本申請根據(jù)37 C.F.R. §1.53(c)要求2011年4月13日提交的美國臨時專利申請序列號61/474,913的權(quán)益，所述申請通過引用整體并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽1 (Glucagon-Like Peptide, GLP-1)類似物的衍生物，更特別地，涉及在肽的K²⁷和另一個K殘基上?；碾p?；疓LP-1衍生物及其藥學用途。

序列表的通過引用并入

序列表，名稱為"SEQUENCE LISTING"，有568字節(jié)，于2012年4月11日創(chuàng)建并通過引用并入本文。

背景技術(shù)：

Journal of Medicinal Chemistry (2000), 第43卷, 第9期, 第1664-1669頁公開了GLP-1(7-37)的衍生物，包括雙?；哪承┭苌?。

WO 98/08871 A1公開了多種GLP-1衍生物，包括雙?；哪承┭苌铩＠旊?liraglutide)，一種于2009年由Novo Nordisk A/S上市的每日施用一次的單酰化GLP-1衍生物，也公開于WO 98/08871 A1(實施例37)。

WO 99/43706 A1公開了多種單?；碗p?；腉LP-1衍生物，包括某些K^26,37衍生物和某些K^27,34衍生物。

WO 06/097537 A2公開了多種GLP-1衍生物，包括塞馬魯肽(semaglutide) (實施例4)，是一種由Novo Nordisk A/S開發(fā)的每周施用一次的單?；疓LP-1衍生物。

Angewandte Chemie International Edition 2008, 第47卷, 第3196-3201頁報道了一類4-(對碘苯基)丁酸衍生物的發(fā)現(xiàn)和表征，據(jù)稱其表現(xiàn)出同時與小鼠血清白蛋白(MSA)和人血清白蛋白(HSA)的穩(wěn)定的非共價結(jié)合相互作用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及GLP-1肽衍生物。

所述衍生物在位置27取代天然谷氨酸的賴氨酸、以及在另一個賴氨酸殘基上被?；?。側(cè)鏈是白蛋白結(jié)合部分。它們包含延長部分，優(yōu)選選自脂肪二酸，以及具有遠端苯氧基的脂肪酸，所有都任選被取代。脂肪酸或脂肪二酸的羧基被酰化到(任選通過接頭)GLP-1肽的賴氨酸殘基，優(yōu)選在其ε-氨基處被?；?。

與GLP-1(7-37)相比，GLP-1肽可以是具有總數(shù)為至多10個氨基酸差異(例如一個或多個添加、一個或多個缺失和/或一個或多個取代)的GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)類似物。

更具體地，本發(fā)明涉及GLP-1類似物的衍生物，所述類似物包含在對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置上的第一K殘基；在對應(yīng)于GLP-1(7-37)的位置T 的位置上的第二K殘基，其中T是7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)；以及與GLP-1(7-37)相比，包含最多10個氨基酸改變；其中所述第一K殘基指定為K²⁷，且第二K殘基指定為K^T；所述衍生物包含分別經(jīng)由接頭連接到K²⁷和K^T的兩個白蛋白結(jié)合部分，其中各個白蛋白結(jié)合部分包含選自HOOC-(CH₂)_x-CO-*和HOOC-C₆H₄-O-(CH₂)_y-CO-*的延長部分，其中x是6-16范圍內(nèi)的整數(shù)，y是3-17范圍內(nèi)的整數(shù)，并且其中接頭包含下式化學式5的接頭元件：

其中k是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯。

本發(fā)明也涉及這樣的衍生物，其用作藥物，尤其是用于治療和/或預(yù)防所有形式的糖尿病和相關(guān)疾病，諸如進食障礙、心血管疾病、胃腸道疾病、糖尿病并發(fā)癥、危急病癥(critical illness)和/或多囊卵巢綜合征；和/或用于改善脂質(zhì)參數(shù)，改善β細胞功能和/或用于延遲或預(yù)防糖尿病進程。

本發(fā)明還涉及新穎GLP-1類似物形式的中間產(chǎn)物，其涉及用于制備本發(fā)明的某些衍生物。

本發(fā)明的衍生物具有生物活性。此外或備選地，它們具有延長的藥代動力學概況。此外或備選地，它們對胃腸道酶的降解具有穩(wěn)定性。此外或備選地，它們具有高的口服生物利用度。這些性能在下一代GLP-1化合物用于皮下、靜脈內(nèi)和/或尤其是口服施用的開發(fā)中是重要的。

描述

在下文中，希臘字母可用其符號或相應(yīng)的書寫名稱代表，例如: α = alpha；β = beta；ε = epsilon；γ = gamma；ω = omega；等。同樣，希臘字母μ可用"u"代表，例如μl=ul，或μM=uM。

化學式中的星號(*)表示i)結(jié)合點，ii)基團，和/或iii)非共享電子。

在第一個方面，本發(fā)明涉及GLP-1類似物的衍生物，所述類似物包含在對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置上的第一K殘基；在對應(yīng)于GLP-1(7-37)的位置T 的位置上的第二K殘基，其中T是7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)；以及與GLP-1(7-37)相比，包含最多10個氨基酸改變；其中所述第一K殘基指定為K²⁷，且第二K殘基指定為K^T；所述衍生物包含分別經(jīng)由接頭連接到K²⁷和K^T的兩個白蛋白結(jié)合部分，其中所述白蛋白結(jié)合部分包含選自化學式1和化學式2的延長部分：

化學式1:

化學式2:

其中x是6-16范圍內(nèi)的整數(shù)，y是3-17范圍內(nèi)的整數(shù)，并且接頭包含化學式5：

化學式5:

其中k是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯。

GLP-1 類似物

本文所用的術(shù)語“GLP-1類似物”或“GLP-1的類似物”是指作為人胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1(7-37))變體的肽或化合物，其序列作為SEQ ID NO: 1包括在序列表中。具有SEQ ID NO: 1序列的肽也可稱為“天然”GLP-1。

在序列表中，SEQ ID NO: 1的第一個氨基酸殘基(組氨酸)編號為1。然而，在下文中，根據(jù)本領(lǐng)域已建立的習慣，該組氨酸殘基編號定為7，并且其后的氨基酸殘基也隨之編號，結(jié)尾是37號甘氨酸。因此，通常，本文所涉及到的GLP-1(7-37)序列的氨基酸殘基編號或位置編號是開始于位置7的His和結(jié)束于位置37的Gly的序列。

本發(fā)明衍生物的GLP-1類似物可根據(jù)以下來描述：i) 在天然GLP-1(7-37)中對應(yīng)于經(jīng)改變的氨基酸殘基的氨基酸殘基編號(即在天然GLP-1中的對應(yīng)位置)，和ii) 實際改變。以下是合適的類似物命名的非限制性實例。

本發(fā)明衍生物的GLP-1類似物的非限制性實例是改變的類似物，使其包含在對應(yīng)于GLP-1(7-37)的位置27的位置上的第一賴氨酸殘基，以及位置12上的第二賴氨酸殘基。該類似物的氨基酸序列否則與天然GLP-1的序列相同，并且該類似物可稱為K¹²,K²⁷-GLP-1(7-37)。該名稱表示天然GLP-1的氨基酸序列，其中位置12的苯丙氨酸已被賴氨酸取代，并且位置27的谷氨酸已被賴氨酸取代。

當與天然GLP-1(7-37)(SEQ ID NO: 1)相比，構(gòu)成本發(fā)明衍生物部分的GLP-1類似物包含最多10個氨基酸改變。換句話說，它是GLP-1(7-37)肽，其中與天然GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)相比，多個氨基酸殘基被改變。這些改變可獨立代表一個或多個氨基酸取代、添加和/或缺失。

以下是適當類似物命名的非限制性實例。

例如，類似物[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,His31,Arg34]-GLP-1-(7-37)表示以下GLP-1(7-37)肽，當與天然GLP-1比較時，其具有以下取代：位置8的丙氨酸被Aib(α-氨基異丁酸)取代，位置22的甘氨酸被賴氨酸取代，位置25的丙氨酸被纈氨酸取代，位置26的賴氨酸被精氨酸取代，位置27的谷氨酸被賴氨酸取代，位置31的色氨酸被組氨酸取代，和位置34的賴氨酸被精氨酸取代。該類似物也可以簡單地表示為(8Aib, 22K, 25V, 26R, 27K, 31H, 34R)。

作為另一個實例，類似物[Aib8,Lys20,Glu22,Arg26,Lys27,Glu30,Gly34]-GLP-1-(7-34)表示以下GLP-1(7-37)肽，當與天然GLP-1比較時，其被以下所改變：位置8的丙氨酸被Aib取代，位置20的亮氨酸被賴氨酸取代，位置22的甘氨酸被谷氨酸取代，位置26的賴氨酸被精氨酸取代，位置27的谷氨酸被賴氨酸取代，位置30的丙氨酸被谷氨酸取代，位置34的賴氨酸被甘氨酸取代，和通過缺失位置35-36-37的甘氨酸-精氨酸-甘氨酸的C-末端。該類似物也可以簡單地表示為(8Aib, 20K, 22E, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37)，其中隱含對GLP-1(7-37)的引用，并且“des”表示缺失。

作為又進一步實例，包含Glu³⁸和Gly³⁹的類似物是指GLP-1(7-37)肽，當與天然GLP-1相比時，其包含(谷氨酸-甘氨酸)二肽添加至GLP-1(7-37)的C-末端。該類似物也可以簡單地被稱為包含(38E, 39G)，其中隱含對GLP-1(7-37)的引用。

“包含”某些特定改變的類似物還可包含與SEQ ID NO: 1相比進一步的改變。包含(38E, 39G)的類似物的一個非限制性實例是化學式51的肽部分。

根據(jù)以上實例，顯而易見的是，可通過氨基酸殘基的全名、它們的首字母代碼和/或它們的三字母代碼而標識氨基酸殘基。這3種方式是完全等同的。

表述“相當位置”或“對應(yīng)位置”可用于在變體GLP-1(7-37)序列中表征相對于天然GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)而言的改變位點?？赏ㄟ^例如簡單書寫和目測，和/或使用標準蛋白或肽比對程序諸如作為Needleman-Wunsch比對的“比對”，容易地推斷出相當位置或?qū)?yīng)位置，以及改變的數(shù)量。所述算法描述于Needleman, S.B.和Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453，以及Myers和W. Miller 在"Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17中的比對程序。為了比對，可使用默認評分矩陣BLOSUM50和默認特性矩陣(identity matrix)，并且空位的第一殘基的罰分可設(shè)置在-12，或優(yōu)選在-10，并且空位的額外殘基的罰分在-2，優(yōu)選在-0.5。

這類比對的實例插入下文中，其中序列號1(SEQ_ID_NO_1)是SEQ ID NO: 1，序列號2(ANALOGUE)是其類似物(22K, 26R, 27K, 30E, 34G, des35-37)：

# 比對的序列: 2

# 1: SEQ_ID_NO_1

# 2: 類似物

# 矩陣: EBLOSUM62

# 空位罰分: 10.0

# 延伸罰分: 0.5

#

# 長度: 31

# 同一性: 23/31 (74.2%)

# 相似性: 25/31 (80.6%)

# 空位: 3/31 (9.7%)

# 分數(shù): 117.0

#

類似物 。

在包含在序列中的非天然氨基酸諸如Aib中，為了比對目的，它們都可用X替代。如有必要，X可在隨后用手工校正。

術(shù)語“肽”當用于例如本發(fā)明衍生物的GLP-1類似物時，是指包含通過酰胺(或肽)鍵相互連接的一系列氨基酸的化合物。

本發(fā)明的肽包含通過肽鍵連接的至少5個組成氨基酸。在特定的實施方案中，肽包含至少10、優(yōu)選至少15、更優(yōu)選至少20、甚至更優(yōu)選至少25、或最優(yōu)選至少28個氨基酸。

在特定的實施方案中，肽由至少5個組成氨基酸組成，優(yōu)選由至少10、至少15、至少20、至少25、或最優(yōu)選由至少28個氨基酸組成。

在額外的特定實施方案中，肽a)由i) 28、ii) 29、iii) 30、iv) 31、v) 32、或vi) 33個氨基酸構(gòu)成，或b)由 i) 28、ii) 29、iii) 30、iv) 31、v) 32、或vi) 33個氨基酸組成。

在再進一步的特定實施方案中，肽由通過肽鍵相互連接的氨基酸組成。

氨基酸是含有胺基和羧酸基，和任選含有一個或多個額外基團，通常稱為側(cè)鏈，的分子。

術(shù)語“氨基酸”包括蛋白質(zhì)性的氨基酸(由遺傳密碼所編碼，包括天然氨基酸和標準氨基酸)、以及非蛋白質(zhì)性(在蛋白質(zhì)中未發(fā)現(xiàn)，和/或在標準遺傳密碼中未編碼)、和合成氨基酸。因此，氨基酸可選自蛋白質(zhì)性的氨基酸、非蛋白質(zhì)性的氨基酸、和/或合成氨基酸的組。

不由遺傳密碼所編碼的氨基酸的非限制性實例是γ-羧基谷氨酸、鳥氨酸和磷酸絲氨酸。合成氨基酸的非限制性實例是氨基酸的D-異構(gòu)體，諸如D-丙氨酸和D-亮氨酸、Aib (α-氨基異丁酸)、β-丙氨酸和des-氨基-組氨酸(desH，替代名稱咪唑丙酸，縮寫Imp)。

在下文中，并未表明旋光異構(gòu)體的所有氨基酸都理解為是指L-異構(gòu)體(除非另有說明)。

本發(fā)明的GLP-1衍生物和類似物具有GLP-1活性。該術(shù)語是指與GLP-1受體結(jié)合并起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而導(dǎo)致促胰島素作用或如本領(lǐng)域已知的其它生理效應(yīng)的能力。例如，可使用本文的實施例33中所述的測定方法，檢測本發(fā)明的類似物和衍生物的GLP-1活性。本文實施例34中描述的GLP-1受體結(jié)合測定也可用于確定GLP-1活性(低HSA實驗)。

GLP-1 衍生物

在GLP-1肽或類似物的情況下，本文所用的術(shù)語“衍生物”是指經(jīng)化學修飾的GLP-1肽或類似物，其中一個或多個取代基已與所述肽共價連接。取代基也可稱為側(cè)鏈。

在特定的實施方案中，側(cè)鏈能與白蛋白形成非共價聚集體，因而促進所述衍生物在血流中循環(huán)，并且還具有延長所述衍生物作用時間的效應(yīng)，這是因為以下事實：GLP-1-衍生物與白蛋白的聚集體僅緩慢分解而釋放活性藥物成分。因此，取代基或側(cè)鏈，作為整體，優(yōu)選是指白蛋白結(jié)合部分。

在另一個特定的實施方案中，白蛋白結(jié)合部分包含與白蛋白結(jié)合并因此與延長特別相關(guān)的部分，所述部分可稱為延長部分。相對于其與肽的結(jié)合點而言，延長部分可以在白蛋白結(jié)合部分相反的一端之上或附近。

在再進一步的特定的實施方案中，白蛋白結(jié)合部分包含介于延長部分和與肽的結(jié)合點之間的部分，所述部分可稱為接頭、接頭部分、間隔基等。接頭可以是任選的，并因此在這種情況下，白蛋白結(jié)合部分可與延長部分相同。

在特定的實施方案中，白蛋白結(jié)合部分和/或延長部分是親脂的，和/或在生理pH (7.4)時帶負電荷。

白蛋白結(jié)合部分、延長部分或接頭可通過?；cGLP-1肽的賴氨酸殘基共價連接。

在一個優(yōu)選的實施方案中，在形成酰胺鍵的條件下，白蛋白結(jié)合部分(優(yōu)選包含延長部分和接頭)的活性酯與賴氨酸殘基的氨基(優(yōu)選其ε氨基)共價連接(該步驟稱為酰化)。

除非另有說明，否則當提及與賴氨酸殘基?；瘯r，理解為其ε-氨基。

包含與第一和第二K殘基(例如，與K²⁷和K^T)通過接頭連接的兩個延長部分的衍生物，可稱為，例如分別在GLP-1肽的位置27和T的第一和第二賴氨酸殘基的ε-氨基上被酰化2次、雙?；螂p重?；难苌?。

為了本文的目的，術(shù)語“白蛋白結(jié)合部分”、“延長部分”和“接頭”可包括這些分子的未反應(yīng)及已反應(yīng)形式。是否是指一種形式或其它形式，根據(jù)施用該術(shù)語的上下文就能清楚。

在一方面，每個延長部分包含獨立選自以下化學式1和化學式2的延長部分，或由所述延長部分組成：

化學式1:

化學式2:

其中x是6-16范圍內(nèi)的整數(shù)，y是3-17范圍內(nèi)的整數(shù)。

在一個實施方案中，*-(CH₂)_x-*是指直鏈或支鏈、優(yōu)選直鏈的亞烷基，其中x是6-16范圍內(nèi)的整數(shù)。

在另一個實施方案中，*-(CH₂)_y-*是指直鏈或支鏈、優(yōu)選直鏈的亞烷基，其中y是3-17范圍內(nèi)的整數(shù)。

術(shù)語“脂肪酸”是指具有4-28個碳原子的脂族單羧酸，優(yōu)選它是非支鏈的，和/或偶數(shù)的，并且它可以是飽和或不飽和的。

術(shù)語“脂肪二酸”是指如上定義的、但在ω位置具有額外羧酸基團的脂肪酸。因此，脂肪二酸是二羧酸。

命名按照本領(lǐng)域通常方式進行，例如在上式*-COOH 以及 HOOC-*中是指羧基；*-C₆H₄-*是指亞苯基；*-CO-*以及 *-OC-*是指羰基(O=C<*_*)；C₆H₅-O-*是指苯氧基。在特定的實施方案中，芳族，諸如苯氧基和亞苯基，可以獨立地為鄰位、間位或?qū)ξ弧?/p>

如上所解釋，本發(fā)明的GLP-1衍生物是經(jīng)雙?；?，即2個白蛋白結(jié)合部分與GLP-1肽共價連接。

在特定的實施方案中，2個白蛋白結(jié)合部分(即完整側(cè)鏈)是類似的，優(yōu)選是基本相同的，或者最優(yōu)選是相同的。

在另一個特定的實施方案中，2個延長部分是類似的，優(yōu)選是基本相同的，或者最優(yōu)選是相同的。

在一個再進一步的具體實施方案中，2個接頭是類似的，優(yōu)選是基本相同的，或者最優(yōu)選是相同的。

術(shù)語“基本相同”包括由于以下原因而導(dǎo)致的特性差異：形成一種或多種鹽、酯和/或酰胺；優(yōu)選形成一種或多種鹽、甲酯和簡單酰胺；更優(yōu)選形成不超過2種鹽、甲酯和/或簡單酰胺；甚至更優(yōu)選形成不超過1種鹽、甲酯和/或簡單酰胺；或最優(yōu)選形成不超過1種鹽。

在化學化合物諸如白蛋白結(jié)合部分、延長部分和接頭的情況下，可使用本領(lǐng)域已知的任何合適的計算機程序和/或算法來確定相似性和/或同一性。

例如，可使用分子指紋適當?shù)販y定2個延長部分、2個接頭和/或2個完整側(cè)鏈的相似性。指紋是表示化學結(jié)構(gòu)的一種數(shù)學方法(參見例如Chemoinformatics: A textbook, Johann Gasteiger and Thomas Engel (Eds), Wiley-VCH Verlag, 2003)。

合適指紋的實例包括但不限于UNITY指紋、MDL指紋和/或ECFP指紋，諸如ECFP_6指紋(ECFP代表擴展連接指紋)。

在特定的實施方案中，2個延長部分、2個接頭和/或2個完整側(cè)鏈被表示為a) ECFP_6指紋；b) UNITY指紋；和/或c) MDL指紋。

Tanimoto系數(shù)優(yōu)選用于計算2種指紋的相似性，無論使用a)、b)或c)。

在特定的實施方案中，無論使用a)、b)或c)，2個延長部分、2個接頭和/或2個完整側(cè)鏈分別具有的相似性為至少0.5 (50%)；優(yōu)選至少0.6 (60%)；更優(yōu)選至少0.7 (70%)，或至少0.8 (80%)；甚至更優(yōu)選至少0.9 (90%)；或最優(yōu)選至少0.99 (99%)，諸如相似性為1.0 (100%)。

可使用程序SYBYL (可得自Tripos, 1699 South Hanley Road, St. Louis, MO 63144-2319 USA)來計算UNITY指紋。可使用程序Pipeline Pilot (可得自 Accelrys Inc., 10188 Telesis Court, Suite 100, San Diego,CA 92121, USA)來計算ECFP_6和MDL指紋。

更多細節(jié)可參見例如

。

相似性計算的實例插入下文中，其中將化學式66的完整側(cè)鏈與其甲酯即谷氨酰胺接頭部分的單甲酯(化學式66a)相比：

化學式66a:

使用a) ECFP_6指紋，相似性為0.798，使用b) UNITY指紋，相似性為0.957；和使用MDL指紋，相似性為0.905。

在2個相同側(cè)鏈(白蛋白結(jié)合部分)的情況下，衍生物可被稱為對稱的。

在特定的實施方案中，相似性系數(shù)為至少0.80，優(yōu)選至少0.85，更優(yōu)選至少0.90，甚至更優(yōu)選至少0.95，或最優(yōu)選至少0.99。

本發(fā)明衍生物的2個接頭中的每一個可包含以下第一接頭元件：

化學式5:

其中k是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

在一個特定的實施方案中，當k=1和n=1時，該接頭元件可稱為OEG，或8-氨基-3,6-二氧雜辛酸的二基，和/或它可被下式代表：

化學式5a:

。

在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明衍生物的每個接頭可獨立包含第二接頭元件，優(yōu)選Glu二基，諸如化學式6和/或化學式7：

化學式6:

化學式7:

其中Glu二基可被包括p次，其中p是1-2范圍內(nèi)的整數(shù)。

化學式6也可被稱為γ-Glu，或簡稱為gGlu，因為事實上它是氨基酸谷氨酸的γ 羧基，其在此可用于與另一接頭元件連接，或與賴氨酸的ε-氨基連接。如上所解釋，另一接頭元件可以是例如另一Glu殘基，或OEG分子。Glu的氨基又可與延長部分的羧基、或與例如OEG分子(如果有的話)的羧基、或與例如另一Glu(如果有的話)的γ-羧基形成酰胺鍵。

化學式7也可被稱為α-Glu，或簡稱為aGlu，或僅Glu，這是由于以下事實：它是氨基酸谷氨酸的α羧基，其在此可用于與另一接頭元件連接，或與賴氨酸的ε-氨基連接。

以上化學式6和化學式7結(jié)構(gòu)覆蓋了Glu的L-型以及D-型。

本發(fā)明的衍生物可存在不同的立體異構(gòu)體形式，其具有相同分子式和鍵合的原子序列，但僅在其原子空間的三維方向上不同。示例的本發(fā)明衍生物的立體異構(gòu)現(xiàn)象，在實驗部分中用標準命名法指出其名稱和結(jié)構(gòu)。除非另有說明，否則本發(fā)明涉及要求保護的衍生物的所有立體異構(gòu)體形式。

可用任何合適方法來測定本發(fā)明GLP-1衍生物的血漿濃度。例如，可使用LC-MS (液相色譜-質(zhì)譜)，或免疫測定諸如RIA (放射免疫測定)、ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)和LOCI (熒光氧通道免疫測定，Luminescence Oxygen Channeling Immunoasssay)。合適的RIA和ELISA測定的通用方案可參見例如WO09/030738，第116-118頁。優(yōu)選的測定是本文的實施例35、39和40中描述的LOCI測定。

藥學可接受的鹽、酰胺或酯

本發(fā)明的衍生物和類似物可以呈藥學可接受的鹽、酰胺或酯的形式。

鹽是例如由堿和酸之間的化學反應(yīng)而形成，例如：2 NH₃ + H₂SO₄ → (NH₄)₂SO₄。

鹽可以是堿式鹽、酸式鹽，或者這兩者都不是(即中性鹽)。在水中堿式鹽產(chǎn)生氫氧離子，酸式鹽產(chǎn)生水合氫離子。

本發(fā)明衍生物的鹽可以用分別與陰離子基團或陽離子基團反應(yīng)的添加的陽離子或陰離子來形成。這些基團可位于肽部分內(nèi)和/或在本發(fā)明衍生物的側(cè)鏈內(nèi)。

本發(fā)明衍生物的陰離子基團的非限制性實例包括側(cè)鏈(如果有的話)以及肽部分中的游離羧基。肽部分通常包括C-端的游離羧酸基團，并且它也可包括在內(nèi)部酸性氨基酸殘基諸如Asp和Glu上的游離羧基。

肽部分的陽離子基團的非限制性實例包括N-端的游離氨基(如果有的話)以及在內(nèi)部堿性氨基酸殘基諸如His、Arg和Lys上的任何游離氨基。

本發(fā)明衍生物的酯可以是例如通過游離羧酸基團與醇或酚反應(yīng)而形成，其導(dǎo)致至少一個羥基被烷氧基或芳氧基取代。

酯的形成可涉及肽的C-端的游離羧基，和/或側(cè)鏈的任何游離羧基。

本發(fā)明衍生物的酰胺可以是例如通過游離羧酸基團與胺或取代胺反應(yīng)，或通過游離或取代氨基與羧酸反應(yīng)而形成。

酰胺的形成可涉及肽的C-端的游離羧基、側(cè)鏈的任何游離羧基、肽的N-端的游離氨基、和/或在肽和/或側(cè)鏈中肽的的任何游離或取代的氨基。

在一個特定的實施方案中，肽或衍生物呈藥學可接受的鹽的形式。在另一個特定的實施方案中，衍生物呈藥學可接受的酰胺的形式，優(yōu)選在肽的C-端具有酰胺基。在再進一步的特定的實施方案中，肽或衍生物呈藥學可接受的酯的形式。

中間產(chǎn)物

在第二個方面，本發(fā)明涉及中間產(chǎn)物。

本發(fā)明的一類中間產(chǎn)物采用GLP-1類似物的形式，與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)相比，其包含以下改變：(i) 38Q；和/或 (ii) 39G；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯。

以GLP-1類似物形式的本發(fā)明的另一個中間產(chǎn)物是與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比包含、優(yōu)選具有以下氨基酸改變的類似物，或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯：

。

功能特性

在第一功能方面，本發(fā)明的衍生物具有良好功效。此外或備選地，在第二功能方面，它們具有延長的藥代動力學特性。此外或備選地，在第三功能方面，它們具有高口服生物利用度。此外或備選地，在第四功能方面，改善了它們的生物物理特性。

生物活性(功效)

根據(jù)第一功能方面，本發(fā)明的衍生物、以及構(gòu)成GLP-1肽本身具有生物活性或功效。

在一個特定的實施方案中，功效和/或活性是指體外功效，即在功能性GLP-1受體測定中的表現(xiàn)，更尤其是在表達克隆的人GLP-1受體的細胞系中刺激cAMP形成的能力。

可優(yōu)選在含有人GLP-1受體的培養(yǎng)基中如下測定對cAMP形成的刺激：使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系諸如BHK467-12A (tk-ts13)，和/或使用用于測定cAMP的功能性受體測定，例如基于內(nèi)源形成的cAMP與外源添加的生物素-標記的cAMP之間的競爭，在所述測定中更優(yōu)選使用特異性抗體捕獲cAMP，和/或其中甚至更優(yōu)選的測定是AlphaScreen cAMP測定，最優(yōu)選實施例33中描述的測定。

術(shù)語半最大有效濃度(EC₅₀)通常是指根據(jù)劑量反應(yīng)曲線誘導(dǎo)介于基線和最大值之間一半反應(yīng)的濃度。EC₅₀用作化合物功效的量度并且代表了所觀察到的其最大效果的50%的濃度。

可如上所述地測定本發(fā)明衍生物的體外功效，并測定目標衍生物的EC₅₀。EC₅₀越低，功效越好。

合適的培養(yǎng)基具有以下組成(最終測定濃度)：

。

本發(fā)明的衍生物的EC₅₀等于或低于3500 pM，優(yōu)選等于或低于3200。EC₅₀可以甚至低于1200pM，優(yōu)選低于1000pM，甚至更優(yōu)選低于500pM，或最優(yōu)選低于200pM。

在第一個功能方面的另一個具體實施方案中，功效和/或活性是指在低濃度的白蛋白下結(jié)合GLP-1受體的能力。在低白蛋白濃度與GLP-1受體的結(jié)合應(yīng)當是盡可能好的，其對應(yīng)于低IC₅₀值。這可以如實施例35中所述進行確定。本發(fā)明的衍生物的IC₅₀(低白蛋白)等于或低于500 nM，許多低于100 nM，或者甚至低于10 nM。

在另一個特定的實施方案中，本發(fā)明的衍生物在體內(nèi)是強效的，其可在任何合適的動物模型以及在臨床試驗中按照本領(lǐng)域已知方式來測定。

糖尿病db/db小鼠是合適動物模型的一個實例，在此類小鼠體內(nèi)可測定血糖降低效應(yīng)，例如按照實施例36所述，或按照WO09/030738的實施例43所述。

此外或備選地，在對豬進行的藥效動力學研究中，可測定對體內(nèi)飼料攝取的效果，例如按照實施例38所述。

延長 -受體結(jié)合/低白蛋白和高白蛋白

根據(jù)第二功能方面，本發(fā)明的衍生物被延長。

GLP-1 受體結(jié)合

在特定實施方案中，延長是指，可如實施例34中所述確定，分別在低和高濃度白蛋白的存在下本發(fā)明衍生物與GLP-1受體的結(jié)合能力。

通常，在低白蛋白濃度時與GLP-1受體的結(jié)合應(yīng)當盡可能好，對應(yīng)于低IC₅₀值。在一個實施方案中，低白蛋白是指0.005% HSA。在另一個實施方案中，低白蛋白是指0.001% HSA。

在高白蛋白濃度時IC₅₀值是白蛋白對衍生物與GLP-1受體結(jié)合的影響的量度。正如所知，GLP-1衍生物也與白蛋白結(jié)合。這通常是所需的效果，其延長它們的血漿壽命。因此，在高白蛋白時IC₅₀值通常高于在低白蛋白時的IC₅₀值，對應(yīng)于與GLP-1受體的結(jié)合降低，這是由與GLP-1受體結(jié)合的白蛋白結(jié)合競爭所致。

因此，可采用高比率(IC₅₀值(高白蛋白)/ IC₅₀值(低白蛋白))，作為目標衍生物與白蛋白結(jié)合良好(可具有長的半衰期)、并且自身與GLP-1受體也結(jié)合良好(IC₅₀值(高白蛋白)高，IC₅₀值(低白蛋白)低)的指示。另一方面，白蛋白結(jié)合可能并非總是滿意的，或者與白蛋白的結(jié)合可能變得太強。因此，IC₅₀ (低白蛋白)、IC₅₀ (高白蛋白)的滿意范圍/和高/低比率可因化合物不同而不同，取決于所需用途和此類用途的周圍環(huán)境、以及其它的潛在目標化合物的特性。

在高和低白蛋白濃度時測定受體結(jié)合的合適測定方法公開于本文的實施例34。當?shù)桶椎鞍状嬖跁r，本發(fā)明的化合物具有非常良好的受體結(jié)合親和力(IC₅₀)。平均而言，實施例34中測試的化合物的IC₅₀(低白蛋白)為14 nM。

延長 - 大鼠體內(nèi)半衰期

根據(jù)第二功能方面，本發(fā)明的衍生物被延長。在一個特定的實施方案中，延長可以合適地確定為i.v.施用之后大鼠中的體內(nèi)半衰期(T_?)。大鼠中的半衰期為至少4小時，且可以高達10小時或更長。

用于測定i.v.施用之后大鼠中的體內(nèi)半衰期的合適測定方法公開于本文的實施例39。

延長 - 小型豬中的體內(nèi)半衰期

根據(jù)第二功能方面，本發(fā)明的衍生物被延長。在一個特定的實施方案中，此外或備選地，延長可以確定為i.v.施用之后小型豬中的體內(nèi)半衰期(T_?)。半衰期為至少12小時，其可能至少24小時，至少36小時，至少48小時，或至少60小時或甚至更長。

用于測定i.v.施用之后小型豬中的體內(nèi)半衰期的合適測定方法公開于本文的實施例37。

口服生物利用度

根據(jù)第三功能方面，本發(fā)明的衍生物具有高口服生物利用度。

市售GLP-1衍生物的口服生物利用度非常低。正在開發(fā)的用于經(jīng)i.v.或s.c.施用的GLP-1衍生物的口服生物利用度也低。

因此，本領(lǐng)域需要具有改善的口服生物利用度的GLP-1衍生物。這樣的衍生物可以是供口服施用用的合適候選者，只要它們的功效一般而言令人滿意，和/或只要它們的半衰期一般而言也令人滿意即可。

本發(fā)明人鑒定了一類新型GLP-1衍生物，其具有意想不到的高口服生物利用度，并且同時還具有令人滿意的功效和/或半衰期。

此外或備選地，這些衍生物具有意想不到的改進的口服生物利用度，并且同時在低濃度白蛋白時還與GLP-1受體具有高結(jié)合親和力(即低IC₅₀值)。

為了獲取活性藥物成分的低的每日口服劑量，這些特征是重要的，為了多種原因，這是期望的，所述原因包括例如生產(chǎn)節(jié)約、潛在的安全問題的可能性、以及施用的舒適問題和環(huán)境上的考慮。

通常，術(shù)語生物利用度是指所施用的活性藥物成分(API)諸如本發(fā)明衍生物到達全身循環(huán)而不變的劑量部分。按照定義，當API經(jīng)靜脈內(nèi)施用時，其生物利用度是100%。然而，當經(jīng)其它途徑(諸如口服)施用時，其生物利用度下降(因為降解和/或不完全吸收和首過代謝)。當計算用于非靜脈內(nèi)施用途徑的劑量時，生物利用度的相關(guān)知識是基本的。

絕對口服生物利用度將口服施用后全身循環(huán)中的API生物利用度(用曲線下面積或AUC來評價)與靜脈內(nèi)施用后相同API的生物利用度相比較。這是通過非靜脈內(nèi)施用所吸收的API與相同API經(jīng)相應(yīng)的靜脈內(nèi)施用相比的分數(shù)。如果使用不同劑量，則比較必須是經(jīng)均一化的劑量；因此，各AUC通過除以所施用的相應(yīng)劑量而得以校正。

在口服和靜脈內(nèi)施用之后繪制血漿API 濃度與時間的曲線。絕對生物利用度(F)是劑量校正的AUC-口服除以AUC-靜脈內(nèi)。

本發(fā)明衍生物的絕對口服生物利用度高于a) 利拉魯肽，和/或b) 塞馬魯肽；優(yōu)選高出至少10%，更優(yōu)選高出至少20%，甚至更優(yōu)選高出至少30%，或最優(yōu)選高出至少40%。在測試口服生物利用度之前，適宜將本發(fā)明的衍生物按照本領(lǐng)域已知方法配制成促胰島素化合物的口服制劑，例如，使用WO 2008/145728所述的任何一種或多種制劑。

預(yù)測口服生物利用度的合適測試描述在實施例35和40中。根據(jù)這些測試，將GLP-1衍生物直接注射到大鼠的腸腔之后和/或口腔填喂大鼠之后，確定其血漿中的濃度(暴露)，并且測量GLP-1衍生物在血漿中的隨后暴露。

生物物理特性

根據(jù)第四個功能方面，本發(fā)明的衍生物具有改善的生物物理特性。這些性質(zhì)包括但不限于物理穩(wěn)定性和溶解性。改進的生物物理特性可以是改變的寡聚特性的結(jié)果。生物物理特性可以使用蛋白化學的標準生物物理方法來測定。本發(fā)明的衍生物的生物物理特性可以適當?shù)嘏c天然GLP-1進行比較。

本發(fā)明的額外的具體實施方案描述于標題為“特定的實施方案”章節(jié)中。

生產(chǎn)工藝

肽諸如GLP-1(7-37)和GLP-1類似物的生產(chǎn)是本領(lǐng)域眾所周知的。

可通過例如經(jīng)典肽合成，例如固相肽合成，使用t-Boc或Fmoc化學或其它充分建立的技術(shù)，產(chǎn)生本發(fā)明衍生物的GLP-1部分(或其片段)，諸如K¹²,K²⁷-GLP-1(7-37)或其類似物或片段，所述技術(shù)參見例如

。

此外或備選地，它們也可通過重組方法而產(chǎn)生，即通過在允許所述肽表達的條件下，在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼所述類似物的DNA序列并能表達所述肽的宿主細胞。適合表達這些肽的宿主細胞的非限制性實例是：大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及哺乳動物BHK細胞系或CHO細胞系。

可按例如實驗部分所述，生產(chǎn)包含非天然氨基酸和/或共價連接的N-端一肽或二肽模擬物的本發(fā)明的那些衍生物?；騾⒁娎鏗odgson等人:"The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids", Chemical Society Reviews, 第33卷, 第7期(2004), 第422-430頁；和WO 2009/083549 A1，名稱為"Semi-recombinant preparation of GLP-1 analogues"。

多種本發(fā)明衍生物制備方法的具體實例包括在實驗部分內(nèi)。

藥物組合物

可按照本領(lǐng)域已知方法制備包含本發(fā)明衍生物或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯、和藥學可接受的賦形劑的藥物組合物。

術(shù)語“賦形劑”廣義上是指除了活性治療成分之外的任何成分。賦形劑可以是惰性物質(zhì)、無活性物質(zhì)和/或并非藥物活性物質(zhì)。

賦形劑可用于多種目的，例如作為載體、媒介物、稀釋劑、片劑助劑、和/或用于改善施用、和/或活性物質(zhì)的吸收。

藥物活性成分與不同賦形劑的配制是本領(lǐng)域已知的，參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)，和任何更新版本)。

賦形劑的非限制性實例是：溶劑、稀釋劑、緩沖劑、防腐劑、張度調(diào)節(jié)劑、螯合劑和穩(wěn)定劑。

制劑的實例包括液體制劑，即含水的水性制劑。液體制劑可以是溶液劑或混懸劑。水性制劑通常包含至少50% w/w的水，或至少60%、70%、80%、或甚至至少90% w/w的水。

或者，藥物組合物可以是固體制劑，例如經(jīng)凍干或噴霧干燥的組合物，其可直接使用，或者由醫(yī)師或患者使用前加入溶劑和/或稀釋劑而使用。

水性制劑的pH可以是pH 3至pH 10的任何值，例如約7.0至約9.5；或約3.0至約7.0。

藥物組合物可包含緩沖劑。緩沖劑可以是例如選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)-氨基甲烷、N-二(羥乙基)甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸及其混合物。

藥物組合物可包含防腐劑。防腐劑可以是例如選自酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苯甲醇、氯丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷基脲、雙氯苯雙胍已烷、脫氫醋酸鈉、氯甲酚、對羥基苯甲酸乙酯、芐索氯銨、氯苯甘醚(3p-氯苯氧基丙烷-1,2-二醇)及其混合物。防腐劑濃度可以是0.1 mg/ml至20 mg/ml。

藥物組合物可包含等張劑。等張劑可以是例如選自鹽(例如氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如甘氨酸、組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、糖醇(例如甘油(甘油)、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)及其混合物?？墒褂萌魏翁?，諸如單糖、雙糖或多糖或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、環(huán)糊精、α和β HPCD、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素-Na。糖醇定義為具有至少一個-OH基團的C4-C8 烴并包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一個實施方案中，糖醇添加劑是甘露醇。

藥物組合物可包含螯合劑。螯合劑可以是例如選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸和天冬氨酸的鹽、及其混合物。藥物組合物可包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑可以是例如一種或多種氧化抑制劑、聚集抑制劑、表面活性劑、和/或一種或多種蛋白酶抑制劑。這些各類穩(wěn)定劑的非限制性實例公開于下文。

術(shù)語“聚集體形成”是指多肽分子間的物理相互作用導(dǎo)致形成寡聚物，其可以保持可溶的，或是從溶液中沉淀下來的大的可見的聚集體。在液體藥物組合物貯存期間由多肽形成聚集體可不利地影響所述多肽的生物活性，導(dǎo)致藥物組合物治療功效的損失。此外，聚集體形成可導(dǎo)致其它問題，諸如當用輸注系統(tǒng)施用含多肽的藥物組合物時會阻塞管道、膜或泵。

藥物組合物可包含一定量的氨基酸基質(zhì)，其足以在所述組合物貯存期間減少多肽聚集體形成。術(shù)語“氨基酸基質(zhì)”是指一種或多種氨基酸(諸如甲硫氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)或其類似物。任何氨基酸都可以其游離堿形式或其鹽形式存在。氨基酸基質(zhì)的任何立體異構(gòu)體(即 L、D或其混合物)都可存在。

當作為治療劑的多肽是包含容易被這樣氧化的至少一個甲硫氨酸殘基的多肽時，可加入甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸類似物)，以抑制甲硫氨酸殘基氧化為甲硫氨酸亞砜?？墒褂眉琢虬彼岬娜魏瘟Ⅲw異構(gòu)體(L或D)或其組合。

藥物組合物可包含選自高分子聚合物或低分子化合物的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑可以是例如選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基-/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)例如單硫代甘油、硫乙醇酸和2-甲硫基乙醇和不同鹽類(例如氯化鈉)。藥物組合物可包含額外的穩(wěn)定劑，諸如但不限于甲硫氨酸和EDTA，其保護多肽以免于甲硫氨酸氧化，和非離子型表面活性劑，其保護多肽以免于凍融或機械剪切相關(guān)的聚集。

藥物組合物可包含一種或多種表面活性劑，優(yōu)選一種表面活性劑、至少一種表面活性劑或2種不同的表面活性劑。術(shù)語“表面活性劑”是指由水溶性(親水性)部分和脂溶性(親脂性)部分構(gòu)成的任何分子或離子。表面活性劑可以是例如選自陰離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑、和/或兩性離子型表面活性劑。

藥物組合物可包含一種或多種蛋白酶抑制劑，諸如例如EDTA (乙二胺四乙酸)和/或苯甲脒HCl。

藥物組合物的額外任選成分包括例如潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、金屬離子、油性媒介物、蛋白質(zhì)(例如人血清白蛋白、明膠)、和/或兩性離子(例如氨基酸諸如甜菜堿、?；撬帷⒕彼?、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。

此外，可將藥物組合物按照本領(lǐng)域已知方法配制成促胰島素化合物的口服制劑，例如，使用WO 2008/145728所述的任何一種或多種制劑。

所施用的劑量可含有0.01 mg - 100 mg的所述衍生物，或0.01-50 mg、或0.01-20 mg、或0.01-10 mg的所述衍生物。

所述衍生物可以藥物組合物的形式施用?？蓪⑺┯糜谟行枰幕颊叩娜舾刹课?，例如局部部位，諸如皮膚或粘膜部位；旁路吸收部位，諸如動脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或心臟內(nèi)；和參與吸收的部位，諸如皮膚內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)或腹內(nèi)。

施用途徑可以是例如舌；舌下；口腔含化；口腔；口服；胃內(nèi)；腸內(nèi)；鼻腔；肺，諸如通過細支氣管、肺泡或其組合；胃腸外、表皮；真皮；透皮；結(jié)膜；輸尿管；陰道；直腸；和/或眼內(nèi)。組合物可以是口服組合物，且施用途徑可以是經(jīng)口服。

組合物可以若干劑型施用，例如作為溶液劑；混懸劑；乳劑；微乳劑；多重乳劑；泡沫劑；藥膏劑；糊劑；膏藥劑；軟膏劑；片劑；包衣片劑；口香糖；漱口水；膠囊劑，諸如硬質(zhì)或軟質(zhì)明膠膠囊劑；栓劑(suppositorium)；直腸膠囊劑；滴劑；凝膠劑；噴霧劑；粉劑；氣溶膠；吸入劑；滴眼劑；眼用軟膏劑；眼用洗劑；陰道栓劑；陰道環(huán)；陰道軟膏劑；注射用溶液劑；原位轉(zhuǎn)化溶液劑諸如原位膠凝、放置、沉淀、和原位結(jié)晶；輸注用溶液劑；或植入物。組合物可以是片劑(任選包衣)、膠囊劑或咀嚼劑。

還可將組合物進一步復(fù)合到藥物載體或藥物遞送系統(tǒng)中，例如，為了改善穩(wěn)定性、生物利用度和/或溶解度。在一個特定的實施方案中，可將組合物通過共價鍵、疏水鍵和/或靜電相互作用連接到所述系統(tǒng)。這類復(fù)合的目的是例如減少副作用，達到長期治療和/或增加患者的依從性。

組合物也可用于控制釋放、持續(xù)釋放、延長釋放、延遲釋放和/或緩慢釋放藥物遞送系統(tǒng)的制劑中。

胃腸外施用可通過注射器方式，任選筆型注射器，或通過輸注泵方式，經(jīng)皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射而進行。

可以溶液劑、混懸劑或粉劑形式經(jīng)鼻腔施用組合物；或其可以液體或粉末噴霧的形式經(jīng)肺部施用。

透皮施用也是再進一步的選擇，例如通過無針注射，從貼劑諸如離子電滲貼劑(iontophoretic patch)，或通過透黏膜途徑，例如經(jīng)口。

組合物可以是穩(wěn)定的制劑。術(shù)語“穩(wěn)定的制劑”是指具有增加的物理和/或化學穩(wěn)定性、優(yōu)選這兩者的制劑。一般而言，制劑在使用和貯存期間必須是穩(wěn)定的(按照推薦的使用和貯存條件)，直至達到有效期。

術(shù)語“物理穩(wěn)定性”是指多肽形成無生物活性的和/或不溶聚集體的趨勢，這由暴露于熱-機械應(yīng)力和/或與不穩(wěn)定界面和表面(諸如疏水性表面)相互作用而引起?？赏ㄟ^目測和/或通過濁度測量，在不同溫度中在機械/物理應(yīng)力(例如，攪拌)中暴露不同時段之后，評價含水多肽制劑的物理穩(wěn)定性?；蛘?，可使用多肽構(gòu)象狀態(tài)的分光試劑或探針評價物理穩(wěn)定性，所述試劑或探針例如硫代黃素T或“疏水性貼片”探針。

術(shù)語“化學穩(wěn)定性”是指多肽結(jié)構(gòu)中的化學(尤其是共價)變化，其導(dǎo)致形成化學降解產(chǎn)物，其可能與完整多肽相比具有降低的生物功效、和/或增加的免疫原性效應(yīng)?？赏ㄟ^在不同時間點、在暴露于不同環(huán)境條件之后測定化學降解產(chǎn)物的量來評價化學穩(wěn)定性，例如通過SEC-HPLC和/或RP-HPLC。

可將本發(fā)明衍生物的治療與一種或多種額外的藥理學活性物質(zhì)聯(lián)用，例如選自抗糖尿病藥、抗肥胖癥藥、食欲調(diào)節(jié)藥、抗高血壓藥、治療和/或預(yù)防糖尿病所致或相關(guān)并發(fā)癥的藥物以及治療和/或預(yù)防肥胖癥所致或相關(guān)并發(fā)癥和障礙的藥物。這些藥理學活性物質(zhì)的實例是：胰島素、磺脲類、雙胍類、美格列奈、葡糖苷酶抑制劑、胰高血糖素拮抗劑、DPP-IV (二肽基肽酶IV)抑制劑、參與糖異生和/或肝糖分解的刺激的肝酶抑制劑、葡萄糖 攝取調(diào)節(jié)劑、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的化合物諸如抗高血脂藥例如HMG CoA 抑制劑(他汀類)、胃抑制性多肽(GIP類似物)、減少食物攝取的化合物、RXR 激動劑和作用于β細胞的ATP依賴性鉀通道的藥物；考來烯胺、考來替泊、氯貝丁酯、吉非貝齊、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他汀、普羅布考、右旋甲狀腺素、那格列奈、瑞格列奈；β-阻滯劑諸如阿普洛爾、阿替洛爾、噻嗎洛爾、吲哚洛爾、普萘洛爾和美托洛爾、ACE (血管緊張素轉(zhuǎn)化酶)抑制劑諸如貝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、賴諾普利、依那普利、喹那普利和雷米普利、鈣通道阻滯劑諸如硝苯地平、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾氮罩和維拉帕米和α-阻滯劑諸如多沙唑嗪、烏拉地爾、哌唑嗪和特拉唑嗪；CART (可卡因安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物)激動劑、NPY (神經(jīng)肽Y)拮抗劑、PYY 激動劑、Y2受體激動劑、Y4受體激動劑、混合型Y2/Y4受體激動劑、MC4 (黑皮質(zhì)素 4)激動劑、食欲肽拮抗劑、TNF (腫瘤壞死因子)激動劑、CRF (促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子)激動劑、CRF BP (促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子結(jié)合蛋白)拮抗劑、尿皮質(zhì)激素激動劑、β3 激動劑、胃泌酸調(diào)節(jié)素和類似物、MSH (黑素細胞刺激激素)激動劑、MCH (黑素細胞濃縮激素)拮抗劑、CCK (縮膽囊素)激動劑、5-羥色胺重攝取抑制劑、5-羥色胺和去甲腎上腺素重攝取抑制劑、混合型5-羥色胺和去甲腎上腺素能化合物、5HT (5-羥色胺)激動劑、鈴蟾肽激動劑、甘丙肽拮抗劑、生長激素、生長激素釋放化合物、TRH (甲狀腺刺激激素釋放激素)激動劑、UCP 2或3 (解聯(lián)蛋白2或3)調(diào)節(jié)劑、瘦蛋白激動劑、DA 激動劑(溴隱亭、doprexin)、脂肪酶/淀粉酶抑制劑、RXR (類視色素 X受體)調(diào)節(jié)劑、TR β激動劑；組胺H3拮抗劑、胃抑制性多肽激動劑或拮抗劑(GIP類似物)、胃泌素和胃泌素類似物。

也可將本發(fā)明衍生物的治療與影響葡萄糖水平和/或脂肪穩(wěn)態(tài)諸如胃束帶或胃旁路的手術(shù)聯(lián)用。

藥物適應(yīng)癥

在第三方面，本發(fā)明也涉及用作藥物的本發(fā)明的衍生物。

在特定的實施方案中，本發(fā)明的衍生物可用于以下藥物治療，所有無論如何都優(yōu)選涉及糖尿?。?/p>

(i) 預(yù)防和/或治療所有形式的糖尿病，諸如高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、非胰島素依賴性糖尿病、MODY (青少年的成人發(fā)作型糖尿病)、妊娠期糖尿病和/或用于降低HbA1C；

(ii) 延遲或預(yù)防糖尿病進程，諸如2型糖尿病的進程，延遲葡萄糖耐量減低(IGT)轉(zhuǎn)為胰島素需要型2型糖尿病的進程，和/或延遲非胰島素需要型2型糖尿病轉(zhuǎn)為胰島素需要型2型糖尿病的進程；

(iii) 改善β細胞功能，諸如減少β細胞細胞凋亡，增加β細胞功能和/或β細胞的量，和/或恢復(fù)β細胞的葡萄糖敏感性；

(iv) 預(yù)防和/或治療認知障礙；

(v) 預(yù)防和/或治療進食障礙，諸如肥胖癥，例如通過減少食物攝取，降低體重，抑制食欲，誘導(dǎo)飽脹感；治療或預(yù)防暴食癥、神經(jīng)性貪食癥和/或因施用安定藥或甾體所致的肥胖癥；減少胃運動；和/或延遲胃排空；

(vi) 預(yù)防和/或治療糖尿病并發(fā)癥，諸如神經(jīng)病，包括周圍神經(jīng)??；腎??；或視網(wǎng)膜??；

(vii) 改善脂質(zhì)參數(shù)，諸如預(yù)防和/或治療高脂血癥，降低總血清脂質(zhì)；降低HDL；降低小密度LDL；降低VLDL；降低甘油三酯；降低膽固醇；增加HDL；降低人血漿中脂蛋白a(Lp(a))的水平；在體外和/或體內(nèi)抑制載脂蛋白a (apo(a))的產(chǎn)生；

(iix) 預(yù)防和/或治療心血管疾病，諸如X綜合征；動脈粥樣硬化；心肌梗塞；冠心??；中風、腦缺血；早期心臟病或早期心血管病，諸如左心室肥大；冠狀動脈病；原發(fā)性高血壓；急性高血壓危象；心肌?。恍墓δ懿蝗诲憻捘褪苄?exercise tolerance)；慢性心力衰竭；心率不齊；心律失常；暈厥(syncopy)；動脈粥樣硬化；輕度慢性心力衰竭；心絞痛；心臟旁路重閉塞(cardiac bypass reocclusion)；間歇性跛行(atheroschlerosis oblitterens)；舒張功能障礙；和/或收縮功能障礙；

(ix) 預(yù)防和/或治療胃腸道疾病，諸如炎性腸綜合征；小腸綜合征或克羅恩病(Crohn’s disease)；消化不良；和/或胃潰瘍；

(x) 預(yù)防和/或治療危急病癥，諸如治療危急病癥患者，危急病癥多發(fā)性腎病(critical illness poly-nephropathy，CIPNP)患者和/或潛在CIPNP 患者；預(yù)防危急病癥或CIPNP的發(fā)展；預(yù)防、治療和/或治愈患者的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)；和/或預(yù)防或減少患者在留醫(yī)期間患有菌血癥、敗血癥和/或膿毒性休克的可能性；和/或

(xi) 預(yù)防和/或治療多囊卵巢綜合征(PCOS)。

在一個特定的實施方案中，所述適應(yīng)癥選自(i)-(iii)和(v)-(iix)，諸如適應(yīng)癥(i)、(ii)和/或(iii)；或適應(yīng)癥(v)、適應(yīng)癥(vi)、適應(yīng)癥(vii)，和/或適應(yīng)癥(iix)。

在另一個特定的實施方案中，適應(yīng)癥是(i)。在進一步的特定的實施方案中，適應(yīng)癥是(v)。在再進一步的特定的實施方案中，適應(yīng)癥是(iix)。

以下適應(yīng)癥特別優(yōu)選：2型糖尿病和/或肥胖癥。

具體實施方式

以下是本發(fā)明特定的實施方案：

1.GLP-1類似物的衍生物，

其中GLP-1類似物包含在對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置上的第一K殘基；在對應(yīng)于GLP-1(7-37)的位置T 的位置上的第二K殘基，其中T是7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)；以及與GLP-1(7-37)相比，包含最多10個氨基酸改變；其中所述第一K殘基指定為K²⁷，且第二K殘基指定為K^T；

所述衍生物包含分別經(jīng)由第一和第二接頭分別連接到K²⁷和K^T的第一和第二延長部分，其中

第一和第二延長部分選自化學式1和化學式2：

化學式1:

化學式2:

其中x是6-16范圍內(nèi)的整數(shù)，y是3-17范圍內(nèi)的整數(shù)，并且第一和第二接頭包含化學式5：

化學式5:

其中k是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)；

或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯。

2.實施方案1的衍生物，其中T是選自7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)。

3.實施方案1-2中任一項的衍生物，其中T選自7-17、19-26、和28-37范圍內(nèi)的任何整數(shù)。

4.實施方案1-3中任一項的衍生物，其中T選自7-17的范圍。

5.實施方案1-4中任一項的衍生物，其中T是12。

6.實施方案1-3中任一項的衍生物，其中T選自19-26的范圍。

7.實施方案1-3和6中任一項的衍生物，其中T選自20、22和24。

8.實施方案1-3和6-7中任一項的衍生物，其中T是20。

9.實施方案1-3和6-7中任一項的衍生物，其中T是22或24。

10.實施方案1-3、6-7和9中任一項的衍生物，其中T是22。

11.實施方案1-3、6-7和9中任一項的衍生物，其中T是24。

12.實施方案1-3中任一項的衍生物，其中T選自28-37的范圍。

13.實施方案1-3和12中任一項的衍生物，其中T選自36和37。

14.實施方案1-3和12-13中任一項的衍生物，其中T是36。

15.實施方案1-3和12中任一項的衍生物，其中T是37。

16.實施方案1-16中任一項的衍生物，其中通過書寫和目測來識別對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置。

17.實施方案1-16中任一項的衍生物，其中通過書寫和目測來識別對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置T的位置。

18.實施方案1-17中任一項的衍生物，其中通過使用標準蛋白或肽比對程序來識別對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置。

19.實施方案1-18中任一項的衍生物，其中通過使用標準蛋白或肽比對程序來識別對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置T的位置。

20.實施方案19的衍生物，其中所述比對程序是Needleman-Wunsch比對。

21.實施方案19-20中任一項的衍生物，其中使用默認評分矩陣和默認特性矩陣。

22.實施方案19-21中任一項的衍生物，其中所述評分矩陣是BLOSUM62。

23.實施方案19-22中任一項的衍生物，其中空位中第一殘基的罰分是-10(負十)。

24.實施方案19-23中任一項的衍生物，其中空位中額外殘基的罰分是-0.5(負零點五)。

25.實施方案1-24中任一項的衍生物，其中所述類似物除第一和第二K殘基之外不含K殘基。

26.實施方案1-25中任一項的衍生物，其中延長部分是化學式1。

27.實施方案1-26中任一項的衍生物，其中x是偶數(shù)。

28.實施方案1-27中任一項的衍生物，其中x是12。

29.實施方案1-28中任一項的衍生物，其中化學式1由化學式1a代表：

化學式1a:

。

30.實施方案1-25中任一項的衍生物，其中延長部分是化學式2。

31.實施方案1-25和30中任一項的衍生物，其中化學式2由化學式2a代表：

化學式2a:

。

32.實施方案1-25和30-31中任一項的衍生物，其中y是奇數(shù)。

33.實施方案1-25和30-32中任一項的衍生物，其中y是9-11范圍內(nèi)的整數(shù)。

34.實施方案1-25和30-33中任一項的衍生物，其中y是9。

35.實施方案1-25和30-33中任一項的衍生物，其中y是11。

36.實施方案1-25和30-35中任一項的衍生物，其中化學式2由化學式2b或化學式2c代表：

化學式2b:

化學式2c:

。

37.實施方案1-25和30-35中任一項的衍生物，其中化學式2由化學式2b代表。

38.實施方案31-35中任一項的衍生物，其中化學式2a由化學式2b或化學式2c代表：

化學式2b:

化學式2c:

。

39.實施方案31-35和38中任一項的衍生物，其中化學式2a由化學式2b代表。

40.實施方案1-39中任一項的衍生物，其中化學式5是第一接頭元件。

41.實施方案1-40中任一項的衍生物，其中k是1。

42.實施方案1-41中任一項的衍生物，其中n是1。

43.實施方案1-42中任一項的衍生物，其中化學式5被包括m次，其中m是1-10范圍內(nèi)的整數(shù)。

44.實施方案43的衍生物，其中所述m是2。

45.實施方案43-44中任一項的衍生物，其中當m不是1時，所述化學式5元件經(jīng)由酰胺鍵互相連接。

46.實施方案1-45中任一項的衍生物，其中所述接頭進一步包含第二接頭元件。

47.實施方案46的衍生物，其中所述第二接頭元件是Glu二基。

48.實施方案46-47中任一項的衍生物，其中所述第二接頭元件選自化學式6和/或 化學式7：

化學式6:

化學式7:

。

49.實施方案48的衍生物，其中所述第二接頭元件是化學式6。

50.實施方案46-49中任一項的衍生物，其中Glu二基被包括p次，其中p是1-2范圍內(nèi)的整數(shù)。

51.實施方案50的衍生物，其中p是1。

52.實施方案50的衍生物，其中p是2。

53.實施方案46-52中任一項的衍生物，其中所述Glu二基是L-Glu的基團。

54.實施方案46-53中任一項的衍生物，其中一個或多個Glu二基和一個或多個化學式5元件經(jīng)由酰胺鍵相互連接。

55.實施方案46-54中任一項的衍生物，其中所述接頭由m次化學式5和p次Glu二基組成。

56.實施方案55的衍生物，其中(m,p)是(2,2)或(2,1)。

57.實施方案56的衍生物，其中(m,p)是(2,1)。

58.實施方案55-57中任一項的衍生物，其中m次化學式5元件和p次Glu二基經(jīng)由酰胺鍵互相連接。

59.實施方案1-58中任一項的衍生物，其中所述接頭和所述延長部分經(jīng)由酰胺鍵互相連接。

60.實施方案1-59中任一項的衍生物，其中所述接頭和所述GLP-1類似物經(jīng)由酰胺鍵互相連接。

61.實施方案1-60中任一項的衍生物，其中所述接頭連接到第一或第二K殘基的ε-氨基。

62.實施方案1-61中任一項的衍生物，其中所述接頭具有5-41個C原子。

63.實施方案1-62中任一項的衍生物，其中所述接頭具有17或22個C原子。

64.實施方案1-63中任一項的衍生物，其中所述接頭具有17個C原子。

65.實施方案1-63中任一項的衍生物，其中所述接頭具有22個C原子。

66.實施方案1-65的衍生物，其中所述接頭具有4-28個雜原子。

67.實施方案1-66中任一項的衍生物，其中所述接頭具有12或16個雜原子。

68.實施方案1-67中任一項的衍生物，其中所述接頭具有12個雜原子。

69.實施方案1-67中任一項的衍生物，其中所述接頭具有16個雜原子。

70.實施方案66-70中任一項的衍生物，其中所述雜原子是N-和/或O-原子。

71.實施方案1-70中任一項的衍生物，其中所述接頭具有1-7個N原子。

72.實施方案1-71中任一項的衍生物，其中所述接頭具有3或4個N原子。

73.實施方案1-72中任一項的衍生物，其中所述接頭具有3個N原子。

74.實施方案1-72中任一項的衍生物，其中所述接頭具有4個N原子。

75.實施方案1-74中任一項的衍生物，其中所述接頭具有3-21個O原子。

76.實施方案1-75中任一項的衍生物，其中所述接頭具有9或12個O原子。

77.實施方案1-76中任一項的衍生物，其中所述接頭具有9個O原子。

78.實施方案1-76中任一項的衍生物，其中所述接頭具有12個O原子。

79.實施方案1-78中任一項的衍生物，其中所述接頭由經(jīng)由酰胺鍵相互連接的2次化學式6和2次化學式5組成，并且在所示序列中所述接頭在其*-NH端與所述延長部分的*-CO端連接，和在其*-CO端與GLP-1類似物的K²⁷或K^T的ε氨基連接。

80.實施方案1-78中任一項的衍生物，其中所述接頭由經(jīng)由酰胺鍵相互連接的2次化學式5和1次化學式6組成，并且在所示序列中所述接頭在其*-NH端與所述延長部分的*-CO端連接，和在其游離*-CO端與GLP-1類似物的K²⁷或K^T的ε氨基連接。

81.實施方案1-78中任一項的衍生物，其中所述接頭由經(jīng)由酰胺鍵相互連接的1次化學式6和2次化學式5組成，并且在所示序列中所述接頭在其*-NH端與所述延長部分的*-CO端連接，和在其*-CO端與GLP-1類似物的K²⁷或K^T的ε氨基連接。

82.實施方案1-78中任一項的衍生物，其中所述接頭由經(jīng)由酰胺鍵相互連接的1次化學式6、2次化學式5和1次化學式6組成，并且在所示序列中所述接頭在其*-NH端與所述延長部分的*-CO端連接，和在其*-CO端與GLP-1類似物的K²⁷或K^T的ε氨基連接。

83.實施方案1-82中任一項的衍生物，其中所述兩個延長部分基本相同。

84.實施方案1-83中任一項的衍生物，其中所述兩個延長部分a)至少80%、b)至少85%、c)至少90%、d)至少95%或e)至少99%相同。

85.實施方案1-83中任一項的衍生物，其中所述兩個延長部分具有a)至少0.5；b)至少0.6；c)至少0.7, d)至少0.8；e)至少0.9；或f)至少0.99的相似性。

86.實施方案1-85中任一項的衍生物，其中所述兩個延長部分具有1.0的相似性。

87.實施方案1-86中任一項的衍生物，其中所述兩個接頭基本相同。

88.實施方案1-87中任一項的衍生物，其中所述兩個接頭具有至少0.5的相似性。

89.實施方案1-88中任一項的衍生物，其中所述兩個接頭具有a)至少0.6；b)至少0.7, c)至少0.8；d)至少0.9；或e)至少0.99的相似性。

90.實施方案1-89中任一項的衍生物，其中所述兩個接頭具有1.0的相似性。

91.實施方案1-90中任一項的衍生物，其中所述兩個白蛋白結(jié)合劑，諸如由延長部分和接頭組成的兩條側(cè)鏈，基本相同。

92.實施方案1-91中任一項的衍生物，其中所述兩個白蛋白結(jié)合劑，諸如由延長部分和接頭組成的兩條側(cè)鏈，a)至少80%、b)至少85%、c)至少90%、d)至少95%、或e)至少99%相同。

93.實施方案1-92中任一項的衍生物，其中所述兩個白蛋白結(jié)合劑，諸如由延長部分和接頭組成的兩條側(cè)鏈，具有a)至少0.5；b)至少0.6；c)至少0.7, d)至少0.8；e)至少0.9；或f)至少0.99的相似性。

94.實施方案1-92中任一項的衍生物，其中所述兩個白蛋白結(jié)合劑，諸如由延長部分和接頭組成的兩條側(cè)鏈，具有1.0的相似性。

95.實施方案83-94中任一項的衍生物，其中待比較的2個化學結(jié)構(gòu)被表示為指紋。

96.實施方案95的衍生物，其中所述指紋是a) ECFP_6 指紋；b) UNITY指紋；和/或c) MDL指紋。

97.實施方案95-96中任一項的衍生物，其中優(yōu)選使用Tanimoto系數(shù)來計算2個指紋的相似性或同一性。

98.實施方案1-97中任一項的衍生物，其中通過書寫和目測來識別與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)相比的氨基酸改變的數(shù)量。

99.實施方案1-98中任一項的衍生物，其中通過使用標準蛋白或肽比對程序來識別與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)相比的氨基酸改變的數(shù)量。

100.實施方案99的衍生物，其中所述比對程序是Needleman-Wunsch比對。

101.實施方案99-100中任一項的衍生物，其中使用默認評分矩陣和默認特性矩陣。

102.實施方案99-101中任一項的衍生物，其中所述評分矩陣是BLOSUM62。

103.實施方案99-102中任一項的衍生物，其中空位中第一殘基的罰分是 -10 (負十)。

104.實施方案99-103中任一項的衍生物，其中空位中額外殘基的罰分是 -0.5 (負零點五)。

105.實施方案1-104中任一項的衍生物，其中所述氨基酸改變是在對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的以下位置的一個或多個位置：8、12、20、22、23、24、25、26、27、30、31、34、35、36、37、38和39。

106.實施方案1-105中任一項的衍生物，其中所述類似物包含至少一個以下變化：Aib⁸、K¹²、K²⁰、E²² 或K²²、E²³、K²⁴、V²⁵、R²⁶ 或H²⁶、K²⁷、E³⁰、H³¹、G³⁴ 或R³⁴ 或Q³⁴、Des³⁵、K³⁶ 或Des³⁶、K³⁷ 或Des³⁷、E³⁸ 或Q³⁸、和/或 G³⁹。

107.實施方案1-106中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K¹²且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴、R³⁴、和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

108.實施方案1-106中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K²⁰且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴、R³⁴、和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

109.實施方案1-106中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K²²且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴、R³⁴、和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

110.實施方案1-106中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K²⁴且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴、R³⁴、和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

111.實施方案1-106中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K³⁶且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴、R³⁴、和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

112.實施方案1-106中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K³⁷且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴、R³⁴、和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

113.實施方案1-112中任一項的衍生物，其中所述類似物包含至少一個以下變化：Aib⁸、E²²、E²³、V²⁵、E³⁰、H³¹、Des³⁵、Des³⁶、Des³⁷、E³⁸ 或Q³⁸、和/或 G³⁹。

114.實施方案1-113中任一項的衍生物，其中所述類似物包含Aib⁸。

115.實施方案1-114中任一項的衍生物，其中所述類似物包含E²²。

116.實施方案1-115中任一項的衍生物，其中所述類似物包含E²³。

117.實施方案1-116中任一項的衍生物，其中所述類似物包含V²⁵。

118.實施方案1-117中任一項的衍生物，其中所述類似物包含E³⁰。

119.實施方案1-118中任一項的衍生物，其中所述類似物包含H³¹。

120.實施方案1-119中任一項的衍生物，其中所述類似物包含Des³⁷。

121.實施方案120的衍生物，其中所述類似物包含Des³⁶。

122.實施方案121中任一項的衍生物，其中所述類似物包含Des³⁵。

123.實施方案1-119中任一項的衍生物，其中所述類似物包含E³⁸或Q³⁸。

124.實施方案123的衍生物，其中所述類似物包含Q³⁸。

125.實施方案123的衍生物，其中所述類似物包含E³⁸。

126.實施方案123-125中任一項的衍生物，其中所述類似物包含G³⁹。

127.實施方案122的衍生物，其是GLP-1(7-34) (SEQ ID NO: 1的氨基酸1-28)的衍生物。

128.實施方案121的衍生物，其是GLP-1(7-35) (SEQ ID NO: 1的氨基酸1-29)的衍生物。

129.實施方案120的衍生物，其是GLP-1(7-36) (SEQ ID NO: 1的氨基酸1-30)的衍生物。

130.實施方案1-119中任一項的衍生物，其是GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1的氨基酸1-31)的衍生物。

131.實施方案123-125中任一項的衍生物，其是GLP-1(7-38)(SEQ ID NO:1的氨基酸1-31，加1個C-末端添加的氨基酸殘基)的衍生物。

132 實施方案126中任一項的衍生物，其是GLP-1(7-39)(SEQ ID NO:1的氨基酸1-31，加兩個C-末端添加的氨基酸殘基)的衍生物。

133.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多9個氨基酸改變。

134.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多8個氨基酸改變。

135.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多7個氨基酸改變。

136.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多6個氨基酸改變。

137.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多5個氨基酸改變。

138.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多4個氨基酸改變。

139.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多3個氨基酸改變。

140.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多2個氨基酸改變。

141.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多1個氨基酸改變。

142.實施方案1-140中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少1個氨基酸改變。

143.實施方案1-139中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少2個氨基酸改變。

144.實施方案1-138中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少3個氨基酸改變。

145.實施方案1-137中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少4個氨基酸改變。

146.實施方案1-136中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少5個氨基酸改變。

147.實施方案1-135中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少6個氨基酸改變。

148.實施方案1-134中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少7個氨基酸改變。

149.實施方案1-133中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少8個氨基酸改變。

150.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少9個氨基酸改變。

151.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有1個氨基酸改變。

152.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有2個氨基酸改變。

153.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有3個氨基酸改變。

154.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有4個氨基酸改變。

155.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有5個氨基酸改變。

156.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有6個氨基酸改變。

157.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有7個氨基酸改變。

158.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有8個氨基酸改變。

159.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有9個氨基酸改變。

160.實施方案1-132中任一項的衍生物，其中所述類似物具有10個氨基酸改變。

161.實施方案1-160中任一項的衍生物，其中所述一個或多個改變是獨立地取代、添加和/或缺失。

162.實施方案1-161中任一項的衍生物，其中所述類似物包含式I的GLP-1類似物：

Xaa₇是L-組氨酸、咪唑并丙?；?、α-羥基-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、N^α-乙?；?組氨酸、N^α-甲?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、 α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、或4-吡啶基丙氨酸；

Xaa₈是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)甲酸、(1-氨基環(huán)丁基)甲酸、(1-氨基環(huán)戊基)甲酸、(1-氨基環(huán)己基)甲酸、(1-氨基環(huán)庚基)甲酸或(1-氨基環(huán)辛基)甲酸；

Xaa₁₂是Lys或Phe；

Xaa₁₆是Val或Leu；

Xaa₁₈是Ser、Arg、Asn、Gln、或Glu；

Xaa₁₉是Tyr或Gln；

Xaa₂₀是Leu、Lys、或Met；

Xaa₂₂是Gly、Glu、Lys、或Aib；

Xaa₂₃是Gln、Glu、或Arg；

Xaa₂₄是Ala或Lys；

Xaa₂₅是Ala或Val；

Xaa₂₆是Val、His、或Arg；

Xaa₃₀是Ala、Glu、或Arg；

Xaa₃₁是Trp或His；

Xaa₃₄是Glu、Asn、Gly、Gln、或Arg；

Xaa₃₅是Gly、Aib、或不存在；

Xaa₃₆是Arg、Gly、Lys、或不存在；

Xaa₃₇是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、Arg、或不存在；

Xaa₃₈是Ser、Gly、Ala、Glu、Gln、Pro、Arg、或不存在；且

Xaa₃₉是Gly或不存在。

163.實施方案162的衍生物，其中所述類似物是式I的GLP-1類似物。

164.實施方案162-163中任一項的衍生物，其中式I的肽是GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的類似物。

165.實施方案162-164中任一項的衍生物，其中如果Xaa₃₈不存在，則Xaa₃₉也不存在。

166.實施方案162-165中任一項的衍生物，其中如果Xaa₃₇不存在，則Xaa₃₈ 和Xaa₃₉也不存在。

167.實施方案162-166中任一項的衍生物，其中如果Xaa₃₆不存在，則Xaa₃₇、Xaa₃₈和Xaa₃₉也不存在。

168.實施方案162-167中任一項的衍生物，其中如果Xaa₃₅不存在，則Xaa₃₆、Xaa₃₇、Xaa₃₈和Xaa₃₉也不存在。

169.實施方案162-168中任一項的衍生物，其中Xaa₇是His；Xaa₈是Ala或Aib；Xaa₁₂是Lys或Phe；Xaa₁₆是Val；Xaa₁₈是Ser；Xaa₁₉是Tyr；Xaa₂₀是Leu或Lys；Xaa₂₂是Glu、Gly或Lys；Xaa₂₃是Gln或Glu；Xaa₂₄是Ala或Lys；Xaa₂₅是Ala或Val；Xaa₂₆是His或Arg；Xaa₃₀是Ala或Glu；Xaa₃₁是Trp或His；Xaa₃₄是Gly、Gln或Arg；Xaa₃₅是Gly或不存在；Xaa₃₆是Arg、Lys或不存在；Xaa₃₇是Gly、Lys、或不存在；Xaa₃₈是Glu或Gln；且Xaa₃₉是Gly或不存在。

170.實施方案162-169中任一項的衍生物，其中Xaa₇是His。

171.實施方案162-170中任一項的衍生物，其中Xaa₈是Ala。

172.實施方案162-170中任一項的衍生物，其中Xaa₈是Aib。

173.實施方案162-172中任一項的衍生物，其中Xaa₁₂是Lys。

174.實施方案162-172中任一項的衍生物，其中Xaa₁₂是Phe。

175.實施方案162-174中任一項的衍生物，其中Xaa₁₆是Val。

176.實施方案162-175中任一項的衍生物，其中Xaa₁₈是Ser。

177.實施方案162-176中任一項的衍生物，其中Xaa₁₉是Tyr。

178.實施方案162-177中任一項的衍生物，其中Xaa₂₀是Leu。

179.實施方案162-177中任一項的衍生物，其中Xaa₂₀是Lys。

180.實施方案162-179中任一項的衍生物，其中Xaa₂₂是Glu。

181.實施方案162-179中任一項的衍生物，其中Xaa₂₂是Gly。

182.實施方案162-179中任一項的衍生物，其中Xaa₂₂是Lys。

183.實施方案162-182中任一項的衍生物，其中Xaa₂₃是Gln。

184.實施方案162-182中任一項的衍生物，其中Xaa₂₃是Glu。

185.實施方案162-184中任一項的衍生物，其中Xaa₂₄是Ala。

186.實施方案162-184中任一項的衍生物，其中Xaa₂₄是Lys。

187.實施方案162-186中任一項的衍生物，其中Xaa₂₅是Ala。

188.實施方案162-186中任一項的衍生物，其中Xaa₂₅是Val。

189.實施方案162-188中任一項的衍生物，其中Xaa₂₆是His。

190.實施方案162-188中任一項的衍生物，其中Xaa₂₆是Arg。

191.實施方案162-190中任一項的衍生物，其中Xaa₃₀是Ala。

192.實施方案162-190中任一項的衍生物，其中Xaa₃₀是Glu。

193.實施方案162-192中任一項的衍生物，其中Xaa₃₁是Trp。

194.實施方案162-192中任一項的衍生物，其中Xaa₃₁是His。

195.實施方案162-194中任一項的衍生物，其中Xaa₃₄是Gly。

196.實施方案162-194中任一項的衍生物，其中Xaa₃₄是Gln。

197.實施方案162-194中任一項的衍生物，其中Xaa₃₄是Arg。

198.實施方案162-197中任一項的衍生物，其中Xaa₃₅是Gly。

199.實施方案162-198中任一項的衍生物，其中Xaa₃₅不存在。

200.實施方案162-199中任一項的衍生物，其中Xaa₃₆是Arg。

201.實施方案162-199中任一項的衍生物，其中Xaa₃₆是Lys。

202.實施方案162-199中任一項的衍生物，其中Xaa₃₆不存在。

203.實施方案162-202中任一項的衍生物，其中Xaa₃₇是Gly。

204.實施方案162-202中任一項的衍生物，其中Xaa₃₇是Lys。

205.實施方案162-202中任一項的衍生物，其中Xaa₃₇不存在。

206.實施方案162-205中任一項的衍生物，其中Xaa₃₈是Glu。

207.實施方案162-205中任一項的衍生物，其中Xaa₃₈是Gln。

208.實施方案162-205中任一項的衍生物，其中Xaa₃₈不存在。

209.實施方案162-208中任一項的衍生物，其中Xaa₃₉是Gly。

210.實施方案162-208中任一項的衍生物，其中Xaa₃₉不存在。

211.實施方案1-210中任一項的衍生物，其中所述衍生物與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比包含以下氨基酸改變：

。

212.實施方案211的衍生物，其中所述類似物具有如(i)-(xxvii)中任一項定義的一組氨基酸改變。

213.選自下列的化合物：化學式50、化學式51、化學式52、化學式53、化學式54、化學式55、化學式56、化學式57、化學式58、化學式59、化學式60、化學式61、化學式62、化學式63、化學式64、化學式65、化學式66、化學式67、化學式68、化學式69、化學式70、化學式71、化學式72、化學式73、化學式74、化學式75、化學式76、化學式77、化學式78、化學式79、化學式80和化學式81；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯。

214.實施方案213的化合物，其是根據(jù)實施方案1-212中任一項所述的化合物。

215.一種化合物，其特征在于其名稱，且選自本文實施例1-32化合物的各名稱列表或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯。

216.實施方案215的化合物，其是根據(jù)實施方案1-214中任一項所述的化合物。

217.實施方案1-216中任一項的衍生物，其具有GLP-1活性。

218.實施方案217的衍生物，其中GLP-1活性是指活化人GLP-1受體的能力。

219.實施方案217的衍生物，其中在體外測定中測定人GLP-1受體的活化。

220.實施方案217-219中任一項的衍生物，其中測定人GLP-1受體的活化作為cAMP產(chǎn)生的功效。

221.實施方案217-220中任一項的衍生物，其功效對應(yīng)于以下EC₅₀

a)低于10000pM，更優(yōu)選低于5000pM，甚至更優(yōu)選低于4000pM，或最優(yōu)選低于3000 pM；

b)低于2000pM，優(yōu)選低于1500pM，更優(yōu)選低于1200pM，甚至更優(yōu)選低于1000pM，或最優(yōu)選低于500 pM；

c)低于400pM，優(yōu)選低于300pM，更優(yōu)選低于200pM，甚至更優(yōu)選低于150pM，或最優(yōu)選低于100 pM；或

d)低于80pM，優(yōu)選低于60pM，更優(yōu)選低于40pM，甚至更優(yōu)選低于30pM，或最優(yōu)選低于20 pM。

222.實施方案217-221中任一項的衍生物，其中對于劑量-反應(yīng)曲線，功效測定為EC₅₀，顯示在含有人GLP-1受體的培養(yǎng)基中cAMP的劑量依賴性形成。

223.實施方案219-222中任一項的衍生物，其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系諸如BHK467-12A (tk-ts13)。

224.實施方案219-223中任一項的衍生物，其中用于測定cAMP的功能性受體測定。

225.實施方案219-224中任一項的衍生物，其中所述測定基于內(nèi)源形成的cAMP與外源添加的生物素-標記的cAMP之間的競爭。

226.實施方案219-225中任一項的衍生物，在所述測定中使用特異性抗體捕獲cAMP。

227.實施方案219-226中任一項的衍生物，其中所述測定是AlphaScreencAMP測定。

228.實施方案219-227中任一項的衍生物，其中所述測定描述于實施例33。

229.實施方案217-228中任一項的衍生物，其中所述人GLP-1受體的活化被測量為在低白蛋白濃度存在的情況下與受體結(jié)合的能力，其中所述低白蛋白濃度為0.005% HSA，或優(yōu)選0.001% HSA。

230.實施方案217-229中任一項的衍生物，其比率[在2.0% HSA (高白蛋白)存在下的GLP-1受體結(jié)合親和力(IC₅₀)，除以在0.001% HSA (低白蛋白)存在下的GLP-1受體結(jié)合親和力(IC₅₀)]為：

a)至少1.0，更優(yōu)選至少 10，甚至更優(yōu)選至少 25，或最優(yōu)選至少 50；

b)至少60，優(yōu)選至少 70，更優(yōu)選至少 80，甚至更優(yōu)選至少 90，或最優(yōu)選至少 100；

c)至少125，優(yōu)選至少 150，更優(yōu)選至少 200，仍更優(yōu)選至少 250，甚至更優(yōu)選至少 400，或最優(yōu)選至少500；或

d)至少600，優(yōu)選至少 800，甚至更優(yōu)選至少 900，或最優(yōu)選至少 1000。

231.實施方案217-230中任一項的衍生物，在0.001% HSA(低白蛋白)存在下其GLP-1受體結(jié)合親和力(IC₅₀)為

a)低于1000nM，優(yōu)選低于750nM，更優(yōu)選低于500nM，或最優(yōu)選低于400nM;或

b)低于300nM，優(yōu)選低于250nM，更優(yōu)選低于200nM，或最優(yōu)選低于100nM;或

c)低于50.0 nM，優(yōu)選低于15.0 nM，更優(yōu)選低于10.0 nM，甚至更優(yōu)選低于5.0 nM，或最優(yōu)選低于1.0 nM

d)低于0.80 nM，優(yōu)選低于0.60 nM，更優(yōu)選低于0.40 nM，甚至更優(yōu)選低于0.30 nM，或最優(yōu)選低于0.20 nM。

232.實施方案217-231中任一項的衍生物，在2.0% HSA (高白蛋白)存在下其GLP-1受體結(jié)合親和力(IC₅₀)為

a)低于1000 nM，更優(yōu)選低于900 nM，或最優(yōu)選低于800 nM; 或

b)低于500 nM，優(yōu)選低于400 nM，更優(yōu)選低于300 nM，甚至更優(yōu)選低于150 nM，或最優(yōu)選低于50.0 nM。

166.實施方案217-232中任一項的衍生物，其中通過從所述受體中取代¹²⁵I-GLP-1的方式測定與GLP-1受體的結(jié)合親和力。

233.實施方案217-232中任一項的衍生物，其中使用SPA結(jié)合測定。

234.實施方案217-233中任一項的衍生物，其中使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系來制備所述GLP-1受體。

235.實施方案217-234中任一項的衍生物，其中使用倉鼠細胞系，優(yōu)選幼倉鼠腎細胞系諸如BHK tk-ts13。

236.實施方案229-235中任一項的衍生物，其中所述IC₅₀值測定為從所述受體中取代50% ¹²⁵I-GLP-1的濃度。

237.實施方案1-236中任一項的衍生物，其口服生物利用度、優(yōu)選絕對口服生物利用度，高于塞馬魯肽。

238.實施方案 237的衍生物，其中在大鼠體內(nèi)測量口服生物利用度。

239.實施方案237-239中任一項的衍生物，其中口服生物利用度被測量為直接注射到腸腔之后的血漿暴露。

240.實施方案237-239中任一項的衍生物，其中在將所述衍生物溶液注入大鼠空腸后30分鐘所測的所述衍生物的血漿濃度(pM)，除以注射溶液濃度(μM) (在30 min的劑量校正暴露)，為a) 至少 39，b) 至少 40；c) 至少 60；d) 至少 80；e) 至少 100；f) 至少 125；或g) 至少 150。

241.實施方案237-240中任一項的衍生物，其中在將所述衍生物溶液注入大鼠空腸后30分鐘所測的所述衍生物的血漿濃度(pM)，除以注射溶液濃度(μM) (在30 min的劑量校正暴露)，為a) 至少 160，b) 至少 180，c) 至少 200，或d) 至少 250。

242.實施方案237-241中任一項的衍生物，其中在與55 mg/ml癸酸鈉的混合物中以1000 uM濃度測定所述GLP-1衍生物。

243.實施方案237-242中任一項的衍生物，其中使用雄性Sprague Dawley大鼠。

244.實施方案237-243中任一項的衍生物，其中大鼠到達時體重為大約 240 g。

245.實施方案237-244中任一項的衍生物，其中所述大鼠在所述實驗之前禁食大約 18小時。

246.實施方案237-245中任一項的衍生物，其中在禁食后和在空腸注射所述衍生物之前，對所述大鼠進行常規(guī)麻醉。

247.實施方案237-246中任一項的衍生物，其中在空腸的近端部分(十二指腸的10 cm遠端)或在中腸(盲腸的50 cm近端)施用所述衍生物。

248.實施方案237-247中任一項的衍生物，其中用注射器，通過導(dǎo)管將100 μl所述衍生物注射到空腸腔內(nèi)，再用另一注射器將200 μl空氣推入空腸腔內(nèi)，然后讓其與導(dǎo)管的連接以防流回到導(dǎo)管中。

249.實施方案237-248中任一項的衍生物，其中在所需時間間隔從尾靜脈采集血液樣品(200 ul)到EDTA管，諸如在時間0、10、30、60、120和240 min，并在20分鐘內(nèi)在10000G在4℃離心5分鐘。

250.實施方案237-249中任一項的衍生物，其中分離血漿(例如，75ul)，立即冷凍并保存在-20℃，直到分析所述衍生物的血漿濃度。

251.實施方案 237-250中任一項的衍生物，其中使用LOCI (發(fā)光氧通道免疫測定，Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay)來分析所述衍生物的血漿濃度。

252.實施方案1-251中任一項的衍生物，其中所述衍生物在db/db小鼠體內(nèi)有效降低血糖。

253.實施方案1-252中任一項的衍生物，其中所述衍生物在db/db小鼠體內(nèi)有效降低體重。

254.實施方案252-253中任一項的衍生物，其中用合適劑量范圍的所述GLP-1衍生物經(jīng)s.c.治療db/db小鼠，并在合適的間隔測量血糖和/或體重。

255.實施方案252-254中任一項的衍生物，其中所述GLP-1衍生物的劑量是0.3 nmol/kg、1.0 nmol/kg、3.0 nmol/kg、10 nmol/kg、30 nmol/kg和100 nmol/kg，其中kg是指小鼠體重。

256.實施方案252-255中任一項的衍生物，其中用媒介物經(jīng)s.c.治療對照組，優(yōu)選用溶解了所述GLP-1衍生物的培養(yǎng)基，例如使用以下組成：50mM磷酸鈉, 145 mM 氯化鈉, 0.05%吐溫80, pH 7.4。

257.實施方案252-256中任一項的衍生物，其中測量血糖，和/或給小鼠稱體重，時間是-?h (給藥(t=0)之前半小時)以及時間1、2、4和8h。

258.實施方案252-257中任一項的衍生物，其中用葡萄糖氧化酶方法測定葡萄糖濃度。

259.實施方案252-258中任一項的衍生物，其中

(i) ED₅₀ (體重(BW))計算為以經(jīng)皮下施用衍生物后8小時Δ(例如降低)BW達到最大效應(yīng)的一半的劑量；和/或

(ii) ED₅₀ (血糖(BG))計算為以經(jīng)皮下施用衍生物后8小時和/或24小時Δ(例如降低)BG的AUC (曲線下面積)達到最大效應(yīng)的一半的劑量。

260.實施方案252-259中任一項的衍生物，其中存在S形劑量-反應(yīng)關(guān)系，優(yōu)選具有明確的最大反應(yīng)定義。

261.實施方案1-260中任一項的衍生物，其具有比利拉魯肽更延長的作用概況。

262.實施方案261的衍生物，其中延長是指在相關(guān)動物物種中的體內(nèi)半衰期。

263.實施方案261-262中任一項的衍生物，其中所述動物是a) db/db小鼠、b)大鼠、c)豬、和/或、d) 小型豬。

264.實施方案263的衍生物，其中所述動物是小型豬。

265.實施方案261-264中任一項的衍生物，其中經(jīng)以下途徑施用所述衍生物：i) s.c.，和/或，ii) i.v.。

266.實施方案1-265中任一項的衍生物，其中經(jīng)i.v.施用所述衍生物。

267.實施方案1-266中任一項的衍生物，其在經(jīng)i.v.施用于小型豬后的終末半衰期(T_?)為

a)至少12小時，優(yōu)選至少24小時，更優(yōu)選至少36小時，甚至更優(yōu)選至少48小時，或最優(yōu)選至少 60小時；

b)至少7小時，優(yōu)選至少16小時，更優(yōu)選至少24小時，甚至更優(yōu)選至少30小時，或最優(yōu)選至少 40小時；

c)至少50小時，優(yōu)選至少60小時，更優(yōu)選至少70小時，甚至更優(yōu)選至少80小時，或最優(yōu)選至少 90小時。

268.實施方案264-267中任一項的衍生物，其中所述小型豬是雄性G?ttingen小型豬。

269.實施方案267-268中任一項的衍生物，其中所述小型豬是7-14月齡。

270.實施方案267-269中任一項的衍生物，其中所述小型豬的體重是16-35kg。

271.實施方案267-270中任一項的衍生物，其中將所述小型豬單獨飼養(yǎng)和每天喂食1次或2次，優(yōu)選用SDS小型豬飼料。

272.實施方案267-271中任一項的衍生物，其中在至少2周適應(yīng)之后經(jīng)i.v.給藥所述衍生物。

273.實施方案267-272中任一項的衍生物，其中所述動物在給藥前禁食大約18h并在給藥后禁食至少4 h，整個周期內(nèi)讓其隨意飲水。

274.實施方案267-273中任一項的衍生物，其中將所述GLP-1衍生物溶于50mM磷酸鈉, 145 mM 氯化鈉, 0.05%吐溫80, pH 7.4中至合適濃度，優(yōu)選20-60 nmol/ml。

275.實施方案267-275中任一項的衍生物，其中靜脈內(nèi)注射所述衍生物，體積對應(yīng)于1-2 nmol/kg。

276.實施方案1-275中任一項的衍生物，其導(dǎo)致豬的飼料攝取下降。

277.實施方案276的衍生物，其中與對照相比，所述攝取下降，所述對照優(yōu)選用媒介物治療或未經(jīng)治療。

278.實施方案276-277中任一項的衍生物，其中

飼料攝取(0-24h)是

a) 相對于媒介物治療的對照，90%或以下, b) 優(yōu)選80% 或以下, c) 更優(yōu)選70%或以下, d)甚至更優(yōu)選60%或以下，或e) 最優(yōu)選50%或以下。

279.實施方案276-278中任一項的衍生物，其中飼料攝取(0-24h)是指施用所述衍生物或媒介物之后的前24小時。

280.實施方案276-279中任一項的衍生物，其中所述豬是雌性Landrace Yorkshire Duroc (LYD)豬。

281.實施方案276-280中任一項的衍生物，其中所述豬是3月齡。

282.實施方案276-281中任一項的衍生物，其中所述豬的體重30-35kg。

283.實施方案276-282中任一項的衍生物，其中將所述動物分組飼養(yǎng)1-2周，讓其適應(yīng)。

284.實施方案276-283中任一項的衍生物，其中在實驗期間，將所述動物放置在單獨圍欄中，從周一早晨到周五下午，以測定個體的食物攝取。

285.實施方案276-284中任一項的衍生物，其中所述動物隨意攝取豬飼料(諸如Svinefoder, Antonio) 。

286.實施方案276-285中任一項的衍生物，其中通過每15分鐘記錄飼料重量而在線監(jiān)測食物攝取，優(yōu)選使用Mpigwin系統(tǒng)。

287.實施方案276-286中任一項的衍生物，其以0.3、1.0、3.0、10或30 nmol/kg濃度給藥。

288.實施方案276-287中任一項的衍生物，其溶于磷酸緩沖液(50mM磷酸鹽，145 mM氯化鈉，0.05%吐溫80,pH8)，優(yōu)選濃度為12、40、120、400或1200nmol/ml。

289.實施方案276-288中任一項的衍生物，其中所述磷酸緩沖液用作媒介物。

290.實施方案276-289中任一項的衍生物，其中在第一天早晨對所述動物給藥單次皮下劑量的衍生物或媒介物(優(yōu)選劑量體積為0.025 ml/kg)，并且給藥后測定食物攝取共4天。

291.實施方案1-290中任一項的衍生物，其在經(jīng)i.v.施用大鼠后的體內(nèi)半衰期(T_?)為a) 至少 4小時，b) 至少 6小時，c) 至少 8小時，或d) 至少 10小時。

292.實施方案1-291中任一項的衍生物，其在經(jīng)i.v.施用大鼠后的體內(nèi)半衰期(T_?)為a) 至少 12小時，b) 至少 15小時，c) 至少 18小時，或d) 至少 20小時。

293.實施方案1-292中任一項的衍生物，其在經(jīng)i.v.施用大鼠后的體內(nèi)半衰期(T_?)為a) 至少 24小時，b) 至少 26小時，或c) 至少 30小時。

294.實施方案291-294中任一項的衍生物，其中所述大鼠是雄性SpragueDawley大鼠，其體重約 400g。

294.實施方案238-294中任一項的衍生物，對于所述衍生物，測定從時間30至180 min的劑量校正(即，除以注射衍生物的以pmol計的劑量)的血漿暴露曲線(即以pM計的血漿中的濃度相比于時間)的AUC(即，結(jié)果以(min x pM / pmol)或簡單以min/L表示)。

295.實施方案294的衍生物，其中所述劑量校正的血漿暴露曲線的AUC是

a) 至少 50，優(yōu)選至少 100，或更優(yōu)選至少 150 min/L；

b) 至少 200，優(yōu)選至少 250，更優(yōu)選至少 300，或最優(yōu)選至少 320 min/L；或

c) 塞馬魯肽的相應(yīng)AUC值的至少 1.5 倍，優(yōu)選至少 2 倍，更優(yōu)選至少 3 倍，或最優(yōu)選至少 4 倍。

296.實施方案1-295中任一項的衍生物，其中在大鼠體內(nèi)測量口服生物利用度，作為直接注射到腸腔之后的血漿暴露。

297.實施方案296的衍生物，隨遇所述衍生物，測定從時間30至180min的劑量校正(即，除以施用衍生物的以pmol計的劑量)的血漿暴露曲線(即以pM計的血漿中的濃度相比于時間)的AUC(即，結(jié)果可以以(min x pM / pmol)或簡單以min/L表示)。

298.實施方案297的衍生物，其中所述劑量校正的血漿暴露曲線的AUC是

a) 至少 10，優(yōu)選至少 20，或更優(yōu)選至少 30 min/L；

b) 至少 40，優(yōu)選至少 50，更優(yōu)選至少 60，或最優(yōu)選至少 70 min/L；或

c) 塞馬魯肽的相應(yīng)AUC值的至少 1.5 倍，優(yōu)選至少 2 倍，更優(yōu)選至少 3 倍，或最優(yōu)選至少 4 倍。

299.實施方案294-298中任一項的衍生物，其中所述GLP-1衍生物在250mg/mlN-[8-(2-羥基苯甲?；?氨基]辛酸鈉(SNAC)的溶液中以約1000 uM的濃度進行測試。

300.實施方案294-299中任一項的衍生物，其中使用雄性Sprague Dawley大鼠，優(yōu)選到達時體重為大約 240 g。

301.實施方案294-300中任一項的衍生物，其中所述大鼠在所述實驗之前禁食大約 18小時。

302.實施方案294-301中任一項的衍生物，其中分別在禁食后和在空腸注射或口服喂養(yǎng)所述衍生物之前，對所述大鼠進行常規(guī)麻醉。

303.實施方案294-302中任一項的衍生物，其中對于注射到腸腔中，將所述衍生物施用于空腸的近端部分(十二指腸的10 cm遠)或中腸(盲腸的50 cm近)，優(yōu)選空腸的近端部分。

304.實施方案294-303中任一項的衍生物，其中用1ml注射器，通過導(dǎo)管將100μl所述衍生物注射到空腸腔內(nèi)，再用另一注射器將200 μl空氣推入空腸腔內(nèi)，然后讓其與導(dǎo)管的連接以防流回到導(dǎo)管中。

305.實施方案294-304中任一項的衍生物，其中在所需時間間隔從尾靜脈采集血液樣品(200 ul)到EDTA管，諸如在時間0、10、30、60、120和240 min，并在20分鐘內(nèi)以10000G在4℃離心5分鐘。

306.實施方案294-305中任一項的衍生物，其中分離血漿(例如，75ul)，立即冷凍并保存在-20℃，直到分析所述衍生物的血漿濃度。

307.實施方案294-306中任一項的衍生物，其中使用LOCI(發(fā)光氧通道免疫測定，Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay)來分析所述衍生物的血漿濃度。

308.以GLP-1類似物的形式的中間產(chǎn)物，其與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比包含以下變化：(i) 38Q；和/或(ii) 39G；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯。

309.實施方案308的GLP-1類似物，其包含(38E,39G)。

310.以GLP-1類似物的形式的中間產(chǎn)物，或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，其與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比包含以下氨基酸改變：

。

311.實施方案310的GLP-類似物，其具有如(i)-(xxvii)中任一項定義的一組氨基酸改變。

312.根據(jù)實施方案1-307中任一項的衍生物，其用作藥物。

313.根據(jù)實施方案1-307中任一項的衍生物，其用于治療和/或預(yù)防所有形式的糖尿病和相關(guān)疾病，諸如進食障礙、心血管疾病、胃腸道疾病、糖尿病并發(fā)癥、危急病癥和/或多囊卵巢綜合征；和/或用于改善脂質(zhì)參數(shù)，改善β細胞功能，和/或用于延遲或預(yù)防糖尿病進程。

314.通過施用藥物活性量的根據(jù)實施方案1-307中任一項的衍生物而治療或預(yù)防所有形式的糖尿病和相關(guān)疾病；和/或改善脂質(zhì)參數(shù)，改善β細胞功能，和/或延遲或預(yù)防糖尿病進程的方法，所述相關(guān)疾病諸如進食障礙、心血管疾病、胃腸道疾病、糖尿病并發(fā)癥、危急病癥和/或多囊卵巢綜合征。

以下是本發(fā)明額外具體實施方案：

1.GLP-1類似物的衍生物；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，

所述類似物包含在對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置上的第一K殘基；在對應(yīng)于GLP-1(7-37)的位置T 的位置上的第二K殘基，其中T是7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)；以及與GLP-1(7-37)相比，包含最多10個氨基酸改變；其中所述第一K殘基指定為K²⁷，且第二K殘基指定為K^T；

所述衍生物包含分別連接到K²⁷和K^T的兩個白蛋白結(jié)合部分，其中

所述白蛋白結(jié)合部分包含選自化學式1和化學式2的延長部分：

化學式1:

化學式2:

其中x是6-18范圍內(nèi)的整數(shù)，y是3-17范圍內(nèi)的整數(shù)；

前提條件是當延長部分是化學式1時，所述白蛋白結(jié)合部分還包含下式化學式5的接頭：

化學式5:

其中k是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

2.實施方案1的衍生物；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，

其中所述GLP-1類似物包含在對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置上的第一K殘基；在對應(yīng)于GLP-1(7-37)的位置T 的位置上的第二K殘基，其中T是7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)；以及與GLP-1(7-37)相比，包含最多10個氨基酸改變；其中所述第一K殘基指定為K²⁷，且第二K殘基指定為K^T；

所述衍生物包含分別連接到K²⁷和K^T的兩個白蛋白結(jié)合部分，其中

所述白蛋白結(jié)合部分包含化學式2的延長部分：

化學式2:

其中y是3-17范圍內(nèi)的整數(shù)。

3.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述白蛋白結(jié)合部分進一步包含接頭。

4.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭包含i)Glu二基；和/或ii) 式化學式5的接頭：

化學式5:

其中k是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，且n是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

5.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述Glu二基選自化學式6和/或化學式7：

化學式6:

化學式7:

優(yōu)選化學式6。

6.上述實施方案中任一項的衍生物；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，

其中所述GLP-1類似物包含在對應(yīng)于GLP-1(7-37)(SEQ ID NO:1)的位置27的位置上的第一K殘基；在對應(yīng)于GLP-1(7-37)的位置T 的位置上的第二K殘基，其中T是7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)；以及與GLP-1(7-37)相比，包含最多10個氨基酸改變；其中所述第一K殘基指定為K²⁷，且第二K殘基指定為K^T；

所述衍生物包含分別連接到K²⁷和K^T的兩個白蛋白結(jié)合部分，其中

所述白蛋白結(jié)合部分包含：

i)式化學式1的延長部分：

化學式1:

其中x是6-18范圍內(nèi)的整數(shù)；且

ii) 式化學式5的接頭：

化學式5:

其中k是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

7.上述實施方案中任一項的衍生物；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，

其中所述GLP-1類似物包含在對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置上的第一K殘基；在對應(yīng)于GLP-1(7-37)的位置T 的位置上的第二K殘基，其中T是7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)；以及與GLP-1(7-37)相比，包含最多10個氨基酸改變；其中所述第一K殘基指定為K²⁷，且第二K殘基指定為K^T；

所述衍生物包含分別經(jīng)由接頭連接到K²⁷和K^T的兩個延長部分，其中

所述延長部分選自化學式1和化學式2：

化學式1:

化學式2:

其中x是6-18范圍內(nèi)的整數(shù)，y是3-17范圍內(nèi)的整數(shù)；且

接頭包含化學式5：

化學式5:

其中k是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，n是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

8.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T是選自7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)。

9.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T選自7-17、19-26和28-37范圍內(nèi)的任何整數(shù)。

10.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T選自7-17的范圍。

11.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T是12。

12.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T選自19-26的范圍。

13.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T選自20、22和24。

14.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T是20。

15.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T是22或24。

16.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T是22。

17.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T是24。

18.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T選自28-37的范圍。

19.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T選自36和37。

20.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T是36。

21.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T是37。

22.上述實施方案中任一項的衍生物，其中通過書寫和目測來識別對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置。

23.上述實施方案中任一項的衍生物，通過書寫和目測來識別對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置T的位置。

24.上述實施方案中任一項的衍生物，其中通過使用標準蛋白或肽比對程序來識別對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置。

25.上述實施方案中任一項的衍生物，其中通過使用標準蛋白或肽比對程序來識別對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置T的位置。

26.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述比對程序是Needleman-Wunsch比對。

27.上述實施方案中任一項的衍生物，其中使用默認評分矩陣和默認特性矩陣。

28.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述評分矩陣是BLOSUM62。

29.上述實施方案中任一項的衍生物，其中空位中第一殘基的罰分是-10(負十)。

30.上述實施方案中任一項的衍生物，其中空位中額外殘基的罰分是-0.5(負零點五)。

31.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物除第一和第二K殘基之外不含K殘基。

32.上述實施方案中任一項的衍生物，其中延長部分是化學式1。

33.上述實施方案中任一項的衍生物，其中x是偶數(shù)。

34.上述實施方案中任一項的衍生物，其中x是12。

35.上述實施方案中任一項的衍生物，其中化學式1由化學式1a代表：

化學式1a:

其中x如上述實施方案中任一項所定義。

36.上述實施方案中任一項的衍生物，其中延長部分是化學式2，優(yōu)選化學式2a：

化學式2a:

其中y如上述實施方案中任一項所定義。

37.上述實施方案中任一項的衍生物，其中y是奇數(shù)。

38.上述實施方案中任一項的衍生物，其中y是9。

39.上述實施方案中任一項的衍生物，其中化學式2由化學式2b或化學式2c代表：

化學式2b:

化學式2c:

優(yōu)選由化學式2b代表;

其中y如上述實施方案中任一項所定義。

39a.上述實施方案中任一項的衍生物，其中化學式2a由化學式2b或化學式2c代表:

化學式2b:

化學式2c:

優(yōu)選由化學式2b代表;

其中y如上述實施方案中任一項所定義。

40.上述實施方案中任一項的衍生物，其包含化學式5。

41.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述化學式5是第一個接頭元件。

42.上述實施方案中任一項的衍生物，其中k是1。

43.上述實施方案中任一項的衍生物，其中n是1。

44.上述實施方案中任一項的衍生物，其中化學式5被包括m次，其中m是1-10范圍內(nèi)的整數(shù)。

45.上述實施方案中任一項的衍生物，其中m是2。

46.上述實施方案中任一項的衍生物，其中當m不是1時，所述化學式5元件經(jīng)由酰胺鍵互相連接。

47.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭進一步包含第二個接頭元件；優(yōu)選Glu二基；更優(yōu)選選自化學式6和/或化學式7:

化學式6:

化學式7:

最優(yōu)選化學式6。

48.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述Glu二基被包括p次，其中p是1-2范圍內(nèi)的整數(shù)。

49.上述實施方案中任一項的衍生物，其中p是1。

50.上述實施方案中任一項的衍生物，其中p是2。

51.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述Glu二基是L-Glu的基團。

52.上述實施方案中任一項的衍生物，其中一個或多個Glu二基和所述一個或多個化學式5元件經(jīng)由酰胺鍵相互連接。

53.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭由m次化學式5和p次Glu二基組成。

54.上述實施方案中任一項的衍生物，其中(m,p)是(2,2)或(2,1)，優(yōu)選(2,1)。

55.上述實施方案的衍生物，其中m次化學式5元件和p次Glu二基經(jīng)由酰胺鍵互相連接。

56.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭和所述延長部分經(jīng)由酰胺鍵互相連接。

57.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭和所述GLP-1類似物經(jīng)由酰胺鍵互相連接。

58.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭連接到第一或第二K殘基的ε-氨基。

59.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有5-41個C原子；優(yōu)選17或22個C原子。

60.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有17個C原子。

61.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有22個C原子。

62.上述實施方案的衍生物，其中所述接頭具有4-28個雜原子；優(yōu)選12或16個雜原子。

63.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有12個雜原子。

64.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有16個雜原子。

65.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述雜原子是N原子和/或O原子。

66.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有1-7個N原子；優(yōu)選3或4個N原子。

67.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有3個N原子。

68.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有4個N原子。

69.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有3-21個O原子；優(yōu)選9或12個O原子。

70.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有9個O原子。

71.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭具有12個O原子。

72.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭由經(jīng)由酰胺鍵相互連接的2次化學式6和2次化學式5組成，并且在所示序列中所述接頭在其*-NH端與所述延長部分的*-CO端連接，和在其*-CO端與GLP-1類似物的K²⁷或K^T的ε氨基連接。

73.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭由經(jīng)由酰胺鍵相互連接的2次化學式5和1次化學式6組成，并且在所示序列中所述接頭在其*-NH端與所述延長部分的*-CO端連接，和在其游離*-CO端與GLP-1類似物的K²⁷或K^T的ε氨基連接。

74.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭由經(jīng)由酰胺鍵相互連接的1次化學式6和2次化學式5組成，并且在所示序列中所述接頭在其*-NH端與所述延長部分的*-CO端連接，和在其*-CO端與GLP-1類似物的K²⁷或K^T的ε氨基連接。

75.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭由經(jīng)由酰胺鍵相互連接的1次化學式6、2次化學式5和1次化學式6組成，并且在所示序列中所述接頭在其*-NH端與所述延長部分的*-CO端連接，和在其*-CO端與GLP-1類似物的K²⁷或K^T的ε氨基連接。

76.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述兩個延長部分基本相同；諸如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%相同。

77.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述兩個延長部分具有至少0.5；優(yōu)選至少0.6；更優(yōu)選至少0.7或至少0.8；甚至更優(yōu)選至少0.9；或最優(yōu)選至少0.99的相似性，諸如1.0的相似性。

78.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述兩個接頭具有至少0.5；優(yōu)選至少0.6；更優(yōu)選至少0.7或至少0.8；甚至更優(yōu)選至少0.9；或最優(yōu)選至少0.99的相似性，諸如1.0的相似性。

79.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述兩個白蛋白結(jié)合劑，諸如由延長部分和接頭組成的兩條側(cè)鏈，基本相同；諸如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至少99%相同。

80.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述兩個白蛋白結(jié)合劑，諸如由延長部分和接頭組成的兩條側(cè)鏈，具有至少0.5；優(yōu)選至少0.6；更優(yōu)選至少0.7或至少0.8；甚至更優(yōu)選至少0.9；或最優(yōu)選至少0.99的相似性，諸如1.0的相似性。

81.上述實施方案中任一項的衍生物，其中待比較的2個化學結(jié)構(gòu)被表示為指紋，諸如a) ECFP_6指紋；b) UNITY指紋；和/或c) MDL指紋；和其中對于a)、b)和c)中的每一項，優(yōu)選使用Tanimoto系數(shù)來計算2個指紋的相似性或同一性。

82.上述實施方案中任一項的衍生物，其中通過書寫和目測來識別與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)相比的氨基酸改變的數(shù)量。

83.上述實施方案中任一項的衍生物，其中通過使用標準蛋白或肽比對程序來識別與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)相比的氨基酸改變的數(shù)量。

84.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述比對程序是Needleman-Wunsch比對。

85.上述實施方案中任一項的衍生物，其中使用默認評分矩陣和默認特性矩陣。

86.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述評分矩陣是BLOSUM62。

87.上述實施方案中任一項的衍生物，其中空位中第一殘基的罰分是-10(負十)。

88.上述實施方案中任一項的衍生物，其中空位中額外殘基的罰分是-0.5(負零點五)。

89.上述實施方案中任一項的衍生物，其中一種或多種所述氨基酸改變是在對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的以下位置的一個或多個位置：8、12、20、22、23、24、25、26、27、30、31、34、35、36、37、38、和39。

90.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含至少一個以下變化：Aib⁸、K¹²、K²⁰、E²²或K²²、E²³、K²⁴、V²⁵、R²⁶ 或H²⁶、K²⁷、E³⁰、H³¹、G³⁴或R³⁴ 或Q³⁴、Des³⁵、K³⁶ 或 Des³⁶、K³⁷或Des³⁷、E³⁸或Q³⁸、和/或 G³⁹。

91.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K¹²且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

92.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K²⁰且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

93.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K²²且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

94.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K²⁴且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

95.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K³⁶且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

96.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述第二K殘基是K³⁷且其中所述類似物，除了變化K²⁷，進一步包含i) 選自G³⁴和Q³⁴的變化，和ii) 選自R²⁶ 和H²⁶的變化。

97.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含至少一個以下變化：Aib⁸、E²²、E²³、V²⁵、E³⁰、H³¹、Des³⁵、Des³⁶、Des³⁷、E³⁸ 或Q³⁸、和/或G³⁹。

98.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含Aib⁸。

99.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含E²²。

100.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含E²³。

101.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含V²⁵。

102.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含E³⁰。

103.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含H³¹。

104.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含Des³⁵。

105.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含Des³⁶。

106.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含Des³⁷。

107.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含E³⁸或Q³⁸，優(yōu)選Q³⁸，或更優(yōu)選E³⁸。

108.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含G³⁹。

109.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含Des³⁵，Des³⁶，和Des³⁷。

110.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含Des³⁶和Des³⁷。

111.上述實施方案中任一項的衍生物，其是GLP-1(7-34)(SEQIDNO:1的氨基酸1-28)的衍生物。

112.上述實施方案中任一項的衍生物，其是GLP-1(7-35)(SEQ ID NO:1的氨基酸1-29)的衍生物。

113.上述實施方案中任一項的衍生物，其是GLP-1(7-36) (SEQ ID NO: 1的氨基酸1-30)的衍生物。

114.上述實施方案中任一項的衍生物，其是GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1的氨基酸1-31)的衍生物。

115.上述實施方案中任一項的衍生物，其是GLP-1(7-38) (SEQ ID NO: 1的氨基酸1-31，加1個C-末端添加的氨基酸殘基)的衍生物。

116.上述實施方案中任一項的衍生物，其是GLP-1(7-39) (SEQ ID NO: 1的氨基酸1-31，加兩個C-末端添加的氨基酸殘基)的衍生物。

117.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多10個氨基酸改變。

118.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多9個氨基酸改變。

119.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多8個氨基酸改變。

120.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多7個氨基酸改變。

121.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多6個氨基酸改變。

122.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多5個氨基酸改變。

123.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多4個氨基酸改變。

124.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多3個氨基酸改變。

125.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多2個氨基酸改變。

126.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最多1個氨基酸改變。

127.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少1個氨基酸改變。

128.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少2個氨基酸改變。

129.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少3個氨基酸改變。

130.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少4個氨基酸改變。

131.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少5個氨基酸改變。

132.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少6個氨基酸改變。

133.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少7個氨基酸改變。

134.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少8個氨基酸改變。

135.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少9個氨基酸改變。

136.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有最少10個氨基酸改變。

137.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有1個氨基酸改變。

138.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有2個氨基酸改變。

139.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有3個氨基酸改變。

140.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有4個氨基酸改變。

141.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有5個氨基酸改變。

142.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有6個氨基酸改變。

143.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有7個氨基酸改變。

144.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有8個氨基酸改變。

145.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有9個氨基酸改變。

146.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物具有10個氨基酸改變。

147.上述實施方案中任一項的衍生物，其中一個或多個所述改變是獨立地取代、添加和/或缺失。

148.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物

a) 包含式I的GLP-1類似物；和/或b)是式I的GLP-1類似物：

Xaa₇是L-組氨酸、咪唑并丙?；?、α-羥基-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、N^α-乙?；?組氨酸、N^α-甲?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、或4-吡啶基丙氨酸；

Xaa₈是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)甲酸、(1-氨基環(huán)丁基)甲酸、(1-氨基環(huán)戊基)甲酸、(1-氨基環(huán)己基)甲酸、(1-氨基環(huán)庚基)甲酸或(1-氨基環(huán)辛基)甲酸；

Xaa₁₂是Lys或Phe；

Xaa₁₆是Val或Leu；

Xaa₁₈是Ser、Arg、Asn、Gln、或Glu；

Xaa₁₉是Tyr或Gln；

Xaa₂₀是Leu、Lys、或Met；

Xaa₂₂是Gly、Glu、Lys、或Aib；

Xaa₂₃是Gln、Glu、或Arg；

Xaa₂₄是Ala或Lys；

Xaa₂₅是Ala或Val；

Xaa₂₆是Val、His、或Arg；

Xaa₃₀是Ala、Glu、或Arg；

Xaa₃₁是Trp或His；

Xaa₃₄是Glu、Asn、Gly、Gln、或Arg；

Xaa₃₅是Gly、Aib、或不存在；

Xaa₃₆是Arg、Gly、Lys、或不存在；

Xaa₃₇是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、Arg、或不存在；

Xaa₃₈是Ser、Gly、Ala、Glu、Gln、Pro、Arg、或不存在；且

Xaa₃₉是Gly或不存在。

149.上述實施方案中任一項的衍生物，其中式I的肽是GLP-1(7-37)(SEQIDNO: 1)的類似物。

150.上述實施方案中任一項的衍生物，其中如果Xaa₃₈不存在，則Xaa₃₉也不存在。

151.上述實施方案中任一項的衍生物，其中如果Xaa₃₇不存在，則Xaa₃₈和Xaa₃₉也不存在。

152.上述實施方案中任一項的衍生物，其中如果Xaa₃₆不存在，則Xaa₃₇、Xaa₃₈和Xaa₃₉也不存在。

153.上述實施方案中任一項的衍生物，其中如果Xaa₃₅不存在，則Xaa₃₆、Xaa₃₇、Xaa₃₈和Xaa₃₉ 也不存在。

154.上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₇是His；Xaa₈是Ala或Aib；Xaa₁₂是Lys或Phe；Xaa₁₆是Val；Xaa₁₈是Ser；Xaa₁₉是Tyr；Xaa₂₀是Leu或Lys；Xaa₂₂是Glu、Gly或Lys；Xaa₂₃是Gln或Glu；Xaa₂₄是Ala或Lys；Xaa₂₅是Ala或Val；Xaa₂₆是His或Arg；Xaa₃₀是Ala或Glu；Xaa₃₁是Trp或His；Xaa₃₄是Gly、Gln或Arg；Xaa₃₅是Gly或不存在；Xaa₃₆是Arg、Lys或不存在；Xaa₃₇是Gly、Lys、或不存在；Xaa₃₈是Glu或Gln；且Xaa₃₉是Gly或不存在。

154a. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₇是His。

154b. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₈是Ala。

154b1.上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₈是Aib。

154c. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₁₂是Lys。

154d. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₁₂是Phe。

154e. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₁₆是Val。

154f. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₁₈是Ser。

154g. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₁₉是Tyr。

154h. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₀是Leu。

154i. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₀是Lys。

154j. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₂是Glu。

154k. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₂是Gly。

154l. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₂是Lys。

154m. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₃是Gln。

154n. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₃是Glu。

154o. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₄是Ala。

154p. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₄是Lys。

154q. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₅是Ala。

154r. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₅是Val。

154s. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₆是His。

154t. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₂₆是Arg。

154u. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₀是Ala。

154v. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₀是Glu。

154x. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₁是Trp。

154y. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₁是His。

154z. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₄是Gly。

154aa. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₄是Gln。

154ab. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₄是Arg。

154ac. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₅是Gly。

154ad. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₅不存在。

154ae. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₆是Arg。

154af. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₆是Lys。

154ag. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₆不存在。

154ah. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₇是Gly。

154ai. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₇是Lys。

154aj. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₇不存在。

154ak. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₈是Glu。

154al. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₈是Gln。

154am. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₈不存在。

154an. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₉是Gly。

154ao. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中Xaa₃₉不存在。

155. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)相比包含，優(yōu)選具有以下氨基酸改變：

。

156. 化合物；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，所述化合物優(yōu)選根據(jù)上述實施方案中任一項，選自下列：化學式50、化學式51、化學式52、化學式53、化學式54、化學式55、化學式56、化學式57、化學式58、化學式59、化學式60、化學式61、化學式62、化學式63、化學式64、化學式65、化學式66、化學式67、化學式68、化學式69、化學式70、化學式71、化學式72、化學式73、化學式74、化學式75、化學式76、化學式77、化學式78和化學式79。

157. 一種化合物，或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，所述化合物優(yōu)選根據(jù)上述實施方案中任一項，其特征在于其名稱，且選自本文實施例1-30化合物的各名稱列表。

158. 上述實施方案中任一項的衍生物，其具有GLP-1活性。

159. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述GLP-1活性是指活化人GLP-1受體的能力。

160. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在體外測定中測定人GLP-1受體的活化，作為cAMP產(chǎn)生的功效。

161. 上述實施方案中任一項的衍生物，其功效對應(yīng)于以下EC₅₀

a)低于10000 pM，更優(yōu)選低于5000 pM，甚至更優(yōu)選低于4000 pM，或最優(yōu)選低于3000 pM；

b)低于2000 pM，優(yōu)選低于1500 pM，更優(yōu)選低于1200 pM，甚至更優(yōu)選低于1000 pM，或最優(yōu)選低于500 pM；

c)低于400 pM，優(yōu)選低于300 pM，更優(yōu)選低于200 pM，甚至更優(yōu)選低于150 pM，或最優(yōu)選低于100 pM；或

d)低于80 pM，優(yōu)選低于60 pM，更優(yōu)選低于40 pM，甚至更優(yōu)選低于30 pM，或最優(yōu)選低于20 pM。

162. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中對于劑量-反應(yīng)曲線，功效測定為EC₅₀，顯示在含有人GLP-1受體的培養(yǎng)基中cAMP的劑量依賴性形成，優(yōu)選使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系諸如BHK467-12A (tk-ts13)，和/或使用用于測定cAMP的功能性受體測定，例如基于內(nèi)源形成的cAMP與外源添加的生物素-標記的cAMP之間的競爭，在所述測定中更優(yōu)選使用特異性抗體捕獲cAMP，和/或其中甚至更優(yōu)選的測定是AlphaScreen cAMP測定，最優(yōu)選描述于實施例31的測定。

163. 上述實施方案中任一項的衍生物，其比率[在2.0% HSA (高白蛋白)存在下的GLP-1受體結(jié)合親和力(IC₅₀)，除以在0.005% HSA (低白蛋白)存在下的GLP-1受體結(jié)合親和力(IC₅₀)]為：

a)至少 1.0，更優(yōu)選至少 10，甚至更優(yōu)選至少 25，或最優(yōu)選至少 50；

b)至少 60，優(yōu)選至少 70，更優(yōu)選至少 80，甚至更優(yōu)選至少 90，或最優(yōu)選至少 100；

c)至少 125，優(yōu)選至少 150，更優(yōu)選至少 200，仍更優(yōu)選至少 250，甚至更優(yōu)選至少 400，或最優(yōu)選至少 500；或

d)至少 600，優(yōu)選至少 800，甚至更優(yōu)選至少 900，或最優(yōu)選至少 1000。

164. 上述實施方案中任一項的衍生物，在0.005% HSA (低白蛋白)存在下其GLP-1受體結(jié)合親和力(IC₅₀)為

a)低于1000 nM，優(yōu)選低于750 nM，更優(yōu)選低于500 nM，或最優(yōu)選低于100 nM；或

b)低于50.0 nM，優(yōu)選低于15.0 nM，更優(yōu)選低于10.0 nM，甚至更優(yōu)選低于5.0 nM，或最優(yōu)選低于1.0 nM。

165. 上述實施方案中任一項的衍生物，在2.0% HSA (高白蛋白)存在下其GLP-1受體結(jié)合親和力(IC₅₀)為

a)低于1100 nM，優(yōu)選低于1000 nM，更優(yōu)選低于900 nM，或最優(yōu)選低于600 nM；或

b)低于500 nM，優(yōu)選低于350 nM，更優(yōu)選低于200 nM，甚至更優(yōu)選低于100 nM，或最優(yōu)選低于50.0 nM。

166. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中通過從所述受體中取代¹²⁵I-GLP-1的方式測定與GLP-1受體的結(jié)合親和力，優(yōu)選使用SPA結(jié)合測定。

167. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系，優(yōu)選倉鼠細胞系，更優(yōu)選幼倉鼠腎細胞系諸如BHK tk-ts13來制備所述GLP-1受體。

168. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述IC₅₀值測定為從所述受體中取代50% ¹²⁵I-GLP-1的濃度。

169. 上述實施方案中任一項的衍生物，其口服生物利用度，優(yōu)選絕對口服生物利用度，高于塞馬魯肽。

170. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在大鼠體內(nèi)測量口服生物利用度，作為直接注射到腸腔之后的血漿暴露。

171. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在將所述衍生物溶液注入大鼠空腸后30分鐘所測的所述衍生物的血漿濃度(pM)，除以注射溶液濃度(μM) (在30 min的劑量校正暴露)，為至少 39，或至少 40；優(yōu)選至少 60；更優(yōu)選至少 80；仍更優(yōu)選至少 100；甚至更優(yōu)選至少 125；或最優(yōu)選至少 150。

172. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在將所述衍生物溶液注入大鼠空腸后30分鐘所測的所述衍生物的血漿濃度(pM)，除以注射溶液濃度(μM) (在30 min的劑量校正暴露)，為至少 160，優(yōu)選至少 180，更優(yōu)選至少 200，或最優(yōu)選至少 250。

173. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在與55 mg/ml癸酸鈉的混合物中以1000 uM濃度測定所述GLP-1衍生物。

174. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中使用雄性Sprague Dawley大鼠，優(yōu)選到達時體重為大約 240 g。

175. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述大鼠在所述實驗之前禁食大約 18小時。

176. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在禁食后和在空腸注射所述衍生物之前，對所述大鼠進行常規(guī)麻醉。

177. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在空腸的近端部分(十二指腸的10 cm遠)或在中腸(盲腸的50 cm近)施用所述衍生物。

178. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中用注射器，通過導(dǎo)管將100 μl所述衍生物注射到空腸腔內(nèi)，再用另一注射器將200 μl空氣推入空腸腔內(nèi)，然后讓其與導(dǎo)管的連接以防流回到導(dǎo)管中。

179. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在所需時間間隔從尾靜脈采集血液樣品(200 ul)到EDTA管，諸如在時間0、10、30、60、120和240 min，并在20分鐘內(nèi)以10000G在4℃離心5分鐘。

180. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中分離血漿(例如，75ul)，立即冷凍并保存在-20℃，直到分析所述衍生物的血漿濃度。

181. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中使用LOCI (發(fā)光氧通道免疫測定，Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay)來分析所述衍生物的血漿濃度。

182. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述衍生物在db/db小鼠體內(nèi)有效降低血糖。

183. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述衍生物在db/db小鼠體內(nèi)有效降低體重。

184. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中用合適劑量范圍的所述GLP-1衍生物經(jīng)s.c.治療db/db小鼠，并在合適的間隔測量血糖和/或體重。

185. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述GLP-1衍生物的劑量是0.3 nmol/kg、1.0 nmol/kg、3.0 nmol/kg、10 nmol/kg、30 nmol/kg和100 nmol/kg，其中kg是指小鼠體重。

186. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中用媒介物經(jīng)s.c.治療對照組、優(yōu)選用溶解了所述GLP-1衍生物的培養(yǎng)基，例如使用以下組成：50mM磷酸鈉, 145 mM 氯化鈉, 0.05%吐溫80, pH 7.4。

187. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中測量血糖，和/或給小鼠稱體重，時間是-?h (施用(t=0)之前半小時)以及時間1、2、4和8h。

188. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中用葡萄糖氧化酶方法測定葡萄糖濃度。

189. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中

(i) ED₅₀ (體重(BW))計算為經(jīng)皮下施用衍生物后8小時Δ(例如降低)BW達到最大效應(yīng)的一半的劑量；和/或

(ii) ED₅₀ (血糖(BG))計算為經(jīng)皮下施用衍生物后8小時和/或24小時 Δ(例如降低)BG 的AUC (曲線下面積)達到最大效應(yīng)的一半的劑量。

190. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中存在S形劑量-反應(yīng)關(guān)系，優(yōu)選具有明確的最大反應(yīng)定義。

191. 上述實施方案中任一項的衍生物，其具有比利拉魯肽更延長的作用概況。

192. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中延長是指在相關(guān)動物物種諸如db/db小鼠、大鼠、豬和/或優(yōu)選小型豬中的體內(nèi)半衰期；其中經(jīng)以下途徑施用所述衍生物：i) s.c.，和/或，ii) i.v.；優(yōu)選，ii) i.v.。

193. 上述實施方案中任一項的衍生物，其在經(jīng)i.v.施用于小型豬后的終末半衰期(T_?)為

a) 至少 12小時，優(yōu)選至少 24小時，更優(yōu)選至少 36小時，甚至更優(yōu)選至少 48小時，或最優(yōu)選至少 60小時；

b)至少 7小時，優(yōu)選至少 16小時，更優(yōu)選至少 24小時，甚至更優(yōu)選至少 30小時，或最優(yōu)選至少 40小時；

c) 至少 50小時，優(yōu)選至少 60小時，更優(yōu)選至少 70小時，甚至更優(yōu)選至少 80小時，或最優(yōu)選至少 90小時。

194. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述小型豬是雄性G?ttingen小型豬。

195. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述小型豬是7-14月齡，且優(yōu)選體重為16-35 kg。

196. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中將所述小型豬單獨飼養(yǎng)且每天喂食1次或2次，優(yōu)選用SDS小型豬飼料。

197. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在適應(yīng)至少2周之后經(jīng)i.v.施用所述衍生物。

198. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述動物在給藥前禁食大約 18 h并在給藥后禁食至少4 h，整個周期內(nèi)讓其隨意飲水。

199. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中將所述GLP-1衍生物溶于50 mM磷酸鈉, 145 mM 氯化鈉, 0.05%吐溫80, pH 7.4中至合適濃度，優(yōu)選20-60 nmol/ml。

200. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中靜脈內(nèi)注射所述衍生物，體積對應(yīng)于1-2 nmol/kg。

201. 上述實施方案中任一項的衍生物，其在小型豬中增加葡萄糖所刺激的胰島素分泌。

202. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述小型豬是雄性G?ttingen小型豬。

203. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述小型豬是7-14月齡。

204. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中將所述小型豬在單獨圍欄中飼養(yǎng)，每日飼喂1次或2次，優(yōu)選用SDS小型豬飼料。

205. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中經(jīng)i.v.或s.c.在耳后薄層皮膚內(nèi)施用單劑量，任選在逐漸增加劑量的周期之后。

206. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在施用之前，所述動物禁食大約 18 h。

207. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中測試基線組和對應(yīng)于2-6個不同血漿濃度水平的多個衍生物施用組，其中所述基線組是a)用媒介物治療，或b)未經(jīng)治療。

208. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述血漿濃度水平為3000-80000 pM。

209. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中進行1小時或2小時靜脈內(nèi)葡萄糖耐受試驗(IVGTT)。

210. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在30秒時段內(nèi)經(jīng)i.v.給予0.3 g/kg 葡萄糖，并在合適時間點采血樣，諸如在以下時間點(t=0對應(yīng)于葡萄糖推注)：-10、-5、0、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120分鐘。

211. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中測定所述衍生物、葡萄糖和胰島素的血漿濃度。

212. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在t= 0 min、以及任選在試驗結(jié)束時(t=60 min或t=120 min)測定所述衍生物濃度。

213. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中用葡萄糖氧化酶方法分析葡萄糖。

214. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中計算胰島素曲線下面積(AUC胰島素)并用作胰島素分泌的量度。

215. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中對于其至少一個 濃度，AUC胰島素高于基線AUC胰島素，優(yōu)選至少其110%，更優(yōu)選至少其120%，甚至更優(yōu)選至少其130%或最優(yōu)選至少其140%。

216. 上述實施方案中任一項的衍生物，與對照(優(yōu)選媒介物治療或未經(jīng)治療)相比，其導(dǎo)致豬的飼料攝取下降；

任選飼料攝取(0-24h)可以是媒介物治療對照的90%或以下，優(yōu)選80%或以下，更優(yōu)選70%或以下，甚至更優(yōu)選60%或以下，或最優(yōu)選50%或以下；

其中飼料攝取(0-24h)是指施用所述衍生物或媒介物之后的前24小時。

217. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述豬是雌性Landrace Yorkshire Duroc (LYD)豬。

218. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述豬是3月齡，優(yōu)選體重30-35 kg。

219. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中將所述動物分組飼養(yǎng)1-2周，讓其適應(yīng)。

220. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在實驗期間，將所述動物放置在單獨圍欄中，從周一早晨到周五下午，以測定個體的食物攝取。

221. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述動物隨意攝取豬飼料(諸如Svinefoder, Antonio)。

222. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中通過每15分鐘記錄飼料重量而在線監(jiān)測食物攝取，優(yōu)選使用Mpigwin系統(tǒng)。

223. 上述實施方案中任一項的衍生物，其以0.3、1.0、3.0、10或30 nmol/kg給予，優(yōu)選溶于磷酸緩沖液(50 mM磷酸鹽，145 mM 氯化鈉，0.05%吐溫80, pH 8)，更優(yōu)選濃度為12、40、120、400或1200 nmol/ml。

224. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述磷酸緩沖液用作媒介物。

225. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中在第一天早晨對所述動物給藥單次皮下劑量的衍生物或媒介物(優(yōu)選劑量體積為0.025 ml/kg)，并且給藥后測定食物攝取共4天。

226. 上述實施方案中任一項的衍生物，其在經(jīng)i.v.施用大鼠后的體內(nèi)半衰期(T_?)為至少 4小時，優(yōu)選至少 6小時，甚至更優(yōu)選至少 8小時，或最優(yōu)選至少 10小時。

227. 上述實施方案中任一項的衍生物，其在經(jīng)i.v.施用大鼠后的體內(nèi)半衰期(T_?)為至少 12小時，優(yōu)選至少 15小時，甚至更優(yōu)選至少 18小時，或最優(yōu)選至少 20小時。

228. 上述實施方案中任一項的衍生物，其在經(jīng)i.v.施用大鼠后的體內(nèi)半衰期(T_?)為至少 24小時，優(yōu)選至少 26小時，或最優(yōu)選至少 30小時。

229. 上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述大鼠是雄性Sprague Dawley大鼠，其體重為約400g。

230. 以GLP-1類似物的形式的中間產(chǎn)物；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，所述中間產(chǎn)物與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比包含以下變化：(i) 38Q；和/或(ii) 39G。

231. 實施方案230的GLP-1類似物，其包含(38E, 39G)。

232. 以GLP-1類似物的形式的中間產(chǎn)物，或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，其與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比包含，優(yōu)選具有以下氨基酸改變：

。

233. 上述實施方案中任一項的衍生物，其用作藥物。

234. 根據(jù)上述實施方案中任一項的衍生物，其用于治療和/或預(yù)防所有形式的糖尿病和相關(guān)疾病，諸如進食障礙、心血管疾病、胃腸道疾病、糖尿病并發(fā)癥、危急病癥和/或多囊卵巢綜合征；和/或用于改善脂質(zhì)參數(shù)，改善β細胞功能，和/或用于延遲或預(yù)防糖尿病進程。

235. 通過施用藥物活性量的根據(jù)上述實施方案中任一項的衍生物而治療或預(yù)防所有形式的糖尿病和相關(guān)疾??；和/或改善脂質(zhì)參數(shù)，改善β細胞功能，和/或延遲或預(yù)防糖尿病進程的方法，所述相關(guān)疾病諸如進食障礙、心血管疾病、胃腸道疾病、糖尿病并發(fā)癥、危急病癥和/或多囊卵巢綜合征。

以下是本發(fā)明的仍進一步具體實施方案：

1. GLP-1類似物的衍生物；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，

所述類似物包含在對應(yīng)于GLP-1(7-37) (SEQ ID NO: 1)的位置27的位置上的第一K殘基；在對應(yīng)于GLP-1(7-37)的位置T 的位置上的第二K殘基，其中T是7-37范圍內(nèi)除了18和27以外的整數(shù)；以及與GLP-1(7-37)相比，包含最多10個氨基酸改變；其中所述第一K殘基指定為K²⁷，且第二K殘基指定為K^T；

所述衍生物包含分別經(jīng)由接頭連接到K²⁷和K^T的兩個延長部分，其中

延長部分選自化學式1和化學式2：

化學式1:

化學式2:

其中x是 6-18范圍內(nèi)的整數(shù)，且y是3-17范圍內(nèi)的整數(shù)；且

接頭包含化學式5:

化學式5:

其中k是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)，且n是1-5范圍內(nèi)的整數(shù)。

2.實施方案1的衍生物，其中所述接頭進一步包含選自化學式6、和/或化學式7的Glu二基：

化學式6:

化學式7:

。

3.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述接頭結(jié)合于第一或第二個K殘基的ε氨基。

4.上述實施方案中任一項的衍生物，其中T是12、20、22、24、36、或37。

5.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物除第一和第二K殘基之外不含K殘基。

6.上述實施方案中任一項的衍生物，其中x是12。

7.上述實施方案中任一項的衍生物，其中y是9。

8.上述實施方案中任一項的衍生物，其中k是1。

9.上述實施方案中任一項的衍生物，其中n是1。

10.上述實施方案中任一項的衍生物，其中所述類似物包含式I的GLP-1類似物：

式I:

其中

Xaa₇是L-組氨酸、咪唑并丙酰基、α-羥基-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、β-羥基-組氨酸、高組氨酸、N^α-乙?；?組氨酸、N^α-甲?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸、或4-吡啶基丙氨酸；

Xaa₈是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Thr、Ser、Lys、Aib、(1-氨基環(huán)丙基)甲酸、(1-氨基環(huán)丁基)甲酸、(1-氨基環(huán)戊基)甲酸、(1-氨基環(huán)己基)甲酸、(1-氨基環(huán)庚基)甲酸或(1-氨基環(huán)辛基)甲酸；

Xaa₁₂是Lys或Phe；

Xaa₁₆是Val或Leu；

Xaa₁₈是Ser、Arg、Asn、Gln、或Glu；

Xaa₁₉是Tyr或Gln；

Xaa₂₀是Leu、Lys、或Met；

Xaa₂₂是Gly、Glu、Lys、或Aib；

Xaa₂₃是Gln、Glu、或Arg；

Xaa₂₄是Ala或Lys；

Xaa₂₅是Ala或Val；

Xaa₂₆是Val、His、或Arg；

Xaa₃₀是Ala、Glu、或Arg；

Xaa₃₁是Trp或His；

Xaa₃₄是Glu、Asn、Gly、Gln、或Arg；

Xaa₃₅是Gly、Aib、或不存在；

Xaa₃₆是Arg、Gly、Lys、或不存在；

Xaa₃₇是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、Arg、或不存在；

Xaa₃₈是Ser、Gly、Ala、Glu、Gln、Pro、Arg、或不存在；且

Xaa₃₉是Gly或不存在。

11.上述實施方案中任一項的化合物；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，所述化合物選自：化學式50、化學式51、化學式52、化學式53、化學式54、化學式55、化學式56、化學式57、化學式58、化學式59、化學式60、化學式61、化學式62、化學式63、化學式64、化學式65、化學式66、化學式67、化學式68、化學式69、化學式70、化學式71、化學式72、化學式73、化學式74、化學式75、化學式76、化學式77、化學式78、和化學式79。

12.以GLP-1類似物的形式的中間產(chǎn)物；或其藥學可接受的鹽、酰胺或酯，所述中間產(chǎn)物與GLP-1(7-37) (SEQ ID NO:1)相比包含以下變化：(i) 38Q；和/或(ii) 39G。

13.實施方案1-11中任一項的衍生物，其用作藥物。

14.實施方案1-11中任一項的衍生物，其用于治療和/或預(yù)防所有形式的糖尿病和相關(guān)疾病，諸如進食障礙、心血管疾病、胃腸道疾病、糖尿病并發(fā)癥、危急病癥和/或多囊卵巢綜合征；和/或用于改善脂質(zhì)參數(shù)，改善β細胞功能，和/或用于延遲或預(yù)防糖尿病進程。

15.通過施用藥物活性量的實施方案1-11中任一項的衍生物而治療或預(yù)防所有形式的糖尿病和相關(guān)疾??；和/或改善脂質(zhì)參數(shù)，改善β細胞功能，和/或延遲或預(yù)防糖尿病進程的方法，所述相關(guān)疾病諸如進食障礙、心血管疾病、胃腸道疾病、糖尿病并發(fā)癥、危急病癥和/或多囊卵巢綜合征。

實施例

本實驗部分開始是縮略語列表，然后是包括合成和表征本發(fā)明類似物和衍生物的通用方法在內(nèi)的部分。然后是涉及具體GLP-1衍生物的制備的多個實施例，最后包括涉及這些類似物和衍生物的活性和性質(zhì)的多個實施例(標題為藥理學方法的部分)。

所述實施例用于說明本發(fā)明。

縮略語

以下縮略語用于下文，按照字母順序排列：

Aib: 氨基異丁酸(α-氨基異丁酸)

API: 活性藥物成分

AUC: 曲線下面積

BG: 血糖

BHK 幼倉鼠腎

BW: 體重

Boc: 叔丁氧基羰基

BSA: 牛血清白蛋白

可力丁(collidine): 2,4,6-三甲基吡啶

DCM: 二氯甲烷

Dde: 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亞環(huán)己基)乙基

DIC: 二異丙基碳二亞胺

DIPEA: 二異丙基乙胺

DMAP: 4-二甲氨基吡啶

DMEM: Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)

EDTA: 乙二胺四乙酸

EGTA: 乙二醇四乙酸

FCS: 胎牛血清

Fmoc: 9-芴基甲氧基羰基

HATU: (O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽)

HBTU: (2-(1H-苯并三唑-1-基-)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽)

HEPES: 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸

HFIP 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇或六氟異丙醇

HOAt: 1-羥基-7-氮雜苯并三唑

HOBt: 1-羥基苯并三唑

HPLC: 高效液相色譜

HSA: 人血清白蛋白

IBMX: 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤

Imp: 咪唑丙酸(也稱為des-氨基組氨酸, DesH)

i.v. 靜脈內(nèi)

ivDde: 1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亞環(huán)己基)-3-甲基丁基

IVGTT: 靜脈內(nèi)葡萄糖耐受試驗

LCMS: 液相色譜-質(zhì)譜

LYD: Landrace Yorkshire Duroc

MALDI-MS: 參見MALDI-TOF MS

MALDI-TOF MS: 基質(zhì)-輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜

MeOH: 甲醇

Mmt: 4-甲氧基三苯甲基

Mtt: 4-甲基三苯甲基

NMP: N-甲基吡咯烷酮

OBz: 苯甲酰基酯

OEG: 8-氨基-3,6-二氧雜辛酸

OtBu: 叔丁酯

PBS: 磷酸緩沖鹽水

PD: 藥效動力學

Pen/Strep: 青霉素/鏈霉素

PK: 藥代動力學

RP: 反相

RP-HPLC: 反相高效液相色譜

RT: 室溫

Rt: 保留時間

s.c.: 經(jīng)皮下

SD: 標準偏差

SEC-HPLC: 大小排阻高效液相色譜

SEM: 平均值的標準誤差

SPA: 閃爍接近測定

SPPS: 固相肽合成

tBu: 叔丁基

TFA: 三氟乙酸

TIS: 三異丙基甲硅烷

Tris: 三(羥甲基)氨基甲烷或2-氨基-2-羥基甲基-丙烷-1,3-二醇

Trt: 三苯基甲基或三苯甲基

Trx: 氨甲環(huán)酸

UPLC: 超高效液相色譜。

制備方法

A.通用方法

本部分涉及固相肽合成方法(SPPS方法，包括氨基酸脫保護法，從樹脂上裂解肽并純化的方法)，以及檢測和表征所得肽的方法(LCMS、MALDI和UPLC方法)。在某些情況下可通過使用在二-肽酰胺鍵上被在酸性條件下可裂解的基團(例如但不限于2-Fmoc-氧基-4-甲氧基芐基或2,4,6-三甲氧基芐基)保護的二肽，而改善肽的固相合成。在絲氨酸或蘇氨酸存在于肽中的情況下，可使用假脯氨酸二肽(可得自例如Novabiochem，另參見W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sci., 5, 403)。所用的被保護的氨基酸衍生物是標準Fmoc-氨基酸(由例如以下供應(yīng)：Anaspec, IRIS或Novabiochem)。N-端氨基酸在α 氨基上被Boc保護(例如Boc-His(Boc)-OH或Boc-His(Trt)-OH，對于在N-端具有His的肽)。序列中賴氨酸的ε氨基可以用Mtt、Mmt、Dde、ivDde或Boc來保護，取決于白蛋白結(jié)合部分和間隔基的連接路線?？赏ㄟ^樹脂結(jié)合的肽的?；蛲ㄟ^在未保護肽溶液中?；鴮椎鞍捉Y(jié)合部分和/或接頭與肽連接。在白蛋白結(jié)合部分和/或接頭與受保護的肽基樹脂連接的情況下，連接可以是模塊的(modular)，使用SPPS和適當保護的構(gòu)建嵌段(building block)諸如但不限于Fmoc-Oeg-OH (Fmoc-8-氨基-3,6-二氧雜辛酸)、Fmoc-Trx-OH (Fmoc-氨甲環(huán)酸)、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸單叔丁酯、十九烷二酸單叔丁酯或4-(9-羧基壬基氧基)苯甲酸叔丁酯。

1. 樹脂結(jié)合的肽的合成

SPPS方法B

SPPS方法B是指使用Fmoc化學，在基于微波的Liberty肽合成儀(CEM Corp., North Carolina)上合成被保護的肽基樹脂。合適的樹脂是獲自Novabiochem的預(yù)先裝載的低載量Wang樹脂(例如，低載量Fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂, 0.35 mmol/g)。Fmoc-脫保護用5%哌啶的NMP溶液，在至多70或75℃。偶聯(lián)化學是DIC/HOAt的NMP溶液。將氨基酸/HOAt溶液(0.3 M/NMP，摩爾過量3-10倍)加入到樹脂中，再加入等摩爾的DIC (0.75M/NMP)。例如，每次偶聯(lián)使用以下量的0.3M 氨基酸/HOAt溶液，用于以下規(guī)模的反應(yīng)：規(guī)模/ml，0.10 mmol/2.5 ml、0.25 mmol/5 ml、1 mmol/15 ml。偶聯(lián)時間和溫度通常是5分鐘，至多70或75℃。使用更長的偶聯(lián)時間，用于更大規(guī)模的反應(yīng)，例如 10 min。組氨酸氨基酸在50℃雙偶聯(lián)，或者如果先前的氨基酸被空間阻礙則是四偶聯(lián)(例如Aib)。精氨酸氨基酸在室溫下偶聯(lián)25 min，然后加熱到70或75℃達5 min。某些氨基酸，諸如但不限于Aib，是“雙偶聯(lián)的”，是指第一偶聯(lián)(例如5 min，75℃)之后，樹脂被排干并加入更多試劑(氨基酸、HOAt和DIC)，將混合物再次加熱(例如5 min，75℃)。當希望賴氨酸側(cè)鏈的化學修飾時，將賴氨酸摻入作為Lys(Mtt)。通過用DCM洗滌樹脂并將樹脂懸浮于凈(未稀釋的)六氟異丙醇持續(xù)20分鐘，再用DCM和NMP洗滌，而除去Mtt基團。通過手動合成(參見SPPS方法D)或通過在如上所述的Liberty肽合成儀上的一個或多個自動化步驟，使用被適當保護的構(gòu)建嵌段(參見通用方法)，任選包括手動偶聯(lián)，進行賴氨酸的化學修飾。

SPPS方法D

SPPS方法D是指使用手動Fmoc化學合成被保護的肽基樹脂。這通常用于將接頭和側(cè)鏈與肽主鏈連接起來。使用以下條件，合成規(guī)模為0.25 mmol。偶聯(lián)化學是DIC/HOAt/collidine的NMP溶液，4-10倍摩爾過量。偶聯(lián)條件是在室溫下1-6 h。Fmoc-脫保護進行如下：用20-25%哌啶的NMP溶液 (3 x 20 ml, 各10 min)，再用NMP洗滌(4 x 20 mL)。Dde-或ivDde-脫保護進行如下：用2%肼的NMP溶液 (2 x 20 ml, 各10 min)，再用NMP洗滌(4 x 20 ml)。Mtt-或Mmt-脫保護進行如下：用2% TFA和2-3% TIS的DCM溶液 (5 x 20 ml, 各10 min)，再用DCM (2 x 20 ml), 10% MeOH和5% DIPEA的DCM溶液 (2 x 20 ml)和NMP (4 x 20 ml)洗滌，或者通過用凈六氟異丙醇(5 x 20 ml, 各10 min)處理，再通過如上洗滌?？赏ㄟ^樹脂結(jié)合的肽的?；蛟谖唇?jīng)保護的肽溶液中?；?參見以下途徑)將白蛋白結(jié)合部分和/或接頭與肽連接。在將白蛋白結(jié)合部分和/或接頭與被保護的肽基樹脂連接的情況下，連接可以是模塊的，其使用SPPS和適當保護的構(gòu)建嵌段(參見通用方法)。

與樹脂結(jié)合的肽的連接- 路線I: 將活化(活性酯或?qū)ΨQ酸酐)白蛋白結(jié)合部分或接頭諸如十八烷二酸單-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等 EP511600, 相對于樹脂結(jié)合的肽的4摩爾當量)溶于NMP (25 mL)，加入到樹脂中并在室溫下振搖過夜。過濾反應(yīng)混合物并用NMP、DCM、2-丙醇、甲醇和乙醚徹底洗滌樹脂。

與樹脂結(jié)合的肽的連接- 路線II: 將白蛋白結(jié)合部分溶于NMP/DCM (1:1、10 ml)。加入活化劑諸如HOBt (相對于樹脂的4摩爾當量)和DIC (相對于樹脂的4摩爾當量)并將溶液攪拌15 min。將溶液加入到樹脂中并加入DIPEA (相對于樹脂的4摩爾當量)。將樹脂在室溫下振搖2-24小時。樹脂用NMP (2 x 20 ml)、NMP/DCM (1:1, 2 x 20ml)和DCM (2 x 20 ml)洗滌。

在溶液中與肽的連接 - 路線III: 將活化(活性酯或?qū)ΨQ酸酐)白蛋白結(jié)合部分或接頭諸如十八烷二酸單-(2,5-二氧代-吡咯烷-1-基)酯(Ebashi等 EP511600，相對于肽的1-1.5摩爾當量)溶于有機溶劑諸如乙腈、THF、DMF、DMSO或溶于水/有機溶劑的混合物(1-2 ml)中，并向肽的水溶液(10-20ml)中加入10摩爾當量的DIPEA。在保護基在白蛋白結(jié)合殘基諸如叔丁基上的情況下，將反應(yīng)混合物凍干過夜，以后再對分離粗制肽脫保護。在叔丁基保護基的情況下，通過將肽溶于三氟乙酸、水和三異丙基甲硅烷的混合物(90:5:5)中而進行脫保護。30min后，所得混合物經(jīng)真空蒸發(fā)，粗制肽通過制備型HPLC純化，如后所述。

SPPS方法E

SPPS方法E是指在來自Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 U.S.A.)的Prelude 固相肽合成儀上通過Fmoc化學合成肽。合適的樹脂是獲自Novabiochem的預(yù)先裝載的低載量Wang樹脂(例如，低載量fmoc-Lys(Mtt)-Wang樹脂, 0.35 mmol/g)。Fmoc-脫保護用25%哌啶的NMP溶液，2 x 10 min。偶聯(lián)化學是DIC/HOAt/collidine的NMP溶液。將氨基酸/HOAt溶液(0.3 M/NMP，摩爾過量3-10倍)加入到樹脂中，再加入等摩爾的DIC (3 M/NMP)和collidine (3 M/NMP)。例如，每次偶聯(lián)使用以下量的0.3M 氨基酸/HOAt溶液，用于以下規(guī)模的反應(yīng)：規(guī)模/ml，0.10 mmol/2.5 ml、0.25 mmol/5 ml。偶聯(lián)時間通常是60分鐘。某些氨基酸，包括但不限于精氨酸、Aib或組氨酸，是“雙偶聯(lián)的”，是指第一偶聯(lián)(例如，60 min)之后，樹脂被排干并加入更多試劑(氨基酸、HOAt、DIC和collidine)，并讓混合物再次反應(yīng)(例如，60 min)。某些氨基酸和脂肪酸衍生物，包括但不限于Fmoc-OEG-OH、Fmoc-Trx-OH、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸單叔丁酯、十九烷二酸單叔丁酯、或4-(9-羧基壬基氧基)苯甲酸叔丁酯，偶聯(lián)延長的時間，例如 6小時。當希望賴氨酸側(cè)鏈的化學修飾時，將賴氨酸摻入作為Lys(Mtt)。通過用DCM洗滌樹脂并將樹脂懸浮于六氟異丙醇/DCM (75:25)中持續(xù)3 x 10分鐘，再用DCM、20%哌啶和NMP洗滌，除去Mtt基團。通過手動合成(參見SPPS方法D)或通過在如上所述的Prelude肽合成儀上的一個或多個自動化步驟，使用被適當保護的構(gòu)建嵌段(參見通用方法)，進行賴氨酸的化學修飾。

2. 從樹脂上裂解肽并純化

合成之后，樹脂用DCM洗滌，并通過用TFA/TIS/水 (95/2.5/2.5或92.5/5/2.5)處理2-3小時，再用二乙醚沉淀，將肽從樹脂上裂解下來。將肽溶于合適的溶劑(諸如例如30%乙酸)中并通過標準RP-HPLC，在C18, 5μM柱上使用乙腈/水/TFA純化。通過UPLC, MALDI和LCMS方法的組合來分析級分，并將合適級分合并和凍干。

3. 檢測和表征的方法

LCMS方法

LCMS方法1 (LCMS1)

從Agilent 1200 Series HPLC系統(tǒng)中洗脫之后，使用Agilent Technologies LC/MSD TOF (G1969A)質(zhì)譜儀來鑒定樣品質(zhì)量。用Agilent蛋白證實軟件計算蛋白質(zhì)譜的去卷積。

洗脫液：

A: 0.1% 三氟乙酸/水

B: 0.1% 三氟乙酸/乙腈

柱：Zorbax 5u, 300SB-C3, 4.8x50mm

梯度：25% - 95 %乙腈，在15 min內(nèi)。

LCMS方法2 (LCMS2)

從Perkin Elmer Series 200 HPLC系統(tǒng)中洗脫之后，使用Perkin Elmer Sciex API 3000質(zhì)譜儀來鑒定樣品質(zhì)量。

洗脫液：

A: 0.05% 三氟乙酸/水

B: 0.05% 三氟乙酸/乙腈

柱： Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 μm

梯度：5% - 90 %乙腈，在7.5 min內(nèi)，流速1.5ml/min。

LCMS方法3 (LCMS3)

從Waters Alliance HT HPLC系統(tǒng)中洗脫之后，使用Waters Micromass ZQ質(zhì)譜儀來鑒定樣品質(zhì)量。

洗脫液：

A: 0.1% 三氟乙酸/水

B: 0.1% 三氟乙酸/乙腈

柱： Phenomenex, Jupiter C4 50 X 4.60 mm id 5 μm

梯度：10% - 90% B，在7.5 min內(nèi)，流速1.0 ml/min。

LCMS方法4 (LCMS4)

在由Waters Acquity UPLC系統(tǒng)和LCT Premier XE質(zhì)譜儀(來自Micromass)組成的裝置上進行LCMS4。將UPLC泵連接到含有以下成分的2個洗脫液池：

A: 0.1% 甲酸/水

B: 0.1% 甲酸/乙腈

通過將合適體積(優(yōu)選2-10μl)的樣品注射到柱中，用A和B的梯度洗脫，在室溫下進行分析。

UPLC條件、檢測器設(shè)置和質(zhì)譜儀設(shè)置為：

柱：Waters Acquity UPLC BEH, C-18, 1.7μm, 2.1mm x 50mm

梯度：線性5% - 95%乙腈，在4.0 min (或者8.0 min)內(nèi)，流速0.4ml/min

檢測：214 nm (類似于從TUV (可調(diào)的UV 檢測器)輸出)

MS電離方式：API-ES

掃描：100-2000 amu (或者500-2000 amu), 步驟0.1 amu。

UPLC和HPLC方法

方法05_B5_1

UPLC (方法05_B5_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。

將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：

A: 0.2 M Na₂SO₄, 0.04 M H₃PO₄, 10 % CH₃CN (pH 3.5)

B: 70 % CH₃CN, 30 % H₂O

使用以下線性梯度：60 % A, 40 % B至30 % A, 70 % B，在8分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法05_B7_1

UPLC (方法05_B7_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。

將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：

A: 0.2 M Na₂SO₄, 0.04 M H₃PO₄, 10 % CH₃CN (pH 3.5)

B: 70 % CH₃CN, 30 % H₂O

使用以下線性梯度：80 % A, 20 % B至40 % A, 60 % B，在8分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法04_A2_1

UPLC (方法04_A2_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。

將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：

A: 90 % H₂O, 10 % CH₃CN, 0.25 M碳酸氫銨

B: 70 % CH₃CN, 30 % H₂O

使用以下線性梯度：90 % A, 10 % B至60 % A, 40 % B，在16分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法04_A3_1

UPLC (方法04_A3_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。

將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：

A: 90 % H₂O, 10 % CH₃CN, 0.25 M碳酸氫銨

B: 70 % CH₃CN, 30 % H₂O

使用以下線性梯度：75 % A, 25 % B至45 % A, 55 % B，在16分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法04_A4_1

UPLC (方法04_A4_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。

將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：

A: 90 % H₂O, 10 % CH₃CN, 0.25 M碳酸氫銨

B: 70 % CH₃CN, 30 % H₂O

使用以下線性梯度：65 % A, 35 % B至25 % A, 65 % B，在16分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法08_B2_1

UPLC (方法08_B2_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。

將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：

A: 99.95%H₂O, 0.05% TFA

B: 99.95% CH₃CN, 0.05% TFA

使用以下線性梯度：95 % A, 5 % B至40 % A, 60 % B，在16分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法08_B4_1

UPLC (方法08_B4_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。

將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：

A: 99.95%H₂O, 0.05% TFA

B: 99.95% CH₃CN, 0.05% TFA

使用以下線性梯度：95 % A, 5 % B至95 % A, 5 % B，在16分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法05_B10_1

UPLC (方法05_B10_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 ?, 1.7 um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。

將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：

A: 0.2 M Na₂SO₄, 0.04 M H₃PO₄, 10 % CH₃CN (pH 3.5)

B: 70 % CH₃CN, 30 % H₂O

使用以下線性梯度：40 % A, 60 % B至20 % A, 80 % B，在8分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法01_A4_2

UPLC (方法01_A4_2)：使用配置有waters 996二極管陣列檢測器的Waters 600S系統(tǒng)進行RP-分析。使用Symmetry300 C18, 5 um, 3.9 mm x 150 mm柱, 42℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將HPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的3個洗滌液池：A: 100 % H₂O, B: 100 % CH₃CN, C: 1% 三氟乙酸/H₂O。使用以下線性梯度：90 % A, 5 % B, 5 %C至0 % A, 95 % B, 5% C，在15分鐘內(nèi)，流速1.0 ml/min。

方法09_B2_1

UPLC (方法09_B2_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：A: 99.95 % H₂O, 0.05 % TFA；B: 99.95 % CH₃CN, 0.05 % TFA。使用以下線性梯度：95 % A, 5 % B至40 % A, 60 % B，在16分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法09_B4_1

UPLC (方法09_B4_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：A: 99.95 % H₂O, 0.05 % TFA；B: 99.95 % CH₃CN, 0.05 % TFA。使用以下線性梯度：95 % A, 5 % B至5 % A, 95 % B，在16分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法05_B8_1

UPLC (方法05_B8_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：A: 0.2 M Na₂SO₄, 0.04 M H₃PO₄, 10% CH₃CN (pH 3.5)；B: 70% CH₃CN, 30% H₂O。使用以下線性梯度：50% A, 50% B至20% A, 80% B，在8分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法10_B14_1

UPLC (方法10_B14_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 50℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：A: 99.95 %H₂O, 0.05 % TFA；B: 99.95 % CH₃CN, 0.05 % TFA。使用以下線性梯度：70 % A, 30 % B至40 % A, 60 % B，在12分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法04_A6_1

UPLC (方法04_A6_1)：使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130?, 1.7um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：A: 10 mM TRIS, 15 mM硫酸銨, 80% H₂O, 20 %, pH 7.3；B: 80 % CH₃CN, 20 % H₂O。使用以下線性梯度：95 % A, 5 % B至10 % A, 90 % B，在16分鐘內(nèi)，流速0.35 ml/min。

方法01_B4_1

HPLC (方法01_B4_1)：在配置有Waters 996二極管陣列檢測器的Waters 600S系統(tǒng)進行RP-分析。使用Waters 3 mm x 150 mm 3.5um C-18 Symmetry 柱采集紫外檢測結(jié)果。將柱加熱到42℃并用5-95%乙腈, 90-0%水和5% 三氟乙酸(1.0%)/水的線性梯度洗脫，在15分鐘內(nèi)，流速1 ml/min。

方法04_A7_1

UPLC (方法04_A7_1): 使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 ?, 1.7 um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：A: 10 mM TRIS, 15 mM磷酸銨, 80% H₂O, 20%, pH 7.3; B: 80% CH₃CN, 20% H₂O。使用以下線性梯度：95% A, 5% B至40% A, 60% B，在16分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法05_B9_1

UPLC (方法05_B9_1): 使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH130, C18, 130 ?, 1.7 um, 2.1 mm x 150 mm柱, 40℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：A: 0.2 M Na₂SO₄, 0.04 M H₃PO₄, 10 %CH₃CN (pH 3.5); B: 70% CH₃CN, 30% H₂O。使用以下線性梯度：70% A, 30% B至20% A, 80% B，在8分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法10_B12_1

UPLC (方法10_B12_1): 使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18, 1.7 um，2.1 mm x 150 mm柱, 50℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：A: 99.95% H₂O, 0.05% TFA; B: 99.95% CH₃CN, 0.05% TFA。使用以下線性梯度：50% A, 50% B至0% A, 100% B，在16分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

方法04_A9_1

UPLC (方法04_A9_1):使用配置有雙波段檢測器的Waters UPLC系統(tǒng)進行RP-分析。使用ACQUITY UPLC BEH Shield RP18, C18, 1.7 um , 2.1 mm x 150 mm柱, 60℃，采集214nm和254nm處的紫外檢測結(jié)果。將UPLC系統(tǒng)連接到含有以下成分的2個洗脫液池：A: 200 mM Na₂SO₄ + 20 mM Na₂HPO₄ + 20mM NaH₂PO₄/90%H₂O / 10%CH₃CN, pH 7.2; B: 70%CH₃CN, 30% H₂O。使用以下步梯度：90% A, 10% B至80% A, 20% B，在3分鐘內(nèi)，80%A, 20% B至50% A, 50% B，在17分鐘內(nèi)，流速0.40 ml/min。

MALDI-MS方法

用基質(zhì)輔助激光解吸和電離飛行時間質(zhì)譜測定分子量，記錄在Microflex或Autoflex (Bruker)上。使用α-氰基-4-羥基肉桂酸的基質(zhì)。

NMR方法

使用Brucker Avance DPX 300 (300 MHz)，用四甲基甲硅烷作為內(nèi)標，記錄質(zhì)子NMR譜?；瘜W位移(δ)表示為ppm，分裂模式命名如下：s，單峰；d，雙重峰；dd，雙重雙分裂峰；dt, 雙重三分裂峰；t，三重峰；tt，三重三分裂峰；q，四重峰；quint，五重峰；sext，六重峰；m，多重峰；和br = 寬。

B. 中間體的合成

1. 脂肪二酸的單酯的合成

將C12、C14、C16和C18二酸與Boc-酸酐、DMAP和叔丁醇的甲苯溶液回流過夜，主要得到叔丁基單酯。檢查之后所獲得的是單酸、二酸和二酯的混合物。通過洗滌、短硅膠塞過濾和結(jié)晶而進行純化。

B. 本發(fā)明化合物的合成

實施例1

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,Arg²⁶,Lys²⁷,Arg³⁴,Lys³⁷]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式50:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B2_1): Rt = 12.4 min

UPLC (方法: 04_A3_1): Rt = 8.3 min。

實施例2

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,Arg²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Arg³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽基-Glu-Gly

化學式51:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B2_1): Rt = 13.1 min

UPLC (方法04_A7_1): Rt = 6.3 min。

實施例3

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,Arg²⁶,Lys²⁷,Arg³⁴,Lys³⁶],des-Gly37-GLP-1-(7-36)-肽

化學式52:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B2_1): Rt = 13.3 min

UPLC (方法05_B5_1): Rt = 6.5 min。

實施例4

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Arg³⁴,Lys³⁷]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式53:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B2_1): Rt = 13.0 min

UPLC (方法04_A7_1): Rt = 6.9 min。

實施例5

N^ε20-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Aib⁸,Lys²⁰,Glu²²,Arg²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Gly³⁴]-GLP-1-(7-34)-肽

化學式54:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 9.02 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 4.61 min。

實施例6

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Arg²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Arg³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽基-Glu

化學式55:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B2_1): Rt = 13.0 min

UPLC (方法05_B5_1): Rt = 5.6 min。

實施例7

N^ε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Aib⁸,Lys²²,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Arg³⁴]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式56:

制備方法：SPPS方法B

LCMS2: Rt = 4.00 min, m/z = 1599 (m/3), 1199 (m/4)

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 7.83 min

UPLC (方法05_B9_1): Rt = 7.45 min。

實施例8

N^ε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib⁸,Lys²²,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Arg³⁴]-GLP-1-(7-34)-肽

化學式57:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法10_B12_1): Rt = 8.92 min。

實施例9

N^ε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Aib8,Lys22,Val25,Arg26,Lys27,Arg34]-GLP-1-(7-35)-肽

化學式58:

制備方法：SPPS方法E

通過MALDI-MS證實4628 Da的理論分子量

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 9.29 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 6.49 min。

實施例10

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[His²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Arg³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽基-Glu

化學式59:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B2_1): Rt = 12.9 min

UPLC (方法05_B5_1): Rt = 5.5 min。

實施例11

N^ε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Lys²²,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Gln³⁴]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式60:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B2_1): Rt = 13.5 min。

實施例12

N^α(N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Arg³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽基)-Gln

化學式61:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 8.9 min

UPLC (方法05_B7_1): Rt = 8.8 min。

實施例13

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Gln³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽基-Glu

化學式62:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法05_B9_1): Rt = 7.9 min

UPLC (方法05_B7_1): Rt = 8.8 min。

實施例14

N^ε22-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-羧基十三?；被?乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁?；鵠，N^ε27-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-羧基十三酰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁?；鵠-[Lys²²,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Gly³⁴]-GLP-1-(7-34)-肽

化學式63:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 8.5 min

UPLC (方法05_B7_1): Rt = 8.8 min。

實施例15

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Aib⁸,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Gln³⁴,Lys³⁷]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式64:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 8.3 min

UPLC (方法05_B9_1): Rt = 7.1 min。

實施例16

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Gln³⁴,Lys³⁷]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式65:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 8.1 min。

實施例17

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε37-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,Glu²³,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Gln³⁴,Lys³⁷]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式66:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 8.0 min

UPLC (方法05_B9_1): Rt = 6.6 min。

實施例18

N^ε12-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Aib⁸,Lys¹²,Glu²²,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Gln³⁴]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式67:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 7.66 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 4.09 min。

實施例19

N^ε22-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Aib⁸,Lys²²,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Gly³⁴]-GLP-1-(7-34)-肽

化學式68:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 8.37 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 4.41 min。

實施例20

N^ε22-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-羧基十三?；被?乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁酰基]，N^ε27-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-羧基十三?；被?乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁酰基]-[Lys²²,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Gln³⁴]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式69:

制備方法：SPPS方法E

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 9.00 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 6.50 min。

實施例21

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,His²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Arg³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽基-Glu

化學式70:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 8.4 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 9.3 min。

實施例22

N^ε24-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-羧基十三?；被?乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁酰基]，N^ε27-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-羧基十三?；被?乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]丁?；鵠-[Glu²²,Lys²⁴,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Gly³⁴]-GLP-1-(7-34)-肽

化學式71:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 8.17 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 4.65 min。

實施例23

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁酰基]氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Gln³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式72:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 8.82 min

UPLC (方法05_B5_1): Rt = 6.10 min。

實施例24

N^ε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三酰基氨基)丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,Lys²⁴,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Arg³⁴]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式73:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 7.52 min

UPLC (方法04_A9_1): Rt = 10.35 min。

實施例25

N^ε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,Lys²⁴,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Gly³⁴]-GLP-1-(7-34)-肽

化學式74:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 8.01 min

UPLC (方法04_A9_1): Rt = 8.00 min。

實施例26

N^ε27-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁?；鵠，N^ε36-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4R)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁?；鵠-[Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Gln³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式75:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 8.96 min

UPLC (方法05_B5_1): Rt = 6.54 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 5.69 min。

實施例27

N^ε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,Lys²⁴,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Gly³⁴]-GLP-1-(7-34)-肽

化學式76:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 9.25 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 6.01 min。

實施例28

N^ε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸?；被鵠丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Glu²²,Lys²⁴,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Arg³⁴]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式77:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 8.19 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 5.24 min。

實施例29

N^ε24-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(13-羧基十三?；被?丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-[Aib⁸,Glu²²,Lys²⁴,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,His³¹,Gln³⁴]-GLP-1-(7-37)-肽

化學式78:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 7.79 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 4.87 min。

實施例30

N^ε24-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-羧基十三?；被?乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁?；鵠，N^ε27-[(4S)-4-羧基-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-(13-羧基十三?；被?乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]丁酰基]-[Glu²²,Lys²⁴,Val²⁵,Arg²⁶,Lys²⁷,Gly³⁴]-GLP-1-(7-34)-肽

化學式79:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法08_B4_1): Rt = 9.33 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 6.13 min。

實施例31

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[10-(4-羧基苯氧基)癸酰基氨基]丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Aib⁸,Glu²²,Arg²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Arg³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽基-Glu-Gly

化學式80:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B4_1):_Rt = 8.58 min

UPLC (方法10_B29_1): Rt = 10.6 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 4.43 min。

實施例32

N^ε27-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二烷?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠，N^ε36-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[12-(4-羧基苯氧基)十二烷?；被鵠丁?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠氨基]乙氧基]乙氧基]乙?；鵠-[Glu²²,Arg²⁶,Lys²⁷,Glu³⁰,Arg³⁴,Lys³⁶]-GLP-1-(7-37)-肽基-Glu-Gly

化學式81:

制備方法：SPPS方法B

UPLC (方法09_B4_1): Rt = 9.19 min

UPLC (方法10_B29_1): Rt = 13.73 min

UPLC (方法04_A6_1): Rt = 5.40 min。

藥理學方法

實施例33: 體外功效

本實施例的目的是在體外測試GLP-1衍生物的活性或功效。。

實施例1-32的GLP-1衍生物的功效如下所述進行測定，即，測定為在含有表達人GLP-1受體的膜的培養(yǎng)基中刺激環(huán)AMP (cAMP)的形成。

原理

來自表達人GLP-1受體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系BHK467-12A (tk-ts13)的純化的質(zhì)膜用目標GLP-1類似物或衍生物刺激，并且cAMP產(chǎn)生的功效使用來自Perkin Elmer Life Sciences的AlphaScreenTM cAMP測定試劑盒進行測量。AlphaScreen測定的基本原理是內(nèi)源cAMP和外源添加的生物素-cAMP之間的競爭。cAMP的捕獲通過使用綴合至受體珠粒的特異性抗體來實現(xiàn)。

細胞培養(yǎng)和膜的制備

選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系和高表達克隆用于篩選。細胞生長在5% CO₂下在DMEM, 5% FCS, 1% Pen/Strep (青霉素/鏈霉素)和0.5 mg/ml選擇標記G418中。

在約80%匯合的細胞用PBS洗滌2次，并且用Versene(乙二胺四乙酸四鈉鹽的水溶液)收獲，以1000 rpm離心5 min，并且去除上清液。額外步驟都在冰上進行。將細胞沉淀物通過Ultrathurax在10 ml緩沖液1(20 mM Na-HEPES, 10 mM EDTA, pH=7.4)中均質(zhì)化20-30 s，以20,000 rpm離心15 min，并且將沉淀再懸浮于10 ml緩沖液2 (20 mM Na-HEPES, 0.1 mM EDTA, pH=7.4)中。將懸浮液均質(zhì)化20-30 s，并且以20,000 rpm離心15 min。將懸浮在緩沖液2中、均質(zhì)化和離心重復(fù)一次，并且將膜重懸浮于緩沖液2中。確定蛋白濃度并將膜儲存在-80℃下直至使用。

在平底96孔板中進行該測定(Costar目錄號：3693)。每孔的終體積為50 μl。

溶液和試劑

來自Perkin Elmer Life Sciences的AlphaScreen cAMP測定試劑盒(目錄號：6760625M)；含抗cAMP受體珠粒(10 U/μl)，鏈霉親和素供體珠粒(10 U/μl)和生物素化的cAMP (133 U/μl)。

AlphaScreen緩沖液, pH=7.4: 50 mM TRIS-HCl (Sigma, 目錄號: T3253)；5 mM HEPES (Sigma, 目錄號: H3375)；10 mM MgCl₂, 6H₂O (Merck, 目錄號: 5833)；150 mM NaCl (Sigma, 目錄號: S9625)；0.01%吐溫(Merck, 目錄號: 822184)。在使用之前將以下添加至AlphaScreen緩沖液中(表示的終濃度)：BSA (Sigma, 目錄號A7906): 0.1%；IBMX (Sigma, 目錄號I5879): 0.5 mM；ATP (Sigma, 目錄號A7699): 1 mM；GTP (Sigma, 目錄號G8877): 1 uM。

cAMP標準品(在測定中的稀釋系數(shù)= 5)：cAMP溶液: 5 μL的5 mM cAMP-儲存物 + 495 μL AlphaScreen緩沖液。

制備cAMP標準品以及待測試的GLP-1類似物或衍生物在AlphaScreen緩沖液中的合適稀釋系列，例如，以下八個濃度的GLP-1化合物：10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13和10^-14M，和從(例如)10^-6至3x10^-11 cAMP的系列。

膜/受體珠粒

從hGLP-1/ BHK 467-12A細胞制備膜，6 μg/孔的濃度對應(yīng)于0.6 mg/ml(每孔使用的膜量可能變化)

“無膜”：AlphaScreen緩沖液中的受體珠粒(最終15μg/ml)

“6 μg/孔膜”：AlphaScreen緩沖液中的膜+受體珠粒(最終15μg/ml)

將“無膜”的等分試樣(10 μl)添加至cAMP標準品(一式兩份孔中的每孔)和陽性對照和陰性對照

將“6 μg/孔膜”的等分試樣(10 μl)添加至GLP-1和類似物(一式兩份或一式三份孔中的每孔)。

陽性對照：10 μl “無膜”+ 10 μl AlphaScreen緩沖液。

陰性對照：10 μl “無膜”+ 10 μl cAMP儲存溶液(50μM)

由于珠粒對于直接光敏感，所以任何操作都在黑暗中(盡可能暗)或在綠光下進行。所有稀釋在冰上進行。

程序

1.制備AlphaScreen緩沖液。

2.將GLP-1/類似物/cAM標準品溶解并稀釋在AlphaScreen緩沖液中。

3.通過混合鏈霉親和素供體珠粒(2單位/孔)和生物素化的cAMP(1.2單位/孔)而制備供體珠粒溶液，并且在黑暗中在室溫下孵育20-30min。

4.將cAMP/GLP-1/類似物添加至板：10μl/孔。

5.制備膜/受體珠粒溶液，并且將其添加至板：10μl/孔。

6.添加供體珠粒：30ml/孔。

7.將板包裹在鋁箔中，并且在RT下在搖床上孵育3小時(非常慢)。

8.在AlphaScreen上計數(shù)-每塊板在計數(shù)前在AlphaScreen中預(yù)孵育3分鐘。

結(jié)果

EC₅₀ [pM]值使用Graph-Pad Prism軟件(版本5)進行計算，并且顯示在下表1中。體外證實所有衍生物的功效。

表1：體外功效

測試化合物的平均體外功效(EC₅₀平均值)為340 pM。大部分衍生物具有對應(yīng)于低于1200 pM的EC₅₀的良好體外功效。

用于比較，Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669的表1中化合物編號13(在K^26,34被雙-C12-二酸?；腉LP-1(7-37))具有對應(yīng)于1200 pM的EC₅₀的體外功效。

實施例34: GLP-1受體結(jié)合

本實驗的目的是研究GLP-1衍生物對GLP-1受體的結(jié)合，以及該結(jié)合如何潛在地受白蛋白的存在的影響。這如下所述在體外實驗中進行。

實施例1-32的GLP-1衍生物與人GLP-1受體的結(jié)合親和力通過它們從受體置換¹²⁵I-GLP-1的能力來測量。為了測試衍生物與白蛋白的結(jié)合，用低濃度的白蛋白(0.001% - 對應(yīng)于其殘留量的示蹤劑)以及用高濃度的白蛋白(添加的2.0％)進行該測定。結(jié)合親和力IC₅₀的轉(zhuǎn)換表明目標肽結(jié)合至白蛋白，并且因此預(yù)測在動物模型中目標肽的潛在延遲的藥代動力學概況。

條件

物種(體外)：倉鼠

生物終點：受體結(jié)合

測定方法：SPA

受體：GLP-1受體

細胞系：BHK tk-ts13。

細胞培養(yǎng)和膜純化

選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系和高表達克隆用于篩選。細胞生長在5% CO₂下在DMEM, 10% FCS, 1% Pen/Strep (青霉素/鏈霉素)和1.0 mg/ml選擇標記G418中。

將細胞(約80%匯合)用PBS洗滌2次，并且用Versene(乙二胺四乙酸四鈉鹽的水溶液)收獲，其后它們通過以1000 rpm離心5 min進行分離。在隨后的步驟中細胞/細胞沉淀必須盡可能保持在冰上。將細胞沉淀在合適量的緩沖液1(取決于細胞的量，但例如10 ml)中用Ultrathurrax均質(zhì)化20-30秒。將勻漿以20000 rpm離心15分鐘。將沉淀在10 ml緩沖液2中重新懸浮(均質(zhì)化)，并且重新離心。該步驟再重復(fù)一次。將獲得的沉淀再懸浮于緩沖液2中，并且確定蛋白濃度。將膜儲存在-80℃。

緩沖液1: 20 mM Na-HEPES + 10 mM EDTA, pH 7.4

緩沖液2: 20 mM Na-HEPES + 0.1 mM EDTA, pH 7.4。

結(jié)合測定：

SPA:

將試驗化合物、膜、SPA-顆粒和[¹²⁵I]-GLP-1(7-36)NH₂稀釋在測定緩沖液中。將50 ul(微升)HSA(含有2％HSA的“高白蛋白”實驗)或緩沖液(含有0.001% HSA 的“低白蛋白”實驗)添加至Optiplate，并且添加25 ul測試化合物。添加對應(yīng)于0.1 - 0.2 mg蛋白/ml的5-10 ug膜蛋白/樣品(50 ul)(優(yōu)選對于每種膜制劑進行優(yōu)化)。以0.5 mg/孔(50 ul)的量添加SPA顆粒(Wheatgerm凝集素SPA珠粒, Perkin Elmer, #RPNQ0001)。用[¹²⁵I]-GLP-1]-(7-36)NH₂ (終濃度0.06 nM，對應(yīng)于49.880 DPM, 25 ul)開始孵育。用PlateSealer將板密封，并且在30℃下孵育120分鐘，同時搖動。將板進行離心(1500 rpm, 10 min)，并且在Topcounter中計數(shù)。

測定緩沖液:

計算

從曲線讀出IC₅₀值，其作為從受體置換50%的¹²⁵I-GLP-1的濃度，并且確定[(IC₅₀/nM)高HSA] / [(IC₅₀/nM)低HSA]的比值。

通常，在低白蛋白濃度與GLP-1受體的結(jié)合應(yīng)當是盡可能好的，其對應(yīng)于低IC₅₀值。

在高白蛋白濃度的IC₅₀值是白蛋白對衍生物與GLP-1受體的結(jié)合的影響的量度。如已知，GLP-1衍生物也結(jié)合白蛋白。這是通常期望的效果，其延長它們在血漿中的壽命。因此，在高白蛋白的IC₅₀值將通常高于在低白蛋白的IC₅₀值，其對應(yīng)于減小的與GLP-1受體的結(jié)合，其由白蛋白競爭與GLP-1受體的結(jié)合所引起。

因此，高比值(IC₅₀值(高白蛋白)/ IC₅₀值(低白蛋白))可以被視為表明目標衍生物良好結(jié)合白蛋白(可能具有長半衰期)，并且本身也良好結(jié)合GLP-1受體(IC₅₀值(高白蛋白)是高的，并且IC₅₀值(低白蛋白)是低的)。

結(jié)果

獲得以下結(jié)果，其中“比值”是指[(IC₅₀/nM)高HSA] / [(IC₅₀/nM)低HSA])：

表2：受體結(jié)合親和力

平均比值非常好(約300)。大部分衍生物具有超過50的比值。

此外，關(guān)于IC₅₀(低白蛋白)，測試的化合物的平均IC₅₀為14 nM，并且大部分衍生物低于15.0 nM。

最后，關(guān)于IC₅₀(高白蛋白)，大部分衍生物具有低于900nM 的IC₅₀(高白蛋白)。

用于比較，Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669的表1中化合物編號13(在K^26,34被雙-C12-二酸?；腉LP-1(7-37))具有51.3的比值，17.7 nM的IC₅₀(低白蛋白)和908 nM的IC₅₀(高白蛋白)。

實施例35: 口服生物利用度的估計 - 大鼠中腸道注射(癸酸鹽)

本實驗的目的是估計GLP-1衍生物的口服生物利用度。

為此，如下所述，在大鼠中在體內(nèi)研究在實施例2-17和19-22的GLP-1衍生物直接注射到腸腔后在血漿中的暴露。

將GLP-1衍生物在55 mg/ml癸酸鈉的溶液以1000 uM的濃度進行測試。

具有約240 g的到達后體重的雄性Sprague Dawley大鼠獲得自Taconic (Denmark)，并且通過簡單隨機化分配到不同治療中，4只大鼠/每組。大鼠在實驗前禁食約18小時，并且進行全身麻醉(Hypnorm/Dormicum)。

將GLP-1衍生物施用于空腸的近端部分(十二指腸的10 cm遠)或中腸(盲腸的50 cm近)。將10 cm長的PE50導(dǎo)管插入空腸，向前至少1.5 cm進入空腸，并在給藥前通過結(jié)扎在腸道周圍進行保護，其中導(dǎo)管在尖端的3/0遠端縫合以防止泄漏或?qū)Ч芤莆?。放置?dǎo)管而不用注射器和針頭，并且將2 ml鹽水施用于腹部，然后用傷口夾閉合切口。

將100 μl各GLP-1衍生物用1 ml注射器通過導(dǎo)管注入空腸腔。隨后，用另一個注射器將200 μl空氣推入空腸腔以“沖洗”導(dǎo)管。使該注射器保持連接到導(dǎo)管，以防止回流到導(dǎo)管中。

以所需時間間隔(通常為時間0、10、30、60、120 和240 min)將血液樣品(200 ul)從尾靜脈收集到EDTA管中，并且在4℃下在20分鐘內(nèi)以10000G離心5分鐘。將血漿(75ul)分離到微型管，立即冷凍，并保存在-20℃，直到通常如Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247中Poulsen和Jensen對于測定胰島素所述用LOCI (Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay，發(fā)光氧通道免疫測定)分析相應(yīng)GLP-1衍生物的血漿濃度。供體珠粒用鏈霉親和素包被，而受體珠粒用識別肽的中-/C-末端表位的單克隆抗體綴合。將對于N-末端特異性的另一種單克隆抗體生物素化。將三種反應(yīng)物與分析物組合并形成雙位的免疫復(fù)合物。復(fù)合物的發(fā)光從供體珠粒釋放單線態(tài)氧，所述單線態(tài)氧通過通道進入受體珠粒，并且觸發(fā)化學發(fā)光，所述化學發(fā)光在Envision板讀數(shù)器中測量。光的量與化合物的濃度成比例。

在采集血液之后，將大鼠在麻醉下處死，打開腹部以確認正確的導(dǎo)管放置。

將平均(n=4)血漿濃度(pmol/l)確定為時間的函數(shù)。對于每種處理計算血漿濃度(pmol/l)除以給藥溶液濃度(μmol/l)的比值，并且將t = 30 min(將化合物注射在空腸中之后30分鐘)的結(jié)果評估(在30 min的劑量校正暴露)為腸道生物利用度的替代量度。已經(jīng)顯示劑量校正暴露與實際生物利用度顯著相關(guān)。

獲得以下結(jié)果，其中在30 min的劑量校正暴露是指(將化合物注射在空腸中之后30分鐘的血漿濃度(pM))除以(化合物在給藥溶液中的濃度(μM))：

表3：在30 min的劑量校正暴露

所有衍生物都具有超過38的在30 min的劑量校正暴露。

用于比較，Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669的表1中化合物編號13(在K^26,34被雙-C12-二酸酰化的GLP-1(7-37))具有38 的在30 min的劑量校正暴露。

實施例36: 對血糖和體重的影響

本研究的目的是驗證在糖尿病設(shè)置中GLP-1衍生物對血糖(BG)和體重(BW)的影響。

如下所述，在肥胖糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)中在劑量-響應(yīng)研究中測試GLP- 1衍生物。

將從出生開始用膳食NIH31 (NIH 31M嚙齒類動物膳食，商業(yè)獲得自Taconic Farms, Inc., US, 參見www.taconic.com)喂養(yǎng)的db/db小鼠(Taconic, Denmark)在7-9周齡招入研究中。小鼠自由獲取標準食物(例如，Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Denmark)和自來水，并保持在24 ℃。適應(yīng)1-2周后，在連續(xù)兩天(即在9 am)評估兩次基礎(chǔ)血糖。具有最低血糖值的小鼠被排除在實驗之外?；谄骄侵?，剩下小鼠被選擇用于進一步實驗并分配到具有匹配的血糖水平的7組(n=6)。在實驗中以48小時的持續(xù)時間和持續(xù)多達4次使用小鼠。最后一次實驗后對小鼠實施安樂死。

七組如下接受處理：

1: 媒介物，s.c.

2: GLP-1衍生物，0.3 nmol/kg, s.c.

3: GLP-1衍生物，1.0 nmol/kg, s.c.

4: GLP-1衍生物，3.0 nmol/kg, s.c.

5: GLP-1衍生物，10 nmol/kg, s.c.

6: GLP-1衍生物，30 nmol/kg, s.c.

7: GLP-1衍生物，100 nmol/kg, s.c.

媒介物：50mM磷酸鈉，145 mM氯化鈉，0.05%吐溫80, pH 7.4。

在媒介物中將GLP-1衍生物溶解至0.05、0.17、0.5、1.7、5.0和17.0 nmol/ml的濃度。將6 ml/kg的劑量-體積(即，300 μl/每50 g小鼠) s.c.給藥于動物。

在給藥當天，在時間-?h (8.30 am)評估血糖，在此之前將小鼠稱重。在約9 am (時間0)給藥GLP-1衍生物。在給藥當天，在時間1、2、4 和8 h (10 am、11 am、1 pm 和5 pm)評估血糖。在8 h血液取樣之后，對小鼠進行稱重。

在接下來的日子，在時間給藥后24和48(即，在第2天和第3天的9 am)評估血糖。每天，在血糖采樣之后對小鼠進行稱重。

將小鼠分別以數(shù)字體重稱重。

從有意識的小鼠的尾尖毛細管獲得樣品，用于測量血糖。將10 μl血液收集到肝素化的毛細管中，并轉(zhuǎn)移到500 μl葡萄糖緩沖液(EKF系統(tǒng)溶液, Eppendorf, Germany)。使用葡萄糖氧化酶方法(葡萄糖分析儀Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Germany)測量葡萄糖濃度。將樣品在室溫下保持長達1 h，直到分析。如果分析必須被推遲，則樣品保存在4 ℃下最多24 h。

ED₅₀是以nmol /kg計的產(chǎn)生半數(shù)最大效應(yīng)的劑量?；谘苌锝档腕w重的能力以及降低血糖的能力計算該值，如下面所解釋。

對于體重的ED₅₀計算為產(chǎn)生在皮下施用衍生物之后8小時對ΔBW的半數(shù)最大效應(yīng)的劑量。例如，如果8小時之后的體重的最大減少為2.0 g，那么ED₅₀體重將是產(chǎn)生8小時之后的體重減少1.0 g的以nmol/kg計的劑量。該劑量(ED₅₀體重)可以從劑量響應(yīng)曲線讀出。

對于血糖的ED₅₀計算為產(chǎn)生在皮下施用類似物之后8小時和/或24小時對AUCΔBG的半數(shù)最大效應(yīng)的劑量。

如果適當?shù)腟形劑量-響應(yīng)關(guān)系存在最大響應(yīng)的明確定義，則可以只計算ED₅₀值。因此，如果不是這樣，則可以在不同的劑量范圍內(nèi)重新測試目標衍生物，以觀察是否獲得S形劑量-響應(yīng)關(guān)系。

實施例37: 小型豬中的半衰期

本研究的目的是確定在i.v.施用于小型豬之后GLP-1衍生物的體內(nèi)延遲，即它們作用時間的延長。這在藥代動力學(PK)研究中進行，其中確定目標衍生物的終末半衰期。終末半衰期一般是指在初始分布階段之后測量的達到一定血漿濃度的一半所需的時間期間。

本研究中使用的雄性G?ttingen小型豬獲得自約7-14個月齡并且稱重約為16-35 kg 的Ellegaard G?ttingen小型豬(Dalmose, Denmark)。該小型豬單獨圈養(yǎng)，并且用SDS小型豬膳食(Special Diets Services, Essex, UK)限制地每天一次或兩次喂養(yǎng)。適應(yīng)至少2周之后，在每個動物中在尾側(cè)腔靜脈或顱側(cè)腔靜脈中植入兩個永久中心靜脈導(dǎo)管。允許所述動物在手術(shù)后恢復(fù)1周，并且然后用于在連續(xù)GLP-1衍生物給藥之間的合適洗脫期重復(fù)藥代動力學研究。

動物在給藥前禁食約18 h和給藥后禁食0至4 h，但在整個期間隨意飲水。

將GLP-1衍生物溶解在50mM磷酸鈉，145 mM氯化鈉，0.05%吐溫80，pH 7.4中至通常20-60 nmol/ml的濃度。通過一個導(dǎo)管給予化合物的靜脈內(nèi)注射(對應(yīng)于通常1-2 nmol/kg、例如0.033ml/kg的體積)，并且在預(yù)定時間點直至給藥后13天(優(yōu)選通過其他導(dǎo)管)采集血液。將血液樣品(例如0.8 ml)收集在EDTA緩沖液(8mM)中，然后在4℃以1942G離心10分鐘。將血漿吸取到在干冰上的微型管中，并且保持在-20℃直到使用ELISA或類似基于抗體的測定法或LC-MS分析各自GLP-1化合物的血漿濃度。個體血漿濃度-時間曲線通過Phoenix WinNonLin ver.6.2. (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)中的非區(qū)室模型進行分析，并且確定獲得的終末半衰期(調(diào)和平均值)。

結(jié)果

測試實施例2的衍生物，并且其具有87小時的半衰期。

用于比較，Journal of Medicinal Chemistry (2000), vol. 43, no. 9, p. 1664-669的表1中化合物編號13(在K^26,34被雙-C12-二酸?；腉LP-1(7-37))具有5小時的半衰期。

實施例38: 對食物攝取的影響

本實驗的目的是研究在豬中GLP-1衍生物對食物攝取的影響。這在如下文所述的藥效動力學(PD)研究中進行，其中與媒介物處理的對照組相比，在施用單次劑量的GLP-1衍生物之后1至4天測量食物攝取。

使用約3個月齡、稱重為約30-35kg的雌性Landrace Yorkshire Duroc (LYD)豬(n=3-4/每組)。在適應(yīng)動物設(shè)施過程中，將動物圈養(yǎng)在一個組中約1周。在實驗期間過程中，在用于測量個體食物攝取的給藥之前至少2天和整個實驗過程中，將動物置于單個圍欄中。在適應(yīng)和實驗期間兩者過程中，動物始終自由食用豬飼料(Svinefoder Danish Top)。通過每15分鐘記錄飼料重量而在線監(jiān)測食物攝取。使用的系統(tǒng)是Mpigwin (Ellegaard Systems, Faaborg, Denmark)。

將GLP-1衍生物以對應(yīng)于0.3、1、3、10 或30 nmol/kg的劑量的12、40、120、400 或1200 nmol/ml的濃度溶解在磷酸鹽緩沖液(50mM磷酸鈉，145 mM氯化鈉，0.05%吐溫80，pH 7.4)中。磷酸鹽緩沖液充當媒介物。在第1天早晨用單次皮下劑量的GLP-1衍生物或媒介物(劑量體積0.025 ml/kg)給藥于動物，并且在給藥后測量食物攝取1-4天。在每個研究的最后一天，在給藥后1-4天，從麻醉動物的心臟采集血液樣品，用于測量GLP-1衍生物的血漿暴露。其后用心內(nèi)過量的戊巴比妥使動物安樂死。使用ELISA或類似的基于抗體的測定或LC-MS分析該GLP-1衍生物的血漿含量。

在實驗的每一天，將食物攝取計算為平均值± SEM 24 h食物攝取。使用兩因素ANOVA重復(fù)量度和隨后的Bonferroni后檢驗進行媒介物相比于GLP-1衍生物組中24小時食物攝取的統(tǒng)計比較。

實施例10的化合物以3 nmol/kg的劑量進行測試，并且在該劑量下沒有看到對食物攝取的影響。實施例2的化合物以3 nmol/kg的劑量進行測試，并且顯示在實驗的兩天食物攝取的顯著減少(在第1天的23％和在第2天的35％)。

實施例39: 大鼠中的藥代動力學

本實施例的目的是在大鼠中研究體內(nèi)半衰期。

如下所述，用實施例2、10、17-18、和31的GLP-1衍生物進行在大鼠中的體內(nèi)藥代動力學研究。包括塞馬魯肽用于比較。

具有約400 g的體重的年齡相同的雄性Sprague Dawley大鼠獲得自Taconic (Denmark)，并且通過對體重簡單隨機化分配到治療中，約4只大鼠/每組，所以每個組中的所有動物都具有類似體重。

將GLP-1衍生物(約6 nmol/ml)溶解在50mM磷酸鈉，145 mM氯化鈉，0.05%吐溫80，pH 7.4中。通過植入在右頸靜脈的導(dǎo)管給予化合物的靜脈內(nèi)注射(1.0 ml/kg)。在給藥后，從舌下靜脈取樣血液，持續(xù)5天。將血液樣品(200 μl)收集在EDTA緩沖液(8mM)中，然后在4℃以10000G離心5分鐘。將血漿樣品保持在-20℃，直到分析相應(yīng)的GLP-1化合物的血漿濃度。

通常如Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247中Poulsen和Jensen對于測定胰島素所述，用發(fā)光氧通道免疫測定(Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay(LOCI))確定GLP-1衍生物的血漿濃度。供體珠粒用鏈霉親和素包被，而受體珠粒用識別肽的中-/C-末端表位的單克隆抗體綴合。將對于N-末端特異性的另一種單克隆抗體生物素化。將三種反應(yīng)物與分析物組合并形成雙位的免疫復(fù)合物。復(fù)合物的發(fā)光從供體珠粒釋放單線態(tài)氧，所述單線態(tài)氧通過通道進入受體珠粒，并且觸發(fā)化學發(fā)光，所述化學發(fā)光在Envision板讀數(shù)器中測量。光的量與化合物的濃度成比例。

血漿濃度-時間曲線使用Phoenix WinNonLin ver.6.2, Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA)進行分析，并且使用來自各動物的個體血漿濃度-時間曲線計算半衰期(T_?)。

結(jié)果

在相同設(shè)置(但是，其中n=8)中測試的塞馬魯肽的半衰期為11小時。

表4：大鼠中的半衰期

本發(fā)明的測試衍生物具有與塞馬魯肽類似或更好的半衰期。

實施例40: 口服生物利用度的估計 - 大鼠中腸道注射和口腔填喂(SNAC)

本實驗的目的是估計GLP-1衍生物在大鼠模型中的口服生物利用度。簡而言之，通過腸道注射(至腸)和口腔填喂(至胃)施用N-[8-(2-羥基苯甲?；?氨基]辛酸鈉(SNAC)中GLP-1衍生物的液體溶液，并且測量GLP-1衍生物在血漿中的隨后暴露。

通過將SNAC (12.5 g)溶解在高純度實驗室水(MilliQ) (50.0 ml)中而制備SNAC的250 mg/ml儲存溶液。用1 N NaOH(水溶液)將pH調(diào)節(jié)至約8.5。

通過將所需量的各自GLP-1衍生物溶解在SNAC儲存溶液中而制備在250 mg/ml SNAC中具有約1000 uM (800-1200 uM)的GLP-1衍生物的溶液。通過本領(lǐng)域現(xiàn)有狀態(tài)的方法諸如CLND-HPLC(用于HPLC的化學發(fā)光氮檢測)在施用前確定GLP-1衍生物的濃度。

具有約240 g的到達后體重的32只雄性Sprague Dawley大鼠獲得自Taconic (Denmark)，并且通過簡單隨機化分配到不同治療中，8只大鼠/每組。所有大鼠在實驗前在柵欄上禁食，持續(xù)約18小時。

對于腸道注射，在實驗當天，將大鼠進行全身麻醉(Hypnorm/Dormicum)，并且在整個實驗過程中維持麻醉。將實施例5-7的GLP-1衍生物施用于空腸的近端部分(十二指腸的10 cm遠)。將10 cm長的PE50導(dǎo)管插入空腸，向前至少1.5 cm進入空腸，并在給藥前通過結(jié)扎在腸道周圍進行保護。此外，導(dǎo)管在尖端的3/0遠端縫合以防止泄漏或?qū)Ч芤莆?。放置?dǎo)管而不用注射器和針頭，并且將2 ml鹽水施用于腹部，然后用傷口夾閉合切口。

將100 μl各GLP-1衍生物的SNAC溶液用1 ml注射器通過導(dǎo)管注入空腸腔。隨后，用另一個注射器將200 μl空氣推入空腸腔以“沖洗”導(dǎo)管。使該注射器保持連接到導(dǎo)管，以防止回流到導(dǎo)管中。

以所需時間間隔(通常為時間0、30、60、120 和180 min)將血液樣品(200 ul)從尾靜脈收集到EDTA管中。

對于口腔填喂，動物在整個實驗過程中有意識。

通過口腔填喂將GLP-1衍生物的100 μl SNAC溶液直接施用到胃。

以所需時間間隔(通常為時間0、30、60、120 和180 min)將血液樣品(200 ul)從舌下叢收集到EDTA管中。

所有獲得的血液樣品保持在冰上，并且并且在4℃下在20分鐘內(nèi)以10000G離心5分鐘。將血漿(75ul)分離到微型管，立即冷凍，并保存在-20℃，直到通常如Journal of Biomolecular Screening 2007, vol. 12, p. 240-247中Poulsen和Jensen對于測定胰島素所述用LOCI (Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay，發(fā)光氧通道免疫測定)分析相應(yīng)GLP-1衍生物的血漿濃度。供體珠粒用鏈霉親和素包被，而受體珠粒用識別肽的中-/C-末端表位的單克隆抗體綴合。將對于N-末端特異性的另一種單克隆抗體生物素化。將三種反應(yīng)物與分析物組合并形成雙位的免疫復(fù)合物。復(fù)合物的發(fā)光從供體珠粒釋放單線態(tài)氧原子，所述單線態(tài)氧原子通過通道進入受體珠粒，并且觸發(fā)化學發(fā)光，所述化學發(fā)光在Envision板讀數(shù)器中測量。光的量與化合物的濃度成比例。

在采集血液之后，將大鼠在麻醉下處死，打開腸道注射大鼠的腹部以確認正確的導(dǎo)管放置。

將平均(n=8)血漿濃度(pmol/l)確定為時間的函數(shù)。將從時間30至180 (min)的血漿暴露(pmol/l)相比于時間曲線的AUC進行劑量校正，即除以給藥溶液中衍生物的量(劑量)(pmol)。如此劑量校正的從時間30-180 min的血漿暴露的AUC(具有單位min x pM / pmol = min/L)用作生物利用度的替代量度 – 關(guān)于它們在大鼠模型中的吸收對衍生物排序的量度。

盡管本發(fā)明的某些特征已經(jīng)在本文中進行了說明和描述，但是許多修改、替換、改變和等同物現(xiàn)在對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是想到的。因此，應(yīng)當理解，所附權(quán)利要求旨在覆蓋落在本發(fā)明的真實精神內(nèi)的所有此類修改和改變。