本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)(又稱納米抗體技術(shù))，以及基因工程抗體技術(shù)，特別是針對組氨酸標簽的單域重鏈抗體或多肽。
技術(shù)背景
組氨酸(His)標簽，通常由6和組氨酸構(gòu)成，也稱為多組氨酸標簽，6×His標簽或hexa組氨酸標簽。組氨酸標簽常融合在目標蛋白的C端或N端，以便于目標蛋白的純化和檢測。組氨酸殘基可以在一定的緩沖液條件下特異性結(jié)合到幾種類型固定的離子上(比如鎳，鈷和銅)，然后通過更換緩沖液條件而從固定相洗脫，從而實現(xiàn)純化含有His標簽的目標蛋白。
His標簽是最常用的蛋白標簽之一，通過檢測His標簽即可獲知樣品中目標蛋白的情況。本發(fā)明公開了一種可以與His標簽特異性結(jié)合的單域重鏈抗體(即納米抗體，下同)，可用于His標簽融合蛋白的純化及檢測。
目前市場上已經(jīng)有針對His標簽的單克隆或多克隆抗體用于檢測，但單克隆抗體的研發(fā)和生產(chǎn)過程及其繁瑣和復雜，多克隆抗體來源有限。相比之下，單域重鏈抗體僅由一個結(jié)構(gòu)域組成，具有耐酸堿、耐高溫、特異性高、分子量小和可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，用單域重鏈抗體作為配基制備的純化介質(zhì)具有可重復使用、無需咪唑洗脫(免除透析操作)等優(yōu)點，應用前景廣闊。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供針對His標簽的單域重鏈抗體，可以被用于制備檢測和純化His標簽的試劑和工具。
本發(fā)明提供一個針對His標簽的單域重鏈抗體(即本發(fā)明針對組氨酸標簽的單域重鏈抗體，下同)，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的IMGT編號和結(jié)構(gòu)域的劃分包括四個框架區(qū)(Framework region,FR)和三個互補決定區(qū)(Complementarity-determining region,CDR)。
本發(fā)明提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.:1，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。
本發(fā)明還提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.:1部分結(jié)構(gòu)域，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。可以為SEQ ID NO.:2核酸分子。
本發(fā)明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達系統(tǒng)進行表達以得到相應的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達系統(tǒng)包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，或無細胞表達系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡并性，該核酸序列可以根據(jù)不同的應用目的而不同。
本發(fā)明還提供一種宿主細胞，包括所述蛋白質(zhì)或表達載體。
本發(fā)明還提供一種檢測His標簽的方法，含有本發(fā)明所述針對His標簽的單域重鏈抗體。基于本發(fā)明提供的針對His標簽的單域重鏈抗體與His標簽特異性結(jié)合的能力，建立His標簽的檢測方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，熒光免疫法(Fluoroimmunoassay,FIA)，免疫芯片法，親和層析法和免疫層析法等。
本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術(shù)進行改造，能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，該突變體能與組氨酸標簽特異性結(jié)合。
本發(fā)明還涉及前述針對His標簽的單域重鏈抗體在免疫檢測、富集以及純化中的應用。這些免疫檢測指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測。
本發(fā)明還涉及針對組氨酸標簽的免疫親和吸附材料，包括載體，搭載在載體上的配基，其特征在于該材料以針對組氨酸標簽的納米抗體作為配基，所述針對組氨酸標簽的納米抗體具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用硅球、納米磁珠等。
本發(fā)明所敘述的一些術(shù)語具有如下含義：
結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
IMGT編號：IMGT數(shù)據(jù)庫(The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一種已經(jīng)標準化的抗體氨基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(Ehrenman,F.,Q.Kaas,et.al.(2010).IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign：a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF.Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,et al.(2003).IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains Dev comp Immunol 27(1):55-77.)中的描述。
密碼子(codon)：又稱為三連體密碼子(triplet code)，指對應于某種氨基酸的核苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過程中決定該種氨基酸插入生長中多肽鏈的位置。
具體實施方式
下面通過單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應用，對本發(fā)明做進一步說明，這些具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應用范圍。
實施例1：
抗His標簽單域重鏈抗體(即針對His標簽的單域重鏈抗體)免疫文庫的構(gòu)建
將6×His標簽與牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)共價偶聯(lián)，得到6×His人工抗原6×His-BSA，取300μg 6×His-BSA與弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝(Lama pacos)進行皮下多點注射免疫。加強免疫采用150μg 6×His-BSA與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測定血清效價，選擇血清效價最高的樣品分離淋巴細胞，提取RNA。
RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進行。以RNA為模板，oligo dT為引物，參照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA第一鏈。
采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經(jīng)巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因(采用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴增cDNA，反應條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個循環(huán)，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。
將第一輪PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的DNA片段，作為第二輪PCR的模板，分別用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，進行擴增，反應條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個循環(huán)，98℃，10s，68℃，40s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。經(jīng)DNA片段回收試劑盒回收、定量，于-20℃保存?zhèn)溆?。將噬菌粒pHEN1和PCR擴增產(chǎn)物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1∶3摩爾比，在16℃，過夜連接。
表1文庫構(gòu)建及鑒定所用的引物
注：下劃線表示限制性內(nèi)切酶識別序列
連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10μL無菌水，分十次進行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。取10μL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h，采用引物M13-R和pHEN-R進行菌落PCR，計算庫容；其余部分全部涂布于24cm×24cm氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h。用10mL，2×YT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終濃度15～30％甘油，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
根據(jù)計算的庫容量結(jié)果，接種10倍庫容量的活細胞于20mL的2×YT(含2％葡萄糖，100μg/mL氨芐青霉素)，30℃，220r/min培養(yǎng)至OD600達0.5，按感染復數(shù)20∶1加入輔助噬菌體，37℃，220r/min，60min。將培養(yǎng)物離心，用50mL的2×YT(含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素)重懸沉淀，30℃，220r/min過夜培養(yǎng)后，3000g離心取上清，加入5×PEG/NaCl溶液，冰上放置1h或4℃過夜，12000rpm離心30min，重懸沉淀于含10％甘油的磷酸緩沖液(PBS，0.01M，pH 7.4)，即得到抗His標簽單域重鏈抗體免疫文庫，取10μL測定滴度，其余分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例2：
抗His標簽單域重鏈抗體的淘選與鑒定
采用固相親和淘選的方法從實施例1所得抗His標簽單域重鏈抗體免疫文庫中淘選針對His標簽的單域重鏈抗體。將6×His與卵清白蛋白(albumin，OVA)共價偶聯(lián)，得到人工抗原6×His-OVA。每孔加入100μL用PBS稀釋的人工抗原6×His-OVA，4℃，包被過夜，每輪淘選的包被濃度分別為100，75，50μg/mL；吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加入300μL 3％脫脂乳(in PBS)，37℃，封閉2h；PBS洗板6次，加入100μL噬菌體抗體文庫(約含2×1011CFU)，37℃，孵育1.5h；吸出未結(jié)合的噬菌體，用PBST(含0.5％Tween-20)洗板5次(逐輪增加5次)，再用PBS洗板10次(洗板次數(shù)逐輪增加5次)；以100μL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附在酶標孔中的噬菌體，用50μL Tris-HCl(1mol/L，pH 8.0)中和洗脫物，取10μL用于滴度測定，其余洗脫物擴增后用于下一輪淘選。
經(jīng)三輪淘選后，采用輔助噬菌體KM13對隨機挑取的單克隆進行救援，分別得到展示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接phage-ELISA測定噬菌體顆粒的結(jié)合活性和特異性，實驗設(shè)定對照，具體加樣步驟見表2。
表2間接phage-ELISA加樣表
將ELISA陽性克隆送生物技術(shù)服務公司進行序列測定，得到插入片段的DNA序列，其編碼針對His標簽的單域重鏈抗體，具體如下(SEQ ID NO.:2)：
CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGAGGAGGGTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCGCCTTCAATAACTATCCTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGACTCGAGTGGGTCTCAGGTATCTATGCTAGTGGTGGTAACCAGATGCTTGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCCTGTATTACTGTGCAATCGGACTTAAGGGCTTGACGACCACGAGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
依據(jù)DNA測序結(jié)果及密碼子表可獲得針對黃曲霉毒素的單域重鏈抗體的氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)：
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFAFNNYPMSWVRQAPGKGLEWVSGIYASGGNQMLADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCAIGLKGLTTTRGQGTQVTVSS。
實施例3：
抗His標簽單域重鏈抗體的規(guī)模制備
編碼抗His標簽單域重鏈抗體的DNA片段的獲?。?.采用限制性內(nèi)切酶SfiI/NotI，雙酶切噬菌粒pHEN-抗His標簽單域重鏈抗體基因，瓊脂糖凝膠電泳回收抗His標簽單域重鏈抗體基因；2.直接將抗His標簽單域重鏈抗體編碼序列送生物技術(shù)服務公司進行化學合成；3.設(shè)計特異性引物，通過PCR技術(shù)從羊駝(Lama pacos)來源的cDNA庫中擴增。
將得到的抗His標簽單域重鏈抗體基因片段克隆至表達載體pET25-flag(已將載體本身所帶His標簽替換為Flag標簽：DYKDDDDK)，經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗His標簽單域重鏈抗體的大腸桿菌表達質(zhì)粒。
將表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，挑取單菌落進行誘導表達。將單菌落接入4mL LBA(Luria-Bertani broth with 100μg/mL ampicillin)液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)12h；以1％培養(yǎng)基體積的接種量將其轉(zhuǎn)接到50mL LBA液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.5(約需2.5～3h)，加入終濃度0.1mM的IPTG，30℃、200r/min誘導培養(yǎng)。
誘導培養(yǎng)物8000r/min離心，在細胞沉淀中加入20mL磷酸緩沖液(pH 7.4)混勻，8000r/min離心，去上清，保留細胞沉淀；在細胞沉淀中加入10mL相同緩沖液，混勻，冰上超聲波細胞破碎處理，超聲破碎條件為200W，破碎2s，間歇3s，共240個循環(huán)，在4℃下對細胞破碎物12000r/min離心20min，取上清進行親和層析純化和SDS-PAGE電泳分析，或在上清中加入終濃度30％的甘油，混勻，保存于-20℃冰柜待用。
通過優(yōu)化誘導表達條件(如宿主菌、表達載體、誘導培養(yǎng)時間、溫度以及IPTG濃度等)，可以進一步提高目的蛋白(單域重鏈抗體)表達量，為大量制備抗His標簽單域重鏈抗體提供了途徑。
實施例4：
抗His標簽單域重鏈抗體的融合表達
將本發(fā)明抗His標簽單域重鏈抗體基因克隆至融合表達載體pAP(含有堿性磷酸酶基因)，經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗His標簽單域重鏈抗體的堿性磷酸酶融合表達質(zhì)粒。
堿性磷酸酶可以非特異性催化磷酸單酯水解生成無機磷酸和相應的醇、酚或糖類化合物。該酶常作為信號元件用于ELISA、免疫印跡、組織化學等檢測方法。融合表達質(zhì)粒將抗His標簽單域重鏈抗體融合于堿性磷酸酶的N端，參考應用實例3中的表達方法，可以在大腸桿菌中表達、純化出融合蛋白AP-抗His標簽單域重鏈抗體。
實施例5：
抗His標簽單域重鏈抗體用于親和純化材料的制備
將重組表達的抗His標簽單域重鏈抗體與固相載體瓊脂糖偶聯(lián)，具體方法如下：
將CNBr活化的瓊脂糖干膠用0.1M HCl洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯(lián)緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.4)洗滌10次，加入抗His標簽單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂糖微球)，室溫反應4h，使抗His標簽單域重鏈抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝膠微球共價偶聯(lián)。用偶聯(lián)緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.4)洗滌2次后，加入封閉液室溫反應2h以封閉未反應的活性基團。用5被膠體積的磷酸緩沖液(10mM，pH 7.4)和醋酸緩沖液(0.1M，pH 4.0)交替洗滌3次，得到共價偶聯(lián)了抗His標簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。
固相載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用硅球、納米磁珠等。