本發(fā)明屬于植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒及其方法，特別涉及一種南瓜花葉病毒的成套引物、實時熒光RT-PCR檢測試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)：

南瓜花葉病毒(Squash mosaic virus，SqMV)是葫蘆科作物上一種重要的種傳病毒，屬于小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、豇豆花葉病毒亞科(Comoviridae)、豇豆花葉病毒屬(Comovirus)的一個成員。該病毒主要侵染葫蘆科(Cucurbitaceae)的南瓜(Cucurbita moschata)和甜瓜(Cucumis melo)，也侵染西瓜(Citrullus lanatus)、黃瓜(Cucumis sativus)、筍瓜(Cucurbita maxima)、西葫蘆(Cucurbita pepo)等作物，另外還侵染灰菜(Chenopodium album)等藜屬植物。在自然界通過葉甲以非持久性方式傳播，種子傳播，以及機械摩擦傳播。在黃瓜、甜瓜、西葫蘆、哈密瓜等葫蘆科植物上引起較為嚴(yán)重的系統(tǒng)侵染癥狀，包括葉面黃斑或深淺相間斑駁花葉、莖蔓和頂葉扭縮、果實出現(xiàn)褪綠斑等癥狀。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒的成套引物。

本發(fā)明的檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒的成套引物由引物1、引物2和引物3組成：

所述引物1為序列1所示的單鏈DNA分子；

所述引物2為序列2所示的單鏈DNA分子；

所述引物3為序列3所示的單鏈DNA分子。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒的實時熒光RT-PCR試劑。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒的實時熒光RT-PCR試劑包括上述成套引物。

上述試劑中，所述引物1、所述引物2和所述引物3在所述實時熒光RT-PCR試劑中的終濃度均為10μmol/L。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒的試劑盒。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒的試劑盒包括上述成套引物或上述實時熒光RT-PCR試劑。

本發(fā)明的第四個目的是提供上述成套引物或上述實時熒光RT-PCR試劑或上述試劑盒的新用途。

本發(fā)明提供了上述成套引物或上述實時熒光RT-PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測南瓜花葉病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述成套引物或上述實時熒光RT-PCR試劑或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測南瓜花葉病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述成套引物或上述實時熒光RT-PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測待測樣品是否感染南瓜花葉病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述成套引物或上述實時熒光RT-PCR試劑或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品是否感染南瓜花葉病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述成套引物或上述實時熒光RT-PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述成套引物或上述實時熒光RT-PCR試劑或上述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒的方法。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測病毒是否為南瓜花葉病毒的方法包括如下步驟：

(1)以所述待測病毒的總RNA為模板，采用上述引物1進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到待測cDNA；

(2)以所述待測cDNA作為模板，采用上述引物2和上述引物3進行實時熒光PCR，并根據(jù)實時熒光PCR的擴增曲線圖、熔解溫度和Ct值大小判斷待測病毒是否為南瓜花葉病毒；

若所述實時熒光PCR產(chǎn)生擴增曲線，且熔解溫度為82-86℃，且Ct值為0-35，則所述待測病毒為或候選為南瓜花葉病毒；反之，則所述待測病毒不為或候選不為南瓜花葉病毒。

本發(fā)明的最后一個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測植物是否感染南瓜花葉病毒的方法。

本發(fā)明提供的檢測或輔助檢測待測植物是否感染南瓜花葉病毒的方法包括如下步驟：

(1)以所述待測植物的總RNA為模板，采用上述引物1進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到待測cDNA；

(2)以所述待測cDNA作為模板，采用上述引物2和引物3進行實時熒光PCR，并根據(jù)實時熒光PCR的擴增曲線圖、熔解溫度和Ct值大小判斷待測植物是否感染南瓜花葉病毒；

若所述實時熒光PCR產(chǎn)生擴增曲線，且熔解溫度為82-86℃，且Ct值為0-35，則所述待測植物感染或候選感染南瓜花葉病毒；反之，則所述待測植物不感染或候選不感染南瓜花葉病毒。

上述方法中，

所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為37℃；

所述實時熒光PCR反應(yīng)的退火溫度為58℃。

較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明所提供的南瓜花葉病毒檢測試劑盒其有益效果在于：

1)良好的特異性：本檢測試劑盒不會與同亞科、同屬的其它病毒及健康的葫蘆科寄主植物發(fā)生交叉反應(yīng)。

2)良好的靈敏度：本檢測試劑盒是基于SYBR Green I的實時熒光RT-PCR方法，其靈敏度與普通RT-PCR方法相當(dāng)。

3)良好的廣譜性：不需要探針，只需要兩條引物，可更有效保證其廣譜性。

4)檢測周期短：整個檢測過程可在2～3小時內(nèi)完成。

5)操作簡單、安全：該方法無需凝膠電泳、染色等步驟，檢測結(jié)果在電腦中直接顯示，不僅節(jié)約檢測時間、減少了檢測步驟，而且也減少了有毒有害物質(zhì)對人體和環(huán)境產(chǎn)生危害的風(fēng)險。

本發(fā)明根據(jù)南瓜花葉病毒的外殼蛋白(CP)基因序列設(shè)計引物，經(jīng)實驗篩選，確定了最適合的引物，再經(jīng)一系列的條件優(yōu)化，建立了南瓜花葉病毒檢測試劑盒及其檢測方法，用于南瓜花葉病毒的快速檢測。通過實驗證明：本發(fā)明的用于檢測南瓜花葉病毒的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒及其方法能夠快速準(zhǔn)確判斷樣品中是否含有南瓜花葉病毒，具有操作簡便、檢測周期短、特異、靈敏、廣譜、安全等優(yōu)點。不僅適用于南瓜花葉病毒疫情的實時監(jiān)測與預(yù)警預(yù)報，而且也可以用于植物檢疫部門、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)部門南瓜花葉病毒的檢測。

附圖說明

圖1為南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒的重復(fù)性評價結(jié)果的擴增曲線圖。

圖2為南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒靈敏度檢測結(jié)果的擴增曲線圖。其中，1～8為南瓜花葉病毒10倍系列稀釋的cDNA，即：10^-1～10^-8；9為空白對照。

圖3為南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒靈敏度檢測結(jié)果的熔解曲線圖。其中，1～8為南瓜花葉病毒10倍系列稀釋的cDNA，即：10^-1～10^-8；9為空白對照。

圖4為南瓜花葉病毒普通RT-PCR方法靈敏度檢測結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1～8為南瓜花葉病毒10倍系列稀釋的cDNA，即：10^-1～10^-8；9為空白對照。

圖5為南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒特異性檢測結(jié)果的擴增曲線圖。其中，1.南瓜花葉病毒病葉樣品；2.安弟斯馬鈴薯斑駁病毒病葉樣品；3.蠶豆染色病毒病葉樣品；4.菜豆莢斑駁病毒病葉樣品；5.豇豆花葉病毒病葉樣品；6.蘿卜花葉病毒病葉樣品；7.紅三葉草斑駁病毒病葉樣品；8.南瓜健康葉片樣品；9.甜瓜健康葉片樣品；10.苦瓜健康葉片樣品；11.西瓜健康葉片樣品；12.冬瓜健康葉片樣品；13.黃瓜健康葉片樣品；14.葫蘆健康葉片樣品；15.豌豆健康葉片樣品；16.空白對照。

圖6為南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒特異性檢測結(jié)果的熔解曲線圖。其中，1.南瓜花葉病毒病葉樣品；2.安弟斯馬鈴薯斑駁病毒病葉樣品；3.蠶豆染色病毒病葉樣品；4.菜豆莢斑駁病毒病葉樣品；5.豇豆花葉病毒病葉樣品；6.蘿卜花葉病毒病葉樣品；7.紅三葉草斑駁病毒病葉樣品；8.南瓜健康葉片樣品；9.甜瓜健康葉片樣品；10.苦瓜健康葉片樣品；11.西瓜健康葉片樣品；12.冬瓜健康葉片樣品；13.黃瓜健康葉片樣品；14.葫蘆健康葉片樣品；15.豌豆健康葉片樣品；16.空白對照。

圖7為南瓜花葉病毒普通RT-PCR方法特異性檢測結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，1.南瓜花葉病毒病葉樣品；2.安弟斯馬鈴薯斑駁病毒病葉樣品；3.蠶豆染色病毒病葉樣品4.菜豆莢斑駁病毒病葉樣品；5.豇豆花葉病毒病葉樣品；6.蘿卜花葉病毒病葉樣品；7.紅三葉草斑駁病毒病葉樣品；8.南瓜健康葉片樣品；9.甜瓜健康葉片樣品；10.苦瓜健康葉片樣品；11.西瓜健康葉片樣品；12.冬瓜健康葉片樣品；13.黃瓜健康葉片樣品；14.葫蘆健康葉片樣品；15.豌豆健康葉片樣品；16.空白對照。

圖8為應(yīng)用南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測模擬感病種子及市售種子的擴增曲線圖。其中，1.南瓜花葉病毒病葉樣品；2.模擬感染南瓜花葉病毒的南瓜種子樣品4282；3.市售南瓜種子樣品4284；4.模擬感染南瓜花葉病毒的甜瓜種子樣品4282；5.市售甜瓜種子樣品0856；6.市售苦瓜種子樣品0856；7.市售黃瓜種子樣品4284；8.市售西瓜種子樣品4283；9.空白對照。

圖9為應(yīng)用南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測模擬感病種子及市售種子的熔解曲線圖。其中，1.南瓜花葉病毒病葉樣品；2.模擬感染南瓜花葉病毒的南瓜種子樣品；3.市售南瓜種子樣品4284；4.模擬感染南瓜花葉病毒的甜瓜種子樣品；5.市售甜瓜種子樣品0856；6.市售苦瓜種子樣品0856；7.市售黃瓜種子樣品4284；8.市售西瓜種子樣品4283；9.空白對照。

圖10為南瓜花葉病毒特異性PCR引物的篩選檢測。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

安弟斯馬鈴薯斑駁病毒：德國生物資源保藏中心(DSMZ)，保藏編號為PV-0057。

菜豆莢斑駁病毒：AC Diagnostics,Inc.公司產(chǎn)品，編號為V082-PV。

菜豆莢斑駁病毒：Agdia,Inc.公司產(chǎn)品，編號為LPC 46400(C1858)。

蠶豆染色病毒：Loewe Biochemica GmbH公司產(chǎn)品，編號為07013PC

紅三葉草斑駁病毒：Loewe Biochemica GmbH公司產(chǎn)品，編號為07040PC。

豇豆花葉病毒：Agdia,Inc.公司產(chǎn)品，編號為LPC 24200(C1319)。

蘿卜花葉病毒：德國生物資源保藏中心(DSMZ)，保藏編號為PV-0355。

南瓜花葉病毒：Agdia,Inc.公司產(chǎn)品，編號為LPC 26400(C2013)。

5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液：Promega Corporation公司產(chǎn)品，其目錄號為M1705。

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶：Promega Corporation公司產(chǎn)品，其目錄號為M1705。

RNA酶抑制劑：Promega Corporation公司產(chǎn)品，其目錄號為N2111。

PCR緩沖液：北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其目錄號為AP111-03。

Taq DNA聚合酶：北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其目錄號為AP111-03。

2×實時熒光PCR反應(yīng)混合液：寶生物工程(大連)有限公司，其目錄號為DRR820。

50×ROX Reference Dye II：寶生物工程(大連)有限公司，其目錄號為DRR820。

實施例1、南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒及其檢測方法

一、檢測南瓜花葉病毒的引物的篩選

1、RNA的提取

提取含有南瓜花葉病毒病葉(Agdia LPC 26400)樣品的總RNA。

2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

在0.6μL離心管中，加入4μL的待測樣品總RNA樣品，2μL的濃度為10μmol/L的引物SqM2，12μL的無RNA酶ddH₂O，于95℃水浴10min后，迅速置于冰上5min，然后繼續(xù)加入5μL的5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，1μL的濃度為10mmol/L的dNTPs，0.5μL的濃度為200U/μL的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，0.5μL的濃度為40U/μL的RNA酶抑制劑，于37℃水浴1h，然后自然冷卻至室溫，即為合成的cDNA模板。

3、PCR擴增

以步驟2獲得的cDNA為模板，按照引物的不同分為如下3組進行PCR反應(yīng)，各反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如(1)-(3)所示。引物序列如表2所示。

(1)引物對SqMV-3F/SqMV-3R

反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL、濃度為10mmol/L的dNTPs 0.5μL、濃度為10μmol/L的引物SqMV-3F 1.5μL、濃度為10μmol/L的引物SqMV-3R 1.5μL、Easy Taq DNA聚合酶0.5μL、cDNA模板3.0μL、ddH₂O 15.5μL，共25μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。

將退火溫度分別替換為52℃、54℃、56℃、60℃、62℃，其他步驟不變進行普通PCR反應(yīng)。

(2)引物對SqMV-2F/SqMV-3R

反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL、濃度為10mmol/L的dNTPs 0.5μL、濃度為10μmol/L的引物SqMV-2F 1.5μL、濃度為10μmol/L的引物SqMV-3R 1.5μL、Easy Taq DNA聚合酶0.5μL、cDNA模板3.0μL、ddH₂O 15.5μL，共25μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。

將退火溫度分別替換為52℃、54℃、56℃、60℃、62℃，其他步驟不變進行普通PCR反應(yīng)。

(3)引物對SqMV-3F/SqMV-2R

反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL、濃度為10mmol/L的dNTPs 0.5μL、濃度為10μmol/L的引物SqMV-3F 1.5μL、濃度為10μmol/L的引物SqMV-2R 1.5μL、Easy Taq DNA聚合酶0.5μL、cDNA模板3.0μL、ddH₂O 15.5μL，共25μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。

將退火溫度分別替換為52℃、54℃、56℃、60℃、62℃，其他步驟不變進行普通PCR反應(yīng)。

表2、用于擴增SqMV的引物序列

檢測結(jié)果如圖10所示，引物對SqMV-3F/SqMV-3R和引物對SqMV-2F/SqMV-3R的非特異性擴增條帶比較多；而引物對SqMV-3F/SqMV-2R沒有非特異性條帶，且特異性擴增的效率較高。因此選取引物對SqMV-3F/SqMV-2R用來檢測南瓜花葉病毒。

二、南瓜花葉病毒檢測試劑盒

1、檢測南瓜花葉病毒的引物

檢測南瓜花葉病毒的引物由SqM2、SqMV-3F和SqMV-2R組成。各個引物序列如下所示：

SqM2：5′-GAAGCCACAACAAAACCCAGA-3′(序列1)；

SqMV-3F：5′-TTTGCTGAAATTCAGGGGCG-3′(序列2)；

SqMV-2R：5′-TAAGTTCCAAGCTGCTGTACCAT-3′(序列3)。

2、南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒的配置

南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒的配置(50次檢測量)：

1)濃度為10μmol/L的反轉(zhuǎn)錄引物SqM2：1管(120μL)；

2)5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液：1管(250μL)；

3)濃度為10mmol/L的dNTPs：1管(100μL)；

4)濃度為200U/μL的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶：，1管(30μL)；

5)濃度為40U/μL的RNA酶抑制劑：，1管(30μL)；

6)無RNA酶ddH₂O，1管(1mL)；

7)2×實時熒光PCR反應(yīng)混合液：1管(550μL)；

8)50×ROX Reference Dye II：1管(25μL)；

9)濃度為10μmol/L的引物SqMV-3F：1管(45μL)；

10)濃度為10μmol/L的引物SqMV-2R：1管(45μL)；

11)南瓜花葉病毒陽性對照樣品，1管(0.1g)。

三、南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測方法

上述南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒的檢測方法的具體步驟如下：

1、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

在0.6μL離心管中，加入4μL的待測樣品總RNA樣品，2μL的濃度為10μmol/L的引物SqM2，12μL的無RNA酶ddH₂O，于95℃水浴10min后，迅速置于冰上5min，然后繼續(xù)加入5μL的5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，1μL的濃度為10mmol/L的dNTPs，0.5μL的濃度為200U/μL的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，0.5μL的濃度為40U/μL的RNA酶抑制劑，于37℃水浴1h，然后自然冷卻至室溫，即為合成的cDNA模板。

2、實時熒光PCR反應(yīng)

以步驟1獲得的cDNA為模板，采用SqMV-3F/SqMV-2R進行實時熒光PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：步驟1合成的cDNA 2.0μL，2×實時熒光PCR反應(yīng)混合液10.0μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4μL，引物SqMV-3F(10μmol/L)0.8μL，引物SqMV-2R(10μmol/L)0.8μL，無RNA酶ddH₂O 6.0μL?；靹蚝蟀凑找韵聴l件下反應(yīng)：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s、58℃退火30s、72℃延伸35s，共40個循環(huán)。

3、結(jié)果判定

反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線和熔解曲線判定結(jié)果，若待測樣品產(chǎn)生擴增曲線，且熔解溫度為82-86℃，且Ct值為0-35，則說明該待測樣品中含有或候選含有南瓜花葉病毒；反之，則不含有或候選不含有南瓜花葉病毒。

實施例2、南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒的驗證

一、南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒的驗證

1、提取含有南瓜花葉病毒病葉(Agdia LPC 26400)樣品的總RNA。

2、按照實施例1的步驟三中的1的方法合成cDNA模板，并把合成的cDNA模板稀釋10^-2、10^-4、10^-6倍的南瓜花葉病毒cDNA樣品，再按照實施例1中的試劑盒及檢測方法分別對不同濃度的cDNA樣品進行檢測。每個樣品重復(fù)檢測三次，計算Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

結(jié)果如表1和圖1所示。隨著樣品稀釋倍數(shù)的降低，Ct值增大且具有良好重現(xiàn)性，其變異系數(shù)分別為7.091％、1.220％、1.634％，說明本發(fā)明的南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

表1、檢測試劑盒的重復(fù)性實驗結(jié)果

實施例3、南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒的靈敏度檢測

一、本發(fā)明的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測

1、提取含有南瓜花葉病毒病葉(Agdia LPC 26400)樣品的總RNA。

2、按照實施例1的步驟三中的1的方法合成cDNA模板，并把合成的cDNA模板進行10倍系列稀釋成10^-1～10^-8共8個梯度濃度的cDNA模板，再按照實施例1中的試劑盒及檢測方法分別對8個梯度濃度的cDNA模板進行檢測，驗證試劑盒的靈敏度。每個樣品重復(fù)檢測三次。

二、普通方法檢測

利用普通PCR方法檢測步驟一中的不同濃度梯度(10^-1～10^-8)的cDNA模板。具體步驟如下：分別以8個梯度濃度的cDNA為模板，采用SqM1(SqM1引物序列：5′-CATGGTACAGCAGCTTGGAAC-3′)和SqM2進行PCR擴增。

普通PCR的反應(yīng)體系為：10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL、濃度為10mmol/L的dNTPs0.5μL、濃度為10μmol/L的引物SqM1 1.5μL、濃度為10μmol/L的引物SqM2 1.5μL、Easy Taq DNA聚合酶0.5μL、cDNA模板3.0μL、ddH₂O 15.5μL，共25μL。反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min，然后94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5μL的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，染色后，觀察、拍照。

實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果如圖2和圖3所示，普通RT-PCR檢測結(jié)果如圖4所示。檢測結(jié)果表明，普通RT-PCR方法檢測到10^-6稀釋倍數(shù)的南瓜花葉病毒cDNA，而本發(fā)明的南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒也能夠檢測到10^-6稀釋倍數(shù)的南瓜花葉病毒cDNA。因此，本發(fā)明的南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒與普通檢測方法的檢測結(jié)果無顯著性差異，說明本發(fā)明的南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒具有良好的檢測靈敏度。

實施例4、南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒的特異性檢測

一、本發(fā)明的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒檢測

1、分別提取南瓜花葉病毒病葉樣品、安弟斯馬鈴薯斑駁病毒病葉樣品、蠶豆染色病毒病葉樣品、菜豆莢斑駁病毒病葉樣品、豇豆花葉病毒病葉樣品、蘿卜花葉病毒病葉樣品、紅三葉草斑駁病毒病葉樣品、南瓜健康葉片樣品、甜瓜健康葉片樣品、苦瓜健康葉片樣品、西瓜健康葉片樣品、冬瓜健康葉片樣品、黃瓜健康葉片樣品、葫蘆健康葉片樣品、豌豆健康葉片樣品的總RNA。

2、利用實施例1中的試劑盒和檢測方法對步驟1中的各個樣品的RNA進行實時熒光RT-PCR檢測；驗證試劑盒的特異性。每個樣品重復(fù)檢測三次。

二、普通方法檢測

同實施例3中的步驟二。

實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果如圖5和圖6所示，普通RT-PCR檢測結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，普通RT-PCR檢測只有陽性樣品出現(xiàn)特異性擴增條帶(圖7)，而實時熒光RT-PCR所有樣品均檢測到熒光信號(圖5)，但熔解曲線顯示只有陽性樣品出現(xiàn)特異性熔解曲線，熔解溫度為82-86℃(圖6)，說明本發(fā)明的南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒與普通RT-PCR方法一樣具有良好的特異性。

實施例5、南瓜花葉病毒實時熒光RT-PCR檢測試劑盒在檢測待測種子是否感染南瓜花葉病毒中的應(yīng)用

1、分別提取南瓜花葉病毒病葉樣品、模擬感染南瓜花葉病毒的南瓜種子樣品4282、市售南瓜種子樣品4284、模擬感染南瓜花葉病毒的甜瓜種子樣品、市售甜瓜種子樣品0856、市售苦瓜種子樣品0856、市售黃瓜種子樣品4284、市售西瓜種子樣品4283的總RNA。

2、利用實施例1中的試劑盒和檢測方法對步驟1中的各個種子樣品的RNA進行檢測。

檢測結(jié)果顯示，所有檢測樣品均產(chǎn)生擴增曲線(圖8)，但熔解曲線顯示，只有南瓜花葉病毒病葉樣品、模擬感染南瓜花葉病毒的南瓜種子和模擬感染南瓜花葉病毒的甜瓜種子的熔解溫度在82℃～86℃之間，顯示出陽性的結(jié)果，而其它市售種子未在該區(qū)域出現(xiàn)熔解曲線(圖9)。說明本發(fā)明的檢測試劑盒可以用于檢測待測種子是否感染南瓜花葉病毒。