本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種對關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用的藥物及驗(yàn)證方法。
背景技術(shù)：
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯某Ｒ娂膊?，臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性加重的關(guān)節(jié)疼痛、畸形及活動(dòng)障礙等。OA發(fā)病率及致畸、致殘率高，但其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，也缺乏有效的治療手段。近年來研究發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)可通過與靶基因(mRNA)結(jié)合引起后者降解或翻譯抑制，調(diào)控著哺乳動(dòng)物約1/3的mRNA表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、衰老及凋亡等方面起重要作用。miRNA-140具有軟骨特異性，在人正常關(guān)節(jié)軟骨中穩(wěn)定表達(dá)，對關(guān)節(jié)軟骨的正常穩(wěn)態(tài)及功能起著重要的調(diào)控作用。目前關(guān)于miRNA-140在OA進(jìn)程中的表達(dá)規(guī)律尚存爭議，但普遍認(rèn)為其在OA發(fā)生發(fā)展過程中對關(guān)節(jié)軟骨起重要保護(hù)作用。因此，miRNA-140可作為治療OA的一個(gè)切入點(diǎn)，但目前相關(guān)研究多為體外軟骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或基因敲除/轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，這對深入研究miRNA-140治療OA的具體方法及途徑指導(dǎo)作用有限。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種對關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用的藥物及驗(yàn)證方法，旨在解決目前miRNA-140治療OA的具體方法及途徑指導(dǎo)作用有限的問題。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種對關(guān)節(jié)軟骨退變調(diào)控作用的藥物，該對關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用的藥物為miRNA-140。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種驗(yàn)證miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的調(diào)控作用方法為：
首先驗(yàn)證miRNA-140在人正常及骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律；
其次篩選miRNA-140轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞的最佳條件；
最后驗(yàn)證miRNA-140表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對人OA軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制。
進(jìn)一步，驗(yàn)證miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及調(diào)控作用方法具體為：
(1)根據(jù)Kellgren and Lawrence(KL)OA影像學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，收集人正常(KL 0級(jí))及輕(KL 1-2級(jí))、中(KL 3級(jí))、重度(KL 4級(jí))OA新鮮軟骨標(biāo)本，體外分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并進(jìn)行鑒定；
(2)采用熒光定量PCR法檢測正常及OA軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)水平，分析其表達(dá)變化規(guī)律；
(3)采用不同濃度(0、25、50、100及200nM)的miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)(24、48及72h)通過PCR和Western blotting法檢測細(xì)胞Collagen Ⅱ及MMP13基因和蛋白表達(dá)水平，篩選miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的最佳濃度及效果檢測最佳時(shí)間；
(4)采用最佳濃度的miRNA-140mimic或miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染正常及OA軟骨細(xì)胞，在最佳時(shí)間檢測細(xì)胞Collagen Ⅱ、MMP13、ADAMTS-5、Sox9及Runx2基因及蛋白表達(dá)水平，比較miRNA-140上調(diào)或下調(diào)后各組軟骨細(xì)胞中上述基因及蛋白表達(dá)差異，分析miRNA-140對OA軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用及分子機(jī)制。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種驗(yàn)證miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的調(diào)控作用方法為：
檢測人正常及OA關(guān)節(jié)液中miRNA-140的表達(dá)規(guī)律，并驗(yàn)證miRNA-140表達(dá)水平與OA嚴(yán)重程度的相關(guān)性。
進(jìn)一步，驗(yàn)證miRNA-140在在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的調(diào)控作用方法具體為：
根據(jù)KL影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集正常及輕、中、重度OA患者膝關(guān)節(jié)液標(biāo)本各10例；
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組關(guān)節(jié)液中miRNA-140的表達(dá)水平，采用單因素ANOVA方差分析比較正常及不同程度OA患者關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)差異；
通過Spearman等級(jí)相關(guān)秩和檢驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)節(jié)液中miRNA-140相對表達(dá)量與KL分級(jí)之間的相關(guān)性。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種驗(yàn)證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用方法為：通過構(gòu)建大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型并進(jìn)行鑒定。
進(jìn)一步，驗(yàn)證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用具體方法為：
以3月齡發(fā)育成熟的SPF級(jí)SD大鼠為對象，取大鼠12只，其中3只作為正常對照，其余9只采用手術(shù)切除內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶的方法建立大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，在術(shù)后第4、8及12周各處死3只，通過大體觀察、組織切片染色(HE+甲苯胺藍(lán))及Mankin’s評分對OA模型進(jìn)行鑒定；
取大鼠42只，其中6只作為正常對照，不做任何處理；其余36只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組各18只，在建模術(shù)后1周時(shí)通過關(guān)節(jié)腔穿刺向?qū)嶒?yàn)組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射5nmol/100μl miRNA-140agomir，對照組注射相同劑量的miRNA-140control，觀察兩組大鼠關(guān)節(jié)腔注射后有無并發(fā)癥；
在建模術(shù)后第4、8及12周每組各處死6只大鼠，通過大體觀察、組織化學(xué)染色(HE+甲苯胺藍(lán))及Mankin’s評分方法比較兩組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變程度；
通過免疫組織化學(xué)染色(Collagen Ⅱ、MMP13及ADAMTS-5)及蛋白表達(dá)平均光密度值(MOD)比較兩組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況，驗(yàn)證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用及分子機(jī)制。
本發(fā)明成功在體外分離并培養(yǎng)人正常及不同程度OA軟骨細(xì)胞，miRNA-140在正常軟骨細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少，在重度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)最低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝56.32，p<0.05)。
隨miRNA-140mimic濃度增加及轉(zhuǎn)染時(shí)間延長，Collagen Ⅱ基因及蛋白表達(dá)逐漸增加，而MMP13基因及蛋白表達(dá)逐漸減少。在濃度為50nM轉(zhuǎn)染72h時(shí)，Collagen Ⅱ及MMP13基因和蛋白表達(dá)水平較對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
50nM miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后72h檢測，與對照組相比，Collagen Ⅱ及Sox9基因表達(dá)增加，在正常及輕、中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而MMP13、ADAMTS-5及Runx2基因表達(dá)減少，其中MMP13在正常及輕度OA軟骨細(xì)胞中、Runx2在中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。在重度OA軟骨細(xì)胞中，上述基因表達(dá)較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染后上述基因表達(dá)變化趨勢相反。
50nM miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染后72h檢測，與對照組相比，正常及各級(jí)OA軟骨細(xì)胞中Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)水平降低，其中MMP13在各級(jí)OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，ADAMTS-5在正常及輕、中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染后上述蛋白表達(dá)變化趨勢相反。
miRNA-140在人正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少。
miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的最佳濃度為50nM，檢測轉(zhuǎn)染效果的最佳時(shí)間為轉(zhuǎn)染后72h。
上調(diào)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)可促進(jìn)Collagen Ⅱ及Sox9表達(dá)，同時(shí)抑制MMP13、ADAMTS-5及Runx2表達(dá)，從而起到阻止及修復(fù)軟骨細(xì)胞OA樣改變的作用，而該作用在輕、中度OA軟骨細(xì)胞中更為明顯。
在正常及OA關(guān)節(jié)液中均可檢測到miRNA-140表達(dá)，OA關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)較正常組明顯減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝15.28，p<0.05)。
miRNA-140在關(guān)節(jié)液中的表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少，并與KL分級(jí)呈顯著負(fù)相關(guān)(r＝-0.92，p<0.05)。
人正常及OA關(guān)節(jié)液中均可檢測到miRNA-140表達(dá)，其表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少，并與OA嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)。
成功建立大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，平均建模手術(shù)時(shí)間為10.60±1.80min/只，手術(shù)切口均在術(shù)后1周內(nèi)愈合，術(shù)后第4、8及12周平均Mankin’s評分分別為6.50±1.52、10.17±0.75及12.83±0.75。
關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir或miRNA-140control后，無大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)感染或死亡等并發(fā)癥。
在建模術(shù)后第4、8及12周，大體觀察及組化染色發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變程度明顯輕于對照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin’s評分(3.50±0.55、6.33±0.82及8.67±1.21)均低于對照組(6.83±1.17、10.50±1.05及13.17±0.75)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
隨建模時(shí)間延長，Collagen Ⅱ表達(dá)逐漸減少，而MMP13及ADAMTS-5表達(dá)逐漸增多。在建模術(shù)后第4、8及12周，實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達(dá)強(qiáng)度高于對照組，而MMP13及ADAMTS-5陽性表達(dá)強(qiáng)度低于對照組。實(shí) 驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Collagen Ⅱ免疫組化MOD值分別為11.03±1.54、7.88±1.66及4.83±1.26(×10-3)，對照組分別為7.60±1.21、4.45±1.35及1.47±0.31(×10-3)，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)MMP13免疫組化MOD值分別為2.93±0.51、5.05±0.98及7.92±1.52(×10-3)，對照組分別為5.63±1.07、8.43±1.09及11.70±1.56(×10-3)，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)ADAMTS-5免疫組化MOD值分別為2.60±0.62、3.70±1.05及8.85±1.73(×10-3)，對照組分別為4.13±0.75、9.72±2.04及18.17±5.20(×10-3)，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
成功建立了大鼠OA模型，關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir安全、可行。
關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可明顯減慢大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變進(jìn)程。
關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可顯著減慢關(guān)節(jié)軟骨組織中Collagen Ⅱ蛋白丟失，同時(shí)明顯抑制MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)，對大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變起到明顯的延緩作用。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的驗(yàn)證miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的調(diào)控作用方法流程圖。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
一種對關(guān)節(jié)軟骨退變調(diào)控作用的藥物，該對關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用的藥物為miRNA-140。
如圖1所示：本發(fā)明提供一種驗(yàn)證miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的調(diào)控作用方法為：
S101：首先驗(yàn)證miRNA-140在人正常及骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律；
S102：其次篩選miRNA-140轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞的最佳條件；
S103：最后驗(yàn)證miRNA-140表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對人OA軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制。
進(jìn)一步，驗(yàn)證miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的調(diào)控作用方法具體為：
(1)根據(jù)Kellgren and Lawrence(KL)OA影像學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，收集人正常(KL 0級(jí))及輕(KL 1-2級(jí))、中(KL 3級(jí))、重度(KL 4級(jí))OA新鮮軟骨標(biāo)本，體外分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并進(jìn)行鑒定；
(2)采用熒光定量PCR法檢測正常及OA軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)水平，分析其表達(dá)變化規(guī)律；
(3)采用不同濃度(0、25、50、100及200nM)的miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)(24、48及72h)通過PCR和Western blotting法檢測細(xì)胞Collagen Ⅱ及MMP13基因和蛋白表達(dá)水平，篩選miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的最佳濃度及效果檢測最佳時(shí)間；
(4)采用最佳濃度的miRNA-140mimic或miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染正常及OA軟骨細(xì)胞，在最佳時(shí)間檢測細(xì)胞Collagen Ⅱ、MMP13、ADAMTS-5、Sox9及Runx2基因及蛋白表達(dá)水平，比較miRNA-140上調(diào)或下調(diào)后各組軟骨細(xì)胞中上述基因及蛋白表達(dá)差異，分析miRNA-140對OA軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用及分子機(jī)制。
本發(fā)明提供一種驗(yàn)證miRNA-140在在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的調(diào)控作用方法為：
檢測人正常及OA關(guān)節(jié)液中miRNA-140的表達(dá)規(guī)律，并驗(yàn)證miRNA-140表達(dá)水平與OA嚴(yán)重程度的相關(guān)性。
進(jìn)一步，驗(yàn)證miRNA-140在在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的調(diào)控作用方法具體為：
根據(jù)KL影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集正常及輕、中、重度OA患者膝關(guān)節(jié)液標(biāo)本各10例；
采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組關(guān)節(jié)液中miRNA-140的表達(dá)水平，采用單因素ANOVA方差分析比較正常及不同程度OA患者關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)差異；
通過Spearman等級(jí)相關(guān)秩和檢驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)節(jié)液中miRNA-140相對表達(dá)量與KL分級(jí)之間的相關(guān)性。
本發(fā)明提供一種驗(yàn)證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用方法為：通過構(gòu)建大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型并進(jìn)行鑒定。
進(jìn)一步，驗(yàn)證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用具體方法為：
以3月齡發(fā)育成熟的SPF級(jí)SD大鼠為對象，取大鼠12只，其中3只作為正常對照，其余9只采用手術(shù)切除內(nèi)側(cè)半月板及內(nèi)側(cè)副韌帶的方法建立大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，在術(shù)后第4、8及12周各處死3只，通過大體觀察、組織切片染色(HE+甲苯胺藍(lán))及Mankin’s評分對OA模型進(jìn)行鑒定；
取大鼠42只，其中6只作為正常對照，不做任何處理；其余36只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組各18只，在建模術(shù)后1周時(shí)通過關(guān)節(jié)腔穿刺向?qū)嶒?yàn)組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射5nmol/100μl miRNA-140agomir，對照組注射相同劑量的miRNA-140control，觀察兩組大鼠關(guān)節(jié)腔注射后有無并發(fā)癥；
在建模術(shù)后第4、8及12周每組各處死6只大鼠，通過大體觀察、組織化學(xué)染色(HE+甲苯胺藍(lán))及Mankin’s評分方法比較兩組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變程度；
通過免疫組織化學(xué)染色(Collagen Ⅱ、MMP13及ADAMTS-5)及蛋白表達(dá)平均光密度值(MOD)比較兩組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況，驗(yàn)證關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用及分子機(jī)制。
本發(fā)明成功在體外分離并培養(yǎng)人正常及不同程度OA軟骨細(xì)胞，miRNA-140在正常軟骨細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少，在重度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)最低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝56.32，p<0.05)。
隨miRNA-140mimic濃度增加及轉(zhuǎn)染時(shí)間延長，Collagen Ⅱ基因及蛋白表達(dá)逐漸增加，而MMP13基因及蛋白表達(dá)逐漸減少。在濃度為50nM轉(zhuǎn)染72h時(shí)，Collagen Ⅱ及MMP13基因和蛋白表達(dá)水平較對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
50nM miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后72h檢測，與對照組相比，Collagen Ⅱ及Sox9基因表達(dá)增加，在正常及輕、中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而MMP13、ADAMTS-5及Runx2基因表達(dá)減少，其中MMP13在正常及輕度OA軟骨細(xì)胞中、Runx2在中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。在重度OA軟骨細(xì)胞中，上述基因表達(dá)較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染后上述基因表達(dá)變化趨勢相反。
50nM miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染后72h檢測，與對照組相比，正常及各級(jí)OA軟骨細(xì)胞中Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)水平均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)水平降低，其中MMP13在各級(jí)OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，ADAMTS-5在正常及輕、中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染后上述蛋白表達(dá)變化趨勢相反。
miRNA-140在人正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少。
miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的最佳濃度為50nM，檢測轉(zhuǎn)染效果的最佳時(shí)間為轉(zhuǎn)染后72h。
上調(diào)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)可促進(jìn)Collagen Ⅱ及Sox9表達(dá)，同時(shí)抑制MMP13、ADAMTS-5及Runx2表達(dá)，從而起到阻止及修復(fù)軟骨細(xì)胞OA樣改變的作用，而該作用在輕、中度OA軟骨細(xì)胞中更為明顯。
在正常及OA關(guān)節(jié)液中均可檢測到miRNA-140表達(dá)，OA關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)較正常組明顯減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝15.28，p<0.05)。
miRNA-140在關(guān)節(jié)液中的表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少，并與KL分級(jí)呈顯著負(fù)相關(guān)(r＝-0.92，p<0.05)。
人正常及OA關(guān)節(jié)液中均可檢測到miRNA-140表達(dá)，其表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少，并與OA嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)。
成功建立大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，平均建模手術(shù)時(shí)間為10.60±1.80min/只，手術(shù)切口均在術(shù)后1周內(nèi)愈合，術(shù)后第4、8及12周平均Mankin’s評分分別為6.50±1.52、10.17±0.75及12.83±0.75。
關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir或miRNA-140control后，無大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)感染或死亡等并發(fā)癥。
在建模術(shù)后第4、8及12周，大體觀察及組化染色發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變程度明顯輕于對照組，實(shí)驗(yàn)組大鼠各時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)軟骨組織Mankin’s評分(3.50±0.55、6.33±0.82及8.67±1.21)均低于對照組(6.83±1.17、10.50±1.05及13.17±0.75)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
隨建模時(shí)間延長，Collagen Ⅱ表達(dá)逐漸減少，而MMP13及ADAMTS-5表達(dá)逐漸增多。在建模術(shù)后第4、8及12周，實(shí)驗(yàn)組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中Collagen Ⅱ陽性表達(dá)強(qiáng)度高于對照組，而MMP13及ADAMTS-5陽性表達(dá)強(qiáng)度低于對照組。實(shí) 驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)Collagen Ⅱ免疫組化MOD值分別為11.03±1.54、7.88±1.66及4.83±1.26(×10-3)，對照組分別為7.60±1.21、4.45±1.35及1.47±0.31(×10-3)，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)MMP13免疫組化MOD值分別為2.93±0.51、5.05±0.98及7.92±1.52(×10-3)，對照組分別為5.63±1.07、8.43±1.09及11.70±1.56(×10-3)，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)ADAMTS-5免疫組化MOD值分別為2.60±0.62、3.70±1.05及8.85±1.73(×10-3)，對照組分別為4.13±0.75、9.72±2.04及18.17±5.20(×10-3)，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
成功建立了大鼠OA模型，關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir安全、可行。
關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可明顯減慢大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變進(jìn)程。
關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可顯著減慢關(guān)節(jié)軟骨組織中Collagen Ⅱ蛋白丟失，同時(shí)明顯抑制MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)，對大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變起到明顯的延緩作用。
下面結(jié)合試驗(yàn)及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種以進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨改變、關(guān)節(jié)周緣骨贅形成及滑膜炎性改變?yōu)樘卣鞯耐诵行约膊?，好發(fā)于負(fù)重大、活動(dòng)多的關(guān)節(jié)(如膝、髖、脊柱、踝及手等)，以中、老年患者多見。隨OA病程進(jìn)展可逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、畸形及活動(dòng)障礙等癥狀，致殘率可高達(dá)53％。我國人口基數(shù)大，并已步入老齡化社會(huì)，OA患病人數(shù)將越來越多，但目前關(guān)于OA的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。軟骨細(xì)胞(Chondrocyte)是關(guān)節(jié)軟骨組織中唯一的細(xì)胞成分，可合成包括膠原蛋白、蛋白多糖及非膠原蛋白的多種細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)成分。在正常關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)，軟骨細(xì)胞合成代謝與分解代謝處于一種動(dòng)態(tài)平衡，這對維持關(guān)節(jié)軟骨正常穩(wěn)態(tài)及功能起著重要作用，并受多種因素調(diào)節(jié)。當(dāng)這種平衡狀態(tài)被打破或相關(guān)調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能紊亂時(shí)，軟骨細(xì)胞代謝失衡，將促進(jìn)軟骨細(xì)胞終末分化及ECM降解，如不能及時(shí)修復(fù)或阻止該過程，最終將導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)OA樣改變。
microRNA(miRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA，長約22個(gè)核苷酸，能在胞漿內(nèi)以完全或部分互補(bǔ)形式與靶基因(mRNA)3’端非翻譯區(qū)(Untranslated regions，UTRs)結(jié)合引起靶mRNA降解或翻譯受到抑制，調(diào)控著哺乳動(dòng)物約1/3的mRNA翻譯，在細(xì)胞增殖、分化、遷移、衰老及凋亡等方面起著重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-140具有軟骨特異性，在人正常關(guān)節(jié)軟骨中穩(wěn)定表達(dá)，對關(guān)節(jié)軟骨的穩(wěn)態(tài)及功能起著特定的調(diào)控作用。目前關(guān)于miRNA-140在OA軟骨中的表達(dá)變化規(guī)律尚存爭議，部研究發(fā)現(xiàn)OA軟骨組織或細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)較正常軟骨組織或細(xì)胞減少，但也有研究報(bào)道m(xù)iRNA-140在OA軟骨中表達(dá)較正常軟骨增高。
因此，為了進(jìn)一步探索miRNA-140在OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律及調(diào)控作用，本部分實(shí)驗(yàn)將首先檢測miRNA-140在人正常及OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)水平，其次篩選miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞的最佳條件，最后探索miRNA-140表達(dá)上調(diào)或下調(diào)對人正常及OA軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用及分子機(jī)制。
2材料和方法
2.1實(shí)驗(yàn)材料
2.1.1人新鮮軟骨標(biāo)本
根據(jù)Kellgren and Lawrence(KL)影像學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)將OA分為0-4級(jí)(表1)。從四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科和急診科選取擬行膝上截肢術(shù)或全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(Total knee arthroplasty，TKA)的患者，手術(shù)時(shí)收集正常(KL 0級(jí))、輕度OA(KL 1-2級(jí))、中度OA(KL 3級(jí))及重度OA(KL 4級(jí))股骨髁軟骨標(biāo)本各5-10例。所有標(biāo)本收集均取得患者和/或其家屬的同意并簽署知情同意書。
表1骨關(guān)節(jié)炎Kellgren-Lawrence(KL)X線片分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)
2.1.2主要試劑
其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純級(jí)優(yōu)質(zhì)試劑。
2.1.3主要溶液的配制
1)0.2％膠原酶溶液：20mg膠原酶粉末+10ml含5％FBS的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，配好后用無菌一次性過濾器(孔徑0.2μm)過濾除菌，使用前現(xiàn)配。
2)20％FBS培養(yǎng)基：20ml FBS+80ml DMEM(高糖)培養(yǎng)基，混勻，每次配100ml，分裝后4℃保存，用完再配。
3)1％甲苯胺藍(lán)染色液：甲苯胺藍(lán)粉末0.2g+2ml 70％酒精充分溶解后，再加18ml 1％NaCl溶液(1gNaCl+100ml蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配)，混勻，濾紙過濾。
2.1.4主要儀器、設(shè)備
其他儀器設(shè)備均為國產(chǎn)或進(jìn)口近幾年引進(jìn)設(shè)備，由四川大學(xué)華西醫(yī)院科技園提供。
2.1.5實(shí)驗(yàn)耗材
各種規(guī)格的細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿、離心管、移液槍槍頭、細(xì)胞篩、濾網(wǎng)等實(shí)驗(yàn)耗材均為國產(chǎn)或進(jìn)口優(yōu)質(zhì)品。
2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)及鑒定
2.2.1.1軟骨組織標(biāo)本收集
2014年6月至2015年8月期間，于四川大學(xué)華西醫(yī)院收集新鮮軟骨組織標(biāo)本，整個(gè)過程嚴(yán)格無菌操作，具體方法如下：
1)TKA術(shù)中暴露股骨髁后，用手術(shù)刀成片削取股骨髁軟骨。對膝上截肢術(shù)患者，肢體被截下后，膝關(guān)節(jié)區(qū)消毒鋪無菌巾，暴露股骨髁后削取軟骨組織。取材過程中避免消毒液或其他刺激性液體接觸取材區(qū)軟骨。
2)將取下的軟骨片置于干凈的無菌彎盤中，用生理鹽水(Normal saline，NS)反復(fù)沖洗三次，轉(zhuǎn)移至盛有DMEM(高糖)培養(yǎng)基的50ml無菌離心管中，在低溫條件下盡快轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞分離。
2.2.1.2原代軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)
采用胰蛋白酶+膠原酶消化法分離原代軟骨細(xì)胞，具體方法如下：
1)取適量軟骨組織標(biāo)本放入50ml無菌離心管中，加少量培養(yǎng)基至淹蓋標(biāo)本。用無菌長柄組織剪將軟骨片剪碎成<1mm3的小塊，用無菌NS清洗2次，離心后倒去倒去NS，吸干。
2)加入3倍體積以上的0.25％胰蛋白酶溶液，搖勻，在37℃水浴鍋中持續(xù)振蕩消化15-30min，離心(1200r/min，3min)，吸去上清液，無菌NS清洗2遍。
3)加入3倍體積以上的2％膠原酶溶液，搖勻，在37℃水浴鍋中振蕩消化4小時(shí)以上，直至組織塊基本消失、消化液變渾濁為止。
4)用200目無菌不銹鋼細(xì)胞篩過濾，收集濾液，離心(1500r/min，10min)，吸去上清液，用無菌NS混懸沉淀細(xì)胞，再重復(fù)離心1次。
用20％FBS培養(yǎng)基混懸沉淀細(xì)胞，按細(xì)胞密度(0.5-2)×105個(gè)/ml種入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶/皿底壁時(shí)，胰蛋白酶溶液消化、傳代。
2.2.1.3軟骨細(xì)胞傳代
1)待軟骨細(xì)胞增殖至覆蓋培養(yǎng)瓶底80％以上時(shí)，吸掉舊培養(yǎng)基，加PBS液清洗2-3次。
2)根據(jù)培養(yǎng)瓶/皿大小，加入適量0.25％胰蛋白酶液，輕搖，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，培養(yǎng)箱中消化1-3分鐘后在顯微鏡下觀察，當(dāng)大部分細(xì)胞胞質(zhì)回縮、間隙增大及變圓漂浮時(shí)，加入等體積20％FBS培養(yǎng)基終止消化；用吸管吸取瓶/皿內(nèi)培養(yǎng)基，反復(fù)地依次吹打瓶/皿壁細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液并移至15ml離心管中，離心(1500r/min，3-5min)。
3)棄上清，加入含20％FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察記錄軟骨細(xì)胞的生長狀況，每2-3天換液1次。
2.2.1.4軟骨細(xì)胞凍存及復(fù)蘇
細(xì)胞凍存與復(fù)蘇時(shí)要“慢凍快融”，具體方法如下：
1)凍存前1天常規(guī)換液，消化細(xì)胞前取二甲亞砜(Dimethylsulfoxide，DMSO，分析純)、FBS及培養(yǎng)基以1:2:7的比例配制細(xì)胞保存液。
2)吸去舊培養(yǎng)液，PBS清洗2-3次，按前述方法消化細(xì)胞。
3)取適量細(xì)胞保存液重懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打使細(xì)胞均勻分布，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整保存液中細(xì)胞的終濃度為(5-10)×106/ml，將細(xì)胞懸液分裝入1.5ml無菌凍存管中，旋緊密封管口，注明相關(guān)信息，放入細(xì)胞凍存盒置于-80℃冰箱中保存，1-3天后將凍存管轉(zhuǎn)移至-150℃冰箱保存。
4)復(fù)蘇時(shí)將細(xì)胞凍存管從-150℃冰箱中取出，在確保管口密封的情況下立即投入37℃水浴鍋中，輕搖使其內(nèi)容物盡快融化。
5)迅速將細(xì)胞懸液吸入50ml離心管中并滴加10倍體積以上的培養(yǎng)基，輕輕混勻后低速離心(1000r/min，3min)，去上清液，用培養(yǎng)液再清洗2次。
6)用20％FBS培養(yǎng)基混懸沉淀細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，以后常規(guī)換液、觀察。
2.2.1.5軟骨細(xì)胞鑒定
軟骨細(xì)胞鑒定采用光鏡下觀察、甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原免疫熒光染色等方法，具體如下：
(1)顯微鏡下觀察體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞形態(tài)、密度、貼壁及生長情況等。
(2)甲苯胺藍(lán)染色
1)將滅菌血蓋片放入六孔板中，接種合適密度軟骨細(xì)胞靜置培養(yǎng)，顯微鏡下觀察血蓋片上軟骨細(xì)胞融合率，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80％左右時(shí)對細(xì)胞爬片進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2)去培養(yǎng)基，PBS洗3次，加4％多聚甲醛磷酸緩沖液至完全淹沒血蓋片，4℃固定45-60min，吸去多聚甲醛，雙蒸水洗3次。
3)加1％甲苯胺藍(lán)染色液完全浸泡細(xì)胞爬片，室溫下染色1.5-2小時(shí)，去除多余染液，雙蒸水洗3-5次，每次3-5min。
4)依次經(jīng)70％→80％→90％→無水乙醇各1min，脫水。
5)顯微鏡下觀察染色情況，必要時(shí)重復(fù)前兩步，染色滿意后晾干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、采圖。
(3)Ⅱ型膠原免疫熒光染色
1)按前述方法制作細(xì)胞爬片并固定。
2)加0.5％TritonX-100室溫下孵育10-20min，PBS洗3次，每次3-5min。
3)現(xiàn)配1％BSA，濕盒，37℃封閉30min，棄封閉液，加兔源性多克隆Collagen Ⅱ抗體(1:100)，每張爬片40μl，置濕盒，4℃過夜。
4)PBS洗3次，每次5min，加Alexa FluorR 488F(ab’)2fragment of goat anti-rabbit IgG(H+L)二抗(1:200)，每張爬片40μl，置濕盒，37℃避光1h。
5)PBS洗3次，每次5min，加1μg/ml DAPI染液，室溫下孵育5min。
6)PBS洗3次，每次5min，中性樹膠封片，熒光顯微鏡下觀察、采圖。
2.2.2正常及OA軟骨細(xì)胞中miRNA-140檢測
2.2.2.1細(xì)胞總miRNA提取
根據(jù)microRNA Purification Kit說明書操作，具體方法如下：
1)六孔板培養(yǎng)軟骨細(xì)胞至融合率達(dá)80％以上，去培養(yǎng)基，PBS洗3次，吸干，每孔加300μl Buffer RL，輕晃、輕拍孔板，裂解5min，將裂解液轉(zhuǎn)移至無RNAase污染的1.5ml離心管內(nèi)，每管加150μl 96-100％乙醇，渦旋儀上混勻10s。
2)將Collection Tube與Large RNA Removal Column組裝，然后將上述混合液轉(zhuǎn)移至Column，離心(14000g，1min)，確?；旌弦喝客ㄟ^Column后，將過濾液轉(zhuǎn)移至無RNAase污染的1.5ml離心管內(nèi)，加350μl 96-100％乙醇，渦旋儀上混勻10s。
3)將Collection Tube與microRNA Enrichment Column組裝，然后將上述混合液取一半轉(zhuǎn)移至Column，離心(>3500g，1min)，確?；旌弦喝客ㄟ^Column后，棄過濾液，重新組裝Column和Collection Tube。重復(fù)這一步驟，完成小RNA收集。
4)將400μl Wash Solution A加入microRNA Enrichment Column，離心(14000g，1min)，確保Wash Solution A全部通過Column后，棄過濾液，重新組裝Column和Collection Tube，重復(fù)2次。
5)清洗microRNA Enrichment Column，確保Wash Solution A全部通過Column后，棄過濾液，重新組裝Column和Collection Tube。再次離心2min，使凝膠柱完全干燥，棄Collection Tube，將microRNA Enrichment Column置入配套的1.7ml Elution Tube中。
6)向Column加入50μl Elution Solution A，離心(200g，2min)，確保Elution Solution A全部通過Column，收集洗脫液。
7)必要時(shí)重復(fù)前兩步以確保最大程度收集microRNA，將收集到的microRNA樣本保存在-70℃冰箱，用時(shí)取出。
2.2.2.2細(xì)胞總miRNA濃度測定及完整性檢測
1)取2μl總miRNA樣品，酶標(biāo)儀檢測濃度。
2)總miRNA的OD260/OD280比例在1.8-2.2ng/μl范圍內(nèi)，檢測3次，取平均值。
3)配制3％瓊脂糖凝膠：0.3g瓊脂糖粉末加30ml TAE((Tris-乙酸，0.04M Tris-乙酸，0.001M EDTA)溶液，錫箔紙封口后微波爐高火至沸騰，反復(fù)操作直到全部溶解澄清，再加2μl Golden well原液，混勻。
4)將膠倒入適合模具中，插上適合孔徑的梳子，冷卻30min，拔出梳子，將凝膠移至電泳槽內(nèi)，倒入0.5×TBE電泳緩沖液，讓液面高出膠面約1-2mm。
5)吸取2μl的6×Laoding buffer，2μl總microRNA，用無RNAase的水補(bǔ)足到12μl，混勻，微離心5s，點(diǎn)樣，每孔上樣量10μl。
6)孔置負(fù)極端(黑色)，電壓150v，電泳20min。
7)電泳結(jié)束后，在手持式紫外光下觀察電泳條帶，從孔端開始可見28S、18S、5S條帶，28S條帶亮度是18S亮度的約2倍。
2.2.2.4逆轉(zhuǎn)錄RT
將提取的總miRNA，利用隨機(jī)引物及逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Fermentas公司的Revert AidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，條件如下：
1)在冰盒上預(yù)混以下溶液：
2)瞬時(shí)離心，70℃預(yù)處理5min，然后冰上冷卻。
3)再依次加入：
4)瞬時(shí)離心，使用PCR儀設(shè)置好條件后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，條件如下：
5)逆轉(zhuǎn)錄完成后，cDNA置于-20℃冰箱保存，待進(jìn)行熒光定量PCR檢測用。
2.2.2.5熒光定量PCR檢測
1)qPCR反應(yīng)體系配制：
2)qPCR反應(yīng)條件如下：
3)反應(yīng)體系在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，當(dāng)39個(gè)循環(huán)擴(kuò)的增反應(yīng)結(jié)束后，繪制擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，確定擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)。
4)利用相對定量的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：ΔCt1＝實(shí)驗(yàn)組目的基因平均Ct值-內(nèi)參基因平均Ct值，ΔCt2＝對照組目的基因平均Ct值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值，ΔΔCt＝ΔCt1-ΔCt2，而目的基因的相對表達(dá)量則為2-ΔΔCt。
2.2.2.6PCR檢測產(chǎn)物凝膠電泳
具體方法同前。
2.2.3miRNA-140mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞條件探索
根據(jù)銳博生物科技有限公司提供的microRNA產(chǎn)品使用說明書操作，轉(zhuǎn)染液均在轉(zhuǎn)染前現(xiàn)配，嚴(yán)格無菌操作。
2.2.3.1配制轉(zhuǎn)染試劑
根據(jù)riboFECTTM CP Transfection Kit試劑盒說明操作，具體方法如下：
1)使用前瞬時(shí)離心，PBS水稀釋Buffer(10×)，制備Buffer(1×)。
2)取出Reagent在漩渦振蕩器中充分振蕩后，室溫放置，使之恢復(fù)到室溫后使用。
2.2.3.2配制不同濃度miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染液
所有操作嚴(yán)格遵循RNA操作規(guī)則，具體方法如下：
1)將5nmol miRNA-140凍干粉取出，使用前瞬時(shí)離心，用滅菌的雙蒸水配制成250μl(20nM)儲(chǔ)存液，分裝保存于-80℃冰箱，使用前取出，避免反復(fù)凍融。
2)用1×Buffer(v2)稀釋miRNA-140mimic(v3)，輕輕混勻，加Reagent(v4)，輕輕吹打混勻，勿振蕩，室溫下孵育0-15min。
3)將混合液添加到細(xì)胞培養(yǎng)液(v1)中，輕輕混勻。
4)不同濃度轉(zhuǎn)染液配制過程中各種試劑用量見表2(6孔板)。
表2不同濃度miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染液配制方案(6孔板)
2.2.3.3miRNA-140mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞
1)接種適當(dāng)數(shù)量輕度OA軟骨細(xì)胞至6孔板中，每孔加不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度能夠達(dá)到30-50％。
2)去舊培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入2ml不同濃度的miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染液，對照組正常更換培養(yǎng)基、不添加任何轉(zhuǎn)染試劑，輕輕搖勻，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24-72h。
2.2.3.4miRNA-140mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞效果檢測
2.2.3.4.1PCR檢測Collagen Ⅱ及MMP13基因表達(dá)水平
1)用6孔板培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，去培養(yǎng)基，PBS洗2次。
2)每孔加1ml Trizol，反復(fù)吹打裂解細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)入無RNAase污染的1.5mlEP管內(nèi)，室溫下靜置5min。
3)每管加入200μl三氯甲烷，封口，劇烈振蕩20s，室溫靜置5min，離心(4℃，12000g，15min)。
4)管內(nèi)液體從上至下分為三層，上層即為總RNA液體，小心吸取上層水相液體，轉(zhuǎn)入新的無RNAase酶污染的1.5ml EP管中。
5)加等體積異丙醇，混勻，室溫靜置10-15min，離心(4℃，12000g，10min)。
6)去上清，加預(yù)冷的75％乙醇1ml，混勻后置于冰盒上10min，離心(4℃，12000g，5min)，去上清，室溫下干燥5-10min。
7)加15-30μl DEPC水，混勻，-80℃保存，待測總RNA濃度及后續(xù)檢測。
8)總RNA濃度測定、RNA完整性檢測、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR及PCR產(chǎn)物凝膠電泳方法同前。
2.2.3.4.2Western blotting檢測Collagen Ⅱ及MMP13蛋白表達(dá)水平
(1)總蛋白提取
1)6孔板培養(yǎng)人軟骨細(xì)胞，去培養(yǎng)液，PBS洗2次，吸盡PBS，加1ml裂解液(RIPA緩沖液：PMSF＝100:1，100mmol)，細(xì)胞刮收集細(xì)胞及裂解液至新的1.5mlEP管中，冰盒上靜置1.5-2h，充分裂解。
2)離心(4℃，12000rpm，10-15min)，小心吸取離心后的上清液，分裝轉(zhuǎn)移至干凈EP管中，將一部分上清液加入4×Loading Buffer沸水煮10min，剩下的-80℃保存。
(2)BCA法檢測蛋白濃度
1)按照BCA蛋白定量試劑盒操作說明進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。
2)酶標(biāo)儀波長設(shè)定為562nm，將96孔板放于酶標(biāo)儀上檢測，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測樣品的吸光值得出樣品蛋白濃度。
(3)SDS-PAGE電泳
1)按下面所列條件制備電泳所需的12％分離膠加入各個(gè)組，混勻，灌膠。
12％分離膠配方
2)30-50min后，倒去膠上層無水乙醇并用吸水紙充分吸干，按如下條件制備濃縮膠，玻璃板間灌滿濃縮膠，立即插好梳子，待到濃縮膠凝固后，輕輕將梳子拔出，用蒸餾水沖洗膠孔。
標(biāo)準(zhǔn)濃縮膠配方
3)取相同量的蛋白組織樣品用上樣緩沖液(Loading buffer)補(bǔ)齊到相同體積，充分混勻。
4)在電泳槽中加入足夠的電泳緩沖液后，將蛋白樣品加入到各上樣孔中，上樣完畢后，蓋上電泳槽蓋子，接通電源，設(shè)置電泳條件，調(diào)整電壓到80V，開始電泳，直到蛋白條帶跑至分離膠時(shí)將電壓調(diào)到110V。
5)當(dāng)電泳至溴酚藍(lán)跑到電泳板底端時(shí)終止電泳。
(4)轉(zhuǎn)膜
1)PVDF膜預(yù)先用甲醇浸泡5min，將玻璃板從電泳槽中取出，流水沖洗的同時(shí)將玻璃板撬開，輕輕刮去濃縮膠，將剝出的膠浸于轉(zhuǎn)膜液中。
2)轉(zhuǎn)膜裝置放置順序依次為海綿墊、濾紙、膠、活化的PVDF膜、濾紙、海綿墊，膠需與濾紙對齊，同時(shí)用玻棒搟去膠和濾紙以及膠和膜之間的氣泡，合上轉(zhuǎn)膜裝置，按正確的方向?qū)⑵浞湃朕D(zhuǎn)移槽，向轉(zhuǎn)移槽的邊緣加入適量冰槽，恒流400mA，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作。
3)根據(jù)目標(biāo)蛋白的大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間，轉(zhuǎn)膜完成后迅速取出膜，在TBST緩沖液中洗3min，封閉液封閉1h。
(5)免疫反應(yīng)
1)印跡后的PVDF膜用5％脫脂奶粉溶液室溫孵育封閉1h或4℃過夜。
2)將一抗稀釋至適當(dāng)濃度，室溫下孵育PVDF膜1-2h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，再用TBS洗一次，10min。
3)用封閉液將HRP標(biāo)記的二抗按適當(dāng)比例稀釋成二抗工作液，將膜放入其中，然后室溫振蕩孵育1h。用TBST于室溫下脫色搖床上洗3次，每次10min，再用TBS洗一次，10min。
(6)顯影和定影反應(yīng)
加入顯色底物后，按X光片顯影方法將轉(zhuǎn)印膜上的信號(hào)轉(zhuǎn)移至X光片上。
(7)半定量分析
掃描上述膠片，然后用Image J軟件分析目標(biāo)蛋白條帶和內(nèi)參的灰度值，進(jìn)行半定量分析。
2.2.4miRNA-140對OA軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制
2.2.4.1培養(yǎng)正常及OA軟骨細(xì)胞方法同前。
2.2.4.2miRNA-140mimic/inhibitor/control轉(zhuǎn)染正常及OA軟骨細(xì)胞
(1)實(shí)驗(yàn)分組每組軟骨細(xì)胞分為：空白對照組、miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染組、miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染組及miRNA-140control轉(zhuǎn)染組。
(2)轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染濃度為前期篩選出的最佳轉(zhuǎn)染濃度，miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染濃度為mimic濃度的2倍，control轉(zhuǎn)染濃度同mimic濃度，空白對照組正常更換培養(yǎng)基、不添加任何轉(zhuǎn)染試劑，具體轉(zhuǎn)染方法同前。
2.2.4.3轉(zhuǎn)染效果檢測
(1)PCR檢測Collagen Ⅱ、MMP13、ADAMTS-5、Sox9及Runx2基因表達(dá)
1)具體方法同前。
2)相關(guān)引物設(shè)計(jì)
(2)Western blotting檢測Collagen Ⅱ、MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)
具體方法同前。
2.3統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組組間比較采用單因素ANOVA方差分析。p<0.05定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
3結(jié)果
3.1人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定
3.1.1軟骨組織標(biāo)本來源患者基本情況
從四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科和急診科收集到正常(KL 0級(jí))、中度(KL 3級(jí))及重度(KL 4級(jí))OA患者股骨髁軟骨標(biāo)本共36例，患者基本資料見表3。
表3軟骨組織標(biāo)本來源患者基本資料
3.1.2軟骨細(xì)胞形態(tài)及染色鑒定
(1)形態(tài)學(xué)觀察
倒置顯微鏡下觀察，可見貼壁的人正常軟骨細(xì)胞呈橢圓形、多角形，隨OA程度加重，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，長梭形狀細(xì)胞增多，類似于成纖維樣細(xì)胞。
(2)甲苯胺藍(lán)染色
取軟骨細(xì)胞爬片行甲苯胺藍(lán)染色后置于正置顯微鏡下觀察，軟骨細(xì)胞核染為深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染為藍(lán)紫色，染色呈陽性表現(xiàn)，符合軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色特征。
(3)Collagen Ⅱ免疫熒光染色
取軟骨細(xì)胞爬片行Collagen Ⅱ免疫熒光染色后置于正置熒光顯微鏡下觀察，軟骨細(xì)胞胞質(zhì)中可見大量綠色熒光，符合軟骨細(xì)胞Collagen Ⅱ免疫熒光染色特征。
3.2miRNA-140在人OA軟骨細(xì)胞中的表達(dá)變化規(guī)律
miRNA-140在軟骨細(xì)胞中的相對表達(dá)量見表4。miRNA-140在正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)均較正常組明顯減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝53.62，p<0.001)。隨OA程度加重，miRNA-140表達(dá)逐漸降低，重度OA軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)最低。
表4人正常及OA軟骨細(xì)胞中miRNA-140相對表達(dá)量
3.3miRNA-140轉(zhuǎn)染人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染濃度及檢測時(shí)間
3.3.1miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞的最佳濃度
隨miRNA-140mimic濃度增加，Collagen Ⅱ基因及蛋白表達(dá)逐漸增加，而MMP13基因及蛋白表達(dá)逐漸減少。與空白對照組相比，當(dāng)miRNA-140mimic濃度為50nM時(shí)，Collagen Ⅱ、MMP13基因及蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。當(dāng)miRNA-140mimic濃度大于50nM時(shí)，Collagen Ⅱ基因及蛋白表達(dá)進(jìn)一步增加，而MMP13基因表達(dá)進(jìn)一步下降，但與50nM組相比，差異多無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究中選擇50nM作為miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞的最佳濃度。
3.3.2miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞效果檢測的最佳時(shí)間
在空白對照組，軟骨細(xì)胞培養(yǎng)72h后Collagen Ⅱ及MMP13基因及蛋白表達(dá)均較24h組有所增加。與24h組相比，miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染72h后Collagen Ⅱ基因及蛋白表達(dá)均顯著增加，而MMP13基因及蛋白表達(dá)顯著減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。因此，本研究選擇轉(zhuǎn)染后72h作為miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞效果檢測的最佳時(shí)間。
3.4miRNA-140表達(dá)上/下調(diào)對OA軟骨細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的調(diào)控作用
根據(jù)上一步篩選結(jié)果，采用50nM miRNA-140mimic或100nM miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染正常及OA軟骨細(xì)胞后72h后，檢測細(xì)胞中Collagen Ⅱ、MMP13、ADAMTS-5、Sox9及Runx2基因和蛋白表達(dá)。
3.4.1miRNA-140表達(dá)上/下調(diào)對Collagen Ⅱ、MMP13、ADAMTS-5、Sox9及Runx2基因表達(dá)的調(diào)控作用在各組軟骨細(xì)胞中，miRNA-140control組各基因表達(dá)與空白對照組相比無明顯差異(p>0.05)。
與miRNA-140control組相比，miRNA-140mimic組Collagen Ⅱ及Sox9基因表達(dá)增加，兩者在正常及輕、中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而MMP13、ADAMTS-5及Runx2基因表達(dá)減少，其中MMP13在正常及輕度OA軟骨細(xì)胞中、Runx2在中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。在重度OA軟骨細(xì)胞中，miRNA-140mimic組這5個(gè)基因表達(dá)較miRNA-140control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
與miRNA-140control組相比，miRNA-140inhibitor組Collagen Ⅱ及Sox9基因表達(dá)減少，其中Collagen Ⅱ在正常、輕度及重度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)(，Sox9在正常及重度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而MMP13、ADAMTS-5及Runx2基因表達(dá)增加，其中MMP13及ADAMTS-5在正常及各級(jí)OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，而Runx2在正常、輕度及中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)
3.4.2miRNA-140表達(dá)上/下調(diào)對Collagen Ⅱ、MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)的影響
與空白對照組相比，miRNA-140mimic組Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)明顯增加，在人正常及各級(jí)OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)明顯減少，其中MMP13在各級(jí)OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，ADAMTS-5在正常、輕度及中度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
與空白對照組相比，miRNA-140inhibitor組Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)減少，在正常及各級(jí)軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；而MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)較空白對照組增加，在正常及各級(jí)軟骨細(xì)胞中表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
4討論
骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種常見的退行性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，關(guān)節(jié)軟骨退變或軟骨細(xì)胞終末分化后再生能力非常弱，迄今為止仍無有效的治療手段。在正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中，合成代謝與分解代謝處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，并受多種因素調(diào)節(jié)。近年發(fā)現(xiàn)microRNA-140具有軟骨特異性，在維持關(guān)節(jié)軟骨的正常穩(wěn)態(tài)及功能中起著重要作用，同時(shí)參與調(diào)控OA發(fā)生發(fā)展。最早在膝關(guān)節(jié)軟骨組織中發(fā)現(xiàn)OA組miRNA-140表達(dá)較正常組明顯減少，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miRNA-140基因敲除小鼠在1月齡時(shí)關(guān)節(jié)軟骨就表現(xiàn)出OA樣改變，而過表達(dá)miRNA-140的轉(zhuǎn)基因小鼠不但無OA樣改變，甚至對誘導(dǎo)OA用的抗原也表現(xiàn)出一定的抵抗作用。相反，Swingler和Wheeler等人通過比較正常(股骨頸骨折)及OA(行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù))股骨頭關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)miRNA-140表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-140在OA軟骨中表達(dá)較正常軟骨明顯增高，這就使miRNA-140在關(guān)節(jié)軟骨中的表達(dá)變化規(guī)律起了爭論。首先檢測了人正常及OA軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)變化情況，所用軟骨細(xì)胞均來自膝關(guān)節(jié)軟骨組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-140表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少，研究結(jié)果一致。出現(xiàn)髖、膝關(guān)節(jié)來源軟骨組織或細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)規(guī)律截然相反這種矛盾結(jié)果的原因不清楚，可能與軟骨標(biāo)本來源不同有關(guān)，文獻(xiàn)中目前尚無比較髖、膝等不同關(guān)節(jié)軟骨中miRNA-140表達(dá)變化趨勢的報(bào)道。因?yàn)轶y、膝關(guān)節(jié)負(fù)重大、OA發(fā)生率相對較高，在以后的中可以嘗試比較分析不同部位關(guān)節(jié)軟骨間miRNA-140的表達(dá)變化差異，或許能為miRNA-140在OA發(fā)病機(jī)制中的作用及后續(xù)治療研究提供新的線索。
關(guān)節(jié)軟骨退變是OA的主要特征之一，其中又以Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)及蛋白多糖(Aggrecans)等ECM降解為主。MMP-13及ADAMTS-5是目前認(rèn)為軟骨基質(zhì)降解酶中最重要的水解酶，L等人也發(fā)現(xiàn)miRNA-140是MMP13的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，在使用促炎因子IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞OA樣改變過程中，miRNA-140和MMP13表達(dá)均增加，而miRNA-140可抑制MMP13表達(dá)，他們進(jìn)一步采用熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)miRNA-140可直接與MMP13 3’端UTR位點(diǎn)結(jié)合。在確定了正常及OA軟骨細(xì)胞中miRNA-140的表達(dá)規(guī)律之后，進(jìn)一步通過miRNA-140mimic或miRNA-140inhibitor轉(zhuǎn)染來上調(diào)或下調(diào)軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)miRNA-140表達(dá)可降低細(xì)胞中MMP13基因及蛋白表達(dá)，其中蛋白表達(dá)差異更為明顯，這與miRNA-140的作用機(jī)制相符，即與靶mRNA結(jié)合后在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)。由此進(jìn)一步證實(shí)miRNA-140可通過抑制基質(zhì)降解酶MMP13表達(dá)來阻止及修復(fù)軟骨細(xì)胞OA樣改變。
除MMP13外，還發(fā)現(xiàn)miRNA-140上調(diào)也可抑制ADAMTS-5基因和蛋白表達(dá)，雖然基因表達(dá)減少較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異，但蛋白表達(dá)減少在正常及輕、中度OA軟骨細(xì)胞中較對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這也進(jìn)一步說明了miRNA-140主要在轉(zhuǎn)錄后水平抑制ADAMTS-5表達(dá)。M等人在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-1β干預(yù)可減少軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)、增加ADAMTS-5表達(dá)；當(dāng)通過基因轉(zhuǎn)染提高miRNA-140表達(dá)后，IL-1β的這種誘導(dǎo)作用明顯減弱。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在miRNA-140-/-小鼠中ADAMTS-5表達(dá)增加，而在miRNA-140轉(zhuǎn)基因小鼠中減少，體外熒光素酶報(bào)告基因分析也發(fā)現(xiàn)ADAMTS-53’端UTR包含有miRNA-140結(jié)合位點(diǎn)。因此，抑制ADAMTS-5表達(dá)也是miRNA-140阻止關(guān)節(jié)軟骨退變的作用機(jī)制之一。
Sox9被認(rèn)為是調(diào)控軟骨生成的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，參與調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)向軟骨細(xì)骨細(xì)胞分化過程，同時(shí)也可調(diào)控Collagen Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ等軟骨特異性蛋白的表達(dá)、維持軟骨細(xì)胞正常增殖速度及阻止軟骨細(xì)胞肥大分化。Sox9在OA軟骨組織中表達(dá)較正常軟骨減少，沉默Sox9基因后，MMP13表達(dá)將增加，Sox9可通過結(jié)合啟動(dòng)區(qū)域特異序列促進(jìn)miRNA-140的表達(dá)，這也在Sox9基因敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠研究中被證實(shí)。因此，目前普遍認(rèn)為Sox9是miRNA-140的上游調(diào)控因子。但是，發(fā)現(xiàn)上調(diào)軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)也可促進(jìn)Sox9表達(dá)增加，而且在正常及輕、中度OA軟骨細(xì)胞中較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；相反，下調(diào)軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)也可抑制Sox9表達(dá)，在正常及重度OA軟骨細(xì)胞中較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這是否說明miRNA-140作為下游因子可也反饋調(diào)節(jié)Sox9表達(dá)呢？K等發(fā)現(xiàn)抑制miRNA-140可導(dǎo)致Sox9蛋白表達(dá)水平降低，而Sox9mRNA表達(dá)并無明顯變化，提示miRNA-140可在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)Sox9表達(dá)。還有發(fā)現(xiàn)miRNA-140基因表達(dá)上調(diào)可抑制RALA(TGF-β通路中的一個(gè)小GTP酶)表達(dá)，而RALA抑制可引起Sox9蛋白表達(dá)明顯增加，但Sox9mRNA表達(dá)并未受到明顯影響。如前所述，本研究發(fā)現(xiàn)Sox9表達(dá)在miRNA-140下調(diào)后減少，尤其是在正常及重度OA軟骨細(xì)胞中，這與K等人研究結(jié)果似有沖突。由于本發(fā)明中未檢測Sox9蛋白表達(dá)變化，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步完善相關(guān)檢測，深入探索miRNA-140和Sox9在軟骨細(xì)胞中的相調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。此外，也有Sox9可抑制Runx2轉(zhuǎn)錄活性，而后者可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大分化，這將在后面詳細(xì)討論]。
Runx2是調(diào)控骨形成的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，在肥大軟骨細(xì)胞中呈高表達(dá)，而在正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中幾乎不表達(dá)?，F(xiàn)已證實(shí)Runx2可與相應(yīng)基因啟動(dòng)子結(jié)合促進(jìn)MMP13、Collagen Ⅹ及堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞終末分化及軟骨內(nèi)成骨過程[21]。究其作用機(jī)制，Runx2主要通過與Smad結(jié)合形成Runx2-Smad復(fù)合體起作用：Smad3與Runx2結(jié)合后，Runx2轉(zhuǎn)錄活性被抑制[28]；而Smad1與Runx2結(jié)合后，Runx2轉(zhuǎn)錄活性被激活[29]。Smad1、Smad3是TGF-β/BMP信號(hào)通路Smads途徑中的關(guān)鍵蛋白[5]，這也說明Runx2對軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用至少部分是通過調(diào)控TGF-β/BMP信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。Tuddenham等在研究長骨和扁骨形成過程中發(fā)現(xiàn)miRNA-140可通過抑制組蛋白脫乙?；?(histone deacetylase 4，HDAC4)來促進(jìn)Runx2表達(dá)。但是，Miyaki等人在miRNA-140-/-大鼠生長板或關(guān)節(jié)軟骨中并未發(fā)現(xiàn)HDAC4基因或蛋白表達(dá)變化[15]。在本研究中，miRNA-140上調(diào)后Runx2的表達(dá)減少，在中度OA軟骨細(xì)胞中較對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Tuddenham報(bào)道的在成骨過程中miRNA-140可促進(jìn)Runx2表達(dá)結(jié)論相反。這也提示miRNA-140可能在成骨過程中及軟骨退變過程中對Runx2起著不同的調(diào)控作用，miRNA-140與Runx2在關(guān)節(jié)軟骨退變過程中的相互調(diào)節(jié)關(guān)系仍有待進(jìn)一步深入研究。
綜上所述，此部分發(fā)現(xiàn)：人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)隨OA程度加重逐漸減少，而通過基因轉(zhuǎn)染上調(diào)OA軟骨細(xì)胞中miRNA-140可促進(jìn)Collagen Ⅱ及Sox9表達(dá)，同時(shí)抑制MMP13、ADAMTS-5及Runx2表達(dá)，從而起到阻止及修復(fù)軟骨細(xì)胞OA樣改變的作用，而該作用在輕、中度OA軟骨細(xì)胞中更為明顯。這就提示，miRNA-140或許可作為預(yù)防及治療OA的一個(gè)重要切入點(diǎn)，但目前對miRNA-140治療OA的研究多為體外軟骨細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及基因敲除/轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，這對探索miRNA-140治療OA的實(shí)際指導(dǎo)作用有限。發(fā)現(xiàn)在大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射miRNA-210可通過提高血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)表達(dá)來促進(jìn)ACL及半月板損傷修復(fù)。因此，關(guān)節(jié)腔應(yīng)用miRNA-140或許能為OA基因治療提供新的研究方法及理論依據(jù)，但目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對miRNA-140關(guān)節(jié)腔應(yīng)用對軟骨退變的作用及機(jī)制進(jìn)一步。
5結(jié)論
(1)miRNA-140在人正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，隨OA程度加重其表達(dá)量逐漸減少。
(2)miRNA-140mimic轉(zhuǎn)染人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的最佳濃度為50nM，檢測轉(zhuǎn)染效果的最佳時(shí)間為轉(zhuǎn)染后72h。
(3)上調(diào)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中miRNA-140表達(dá)可促進(jìn)Collagen Ⅱ及Sox9表達(dá)，同時(shí)抑制MMP13、ADAMTS-5及Runx2 表達(dá)，從而起到阻止及修復(fù)軟骨細(xì)胞OA樣改變的作用，而該作用在輕、中度OA軟骨細(xì)胞中更為明顯。
下面結(jié)合miRNA-140在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的表達(dá)規(guī)律對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
1、材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1人膝關(guān)節(jié)液
根據(jù)KL影像診斷標(biāo)準(zhǔn)將OA分級(jí)(同第一部分)，從四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科住院部和門診關(guān)節(jié)腔穿刺室收集正常、輕度、中度及重度OA患者膝關(guān)節(jié)液標(biāo)本各10例，行關(guān)節(jié)腔藥物注射患者僅收集第一次注射前的關(guān)節(jié)液。所有標(biāo)本收集均取得患者和/或其家屬的同意并簽署知情同意書。
2.1.2主要試劑
其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純級(jí)優(yōu)質(zhì)試劑。
1.1.3主要儀器
其他儀器設(shè)備均為國產(chǎn)或進(jìn)口近幾年引進(jìn)設(shè)備，由四川大學(xué)華西醫(yī)院科技園提供。
1.1.4主要實(shí)驗(yàn)耗材
各種規(guī)格無RNA酶污染的離心管、槍頭等實(shí)驗(yàn)耗材均為國產(chǎn)或進(jìn)口優(yōu)質(zhì)品。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1膝關(guān)節(jié)液收集、分裝及保存
1)關(guān)節(jié)液抽出后迅速轉(zhuǎn)移至15ml無菌、無RNAase的離心管中，離心(3000rpm，5min)。
2)取上清液分裝至1ml無RNAase的1.5ml離心管內(nèi)，置于液氮罐保存，用時(shí)取出。
1.2.2關(guān)節(jié)液總miRNA提取
根據(jù)microRNA Purification Kit試劑盒說明書操作，具體方法如下：
1)將100μl關(guān)節(jié)液轉(zhuǎn)移至無RNAase污染的1.5ml離心管中，加250μl Buffer RL，渦旋振蕩器上混勻，15s。
2)加入150μl 96-100％乙醇，渦旋儀上混勻10s。
3)將Collection Tube與Large RNA Removal Column組裝，然后將細(xì)胞裂解液與乙醇混合液轉(zhuǎn)移至Column，離心(14000g，1min)，確?；旌弦喝客ㄟ^Column后，保留flowthrough。
4)將flowthrough轉(zhuǎn)移至無RNAase污染的1.5ml離心管內(nèi)，加入350μl 96-100％乙醇，渦旋儀上混勻10s。
5)將Collection Tube與microRNA Enrichment Column組裝，然后將上步得到的混合液取一半轉(zhuǎn)移至Column，離心(＞3500g，1min)，確保混合液全部通過Column后，丟棄flowthrough，重新組裝Column和Collection Tube。
6)重復(fù)上一步驟，完成小RNA收集。
7)將400μl Wash Solution A加入microRNA Enrichment Column，離心(14000g，1min)，確保Wash Solution A全部通過Column后，丟棄flowthrough，重新組裝Column和Collection Tube。
8)重復(fù)上一步驟2次，清洗microRNA Enrichment Column，確保Wash Solution A全部通過Column后，丟棄flowthrough，重新組裝Column和Collection Tube。
9)再次離心2min，使凝膠柱完全干燥，丟棄Collection Tube，將microRNA Enrichment Column置入配套的1.7ml Elution Tube。
10)向Column加入50μl Elution Solution A，離心(200g，2min)，確保Elution Solution A全部通過Column，收集洗脫液。
11)必要時(shí)重復(fù)前兩步以確保最大程度收集microRNA。
12)將收集到的microRNA樣本保存在-70℃冰箱，用時(shí)取出。
1.2.3關(guān)節(jié)液總microRNA濃度及完整性測定
具體方法同前。
1.2.4逆轉(zhuǎn)錄RT
具體方法同前。
1.2.5熒光定量PCR檢測
具體方法同前。
1.2.6PCR檢測產(chǎn)物凝膠電泳
具體方法同前。
1.3統(tǒng)計(jì)分析
采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素ANOVA方差分析對多組間miRNA-140相對表達(dá)量進(jìn)行組間比較，同時(shí)采用Spearman等級(jí)相關(guān)秩和檢驗(yàn)分析miRNA-140相對表達(dá)量與OAKL分級(jí)之間的相關(guān)性。p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
2結(jié)果
2.1關(guān)節(jié)液標(biāo)本來源患者基本情況
從四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科住院部和門診關(guān)節(jié)腔穿刺室共收集到正常(KL 0級(jí))、輕度(KL1-2級(jí))、中度(KL 3級(jí))及重度(KL 4級(jí))OA患者膝關(guān)節(jié)液標(biāo)本各10例，患者基本資料見表5，各組典型X片。
表5關(guān)節(jié)液標(biāo)本來源患者基本資料
2.2人膝關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)變化規(guī)律
在正常及OA關(guān)節(jié)液中均可檢測到miRNA-140表達(dá)，OA關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)均較正常組明顯減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F＝15.275，p<0.001)。隨OA程度加重，miRNA-140表達(dá)逐漸減少，重度OA關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)最低(表6，)。
表6人膝關(guān)節(jié)液中miRNA-140的相對表達(dá)量
2.3人膝關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)與OA嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析
采用Spearman等級(jí)相關(guān)秩和檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，人膝關(guān)節(jié)液中miRNA-140相對表達(dá)量與KL分級(jí)呈顯著負(fù)相關(guān)(r＝-0.924p<0.001)。
3討論
OA好發(fā)于負(fù)重大、活動(dòng)多的關(guān)節(jié)，如膝、髖、脊柱(頸椎和腰椎)、踝及手等，常為單發(fā)或幾個(gè)關(guān)節(jié)發(fā)病[6]。輕、中度OA主要以保守治療為主，治療方式包括理療、口服消炎鎮(zhèn)痛藥(NSAIDs類藥物)及軟骨營養(yǎng)藥物(氨基葡萄糖、硫酸軟骨素等)、關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉或類固醇激素等。重度OA患者關(guān)節(jié)疼痛及畸形明顯，對生活質(zhì)量影響大，保守治療效果欠佳且易復(fù)發(fā)，為緩解癥狀及改善生活質(zhì)量，關(guān)節(jié)置換術(shù)成了很大一部分患者的首選治療方案[7]。雖然關(guān)節(jié)置換手術(shù)能最終緩解受累關(guān)節(jié)疼痛、改善關(guān)節(jié)功能，但手術(shù)也存在很多并發(fā)癥，比如對病人身體和精神打擊較大、術(shù)后存在一定時(shí)間的恢復(fù)期、有一定的感染、血栓血腫形成及假體松動(dòng)等風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)期壽命較長者還存在人工關(guān)節(jié)翻修等問題，同時(shí)對患者經(jīng)濟(jì)上也會(huì)造成一定的負(fù)擔(dān)。因此，尋找能有效延緩、阻止甚至修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨退變的新方法一直以來是OA相關(guān)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。如前部分實(shí)驗(yàn)所述，現(xiàn)有發(fā)現(xiàn)miRNA-140可作為治療OA的一個(gè)重要切入點(diǎn)，但因?yàn)镺A常為單發(fā)或幾個(gè)關(guān)節(jié)發(fā)病，系統(tǒng)應(yīng)用miRNA-140治療OA的風(fēng)險(xiǎn)及效果都不確定，而且目前也暫無系統(tǒng)應(yīng)用miRNA的相關(guān)報(bào)道，所以，局部應(yīng)用miRNA-140或許更具有可行性。
miRNA-140在人關(guān)節(jié)軟骨中穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少，我們就猜測關(guān)節(jié)液中是否也存在miRNA-140表達(dá)呢？本發(fā)明證實(shí)了miRNA-140在人膝關(guān)節(jié)液中表達(dá)，并且其表達(dá)量隨OA程度加重逐漸降低，與OA嚴(yán)重程度成顯著負(fù)相關(guān)，這與其在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)變化規(guī)律一致。針對關(guān)節(jié)液中miRNA-140的來源問題，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。軟骨細(xì)胞是軟骨組織中唯一的細(xì)胞成分，成熟的miRNA-140在其中合成。在OA軟骨組織中，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，miRNA-140合成量也就減少。因此，推測膝關(guān)節(jié)液中miRNA-140可能來源于關(guān)節(jié)軟骨組織中的軟骨細(xì)胞，但具體來源及其產(chǎn)生機(jī)制有待進(jìn)一步。此外，關(guān)節(jié)液是由關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織分泌產(chǎn)生，能通過滲透作用進(jìn)入軟骨基質(zhì)為軟骨細(xì)胞提供營養(yǎng)支持，既然目前已證實(shí)miRNA-140可在關(guān)節(jié)液中表達(dá)，那么miRNA-140是否也能隨關(guān)節(jié)液滲透進(jìn)入軟骨基質(zhì)作用于軟骨細(xì)胞呢？查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前暫無相關(guān)報(bào)道。
軟骨退變又主要以軟骨細(xì)胞終末分化、ECM降解為主要特征，而MMP-13及ADAMTS-5是基質(zhì)降解酶中最重要的水解。前一部分實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)了miRNA-140表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Collagen Ⅱ表達(dá)、抑制MMP13及ADAMTS-5表達(dá)，對軟骨細(xì)胞OA樣改變起到明顯的阻止和修復(fù)作用。結(jié)合本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測通過關(guān)節(jié)腔注射外源性miRNA-140提高關(guān)節(jié)液中miRNA-140表達(dá)量是否也能起到類似作用。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)目前尚無miRNA-140關(guān)節(jié)腔局部應(yīng)用的研究報(bào)道。S等人在大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射miRNA-210并其對前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament，ACL)損傷的修復(fù)重建作用，發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)腔應(yīng)用miRNA-210可明顯提高韌帶中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，最終加快ACL修復(fù)[4]。隨后Kawanishi等人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射miRNA-210可通過上調(diào)半月板細(xì)胞中Collagen Ⅱ、VEGF及FGF2表達(dá)來促進(jìn)半月板白區(qū)損傷修復(fù)[5]。
因此，基于前期結(jié)果及現(xiàn)有文獻(xiàn)支持提出假設(shè)：通過關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140能有效的延緩、阻止甚至修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨退變。為了驗(yàn)證該假設(shè)，將在下一步驗(yàn)證，首先構(gòu)建大鼠膝OA模型，然后通過關(guān)節(jié)腔穿刺注射大鼠miRNA-140agomir，最后在OA進(jìn)程中選擇適當(dāng)時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變程度并探索其作用機(jī)制。
4結(jié)論
人正常及OA關(guān)節(jié)液中均可檢測到miRNA-140表達(dá)，其表達(dá)量隨OA程度加重逐漸減少，與OA嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)。
下面結(jié)合關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的調(diào)控作用及機(jī)制對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
1材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
3月齡發(fā)育成熟的SPF級(jí)雄性SD大鼠共54只，購自達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，體重300±20g。大鼠購買后飼養(yǎng)于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度維持在16℃-25℃，相對濕度維持在60％-80％，常規(guī)喂食及喂水，4只/籠分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前至少適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。所有動(dòng)物操作均按四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例執(zhí)行。
2.1.2主要試劑
其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純級(jí)優(yōu)質(zhì)試劑。
1.1.3主要溶液的配制
0.5％甲苯胺藍(lán)染色液：甲苯胺藍(lán)粉末0.1g+2ml 70％酒精充分溶解后，再加18ml 1％NaCl溶液(1gNaCl+100ml蒸餾水，現(xiàn)用現(xiàn)配)，混勻，濾紙過濾。
2.1.4主要儀器
其他儀器設(shè)備均為國產(chǎn)或進(jìn)口近幾年引進(jìn)設(shè)備，由四川大學(xué)華西醫(yī)院科技園提供。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1大鼠膝OA模型建立
取同齡大鼠12只，其中3只作為正常對照，9只進(jìn)行膝關(guān)節(jié)OA建模。建模手術(shù)過程在四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)SD大鼠手術(shù)間完成，采用切斷內(nèi)側(cè)副韌帶+切除內(nèi)側(cè)半月板的方法[4]，整個(gè)手術(shù)過程嚴(yán)格無菌操作，具體建模方法如下：
1)術(shù)前稱大鼠體重，按3-4ml/kg劑量計(jì)算麻醉所需的10％水合氯醛用量，經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠。
2)麻醉滿意后，以膝關(guān)節(jié)為中心，用剃毛機(jī)剃除上下約4cm及左右約2cm大小區(qū)域的毛發(fā)。
3)將已備皮大鼠仰臥位置于操作臺(tái)上，除手術(shù)后肢外，對其余肢體進(jìn)行固定。
4)用棉球沾取5％聚維酮碘溶液消毒膝關(guān)節(jié)手術(shù)備皮區(qū)2次，鋪?zhàn)灾茻o菌一次性洞巾。
5)用15號(hào)手術(shù)刀沿髕骨及髕韌帶內(nèi)側(cè)緣縱行向下切開皮膚，切口長約0.5-1cm，切開皮下各層及肌肉層，直至暴露關(guān)節(jié)囊。
6)用眼科剪將關(guān)節(jié)囊沿髕骨及髕韌帶內(nèi)側(cè)剪開，鈍性分開脛前及髁間窩脂肪墊，手術(shù)過程中有出血時(shí)用無菌棉球按壓止血。
7)伸直膝關(guān)節(jié)，將髕骨推向外側(cè)后屈曲膝關(guān)節(jié)，充分暴露內(nèi)側(cè)半月板前角及內(nèi)側(cè)副韌帶，在手術(shù)過程中用棉球蘸無菌NS保持關(guān)節(jié)濕潤。
8)用小尖刀切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，外旋脛骨，充分暴露內(nèi)側(cè)半月板前角及體部，用眼科剪小心摘除內(nèi)側(cè)半月板，該過程中注意尖刀及剪刀切勿傷及股骨髁關(guān)節(jié)軟骨。檢查切下內(nèi)側(cè)半月板是否完整，尤其是半月板后角。
9)確定完整切下內(nèi)側(cè)半月板后，聚維酮碘溶液及NS依次沖洗，伸直膝關(guān)節(jié)，復(fù)位髕骨，用5-0可吸收線連續(xù)縫合關(guān)節(jié)囊，5-0絲線間斷縫合皮膚切口，再次聚維酮碘溶液消毒切口。
10)術(shù)后腹腔注射青霉素(4萬u/ml)1ml預(yù)防感染，待大鼠清醒后按編號(hào)分籠，放回大鼠房常規(guī)飼養(yǎng)，讓其自由活動(dòng)及進(jìn)食進(jìn)水。
術(shù)后第1、2、3天查看大鼠手術(shù)切口，如有滲液或紅腫，用聚維酮碘溶液予切口消毒。
1.2.2大鼠膝OA模型鑒定
建模手術(shù)后第4周、8周及12周，通過過量麻醉的方法處死大鼠，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3只，
取3只正常大鼠作為正常對照。手術(shù)暴露膝關(guān)節(jié)，通過大體觀察及組織學(xué)觀察鑒定大鼠膝OA建模是否成功。
1.2.2.1大體觀察
充分暴露膝關(guān)節(jié)股骨髁，肉眼觀察并用數(shù)碼相機(jī)在相同條件下記錄股骨髁負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨退變情況。大體觀察的主要內(nèi)容包括：關(guān)節(jié)軟骨面的光滑度及色澤，軟骨表面是否有裂隙、缺損、潰瘍及其程度，是否有軟骨下骨裸露等。
1.2.2.2組織切片觀察
(1)標(biāo)本取材及處理
1)大體觀察結(jié)束后，迅速分離建模膝關(guān)節(jié)，小心剪掉關(guān)節(jié)周圍軟組織，保證股骨髁完整，立即置于盛有足量10％多聚甲醛的50ml離心管中，完全淹沒膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，固定24-48h。
2)將膝關(guān)節(jié)標(biāo)本轉(zhuǎn)移至盛有足夠20％EDTA液的50ml離心管中，脫鈣4周，每周更換一次脫鈣液。
3)取出膝關(guān)節(jié)標(biāo)本，用干凈鋒利手術(shù)刀片修整股骨髁近端不規(guī)整骨組織，沿髁間窩中線矢狀位剖開股骨髁，丟棄股骨外側(cè)髁，保留內(nèi)側(cè)髁，繼續(xù)脫鈣2周。
4)脫鈣結(jié)束后用自來水流水沖洗12-24h，逐級(jí)丙酮脫水、二甲苯透明。
5)浸蠟后包埋。
6)沿矢狀面切片，每隔300μm切片，厚度5μm，保存于4℃冰箱備用。
(2)HE染色
1)將石蠟切片置于60℃20min復(fù)溫，再經(jīng)二甲苯(I)和二甲苯(II)各10min脫蠟。
2)依次經(jīng)二甲苯(I)、(II)各5min，100％乙醇2min，95％→80％→75％乙醇各1min，蒸餾水洗1min。
3)蘇木精染色液浸泡染色15min，自來水沖洗30s。
4)1％鹽酸乙醇分化30s，自來水沖洗30s。
5)促藍(lán)液浸潤返藍(lán)10-30s，自來水浸泡15min或50℃溫水浸泡5min。
6)5％伊紅染色液染色2min。
7)依次經(jīng)95％(I)→95％(II)→100％(I)→100％(II)乙醇各1min，脫水。
8)依次經(jīng)二甲苯石碳酸→二甲苯(I)→二甲苯(II)各1min，透明。
9)中性樹膠封片。
(3)甲苯胺藍(lán)染色
1)將石蠟切片置于60℃20min復(fù)溫，再經(jīng)二甲苯(I)→二甲苯(II)各15min脫蠟。
2)依次經(jīng)100％(I)→100％(II)→95％(I)→95％(II)→80％→75％乙醇各1min，蒸餾水洗1min。
3)將切片放入0.5％甲苯胺藍(lán)水溶液10min后。
4)自來水流水沖洗2min。
5)丙酮分化，至骨軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚時(shí)停止。
6)依次經(jīng)70％→80％→90％→95％(I)→95％(II)→100％(I)→100％(II)乙醇各1min，脫水。
7)依次經(jīng)二甲苯(I)→二甲苯(II)各10min，透明。
8)中性樹膠封片。
(4)組織切片觀察
每組標(biāo)本隨機(jī)選取同一部位的HE及甲苯胺藍(lán)染色的組織切片進(jìn)行組織學(xué)觀察，主要觀察指標(biāo)包括軟骨組織結(jié)構(gòu)、軟骨細(xì)胞數(shù)量、基質(zhì)著色及潮線完整性，并根據(jù)改良Mankin’s法進(jìn)行組織學(xué)評分(表7)。
表7關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)Mankin’s評分表細(xì)則
1.2.3大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射miRNA-140agomir
建模術(shù)后1周，在建模手術(shù)切口基本愈合的情況下行關(guān)節(jié)腔穿刺注射，該過程在四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)SD大鼠手術(shù)間完成，整個(gè)過程嚴(yán)格無菌操作，具體方法如下：
1.2.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組
此部分共需大鼠42只，其中6只大鼠作為正常對照組不做任何處理，36只大鼠OA建模手術(shù)后隨機(jī)分為miRNA-140agomir組及miRNA-140control組，每組18只。
1.2.3.2miRNA-140agomir注射液配制
將5nmol miRNA-140agomir凍干粉取出，使用前瞬時(shí)離心，用滅菌的雙蒸水配制成100μl注射液，每次實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)配。miRNA-140control注射液配制方法一樣。
2.2.3.3關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射miRNA-140agomir
1)操作前稱量大鼠體重，按3-4ml/kg劑量計(jì)算麻醉所需的10％水合氯醛用量，經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠。
2)麻醉滿意后，將大鼠仰臥位置于操作臺(tái)上，除手術(shù)后肢外，對其余肢體進(jìn)行固定。
3)取髕韌帶內(nèi)側(cè)膝關(guān)節(jié)間隙中點(diǎn)為進(jìn)針點(diǎn)，用棉球沾取5％聚維酮碘溶液消毒膝關(guān)節(jié)操作區(qū)。
4)在無菌條件下用微量注射器穿刺進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，注射100μl miRNA-140agomir或miRNA-140control注射液。
5)用無菌棉球輕壓拔針后，繼續(xù)壓迫2-5min，防止注射液外漏。
待大鼠清醒后按編號(hào)分籠放回大鼠房常規(guī)飼養(yǎng)，讓其自由活動(dòng)及進(jìn)食進(jìn)水。
1.2.4關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射miRNA-140對關(guān)節(jié)軟骨退變的作用效果檢測
按前述方法，miRNA-140agomir組及miRNA-140control組在建模術(shù)后第4周、8周及12周各處死6只大鼠，6只正常大鼠作為對照。手術(shù)暴露膝關(guān)節(jié)，通過大體觀察、病理組織切片染色及免疫組織化學(xué)染色方法檢測關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir對大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的作用效果及分子機(jī)制。
1.2.4.1大體觀察
充分暴露膝關(guān)節(jié)股骨髁，肉眼觀察并用數(shù)碼相機(jī)在相同條件下記錄股骨髁負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨退變情況。大體觀察的主要內(nèi)容包括：關(guān)節(jié)軟骨面的光滑度及色澤，軟骨表面是否有裂隙、缺損或潰瘍及其程度，是否有軟骨下骨外露等。
1.2.4.2組織切片觀察
(1)HE染色
具體方法同前。
(2)甲苯胺藍(lán)染色
具體方法同前。
(3)Mankin’s組織學(xué)評分
具體方法同前。
1.2.4.3免疫組織化學(xué)觀察
取組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察軟骨組織中Collagen Ⅱ、MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)情況，并通過計(jì)算陽性區(qū)域平均光密度值對相應(yīng)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。
(1)免疫組織化學(xué)方法
1)將石蠟切片置于60℃烤箱烘烤20-30min復(fù)溫。
2)依次經(jīng)過二甲苯(I)→二甲苯(II)各20min，再依次經(jīng)過100％→95％→80％→70％乙醇各浸泡5min，自來水流水沖洗5min，蒸餾水沖洗1次。
3)PBS清洗3次，每次5min。
4)每張切片滴加適量3％H2O2，室溫下孵育10min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶。
5)PBS清洗3次，每次5min。
6)滴加適當(dāng)稀釋比例的一抗30μl，充分覆蓋組織，放入濕盒中在4℃冰箱中過夜。
7)37℃烤箱中復(fù)溫，20min，PBS清洗3次，每次5min。
8)去除PBS，每張切片滴加30μl二抗工作液，室溫下孵育30min。
9)PBS清洗3次，每次5min。
10)去除PBS，每張切片滴加30μl新鮮配制的DAB，室溫下染色5-10min，顯微鏡下觀察染色程度，適時(shí)終止染色，自來水沖洗30min。
11)蘇木精染色液復(fù)染5min，0.5％鹽酸乙醇分化10s，自來水沖洗15min返藍(lán)。
12)依次經(jīng)過95％乙醇(I)→95％乙醇(II)各5min，調(diào)色脫水，再依次經(jīng)過100％乙醇(I)→100％乙醇(II)→二甲苯(I)→二甲苯(II)各5min，自來水沖洗5min，透明。
13)中性樹膠封片。
(2)免疫組織化學(xué)結(jié)果分析
各組免疫組織化學(xué)染色切片均在同一條件下拍攝并保存圖片，采用Image-Pro Plus(IPP)6.0軟件在相同設(shè)置下檢測每張圖片軟骨層陽性區(qū)域總面積(Area(sum))及總積分光密度值(Integrated optical density，IOD(sum))，計(jì)算平均光密度值(Mean optical density，MOD)＝IOD(sum)/Area(sum)，對蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析。每個(gè)標(biāo)本選取3個(gè)陽性區(qū)域進(jìn)行檢測 計(jì)算后取平均值，最后應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對組間差異情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
1.3統(tǒng)計(jì)分析
采用Excel收集數(shù)據(jù)，SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，p<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1大鼠膝OA模型鑒定
2.1.1大鼠膝OA建模后一般情況
大鼠膝OA建模手術(shù)平均時(shí)間10.60±1.80min，所有大鼠均在術(shù)后2h內(nèi)清醒，手術(shù)切口均在術(shù)后1周內(nèi)愈合，無關(guān)節(jié)感染及死亡大鼠。
2.1.2大體觀察結(jié)果
建模手術(shù)后第4、8及12周時(shí)各處死大鼠3只，另取3只正常大鼠做正常對照。暴露股骨髁后肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨退變程度并用數(shù)碼相機(jī)拍照記錄，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)典型關(guān)節(jié)軟骨圖像。
正常大鼠：股骨髁軟骨面光滑，色澤明亮。
術(shù)后4周：股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨表面粗糙，色澤變淡，未見明確破損及潰瘍形成，無明顯骨贅形成。
術(shù)后8周：股骨內(nèi)側(cè)髁負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨明顯磨損，部分大鼠關(guān)節(jié)面出現(xiàn)潰瘍、軟骨缺損、軟骨下骨質(zhì)外露等，周圍可見骨贅形成。
術(shù)后12周：股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨嚴(yán)重磨損，軟骨下骨質(zhì)外露，周圍可見明顯骨贅形成。
2.1.3組織化學(xué)結(jié)果
取股骨內(nèi)側(cè)髁經(jīng)病理切片后行HE及甲苯胺藍(lán)染色，并采用Mankin’s組織學(xué)評分對軟骨退變進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果如下。
(1)HE染色
各個(gè)時(shí)間點(diǎn)典型HE染色圖像。
正常大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨：經(jīng)HE染色后，軟骨基質(zhì)染色均一、呈粉紅色，軟骨細(xì)胞分布規(guī)則、呈藍(lán)色。關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)分明，可分為表層、移行層、輻射層及鈣化層。表層軟骨細(xì)胞體積較小，呈扁平狀排列；移行層及輻射層軟骨細(xì)胞逐漸變大變圓，排列稀疏；鈣化層軟骨細(xì)胞體積最大，緊貼潮線呈類柱狀排列。
術(shù)后4周：軟骨表面纖維組織覆蓋明顯，表層及中層細(xì)胞收縮，部分關(guān)節(jié)面軟骨細(xì)胞脫落，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞整體上呈彌漫性增多，并伴有大量簇集細(xì)胞團(tuán)，潮線模糊，部分?jǐn)嗔选?/p>
術(shù)后8周：關(guān)節(jié)軟骨破壞至鈣化層和軟骨下骨交界處，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，并可見壞死崩解細(xì)胞，潮線結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂。
術(shù)后12周：關(guān)節(jié)軟骨破壞進(jìn)一步加重，軟骨破壞至軟骨下骨層，軟骨下骨外露，關(guān)節(jié)面破壞區(qū)見纖維覆蓋，極少軟骨細(xì)胞殘留，潮線消失。
(2)甲苯胺藍(lán)染色
各個(gè)時(shí)間點(diǎn)典型甲苯胺藍(lán)染色圖像。
正常大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨：經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，軟骨基質(zhì)染色均一、呈深藍(lán)色色，軟骨細(xì)胞分布規(guī)則。關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)分明。
術(shù)后4周：軟骨表面纖維組織覆蓋明顯，表層及中層細(xì)胞收縮，部分脫落，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，伴有簇集細(xì)胞團(tuán)，潮線模糊，部分?jǐn)嗔眩浌腔|(zhì)著色輕度到中度降低。
術(shù)后8周：關(guān)節(jié)軟骨磨損加重，軟骨表面破損，部分可達(dá)輻射層，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，潮線結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂，軟骨基質(zhì)著色中度到重度降低。
術(shù)后12周：關(guān)節(jié)軟骨破壞進(jìn)一步加重，極少軟骨細(xì)胞殘留，軟骨破壞至鈣化層甚至軟骨下骨交界處，大面積軟骨下骨外露，潮線消失，殘留基質(zhì)著色重度降低甚至不著色。
(3)Mankin’s組織學(xué)評分
建模術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s組織學(xué)評分見表8。正常大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin's評分為0，建模術(shù)后4、8及12周分別為6.50±1.52、10.17±0.75及12.83±0.75。
表8建模后不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s組織學(xué)評分比較
2.2miRNA-140關(guān)節(jié)腔注射對大鼠膝軟骨退變的影響
大鼠膝OA建模術(shù)后1周時(shí)，手術(shù)切口基本愈合(同前)，此時(shí)麻醉大鼠后，通過關(guān)節(jié)腔穿刺注射50nmol/100μl miRNA-140agomir或miRNA-140control，觀察大鼠一般情況。建模手術(shù)后第4、8及12周時(shí)兩組各處死大鼠6只，6只正常大鼠作為對照。通過大體觀察、組織切片染色及免疫組織化學(xué)染色觀察并比較miRNA-140agomir及miRNA-140control關(guān)節(jié)腔注射后大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變情況。
2.2.1關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140后大鼠一般情況
所有大鼠均在關(guān)節(jié)腔穿刺術(shù)后2h內(nèi)清醒。直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir或miRNA-140control大鼠均未出現(xiàn)關(guān)節(jié)感染或死亡等并發(fā)癥。因此，關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140安全、可行。
2.2.2大體觀察結(jié)果
各個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩組典型關(guān)節(jié)軟骨圖像。正常大鼠股骨髁軟骨面光滑，色澤明亮。
miRNA-140control組術(shù)后4周股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨表面變得粗糙，色澤變暗；術(shù)后8周時(shí)股骨內(nèi)側(cè)髁負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨明顯磨損，部分出現(xiàn)潰瘍、軟骨缺損及骨贅形成；術(shù)后12周時(shí)股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨磨損嚴(yán)重，軟骨下骨質(zhì)大面積外露，周圍可見明顯骨贅形成。
miRNA-140agomir組術(shù)后4周時(shí)股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨表面仍光滑，色澤偏暗，關(guān)節(jié)面無破損及潰瘍形成，無明顯骨贅形成；術(shù)后8周股骨內(nèi)側(cè)髁負(fù)重區(qū)關(guān)節(jié)軟骨表面稍顯粗糙，偶見小潰瘍及骨贅形成；術(shù)后12周時(shí)股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨磨損，表面粗糙，部分可見潰瘍及骨贅形成。因此，從大體上觀察，關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可明顯延緩大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變進(jìn)程。
2.2.3組織學(xué)結(jié)果
(1)HE染色
兩組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)典型HE染色圖像。正常大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)HE染色后，軟骨基質(zhì)染色均一，軟骨細(xì)胞分布規(guī)則，關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)分明。
miRNA-140control組術(shù)后4周軟骨表面可見纖維組織覆蓋，軟骨層變薄，部分細(xì)胞收縮、關(guān)節(jié)面軟骨細(xì)胞脫落，軟骨細(xì)胞整體上增多，并伴有簇集細(xì)胞團(tuán)，潮線模糊，部分?jǐn)嗔眩恍g(shù)后8周時(shí)可見關(guān)節(jié)軟骨破壞，部分深達(dá)鈣化層或軟骨下骨交界處，軟骨層內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯減少并可見壞死細(xì)胞，潮線結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂；術(shù)后12周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨破壞進(jìn)一步加重，軟骨層磨損殆盡，極少軟骨細(xì)胞殘留，軟骨下骨外露，部分關(guān)節(jié)面破壞區(qū)可見纖維覆蓋，潮線消失。
miRNA-140agomir組術(shù)后4周軟骨結(jié)構(gòu)基本正常，軟骨細(xì)胞無明顯變化或輕度增多，未見明顯細(xì)胞簇集現(xiàn)象，潮線完整；術(shù)后8周時(shí)軟骨層稍變薄，表面粗糙，軟骨細(xì)胞數(shù)量正?；蜉p度減少，部分可見簇集細(xì)胞團(tuán)，部分潮線紊亂；術(shù)后12周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨破壞加重，部分表層脫落，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，潮線結(jié)構(gòu)紊亂、斷裂。
(2)甲苯胺藍(lán)染色
兩組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)典型甲苯胺藍(lán)染色圖像。正常大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，軟骨基質(zhì)染色均一，軟骨細(xì)胞分布規(guī)則，關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)分明。
miRNA-140control組術(shù)后4周可見軟骨細(xì)胞數(shù)量增多伴有簇集細(xì)胞團(tuán)，軟骨基質(zhì)著色輕度到中度降低；術(shù)后8周時(shí)關(guān) 節(jié)軟骨層進(jìn)一步變薄，軟骨破壞進(jìn)一步加深，軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯減少，軟骨基質(zhì)著色重度降低，部分重度降低；術(shù)后12周時(shí)軟骨層幾乎全部磨損，極少軟骨細(xì)胞殘留，大面積軟骨下骨外露，殘留基質(zhì)著色重度降低甚至不著色。
miRNA-140agomir組4周時(shí)軟骨細(xì)胞數(shù)量無明顯減少，軟骨基質(zhì)著色正常后輕度降低；術(shù)后8周時(shí)關(guān)節(jié)軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，軟骨基質(zhì)著色輕到中度降低；術(shù)后12周時(shí)軟骨磨損加重，軟骨層變薄，表面粗糙，細(xì)胞數(shù)量減少，基質(zhì)著色中到重度降低。
(3)Mankin’s組織學(xué)評分
兩組在不同時(shí)間點(diǎn)的Mankin’s組織學(xué)評分見表9，各時(shí)間點(diǎn)miRNA-140agomir組Mankin’s評分明顯均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。可見，組織學(xué)觀察進(jìn)一步證實(shí)了關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可明顯延緩大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變進(jìn)程。
表9兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s組織學(xué)評分比較
2.2.4免疫組織化學(xué)結(jié)果
OA建模手術(shù)后第4、8及12周時(shí)各處死大鼠6只，取股骨內(nèi)側(cè)髁經(jīng)組織切片后行免疫組織化學(xué)法檢測，光鏡下觀察軟骨組織中Collagen Ⅱ、MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)情況，陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，通過IPP6.0軟件計(jì)算陽性區(qū)域平均光密度值(MOD)值實(shí)現(xiàn)蛋白表達(dá)半定量分析，并比較miRNA-140agomir組與miRNA-140control組Collagen Ⅱ、MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)。
(1)關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir對軟骨組織中Collagen Ⅱ表達(dá)的調(diào)控作用
光鏡下觀察軟骨組織中Collagen Ⅱ蛋白表達(dá)情況，正常大鼠軟骨組織中可見大量棕黃色陽性表達(dá)，主要位于表層、移行層和輻射層。
miRNA-140control組在術(shù)后4周陽性表達(dá)明顯減弱，移行層和輻射層減弱更明顯；術(shù)后8周時(shí)陽性表達(dá)進(jìn)一步減弱，僅在破壞的軟骨表層及移行層可見少量陽性表達(dá)；在術(shù)后12周時(shí)，軟骨層消失殆盡，僅殘留極少量的軟骨細(xì)胞伴微弱的陽性表達(dá)。
miRNA-140agomir組在術(shù)后4周仍可見較強(qiáng)的陽性表達(dá)；術(shù)后8周時(shí)陽性表達(dá)減弱，主要是輻射層表達(dá)減弱；術(shù)后12周時(shí)陽性表達(dá)進(jìn)一步減弱，但在不規(guī)整的軟骨表層仍可見到一定的陽性表達(dá)。
MOD定量分析結(jié)果提示，miRNA-140agomir組術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MOD值均顯著高于miRNA-140control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表10)。由此說明，隨關(guān)節(jié)軟骨退變程度加重，軟骨組織中Collagen Ⅱ表達(dá)逐漸減少；而在關(guān)節(jié)軟骨退變過程中通過關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可顯著減慢軟骨組織中Collagen Ⅱ蛋白丟失。
表10不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠軟骨組織中Collagen Ⅱ表達(dá)比較(MOD，×10-3)
(2)關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir對軟骨組織中MMP13表達(dá)的調(diào)控作用
光鏡下觀察軟骨組織中MMP13蛋白表達(dá)情況，正常大鼠軟骨組織中可見很少量棕黃色陽性表達(dá)，散在分布于移行層和輻射層。
miRNA-140control組在術(shù)后4周陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，深層增強(qiáng)更明顯；術(shù)后8周時(shí)陽性表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，破壞的關(guān)節(jié)面中也可見強(qiáng)陽性表達(dá)；在術(shù)后12周時(shí)，軟骨層磨損嚴(yán)重，在殘存的軟骨組織中可見強(qiáng)陽性表達(dá)。
miRNA-140agomir組在術(shù)后4周可見較明顯的陽性表達(dá)，但較對照組低；術(shù)后8周時(shí)陽性表達(dá)有所增強(qiáng)，軟骨深層增強(qiáng)更明顯；術(shù)后12周時(shí)軟骨淺層陽性表達(dá)增強(qiáng)。
MOD定量分析結(jié)果提示，miRNA-140agomir組術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MOD值顯著低于miRNA-140control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表11)。由此說明，MMP13在正常軟骨組織中呈低水平表達(dá)，隨關(guān)節(jié)軟骨退變程度加重，軟骨組織中MMP13表達(dá)逐漸增加；而在關(guān)節(jié)軟骨退變過程中通過關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可顯著抑制軟骨組織中MMP13蛋白表達(dá)。
表11不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠軟骨組織中MMP13表達(dá)比較(MOD，×10-3)
(3)關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir對軟骨組織中ADAMTS-5表達(dá)的調(diào)控作用
正常大鼠軟骨組織中可見少量棕黃色顆粒表達(dá)，散在分布于軟骨組織全層。
miRNA-140control組在術(shù)后4周陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，表層明顯；術(shù)后8周時(shí)陽性表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，淺層表達(dá)強(qiáng)于深層；在術(shù)后12周時(shí)，軟骨層明顯變薄，在殘存的軟骨組織中可見強(qiáng)陽性表達(dá)。
miRNA-140agomir組在術(shù)后4-8周時(shí)陽性表達(dá)有所增強(qiáng)，主要集中在深層；術(shù)后12周時(shí)軟骨全層表達(dá)明顯增強(qiáng)。
MOD定量分析結(jié)果提示，miRNA-140agomir組術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)MOD值顯著低于miRNA-140control組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)(表12)。由此說明，ADAMTS-5在正常軟骨組織中呈低水平表達(dá)，隨關(guān)節(jié)軟骨退變程度加重，軟骨組織中ADAMTS-5表達(dá)逐漸增加；而在關(guān)節(jié)軟骨退變過程中通過關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可顯著抑制軟骨組織中ADAMTS-5蛋白的表達(dá)。
表12不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠軟骨組織ADAMTS-5表達(dá)比較(MOD，×10-3)
關(guān)節(jié)軟骨退變是OA的主要特征之一，其中又以Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)及蛋白多糖(Aggrecans)等ECM降解為主。MMP-13及ADAMTS-5是基質(zhì)降解酶中最重要的水解酶，L人發(fā)現(xiàn)miRNA-140是MMP13的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子，在使用促炎因子IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞OA樣改變過程中，miRNA-140可抑制MMP13表達(dá)；他們進(jìn)一步采用熒光素酶報(bào)告基因分析發(fā)現(xiàn)miRNA-140可直接與MMP13 3’端UTR位點(diǎn)結(jié)合。M等人在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)促炎因子IL-1β干預(yù)可減少軟骨細(xì)胞miRNA-140表達(dá)、增加ADAMTS-5表達(dá)；當(dāng)通過基因轉(zhuǎn)染提高miRNA-140表達(dá)后，IL-1β的這種誘導(dǎo)作用明顯減弱。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在miRNA-140-/-小鼠中ADAMTS-5表達(dá)增加，而在miRNA-140轉(zhuǎn)基因小鼠中減少，體外熒光素酶報(bào)告基因分析也發(fā)現(xiàn)ADAMTS-53’端UTR包含有miRNA-140結(jié)合位點(diǎn)。因此，ADAMTS-5表達(dá)抑制也是miRNA-140阻止關(guān)節(jié)軟骨退變的作用機(jī)制之一。在本發(fā)明中，通過關(guān)節(jié)腔穿刺注射外源性miRNA-140，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在大鼠OA模型誘導(dǎo)過程中，關(guān)節(jié)軟骨中Collagen Ⅱ丟失較對照組明顯減慢，而MMP13及ADAMTS-5表達(dá)明顯被抑制，這與第一部分中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及既往轉(zhuǎn)基因/基因敲除動(dòng) 物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此，也可以得出結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)中關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的作用至少部分是通過抑制關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP13及ADAMTS-5表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明成功建立了大鼠OA模型，關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir安全、可行。
關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可明顯減慢大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變進(jìn)程。
關(guān)節(jié)腔注射miRNA-140agomir可顯著減慢關(guān)節(jié)軟骨組織中Collagen Ⅱ蛋白丟失，同時(shí)明顯抑制MMP13及ADAMTS-5蛋白表達(dá)，對大鼠關(guān)節(jié)軟骨退變起到明顯延緩作用。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。