本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，特別涉及一種雜化抗癌藥物及其制備方法與應用。

背景技術：

在過去的幾年中，為了使藥物具有雙重或多重作用，將兩個藥效團雜化在一個藥物分子里的雜化藥物已經(jīng)成為新藥開發(fā)中的新熱點。由于癌癥、神經(jīng)變性疾病等許多嚴重疾病的復雜性，這些疾病很難通過一個高度選擇性的藥效團來治愈，這也是雜化藥物近年受到特別關注的原因。相較于普通藥物，雜化藥物可以用來改善分子親和力和選擇性，降低副作用等。雜化分子的組成單位可以是人工設計的或者天然有機小分子、多肽、核酸等。針對作用靶點，這些藥效團之間有望起著協(xié)同的作用。

細胞凋亡是多細胞生物體內由一系列有序信號流調控的細胞程序性死亡行為，是機體消除有害細胞、防止細胞過度增殖的正常生理過程，在生物體的生長發(fā)育、維持內環(huán)境的穩(wěn)定中起著重要的作用。研究表明，細胞凋亡機制失調是癌癥等疾病的重要病理學特征。在過去的幾十年間，盡管癌癥治療取得了一些進展，但腫瘤細胞對各種細胞毒刺激產生耐受，細胞凋亡紊亂和失調，仍然是癌癥治療不得不克服的主要障礙。

凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis,IAP)是細胞凋亡通路內抑制細胞死亡的關鍵調節(jié)因子。凋亡抑制蛋白在多種腫瘤細胞中過度表達。目前，IAPs家族包括八個成員，分別是Cp-IAP、Op-IAP、XIAP、c-IAP1、c-IAP2、NAIP、Livin/ML-IAP和Survivin，其中四種凋亡抑制蛋白XIAP、c-IAP1、c-IAP2以及ML-IAP直接參與調節(jié)細胞凋亡，這些IAPs蛋白主要是通過抑制半胱天冬酶(caspase)來抑制細胞凋亡。

Smac/DIABLO(第二個線粒體來源的胱氨酸酶激活劑/低等電點IAP直接結合蛋白)是一種從線粒體中釋放至細胞質的IAP內源性拮抗劑。Smac通過其N端的Ala-Val-Pro-Ile(AVPI)四肽基序與IAPs結合，從而移除IAPs對細胞凋亡的抑制作用，促進細胞凋亡。以AVPI四肽分子為先導化合物，設計和合成非肽類小分子Smac模擬物，以IAPs為靶點，開發(fā)誘導細胞凋亡的抗癌藥物成為癌癥治療領域的研究熱點。

技術實現(xiàn)要素：

為克服上述現(xiàn)有技術中存在的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種雜化抗癌藥物。所述的雜化抗癌藥物能拮抗細胞凋亡抑制蛋白作用以及產生醌的甲基化物中間體。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述雜化抗癌藥物的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述雜化抗癌藥物的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種雜化抗癌藥物，其結構式如式Ⅰ所示：

其中：

X選自-SCH₂-、-CH＝CH-或-(CH₂)₂-取代基中的一種：

Y選自-O-或-OCH₂O-中的一種；

R₁選自取代基中的一種；

R₂選自-CN或-ONO₂中的一種。

上述的雜化抗癌藥物的制備方法，包括下述步驟：

1)將化合物A和無機堿溶于極性有機溶劑中，懸浮液攪拌1～30分鐘，然后加入碘甲烷或碘乙烷，混合液在惰性氣體的保護下，室溫攪拌4～12小時，濃縮，所得殘留物溶于非極性有機溶劑中，有機相用水洗滌，干燥劑干燥，濃縮所得粗產品過柱純化，得到無色油狀物B；

其中，所述的化合物A、無機堿、碘甲烷或碘乙烷的摩爾比為：1：1～10：1～5；

2)-10～15℃下，將TFA的氯代烴溶液加入至化合物B的氯代烴溶液中，混合液攪拌0.3～5小時，濃縮得到粗產品胺C，-10～15℃下，將化合物C溶于干燥的氯代烴溶液中，加入叔丁氧羰基保護的氨基酸、縮合劑和添加劑，然后加入有機堿調節(jié)反應液pH至堿性，混合液室溫攪拌過夜，反應液依次用稀酸溶液、稀堿溶液、飽和食鹽水洗滌，干燥，減壓濃縮所得粗產品過柱純化，得到無色油狀物D；

其中，所述的化合物C、叔丁氧羰基保護的氨基酸、縮合劑、添加劑的摩爾比為1：1～5：1～20：0.25～20；

3)將化合物D溶于極性有機溶劑和水的混合溶劑中，加入強堿，懸浮液室溫攪拌2～7小時，濃縮，殘留物用水稀釋，用稀鹽酸溶液調節(jié)pH值至酸性，水溶液用非極性有機溶劑萃取三次，合并有機相，干燥劑干燥，濃縮得到無色油狀物E；

其中，所述的化合物D、強堿的摩爾比為1：1～5；

4)-10～15℃下，將化合物E溶于干燥氯代烴溶液中，加入有機堿或縮合劑和有機堿的混合氯代烴溶液，然后加入2-(4-(氯代甲氧基)苯基)乙腈或2-(4-(氯代甲氧基)苯基)甲基硝酸酯或2-(4-羥基苯基)乙腈或2-(4-羥基苯基)甲基硝酸酯，混合液在惰性氣體保護下，室溫攪拌過夜，濃縮得到粗產品F，-10～15℃，將TFA加入至化合物F的氯代烴溶液中，混合液攪拌0.1～5小時，濃縮，高效液相純化，冷凍干燥，得到白色成品G；

其中，所述的化合物E、2-(4-(氯代甲氧基)苯基)乙腈或2-(4-(氯代甲氧基)苯基)甲基硝酸酯或2-(4-羥基苯基)乙腈或2-(4-羥基苯基)甲基硝酸酯、有機堿、縮合劑的摩爾比為1：1～5：1～20：1～20。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的化合物A的結構通式為：其中，X為-SCH₂-、-CH＝CH-或-(CH₂)₂-中的一種。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的無機堿為K₂CO₃、Na₂CO₃、KHCO₃、NaHCO₃、KOH、NaOH或LiOH中的一種或多種。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的強堿為KOH、NaOH、Ca(OH)₂、NaH、KH或LiOH中的一種或多種。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的極性有機溶劑為DMF、DMSO、THF或MeCN中的一種或多種。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的非極性有機溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或乙醚中的一種或多種。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的惰性氣體為氮氣或氬氣。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的氯代烴溶液為二氯甲烷或氯仿。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的叔丁氧羰基保護的氨基酸為N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸、(S)-2-(叔丁氧羰基)氨基丁酸、(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丙酸或(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丁酸中的一種或多種。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的縮合劑為BOP、DCC、EDCI、DIC、PyBOP、TBTU、HBTU、HATU或TATU中的一種或多種。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的添加劑為HOBt、HOOBt或HOSu中的一種或多種。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的有機堿為三乙胺、吡啶、DBU、DIEA或N-甲基嗎啉中的一種或多種。

優(yōu)選的，上述的雜化抗癌藥物的制備方法，所述的干燥劑為無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、無水碳酸鉀或無水氯化鈣中的一種。

上述的雜化抗癌藥物作為抗癌藥物的應用。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的提供的技術方案與XIAP-BIR3的結合親和力較強，非肽特征更加明顯，且有望作用于多個抗癌靶點。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：

本發(fā)明為了加強Smac模擬物的抗癌活性，用一個新的基團替代Smac模擬物碳端的疏水性基團，設計和合成了一類雜化抗癌藥物。所引入的新基團不僅與凋亡抑制蛋白作用，還能在酯酶的水解作用下，生成醌的甲基化物。醌的甲基化物中間體高度親電，可以參與多項生理過程，誘導細胞死亡以及抑制細胞生長。因此，該類雜化藥物包括兩個藥效團：一個藥效團與IAPs結合，拮抗IAPs對細胞凋亡的抑制作用；另一個藥效團產生醌的甲基化物中間體，參與多項生理過程。因此，本發(fā)明所設計及合成的雜化抗癌藥物與XIAP-BIR3的結合親和力較強，非肽特征更加明顯，可以作用于多個靶點，起著多重功效。

附圖說明

圖1是化合物G₁的¹H NMR檢測譜圖；

圖2是化合物G₂的¹H NMR檢測譜圖；

圖3是化合物G₃的¹H NMR檢測譜圖；

圖4是化合物G₁與XIAP-BIR3競爭性結合抑制曲線；

圖5是化合物G₁與TRAIL對MDA-MB-231細胞凋亡的協(xié)同作用。

具體實施方式

下面結合具體實施方式，對本發(fā)明的權利要求做進一步的詳細說明，但是不構成對本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權利要求保護范圍內所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的權利要求保護范圍之內。

所有試劑未經(jīng)特別說明，均為市售分析純，無進一步純化，直接使用。無水無氧反應的玻璃儀器在使用前，在烘箱中干燥，反應在Ar保護下進行。溶劑重蒸均在Ar保護下進行，THF在金屬鈉和二苯甲酮的條件下干燥，二氯甲烷、乙酸乙酯用氫化鈣干燥。柱層析使用63～200目硅膠，薄層層析使用Merck TLC silica gel 60F254塑料色譜板，用254nm紫外光照、或碘蒸氣、或2％茚三酮的乙醇溶液顯色檢測。核磁共振譜使用Bruker AVANCE III 400NMR譜儀測定，化學位移值以ppm為單位記錄。質譜使用LCT Premier XE型飛行時間質譜儀測定。旋光值用JASCO P-1010旋光儀測定。

高效液相色譜(HPLC)條件：(1)制備型HPLC：Perkin Elmer Series 200UV/VIS檢測器；Perkin Elmer Series 200二相泵；真空除氣器；Gilson FC203b餾分接收儀；(2)分析型HPLC：Perkin Elmer Series 225自動進樣器；Perkin Elmer Series 220UV/VIS檢測器；Perkin Elmer Series 200四相泵；真空除氣器。流動相：(1)流動相A：水+0.045％TFA；(2)流動相B：10％水+90％乙腈+0.038％TFA。

實施例1(雜化抗癌藥物G₁)

化合物A₁(A₁的結構式見式Ⅱ中所示)的合成方法參照中國專利201610036840.2第[0046]至[0083]段的制備方法。

(5R,8S,10aR)-5-((叔丁氧甲酰胺基)-6-羰基硫雜氮雜卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酸甲酯(化合物B₁)的制備：

將化合物A₁(36mg,0.10mmol)和K₂CO₃(69mg,0.50mmol)溶于DMF(2mL)中。懸浮液攪拌15分鐘，然后加入碘甲烷(31μL,0.50mmol)?；旌弦涸贏r保護下，室溫攪拌8小時，濃縮，所得殘留物溶于乙酸乙酯中。有機相用水洗滌，無水硫酸鎂干燥，濃縮所得粗產品過柱純化(環(huán)己烷/乙酸乙酯＝3/1)，得到無色油狀物B₁(28mg,78％)，反應化學方程式見式Ⅱ所示。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.87(d,J＝6.9Hz,1H),4.71-4.66(m,1H),4.61-4.56(m,1H),4.49(t,J＝9.0Hz,1H),3.74(s,3H),2.96-2.88(m,2H),2.75-2.67(m,2H),2.43-2.36(m,1H),2.14-1.91(m,3H),1.80(dd,J＝11.7,6.7Hz,1H),1.75-1.66(m,1H),1.40(s,9H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ173.29,170.41,154.97,80.06,59.67,56.82,56.34,52.63,38.43,31.40,30.49,28.64,27.04.

(5R,8S,10aR)-5-((S)-2-(叔丁氧甲酰胺基)丙酰胺基)-6-羰基硫雜氮雜卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酸甲酯(化合物D₁)的制備：

-10℃下，將TFA(300μL)的二氯甲烷溶液(1mL)加入至化合物B₁(28mg,0.08mmol)的二氯甲烷溶液(2mL)中?；旌弦簲嚢?h，濃縮得到化合物胺C₁。-10℃下，將所得的化合物C₁溶于干燥的二氯甲烷(3mL)中，加入Boc-Ala-OH(15mg,0.08mmol)、EDCI(307mg,1.6mmol)、HOBt(216mg,1.6mmol)，然后加入DIEA調節(jié)反應液至堿性?；旌弦菏覝財嚢柽^夜，反應液依次用稀鹽酸溶液、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水洗滌。有機相用無水硫酸鎂干燥，減壓濃縮，所得粗產品過柱純化(環(huán)己烷/丙酮＝3/1)，得到無色油狀物D₁(25mg，兩步反應總產率73％)，反應化學方程式見式Ⅲ。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.33(d,J＝4.2Hz,1H),5.02(d,J＝6.1Hz,1H),4.81-4.76(m,1H),4.72-4.67(m,1H),4.49(t,J＝9.0Hz,1H),4.19-4.05(m,1H),3.74(s,3H),2.98-2.86(m,2H),2.76-2.65(m,2H),2.44-2.37(m,1H),2.15-1.92(m,3H),1.81(dd,J＝11.8,6.8Hz,1H),1.72(tt,J＝13.9,4.5Hz,1H),1.42(s,9H),1.32(d,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ173.18,171.85,169.90,155.52,80.38,59.72,56.39,55.76,52.67,50.63,38.01,37.09,31.54,31.38,28.62,27.02,19.13.

(5R,8S,10aR)-5-((S)-2-(叔丁氧甲酰胺基)丙酰胺基)-6-羰基硫雜氮雜卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酸(化合物E₁)的制備：

將化合物D₁(25mg,0.06mmol)溶于MeCN/H₂O(1:1，2mL)的混合溶劑中，加入KOH(3.3mg,0.06mmol)。懸浮液室溫攪拌2小時，濃縮，殘留物用水稀釋，用稀鹽酸溶液調節(jié)pH值至2。水溶液用乙酸乙酯萃取三次，合并有機相，無水硫酸鎂干燥，濃縮得到無色油狀物E₁(23mg,95％)。無需進一步純化，直接進行下一步反應。反應化學方程式見式Ⅳ。

¹H NMR(400MHz,MeOD):δ4.84(dd,J＝10.1,2.3Hz,1H),4.76-4.71(m,1H),4.48(t,J＝8.8Hz,1H),4.08(q,J＝7.2Hz,1H),2.98-2.72(m,4H),2.49-2.43(m,1H),2.20-2.00(m,3H),1.86(dd,J＝11.1,6.1Hz,1H),1.80-1.72(m,1H),1.46(s,9H),1.33(d,J＝7.2Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,MeOD):δ177.10,175.63,172.01,158.56,81.59,62.07,58.77,57.62,52.57,38.94,38.71,32.69,32.16,29.55,28.76,18.87.

(5R,8S,10aR)-(4-(氰甲基)苯氧基)甲基5-((S)-2-氨基丙酰胺基)-6-羰基硫雜氮雜卓[1,5]并吡咯烷[2,1-d]-8-羧酸酯三氟乙酸鹽(G₁)的制備：

-10℃下，將化合物E₁(23mg,0.06mmol)溶于干燥二氯甲烷溶液(3mL)中，加入三乙胺(8μL,0.06mmol)，然后加入2-(4-(氯代甲氧基)苯基)乙腈(11mg,0.06mmol)的干燥二氯甲烷溶液(2mL)。混合液在Ar保護下室溫攪拌過夜，濃縮得到粗產品F ₁。-10℃下，將化合物F₁溶于二氯甲烷(2mL)中，加入TFA(300μL)的二氯甲烷溶液(1mL)，混合液攪拌5小時，濃縮所得殘留物經(jīng)HPLC純化，冷凍干燥，得到白色固體G₁(7.8mg,兩步總產率23％)。反應化學方程式見式Ⅴ?；衔颎₁的¹H NMR檢測譜圖如圖1所示。

¹H NMR(400MHz,D₂O):δ7.27(d,J＝8.8Hz,2H),7.01(d,J＝8.8Hz,2H),5.84,5.76(ABq,J＝6.8Hz,2H),4.49-4.44(m,1H),4.35(t,J＝9.1Hz,1H),3.97(q,J＝7.1Hz,1H),3.76(s,2H),2.76(dd,J＝14.1,3.0Hz,1H),2.67(dt,J＝15.6,4.5Hz,1H),2.32-2.24(m,3H),2.07-1.97(m,1H),1.93-1.83(m,1H),1.72-1.62(m,3H),1.36(d,J＝7.1Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,D₂O):δ172.82,172.77,170.92,170.88,169.81,169.77,155.11,155.05,129.72,129.67,125.71,125.63,120.19,120.13,117.22,117.14,86.23,86.15,60.62,60.57,57.94,57.88,54.70,54.65,48.91,48.83,35.94,35.88,34.73,34.66,30.89,30.83,29.48,29.42,26.47,26.41,22.03,21.98,16.44,16.39；MS(ESI):m/z 461.2(M+H)⁺；HR ESI MS for C₂₂H₂₉N₄O₅S required 461.1859,found:461.1880.

實施例2(雜化抗癌藥物G₂)

化合物A₂(A₂的結構式見式Ⅵ中所示)的合成方法參照Duggan,H.M.等人在Organic&biomolecular chemistry(《有機和生物分子化學》)雜志2005年第3期2287頁報道的方法。

(3S,6S,10aR)-6-(叔丁氧甲酰胺基)-5-羰基-1,2,3,5,6,7,10,10a-八氫吡咯并[1,2-a]氮雜環(huán)辛烯-3-羧酸乙酯(化合物B₂)的制備：

將化合物A₂(32mg,0.10mmol)和Na₂CO₃(106mg,1.00mmol)溶于DMSO(2mL)中。懸浮液攪拌30分鐘，然后加入碘乙烷(8μL,0.10mmol)?；旌弦涸贜₂保護下，室溫攪拌4小時，濃縮，所得殘留物溶于二氯甲烷中。有機相用水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮所得粗產品過柱純化(環(huán)己烷/乙酸乙酯＝6/1)，得到無色油狀物B₂(25mg,72％)。反應化學方程式見式Ⅵ。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.83-5.72(m,1H),5.72-5.62(m,1H),5.56(d,J＝7.5Hz,1H),4.86-4.76(m,1H),4.50-4.39(m,1H),4.12(q,J＝7.1Hz,3H,containing 1H),2.76-2.70(m,2H),2.45-2.33(m,1H),2.32-2.19(m,1H),2.15-2.06(m,1H),2.06-1.98(m,1H),1.98-1.82(m,2H),1.39(s,9H),1.22(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ171.89,171.05,155.23,129.32,125.92,79.58,60.97,60.38,58.74,51.91,35.37,33.03,32.97,28.42(3C),27.29,14.21.

(3S,6S,10aR)-6-((S)-2-(叔丁氧甲酰胺基)丙酰胺基)-5-羰基-1,2,3,5,6,7,10,10a-八氫吡咯并[1,2-a]氮雜環(huán)辛烯-3-羧酸乙酯(化合物D₂)的制備：

0℃下，將TFA(300μL)的二氯甲烷溶液(1mL)加入至化合物B₂(28mg,0.08mmol)的二氯甲烷溶液(2mL)中。混合液攪拌2.5h，濃縮得到化合物胺C₂。0℃下，將所得的化合物C₂溶于干燥的二氯甲烷(3mL)中，加入Boc-Ala-OH(38mg,0.20mmol)、BOP(35mg,0.08mmol)、HOOBt(3mg,0.02mmol)，然后加入NEt₃調節(jié)反應液至堿性?；旌弦菏覝財嚢柽^夜，反應液依次用飽和氯化銨溶液、飽和碳酸氫鉀溶液、飽和食鹽水洗滌。有機相用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，所得粗產品過柱純化(環(huán)己烷/乙酸乙酯＝5/1)，得到無色油狀物D₂(26mg，兩步反應總產率77％)。反應化學方程式見式Ⅶ。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.06(d,J＝5.7Hz,1H),5.93-5.78(m,1H),5.78-5.62(m,1H),5.13-4.90(m,2H),4.46(dd,J＝8.9,3.9Hz,1H),4.28-4.05(m,4H),2.87-2.66(m,2H),2.54-2.38(m,1H),2.38-2.24(m,1H),2.24-2.08(m,1H),2.08-1.82(m,3H),1.43(s,9H),1.33(d,J＝7.0Hz,3H),1.26(t,J＝7.1Hz,3H).

(3S,6S,10aR)-6-((S)-2-(叔丁氧甲酰胺基)丙酰胺基)-5-羰基-1,2,3,5,6,7,10,10a-八氫吡咯并[1,2-a]氮雜環(huán)辛烯-3-羧酸(化合物E₂)的制備：

將化合物D₂(25mg,0.06mmol)溶于THF/H₂O(1:1，2mL)的混合溶劑中，加入LiOH(4.3mg,0.18mmol)。懸浮液室溫攪拌4.5小時，濃縮，殘留物用水稀釋，用稀鹽酸溶液調節(jié)PH值至2。水溶液用二氯甲烷萃取三次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，濃縮得到無色油狀物E₂(22mg,93％)。無需進一步純化，直接進行下一步反應。反應化學方程式見式Ⅷ。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ9.55(bs,1H),7.63(bs,1H),7.50(bs,1H),5.96-5.62(m,2H),5.35-5.14(m,1H),4.71-4.45(m,1H),4.33-4.08(m,2H),3.00-2.70(m,2H),2.54-2.32(m,1H),2.32-2.14(m,2H),2.14-1.98(m,2H),1.98-1.84(m,1H),1.44(d,J＝5.0Hz,9H),1.37(dd,J＝6.9,3.5Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ172.33,155.85,129.25,125.94,80.54,60.73,59.29,50.52,49.93,34.59,33.07,32.78,28.46,26.59,19.56,14.33.

(3S,6S,10aR)-(4-乙氰基苯基)-6-((S)-2-氨基丙酰胺基)-5-羰基-1,2,3,5,6,7,10,10a-八氫吡咯并[1,2-a]氮雜環(huán)辛烷-3-羧酸酯三氟乙酸鹽(G₂)的制備：

0℃下，將化合物E₂(22mg,0.06mmol)溶于干燥的氯仿(5mL)中，加入EDCI(115mg,0.60mmol)和DIEA(99μL,0.60mmol)的混合氯仿溶液，然后加入2-(4-羥基苯基)乙腈(24mg,0.18mmol)，混合液室溫攪拌過夜。減壓抽干溶劑，得到淡黃色油狀物F₂。將F₂溶于氯仿(3mL)，冷至0℃，滴加TFA(0.5mL)，2.5h后，蒸干溶劑，濃縮所得殘留物經(jīng)HPLC純化，冷凍干燥，得到白色固體G₂(3.1mg,兩步反應總產率10％)。反應化學方程式見式Ⅸ?；衔颎₂的¹H NMR檢測譜圖如圖2所示。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.70(bs,1H),7.32(d,J＝8.3Hz,2H),7.07(d,J＝8.3Hz,2H),5.85-5.51(m,2H),5.16-5.04(m,1H),4.64(d,J＝5.9Hz,1H),4.33-4.16(m,1H),4.16-3.99(m,1H),3.72(s,2H),2.86-2.59(d,J＝14.8Hz,2H),2.51-2.34(m,1H),2.25-2.20(m,2H),2.20-2.07(m,3H),2.06-1.90(m,2H),1.55-1.43(m,3H).MS(ESI):m/z 411.2(M+H)⁺；HR ESI MS for C₂₂H₂₇N₄O₄required 411.1954,found:411.1932.

實施例3(雜化抗癌藥物G₃)

化合物A₂(A₂的結構式見式Ⅹ中所示)的合成方法參照Duggan,H.M.等人在Organic&biomolecular chemistry(《有機和生物分子化學》)雜志2005年第3期2287頁報道的方法。

(3S,6S,10aR)-6-(叔丁氧甲酰胺基)-5-羰基-1,2,3,5,6,7,10,10a-八氫吡咯并[1,2-a]氮雜環(huán)辛烯-3-羧酸乙酯(化合物B₂)的制備：

將化合物A₂(32mg,0.10mmol)和KOH(6mg,0.10mmol)溶于THF(2mL)中。懸浮液攪拌1分鐘，然后加入碘乙烷(20μL,0.25mmol)。混合液在N₂保護下，室溫攪拌12小時，濃縮，所得殘留物溶于氯仿中。有機相用水洗滌，無水碳酸鉀干燥，濃縮所得粗產品過柱純化(環(huán)己烷/乙酸乙酯＝6/1)，得到無色油狀物B₂(29mg,82％)。反應化學方程式見式Ⅹ。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ5.83-5.72(m,1H),5.72-5.62(m,1H),5.56(d,J＝7.5Hz,1H),4.86-4.76(m,1H),4.50-4.39(m,1H),4.12(q,J＝7.1Hz,3H,containing 1H),2.76-2.70(m,2H),2.45-2.33(m,1H),2.32-2.19(m,1H),2.15-2.06(m,1H),2.06-1.98(m,1H),1.98-1.82(m,2H),1.39(s,9H),1.22(t,J＝7.1Hz,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3):δ171.89,171.05,155.23,129.32,125.92,79.58,60.97,60.38,58.74,51.91,35.37,33.03,32.97,28.42(3C),27.29,14.21.

(3S,6S,10aR)-6-((S)-2-(叔丁氧甲酰胺基)丙酰胺基)-5-羰基-1,2,3,5,6,7,10,10a-八氫吡咯并[1,2-a]氮雜環(huán)辛烯-3-羧酸乙酯(化合物D₂)的制備：

15℃下，將TFA(300μL)的氯仿溶液(1mL)加入至化合物B₂(28mg,0.08mmol)的氯仿溶液(2mL)中?；旌弦簲嚢?.3h，濃縮得到化合物胺C₂。15℃下，將所得的化合物C₂溶于干燥的氯仿(3mL)中，加入Boc-Ala-OH(76mg,0.40mmol)、DCC(165mg,0.80mmol)、HOSu(92mg,0.80mmol)，然后加入DBU調節(jié)反應液pH至堿性?；旌弦菏覝財嚢柽^夜，反應液依次用飽和氯化銨溶液、飽和碳酸氫鉀溶液、飽和食鹽水洗滌。有機相用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，所得粗產品過柱純化(環(huán)己烷/乙酸乙酯＝5/1)，得到無色油狀物D₂(23mg，兩步反應總產率68％)。反應化學方程式見式Ⅺ。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.06(d,J＝5.7Hz,1H),5.93-5.78(m,1H),5.78-5.62(m,1H),5.13-4.90(m,2H),4.46(dd,J＝8.9,3.9Hz,1H),4.28-4.05(m,4H),2.87-2.66(m,2H),2.54-2.38(m,1H),2.38-2.24(m,1H),2.24-2.08(m,1H),2.08-1.82(m,3H),1.43(s,9H),1.33(d,J＝7.0Hz,3H),1.26(t,J＝7.1Hz,3H).

(3S,6S,10aR)-6-((S)-2-(叔丁氧甲酰胺基)丙酰胺基)-5-羰基-1,2,3,5,6,7,10,10a-八氫吡咯并[1,2-a]氮雜環(huán)辛烯-3-羧酸(化合物E₂)的制備：

將化合物D₂(25mg,0.06mmol)溶于MeCN/H₂O(1:1，2mL)的混合溶劑中，加入NaOH(12mg,0.30mmol)。懸浮液室溫攪拌7小時，濃縮，殘留物用水稀釋，用稀鹽酸溶液調節(jié)pH值至2。水溶液用氯仿萃取三次，合并有機相，無水碳酸鉀干燥，濃縮得到無色油狀物E₂(20mg,84％)。無需進一步純化，直接進行下一步反應。反應化學方程式見式Ⅻ。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ9.55(bs,1H),7.63(bs,1H),7.50(bs,1H),5.96-5.62(m,2H),5.35-5.14(m,1H),4.71-4.45(m,1H),4.33-4.08(m,2H),3.00-2.70(m,2H),2.54-2.32(m,1H),2.32-2.14(m,2H),2.14-1.98(m,2H),1.98-1.84(m,1H),1.44(d,J＝5.0Hz,9H),1.37(dd,J＝6.9,3.5Hz,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃):δ172.33,155.85,129.25,125.94,80.54,60.73,59.29,50.52,49.93,34.59,33.07,32.78,28.46,26.59,19.56,14.33.

(3S,6S,10aR)-(4-硝酸酯亞甲基苯基)-6-((S)-2-氨基丙酰胺基)-5-羰基-1,2,3,5,6,7,10,10a-八氫吡咯并[1,2-a]氮雜環(huán)辛烷-3-羧酸酯三氟乙酸鹽(G₃)的制備：

15℃下，將化合物E₂(20mg,0.05mmol)溶于干燥的氯仿(5mL)，加入DCC(206mg,1mmol)和DIEA(165μL,1mmol)的混合氯仿溶液，然后加入2-(4-羥基苯基)甲基硝酸酯(42mg,0.25mmol)，混合液室溫攪拌過夜。減壓抽干溶劑，得到淡黃色油狀物F₃。將F₃溶于氯仿(3mL)，在15℃下，滴加TFA(0.5mL)，0.3h后，蒸干溶劑，濃縮所得殘留物經(jīng)HPLC純化，冷凍干燥，得到白色固體G₃(2.3mg,8％)。反應化學方程式見式ⅩⅢ。化合物G₃的¹H NMR檢測譜圖如圖3所示。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.46-7.29(m,2H),7.27-7.10(m,2H),5.95-5.66(m,2H),5.04-4.80(m,1H),4.67(dd,J＝7.7,6.1Hz,1H),4.24-4.10(m,2H),4.07-3.99(m,1H),3.71-3.51(m,1H),2.77-2.47(m,2H),2.47-2.23(m,1H),2.20-1.45(m,7H),1.54(d,J＝6.4Hz,3H).MS(ESI):m/z 447.2(M+H)⁺；HR ESI MS for C₂₁H₂₇N₄O₇required 446.1801,found:446.1859.

化合物G₄～G₄₈可采用與制備G₁或G₂相同的方法制得，所不同是：

采用BOP、或DCC、或PyBOP、或DIC、或TBTU、或HBTU、或HATU、或TATU替換實施例1中的EDCI；

采用HOOBt、或HOSu替換實施例1中的HOBt；

采用2-(4-(氯代甲氧基)苯基)甲基硝酸酯或2-(4-羥基苯基)乙腈或2-(4-羥基苯基)甲基硝酸酯替換實施例1中的2-(4-(氯代甲氧基)苯基)乙腈；

采用(S)-2-(叔丁氧羰基)氨基丁酸、或(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丙酸、或(S)-2-((叔丁氧羰基)甲基氨基)丁酸替換實施例1中的N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸。

采用吡啶、或DBU、或N-甲基嗎啉替換實施例1中的DIEA和三乙胺。

為了更好的說明本發(fā)明的效果，下面結合給出本發(fā)明的實驗證明例：

1、實驗證明例1

X-連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是IAP蛋白家族的重要成員，XIAP通過直接與caspase-3、caspase-7、caspase-9結合，來抑制caspase的活性，從而抑制細胞凋亡。本發(fā)明以G₁、G₂以及G₃為例，在熒光偏振試驗中，分別測定G₁、G₂以及G₃拮抗X-連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)的BIR3域活性的能力。

1.1實驗材料及儀器

(1)熒光標記的多肽配體

由同事合成七肽分子H-AVPFAQK-(6-FAM)-NH₂，在其賴氨酸支鏈的ε氨基上做熒光標記。該熒光肽的結構由ESI-MS確認，經(jīng)HPLC分析，其純度高于98％。熒光肽溶于超純水中，其溶液濃度經(jīng)紫外吸收法確定為467μM。溶液每10μL分裝，用錫紙包裹避光，-20℃保存。

(2)XIAP-BIR3重組蛋白

XIAP-BIR3重組蛋白購于R&D Systems Inc.。蛋白是大腸桿菌來源的，含Asn252-Thr356殘基，帶一個N端Met和6-His標簽。每50μg分裝，-20℃下保存在50μL的pH值為8.0，含50mM Tris–HCl、300mM KCl、50μM醋酸鋅、1mM DTT的緩沖溶液中。

(3)反應緩沖液

本測試使用的反應緩沖液包含20mM Hepes、2mM dithiothreitol(DTT)、100mM NaCl、0.1％Bovine serum albumin(BSA)，pH儀調節(jié)其pH值至7.4。所用試劑均購于Sigma-Aldrich公司，純度為最高級別。

(4)樣品溶液的配制

首先將化合物G₁、G₂以及G₃分別溶于超純水，配制為10mM的母液，然后將母液稀釋至所需濃度。

(5)實驗儀器

Perkin Elmer EnVision多標記微孔板檢測儀(EnVision Multilabel Reader)，pH計，紫外吸收檢測儀，384孔檢測板。

1.2實驗方法

(1)準備384孔檢測板

首先，將2.5nM的熒光肽和250nM的XIAP-BIR3蛋白加入至反應緩沖液中，形成測試緩沖溶液，并孵化半小時。與此同時，將樣品母液稀釋成一系列濃度，濃度范圍為5mM至5nM。

然后，在384孔檢測板上，每一個濃度點三個重復樣。首先，用移液槍向384孔檢測板的孔中加入16μL的測試緩沖溶液，再加入4μL樣品溶液?；旌现?，孔中溶液體積變?yōu)?0μL，于是，熒光肽和XIAP-BIR3的濃度分別變?yōu)樽罴褱y試濃度，即2nM和200nM。樣品的最終濃度變?yōu)?mM至1nM。將384孔檢測板室溫孵化20～30分鐘，用微孔板檢測儀讀數(shù)。然后將檢測板再孵化20～30分鐘，再次讀數(shù)。

(2)數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均運用GraphPad Prism的非線性回歸曲線擬合程序分析。

1.3結果與討論

熒光肽和XIAP-BIR3蛋白的最終測試濃度分別固定為2nM和200nM，所測試樣品的最終濃度范圍為1mM至1nM?；衔颎₁與XIAP-BIR3競爭性結合抑制曲線如圖4所示，以mP值為Y軸，log C為X軸(C為測試樣品的濃度)。結果表明，化合物G₁具有較好的與XIAP-BIR3的結合親和力。由于化合物G₁對XIAP-BIR3競爭性結合抑制，其結合曲線為S型，即mP值隨測試樣品濃度的增加而減小，當樣品濃度足夠低時，mP值達到最大值，不再變化。反之，當樣品濃度足夠高時，mP值達到最小值，抑制飽和。所測數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism分析，得出化合物G₁的IC₅₀值為3.6μM。

在同樣的條件下，用同樣的檢測方法，測得G₂的IC₅₀值為6.7μM，G_,3的IC₅₀值為8.3μM。此外，陽性對照物——四肽分子AVPI(Ala-Val-Pro-Ile)的IC₅₀值為0.8μM。雖然G₁、G₂以及G₃的IC₅₀值不如AVPI，但是化合物G₁、G₂以及G₃的非肽特征更加明顯，且有望作用于多個抗癌靶點。熒光偏振試驗結果表明，化合物G₁、G₂以及G₃是一種新型、較高效的XIAP非肽拮抗劑。

2、實驗證明例2

以G₁為例，在MDA-MB-231乳腺癌細胞株中，測定G₁與另一種抗癌藥物TRAIL一起使用，對細胞凋亡的協(xié)同作用。

2.1實驗材料及方法

(1)細胞培養(yǎng)及試劑

所有化合物溶于DMSO中，配制為濃度為10mM的儲備溶液。細胞在補充10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100mg/mL)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。TRAIL購于PeproTech Inc.。

(2)3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)試驗

細胞存活率用MTT法測試。首先，將細胞置于96孔板(1×10⁶細胞/孔)，然后加入相應濃度的所測化合物和TRAIL，在培養(yǎng)皿中維持24、48、96小時。最后，加入20μL的MTT(5mg/mL的磷酸鹽緩沖液)加入至細胞培養(yǎng)皿中，37℃下孵化2小時。所得晶體溶于200μL的DMSO中，用Vector3在490nm波長下測量吸收強度。

2.2結果與討論

首先，在MDA-MB-231細胞株中，運用MTT試驗，測試了10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL三個濃度的TRAIL單獨使用時對細胞凋亡的影響。結果如圖5所示，隨著時間的增長，以及隨著TRAIL濃度的增大，細胞存活率降低。但是，總的來說，即使在100ng/mL的濃度條件下，TRAIL對MDA-MB-231癌細胞的細胞凋亡作用也不是太明顯，細胞培養(yǎng)96小時后，仍有65％的癌細胞存活。

然后，運用MTT試驗，測試了5μM G₁分別與10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL三個濃度的TRAIL共同作用，對細胞凋亡的影響。結果如圖5所示，細胞培養(yǎng)48小時后，化合物G₁與TRAIL顯示出良好的劑量依存性的協(xié)同作用，而這種協(xié)同作用在較高濃度下顯得更為明顯。根據(jù)所得結果，可以推斷出細胞凋亡越活躍，這種協(xié)同作用越明顯。譬如，96小時孵化后，100ng/mL的TRAIL單獨使用，65％細胞存活，然而，TRAIL與5μM G₁一起使用時，僅31％的細胞存活，抗癌活性大大提高。

試驗結果表明，該類雜化藥物可以有效地拮抗IAPs的作用，在MDA-MB-231乳腺癌細胞株中，可以使原本對TRAIL產生藥耐受的MDA-MB-231細胞變得對TRAIL敏感，從而加速細胞凋亡。該類雜化藥物可以作為新型抗癌藥物的先導化合物，用于新型抗癌藥物的開發(fā)和研究中。

縮略詞表(按字母順序)

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。