本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)(又稱納米抗體技術(shù))，以及基因工程抗體技術(shù)，特別是針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的單域重鏈抗體或多肽。
技術(shù)背景
組氨酸(His)標(biāo)簽，通常由6和組氨酸構(gòu)成，也稱為多組氨酸標(biāo)簽，6×His標(biāo)簽或hexa組氨酸標(biāo)簽。組氨酸標(biāo)簽常融合在目標(biāo)蛋白的C端或N端，以便于目標(biāo)蛋白的純化和檢測(cè)。組氨酸殘基可以在一定的緩沖液條件下特異性結(jié)合到幾種類型固定的離子上(比如鎳，鈷和銅)，然后通過更換緩沖液條件而從固定相洗脫，從而實(shí)現(xiàn)純化含有His標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白。
His標(biāo)簽是最常用的蛋白標(biāo)簽之一，通過檢測(cè)His標(biāo)簽即可獲知樣品中目標(biāo)蛋白的情況。本發(fā)明公開了一種可以與His標(biāo)簽特異性結(jié)合的單域重鏈抗體(即納米抗體，下同)，可用于His標(biāo)簽融合蛋白的純化及檢測(cè)。
目前市場(chǎng)上已經(jīng)有針對(duì)His標(biāo)簽的單克隆或多克隆抗體用于檢測(cè)，但單克隆抗體的研發(fā)和生產(chǎn)過程及其繁瑣和復(fù)雜，多克隆抗體來源有限。相比之下，單域重鏈抗體僅由一個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，具有耐酸堿、耐高溫、特異性高、分子量小和可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，用單域重鏈抗體作為配基制備的純化介質(zhì)具有可重復(fù)使用、無需咪唑洗脫(免除透析操作)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體，可以被用于制備檢測(cè)和純化His標(biāo)簽的試劑和工具。
本發(fā)明提供一個(gè)針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體(即本發(fā)明一種特異性識(shí)別組氨酸標(biāo)簽的納米抗體，下同)，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的IMGT編號(hào)和結(jié)構(gòu)域的劃分包括四個(gè)框架區(qū)(Framework region,FR)和三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(Complementarity-determining region,CDR)。
本發(fā)明提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.:1，通過遺傳密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。
本發(fā)明還提供一個(gè)核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.:1部分結(jié)構(gòu)域，通過遺傳密碼子可以隨時(shí)獲得該核酸分子的具體序列。可以為SEQ ID NO.:2核酸分子。
本發(fā)明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌，酵母菌，絲狀真菌，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，或無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡(jiǎn)并性，該核酸序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。
本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，包括所述蛋白質(zhì)或表達(dá)載體。
本發(fā)明還提供一種檢測(cè)His標(biāo)簽的方法，含有本發(fā)明所述針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體。基于本發(fā)明提供的針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體與His標(biāo)簽特異性結(jié)合的能力，建立His標(biāo)簽的檢測(cè)方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，熒光免疫法(Fluoroimmunoassay,FIA)，免疫芯片法，親和層析法和免疫層析法等。
本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機(jī)或定點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行改造，能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，該突變體能與組氨酸標(biāo)簽特異性結(jié)合。
本發(fā)明還涉及前述針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體在免疫檢測(cè)、富集以及純化中的應(yīng)用。這些免疫檢測(cè)指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測(cè)。
本發(fā)明還涉及針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的免疫親和吸附材料，包括載體，搭載在載體上的配基，其特征在于該材料以針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的納米抗體作為配基，所述針對(duì)組氨酸標(biāo)簽的納米抗體具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用硅球、納米磁珠等。
本發(fā)明所敘述的一些術(shù)語具有如下含義：
結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
IMGT編號(hào)：IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)(The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一種已經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的抗體氨基酸序列編號(hào)方法。具體編號(hào)方法可以參考文獻(xiàn)(Ehrenman,F.,Q.Kaas,et.al.(2010).IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAlign：a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF.Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,et al.(2003).IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains Dev comp Immunol 27(1):55-77.)中的描述。
密碼子(codon)：又稱為三連體密碼子(triplet code)，指對(duì)應(yīng)于某種氨基酸的核苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過程中決定該種氨基酸插入生長(zhǎng)中多肽鏈的位置。
具體實(shí)施方式
下面通過單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應(yīng)用，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，這些具體實(shí)施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
實(shí)施例1：
抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體(即針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體)免疫文庫(kù)的構(gòu)建
將6×His標(biāo)簽與牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)共價(jià)偶聯(lián)，得到6×His人工抗原6×His-BSA，取300μg 6×His-BSA與弗氏完全佐劑乳化后，對(duì)羊駝(Lama pacos)進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫。加強(qiáng)免疫采用150μg 6×His-BSA與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進(jìn)行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測(cè)定血清效價(jià)，選擇血清效價(jià)最高的樣品分離淋巴細(xì)胞，提取RNA。
RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進(jìn)行。以RNA為模板，oligo dT為引物，參照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA第一鏈。
采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經(jīng)巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因(采用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴(kuò)增cDNA，反應(yīng)條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個(gè)循環(huán)，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。
將第一輪PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的DNA片段，作為第二輪PCR的模板，分別用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個(gè)循環(huán)，98℃，10s，68℃，40s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。經(jīng)DNA片段回收試劑盒回收、定量，于-20℃保存?zhèn)溆?。將噬菌粒pHEN1和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1∶3摩爾比，在16℃，過夜連接。
表1文庫(kù)構(gòu)建及鑒定所用的引物
注：下劃線表示限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列
連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10μL無菌水，分十次進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。取10μL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h，采用引物M13-R和pHEN-R進(jìn)行菌落PCR，計(jì)算庫(kù)容；其余部分全部涂布于24cm×24cm氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h。用10mL，2×YT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終濃度15～30％甘油，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
根據(jù)計(jì)算的庫(kù)容量結(jié)果，接種10倍庫(kù)容量的活細(xì)胞于20mL的2×YT(含2％葡萄糖，100μg/mL氨芐青霉素)，30℃，220r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5，按感染復(fù)數(shù)20∶1加入輔助噬菌體，37℃，220r/min，60min。將培養(yǎng)物離心，用50mL的2×YT(含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素)重懸沉淀，30℃，220r/min過夜培養(yǎng)后，3000g離心取上清，加入5×PEG/NaCl溶液，冰上放置1h或4℃過夜，12000rpm離心30min，重懸沉淀于含10％甘油的磷酸緩沖液(PBS，0.01M，pH 7.4)，即得到抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體免疫文庫(kù)，取10μL測(cè)定滴度，其余分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實(shí)施例2：
抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的淘選與鑒定
采用固相親和淘選的方法從實(shí)施例1所得抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體免疫文庫(kù)中淘選針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體。將6×His與卵清白蛋白(albumin，OVA)共價(jià)偶聯(lián)，得到人工抗原6×His-OVA。每孔加入100μL用PBS稀釋的人工抗原6×His-OVA，4℃，包被過夜，每輪淘選的包被濃度分別為100，75，50μg/mL；吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加入300μL 3％脫脂乳(in PBS)，37℃，封閉2h；PBS洗板6次，加入100μL噬菌體抗體文庫(kù)(約含2×1011CFU)，37℃，孵育1.5h；吸出未結(jié)合的噬菌體，用PBST(含0.5％Tween-20)洗板5次(逐輪增加5次)，再用PBS洗板10次(洗板次數(shù)逐輪增加5次)；以100μL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附在酶標(biāo)孔中的噬菌體，用50μL Tris-HCl(1mol/L，pH 8.0)中和洗脫物，取10μL用于滴度測(cè)定，其余洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪淘選。
經(jīng)三輪淘選后，采用輔助噬菌體KM13對(duì)隨機(jī)挑取的單克隆進(jìn)行救援，分別得到展示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接phage-ELISA測(cè)定噬菌體顆粒的結(jié)合活性和特異性，實(shí)驗(yàn)設(shè)定對(duì)照，具體加樣步驟見表2。
表2間接phage-ELISA加樣表
將ELISA陽(yáng)性克隆送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到插入片段的DNA序列，其編碼針對(duì)His標(biāo)簽的單域重鏈抗體，具體如下(SEQ ID NO.:2)：
CAGGTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGCAATCTCTGAGGCTCTCCTGTTCCGCCCCTGGATTCACTTTTAACAATTTTGGACTAGCCTGGTTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGAGCGTGAAGAGGTGGCGTGTATTAGAAGTCACGGTGTCCGGACACATTATGGCGCCTCCGTAGAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAGCGACAACAAGGCACTTTGGCTACAAATGAACGATCTGAAACCTGAGGACTCAGCCGTCTATTACTGTGCAGCGGATCCGGTACCGGCCAACTTCGATACATGTGTTCACAACGGATATGATTACTGGGGCCTGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
依據(jù)DNA測(cè)序結(jié)果及密碼子表可獲得針對(duì)黃曲霉毒素的單域重鏈抗體的氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)：
QVQLVESGGGLVQPGQSLRLSCSAPGFTFNNFGLAWFRQAPGKEREEVACIRSHGVRTHYGASVEGRFTISRDSDNKALWLQMNDLKPEDSAVYYCAADPVPANFDTCVHNGYDYWGLGTQVTVSS。
實(shí)施例3：
抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的規(guī)模制備
編碼抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的DNA片段的獲取：1.采用限制性內(nèi)切酶SfiI/NotI，雙酶切噬菌粒pHEN-抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體基因，瓊脂糖凝膠電泳回收抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體基因；2.直接將抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體編碼序列送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行化學(xué)合成；3.設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR技術(shù)從羊駝(Lama pacos)來源的cDNA庫(kù)中擴(kuò)增。
將得到的抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體基因片段克隆至表達(dá)載體pET25-flag(已將載體本身所帶His標(biāo)簽替換為Flag標(biāo)簽：DYKDDDDK)，經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒。
將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將單菌落接入4mL LBA(Luria-Bertani broth with 100μg/mL ampicillin)液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)12h；以1％培養(yǎng)基體積的接種量將其轉(zhuǎn)接到50mL LBA液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.5(約需2.5～3h)，加入終濃度0.1mM的IPTG，30℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)物8000r/min離心，在細(xì)胞沉淀中加入20mL磷酸緩沖液(pH 7.4)混勻，8000r/min離心，去上清，保留細(xì)胞沉淀；在細(xì)胞沉淀中加入10mL相同緩沖液，混勻，冰上超聲波細(xì)胞破碎處理，超聲破碎條件為200W，破碎2s，間歇3s，共240個(gè)循環(huán)，在4℃下對(duì)細(xì)胞破碎物12000r/min離心20min，取上清進(jìn)行親和層析純化和SDS-PAGE電泳分析，或在上清中加入終濃度30％的甘油，混勻，保存于-20℃冰柜待用。
通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件(如宿主菌、表達(dá)載體、誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間、溫度以及IPTG濃度等)，可以進(jìn)一步提高目的蛋白(單域重鏈抗體)表達(dá)量，為大量制備抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體提供了途徑。
實(shí)施例4：
抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的融合表達(dá)
將本發(fā)明抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體基因克隆至融合表達(dá)載體pAP(含有堿性磷酸酶基因)，經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的堿性磷酸酶融合表達(dá)質(zhì)粒。
堿性磷酸酶可以非特異性催化磷酸單酯水解生成無機(jī)磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖類化合物。該酶常作為信號(hào)元件用于ELISA、免疫印跡、組織化學(xué)等檢測(cè)方法。融合表達(dá)質(zhì)粒將抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體融合于堿性磷酸酶的N端，參考應(yīng)用實(shí)例3中的表達(dá)方法，可以在大腸桿菌中表達(dá)、純化出融合蛋白AP-抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體。
實(shí)施例5：
抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體用于親和純化材料的制備
將重組表達(dá)的抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體與固相載體瓊脂糖偶聯(lián)，具體方法如下：
將CNBr活化的瓊脂糖干膠用0.1M HCl洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯(lián)緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.4)洗滌10次，加入抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂糖微球)，室溫反應(yīng)4h，使抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝膠微球共價(jià)偶聯(lián)。用偶聯(lián)緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.4)洗滌2次后，加入封閉液室溫反應(yīng)2h以封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)。用5被膠體積的磷酸緩沖液(10mM，pH 7.4)和醋酸緩沖液(0.1M，pH 4.0)交替洗滌3次，得到共價(jià)偶聯(lián)了抗His標(biāo)簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。
固相載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用硅球、納米磁珠等。