白酶K(proteinaseK)與3％(質(zhì)量百分含量)EDTA，在37℃消化2小時(shí)，添加10％質(zhì)量百分含量Tween20表面活性劑后混合30分鐘，去除結(jié)合著microRNA的蛋白質(zhì)，釋放microRNA；再加入10U/mLDNA酶I，37℃反應(yīng)1小時(shí)，得到包含有microRNAlet-7a的總RNA，即為待測(cè)樣本。二、利用SSSN酶高通量檢測(cè)microRNAlet-7a的方法1、microRNAlet-7a探針制備探針?lè)N類(lèi)數(shù)量由要檢測(cè)的待檢測(cè)microRNA的數(shù)量決定；其中，探針的序列與其對(duì)應(yīng)的待檢測(cè)microRNA的核酸序列完全反向互補(bǔ)，且5’端氨基修飾并連接C12，3’端生物素修飾。microRNAlet-7a的探針如下：NH2-A-B-生物素；A為(CH2)n，其中，n為6-12的整數(shù)；B為序列1所示的單鏈DNA分子；單鏈DNA分子的5’端與(CH2)n連接，單鏈DNA分子的3’端與生物素連接。其中，5’NH2修飾和3’Biotin(生物素)修飾不可缺少；中間(CH2)12間隔可以是(CH2)6、(CH2)9、(CH2)12、(CH2)18、(CH2)24；但是考慮成本和效率，選用了(CH2)12。microRNAlet-7a的探針為：5’NH2—CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2—AACTATACAACCTACTACCTCA(序列1)—Biotin(生物素)3’合成上述microRNAlet-7a的探針，溶解到pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液(8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于1000ml水中)中，得到濃度為1μM的microRNAlet-7a探針溶液。2、反應(yīng)后酶標(biāo)板的獲得1)連接探針的酶標(biāo)板先將馬來(lái)酸酐化96孔酶標(biāo)板(ThermoScientific公司15108)用PBS-Tween20溶液(0.1M磷酸鈉、0.15M氯化鈉、0.05％質(zhì)量百分含量Tween-20和水混勻，pH7.2)沖洗三次，活化其上的馬來(lái)酸酐基團(tuán)；再將上述1制備的濃度為1μMmicroRNAlet-7a的探針溶液加入96孔酶標(biāo)板各孔中，每孔加入200μl，室溫震蕩反應(yīng)1小時(shí)，探針的氨基與酶標(biāo)板表面的馬來(lái)酸酐基團(tuán)發(fā)生酰胺反應(yīng)，得到連接探針的酶標(biāo)板；再用200μl10mg/mL牛血清白蛋白溶液(用pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液溶解)加入連接探針的酶標(biāo)板各孔中，室溫震蕩反應(yīng)3小時(shí)，封閉酶標(biāo)板上未參與反應(yīng)的馬來(lái)酸酐基團(tuán)，pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液(8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于1000ml水中)清洗三遍后，酶標(biāo)板用塑料膜覆蓋，存儲(chǔ)于4℃環(huán)境中，得到封閉處理后酶標(biāo)板。2)含有雜交產(chǎn)物的酶標(biāo)板將上述一的待測(cè)樣本分別加入到上述封閉處理后酶標(biāo)板上各孔中，每孔加入200μl，45℃雜交2小時(shí)，使探針與其目標(biāo)microRNA雜交，形成含有雜交產(chǎn)物的酶標(biāo)板。3)、SSSN酶酶切向上述含有雜交產(chǎn)物的酶標(biāo)板的每個(gè)孔中加入10U/mLSSSN酶(S1核酸酶，ThermoScientific,EN0321)，每孔加入200μl，37℃反應(yīng)1小時(shí)，使SSSN酶識(shí)別并剪切核酸雜交中堿基錯(cuò)配和部分互補(bǔ)的核酸；然后PBS溶液清洗三遍，得到酶切后酶標(biāo)板(即為反應(yīng)后酶標(biāo)板)。3、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)熒光信號(hào)或熒光強(qiáng)度值1)酶促化學(xué)發(fā)光放大microRNA檢測(cè)信號(hào)向上述酶切后酶標(biāo)板中各孔中加入200μl的200μg/mL的HRP標(biāo)記鏈霉親和素(SA-HRP，ThermoScientific,21140)，該蛋白與探針上生物素標(biāo)記迅速結(jié)合，反應(yīng)15min，用PBS溶液清洗三遍，得到結(jié)合HRP的酶標(biāo)板；再向結(jié)合HRP的酶標(biāo)板各孔中添加200μl的化學(xué)發(fā)光試劑(SuperSignalELISAFemtoSubstrate；ThermoScientific,37074)，使化學(xué)發(fā)光中的Luminol、H2O2與結(jié)合HRP的酶標(biāo)板中的HRP發(fā)生酶促反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的425nm熒光，得到酶促反應(yīng)后孔板。2)檢測(cè)用熒光酶標(biāo)儀(化學(xué)發(fā)光模式)檢測(cè)上述酶促反應(yīng)后孔板中各孔熒光強(qiáng)度值。若某孔有熒光信號(hào)或熒光強(qiáng)度值，則該孔中加入的待測(cè)樣本中或候選含有所述目標(biāo)microRNA；若某孔沒(méi)有熒光信號(hào)或熒光強(qiáng)度值，則該孔中加入的待測(cè)樣本不含有或候選不含有目標(biāo)microRNA。結(jié)果如表1所示，濃度為0.1fM至100nM的microRNAlet-7a溶液作為待測(cè)樣本所在孔中均有熒光強(qiáng)度值，表明本發(fā)明的方法可以檢測(cè)待測(cè)樣本是否含有microRNA。表1為濃度為0.1fM至100nM的microRNAlet-7a溶液作為待測(cè)樣本的熒光強(qiáng)度值待測(cè)樣本(fM)0.51510501005001000相對(duì)熒光值3878799000580957118300060026401202673760219497120460447實(shí)施例2、利用SSSN酶檢測(cè)待測(cè)樣本中microRNAlet-7a含量的方法一、待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品為濃度為0.5fM、1fM、5fM、50fM、500fM、1000fM的microRNAlet-7a溶液；待測(cè)樣本為濃度為10fM的microRNAlet-7a溶液和濃度為100fM的microRNAlet-7a溶液。上述溶液中的溶質(zhì)為microRNAlet-7a，溶劑為pH值為7.2、濃度為0.01M的PBS緩沖液(8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于1000ml水中)。二、利用SSSN酶高通量檢測(cè)microRNAlet-7a含量的方法1、microRNAlet-7a探針制備與實(shí)施例1相同。2、反應(yīng)后酶標(biāo)板的獲得1)連接探針的酶標(biāo)板與實(shí)施例1相同。2)含有雜交產(chǎn)物的酶標(biāo)板將上述一的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別加入到上述封閉處理后酶標(biāo)板上各孔中，每孔加入200μl，45℃雜交2小時(shí)，使探針與其目標(biāo)microRNA雜交，形成含有雜交產(chǎn)物的酶標(biāo)板。3)、SSSN酶酶切與實(shí)施例1相同。3、化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品熒光信號(hào)或熒光強(qiáng)度值1)酶促化學(xué)發(fā)光放大microRNA檢測(cè)信號(hào)與實(shí)施例1相同。2)檢測(cè)用熒光酶標(biāo)儀(化學(xué)發(fā)光模式)檢測(cè)上述酶促反應(yīng)后孔板中各孔熒光強(qiáng)度值，得到濃度為0.5fM、1fM、5fM、50fM、500fM、1000fM的microRNAlet-7a溶液標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度及各自對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)。4、待測(cè)樣本中microRNAlet-7a的含量將濃度為10fM的microRNAlet-7a溶液和濃度為100fM的microRNAlet-7a溶液分別替換步驟2中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)步驟2和3，得到濃度為10fM的microRNAlet-7a溶液和濃度為100fM的microRNAlet-7a溶液的熒光強(qiáng)度值，將該熒光強(qiáng)度值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到待測(cè)樣本中microRNAlet-7a的含量(見(jiàn)表1所示)?？梢钥闯觯景l(fā)明檢測(cè)出待測(cè)樣本中microRNAlet-7a的含量與已知樣本濃度一致，表明本發(fā)明能檢測(cè)待測(cè)microRNAlet-7a的濃度。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3