本發(fā)明涉及類球紅細(xì)菌(Rhodobacter sphaeroides)輔酶Q10的生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其涉及類球紅細(xì)菌菌株及其制備方法和利用其生產(chǎn)類球紅細(xì)菌輔酶Q10的方法。
背景技術(shù)：
輔酶Q10(Coenzyme Q10)是自然界存在的一種脂溶性醌類化合物，其結(jié)構(gòu)是醌類衍生物與多個(gè)異戊烯單體合成而來，只是不同來源的輔酶Q10其側(cè)鏈異戊烯單位的數(shù)目不同，人類和哺乳動(dòng)物是10個(gè)異戊烯單位。輔酶Q10作為生物細(xì)胞呼吸鏈中的重要遞氫體，參與細(xì)胞的能量代謝。在人類體細(xì)胞內(nèi)參與能量制造及活化，是預(yù)防動(dòng)脈硬化形成最有效的抗氧化成份。除此之外，輔酶Q10在抗腫瘤、抗衰老作用和治療胃腸道、肝、心臟疾病及提高免疫系統(tǒng)功能等方面具有重要的作用，在治療壞血病、十二指腸潰瘍、壞死性牙周炎以及促進(jìn)胰腺功能和分泌等方面也有顯著效果，其臨床應(yīng)用價(jià)值極高。
輔酶Q10存在于野生植物、動(dòng)物體內(nèi)，目前輔酶Q10的生產(chǎn)方法有動(dòng)植物組織提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。提取法和化學(xué)合成法存在原料來源少、過程復(fù)雜且產(chǎn)量低的問題，微生物發(fā)酵法具有來源廣泛、產(chǎn)物活性好和產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為輔酶Q10工業(yè)生產(chǎn)的主要方法。產(chǎn)輔酶Q10的微生物種類較多，其中，屬于光合細(xì)菌的類球紅細(xì)菌目前工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)輔酶Q10的重要菌株，因?yàn)槠浒麅?nèi)合成輔酶Q10含量較高，提取步驟相對(duì)簡單。然而，目前制約微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10的主要因素在于菌種遺傳特性和發(fā)酵調(diào)控復(fù)雜所造成的產(chǎn)品得率不高。
利用代謝工程手段對(duì)類球紅細(xì)菌輔酶Q10的生物合成途徑進(jìn)行遺傳修飾和改造，可以提高類球紅細(xì)菌輔酶Q10的產(chǎn)量。中國專利申請(qǐng)CN105441371 A公開了一種代謝工程的方法改造類球紅細(xì)菌及其在生產(chǎn)輔酶Q10中的應(yīng)用。將輔酶Q10生物合成途徑中的限速酶基因UbiE，UbiG，UbiF轉(zhuǎn)化至類球紅細(xì)菌基因組中，利用這三個(gè)基因串聯(lián)過表達(dá)來強(qiáng)化其自身的輔酶Q10合成能力，經(jīng)改造的工程菌輔酶Q10產(chǎn)量明顯提高。中國專利申請(qǐng)CN 103509729 A利用強(qiáng)化類球紅細(xì)菌胞內(nèi)MEP途徑中聚十異戊烯焦磷酸合成的關(guān)鍵基因DXS和DDS，從而增加了工程菌輔酶Q10的產(chǎn)量。目前尚沒有通過改造分支酸途徑即醌環(huán)合成過程強(qiáng)化類球紅細(xì)菌輔酶Q10產(chǎn)量的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本申請(qǐng)的發(fā)明人對(duì)于類球紅細(xì)菌胞內(nèi)合成輔酶Q10的途徑進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)類球紅細(xì)菌胞內(nèi)合成輔酶Q10的途徑主要包括異戊二烯焦磷酸合成(甲羥戊酸途徑)、聚十異戊二烯焦磷酸合成(MEP途徑)和醌環(huán)合成及修飾(分支酸途徑)等過程。其中醌環(huán)合成及修飾是輔酶Q10的關(guān)鍵限速步驟，而對(duì)羥基苯甲酸(pHBA)是醌環(huán)合成過程的重要中間產(chǎn)物，直接影響了輔酶Q10合成量，細(xì)胞自身合成對(duì)羥基苯甲酸的能力是有限的，通過強(qiáng)化細(xì)胞從胞外攝取對(duì)羥基苯甲酸的能力，可提高類球紅細(xì)菌合成輔酶Q10的產(chǎn)量。此外，雖然許多物種中具有對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(pcaK)基因，但是并非所有物種的該基因均能夠在不同物種內(nèi)有效或以高水平發(fā)揮功能。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)從乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)中克隆得到對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(pcaK)基因，通過細(xì)菌結(jié)合的方法，將對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在類球紅細(xì)菌胞內(nèi)表達(dá)，增加對(duì)羥基苯甲酸的攝取量，進(jìn)而強(qiáng)化類球紅細(xì)菌生產(chǎn)輔酶Q10的能力。
具體地，本發(fā)明提供以下內(nèi)容。
在本發(fā)明的一方面，提供一種類球紅細(xì)菌菌株，其包含來自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK基因。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述類球紅細(xì)菌菌株中，對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，類球紅細(xì)菌菌株過表達(dá)具有活性的對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK。
在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述類球紅細(xì)菌菌株從胞外攝取對(duì)羥基苯甲酸的能力得到強(qiáng)化。
在另外優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述類球紅細(xì)菌菌株胞內(nèi)合成輔酶Q10的產(chǎn)量得到提高。
本發(fā)明的另一方面，提供一種類球紅細(xì)菌菌株的制備方法，其包括將SEQ ID NO:1所示的序列引入所述類球紅細(xì)菌菌株，從而使所述類球紅細(xì)菌菌株過表達(dá)具有活性的對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK。
優(yōu)選地，類球紅細(xì)菌菌株的制備方法包括以下步驟：
(1)構(gòu)建pBBR1MCS-2-pcaK重組質(zhì)粒的步驟，其包括從乙酸鈣不動(dòng)桿菌的基因組中克隆得到SEQ ID NO:1所示的序列，其中克隆時(shí)采用的引物對(duì)分別如SEQ ID NO:2和3所示；
(2)用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1的步驟；
(3)接合轉(zhuǎn)化所述重組質(zhì)粒至所述類球紅細(xì)菌菌株的步驟。
本發(fā)明的其他方面，提供一種改造類球紅細(xì)菌菌株的分支酸途徑的方法，其包括將SEQ ID NO:1所示的序列引入所述類球紅細(xì)菌菌株的步驟。
本發(fā)明的再一方面，提供一種強(qiáng)化類球紅細(xì)菌輔酶Q10產(chǎn)量的方法，其包括用來自乙酸鈣不動(dòng)桿菌的對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK基因來改造分支酸途徑的步驟。
本發(fā)明的又一方面，提供一種生產(chǎn)類球紅細(xì)菌輔酶Q10的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明中所述的類球紅細(xì)菌菌株的步驟。
本發(fā)明解決了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)輔酶Q10產(chǎn)量較低且生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)。此外，本發(fā)明可以顯著提高類球紅細(xì)菌胞內(nèi)合成輔酶Q10的產(chǎn)量，降低了工業(yè)化生產(chǎn)輔酶Q10的成本。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
除非特別聲明，否則本發(fā)明的“％”表示重量百分比wt％。本發(fā)明中所述的術(shù)語具有本領(lǐng)域內(nèi)通常理解的含義，除非在本發(fā)明中明確說明。本發(fā)明中所述的細(xì)胞培養(yǎng)、接合轉(zhuǎn)化、基因工程手段等均為本領(lǐng)域內(nèi)通過采用的手段，具體可參見例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第4版)，美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，科學(xué)出版社原版引進(jìn)；《細(xì)胞培養(yǎng)》司徒鎮(zhèn)強(qiáng)、吳軍正，世界圖書出版等。
本發(fā)明中，“對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK基因”是指能夠編碼具有活性的對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK的全長基因或其功能片段或者它們的人工改造形式。本發(fā)明中，所述“人工改造”包括，但不局限于一個(gè)以上核酸的插入、缺失、置換、替換等的基因突變或基因誘變?！叭斯じ脑臁笨砂l(fā)生在基因的3’端、5’端和基因內(nèi)部的任何位置中的至少一處，只要上述“人工改造”沒有降低、減少或喪失基因編碼具有活性的對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK的功能即可。優(yōu)選地，本發(fā)明中所述的對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK基因可為全長基因。例如，SEQ ID NO：1所示的基因。
本發(fā)明中，“具有活性”是指能夠使對(duì)羥基苯甲酸從胞外攝取、吸收、進(jìn)入至胞內(nèi)的功能?！熬哂谢钚缘膶?duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK”包括全長蛋白質(zhì)、其功能性片段或在天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)性改造的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，優(yōu)選通過對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白pcaK基因在菌株內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)化從胞外攝取對(duì)羥基苯甲酸的能力，進(jìn)一步優(yōu)選能夠提高類球紅細(xì)菌菌株胞內(nèi)合成輔酶Q10的產(chǎn)量。本發(fā)明中，攝取能力的“強(qiáng)化”是指細(xì)胞攝取量的提高，包括單個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)效率的提高和/或細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量的增加。本發(fā)明中，優(yōu)選地所述“強(qiáng)化”不僅僅包括細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量的增加，更重要的是單個(gè)轉(zhuǎn)動(dòng)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)效率的提高。
本發(fā)明中，優(yōu)選地，從乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)基因組克隆對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(pcaK)基因。優(yōu)選地包括提取乙酸鈣不動(dòng)桿菌的基因組，通過PCR方法克隆pcaK基因。優(yōu)選地，PCR引物對(duì)中可包含酶切位點(diǎn)。酶切位點(diǎn)通常需要根據(jù)質(zhì)粒載體中已有酶切位點(diǎn)而適當(dāng)選擇。本發(fā)明中，優(yōu)選選用例如，EcoRI酶切位點(diǎn)、BamHI酶切位點(diǎn)。特別優(yōu)選地，本發(fā)明中使用引物pcaK-F(EcoRI酶切位點(diǎn))和pcaK-R(BamHI酶切位點(diǎn))，它們的序列分別為SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3。
本發(fā)明中，用于連接基因的載體可優(yōu)選質(zhì)粒。作為質(zhì)?？墒褂萌魏维F(xiàn)有或在現(xiàn)有質(zhì)粒基礎(chǔ)上改造的質(zhì)?；蛸|(zhì)粒類載體。然而，本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)在選用質(zhì)粒pBBR1MCS-2時(shí)具有更加良好的轉(zhuǎn)化效果。
本發(fā)明中，將基因與載體連接的方法可包括：
1)用EcoRI酶和BamHI酶分別，或者用兩者同時(shí)切割基因；
2)用EcoRI酶和BamHI酶分別，或者用兩者同時(shí)切割載體或質(zhì)粒；
3)用連接酶將切割后的基因和載體或質(zhì)粒連接。
需要說明的是，對(duì)于上述步驟1)和2)的順序沒有特別限定，可優(yōu)先進(jìn)行步驟1)，然后再進(jìn)行步驟2)，反之亦可?？蛇x地，可同時(shí)進(jìn)行步驟1)和2)。對(duì)于步驟3)，優(yōu)選使用T4DNA連接酶。連接反應(yīng)的條件優(yōu)選：溫度在10～20℃之間，優(yōu)選16℃；反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選1至24小時(shí)，更優(yōu)選3～8小時(shí)，例如3小時(shí)。
本發(fā)明中，將質(zhì)粒或基因?qū)牍w菌。作為質(zhì)?；蚧?qū)氲姆椒?，可采用本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的方法，包括但不局限于電激法、基因槍法、微注射法等方法。在選用質(zhì)粒pBBR1MCS-2的情況下，優(yōu)選采用熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明中，作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的重組子的驗(yàn)證，可采用本領(lǐng)域內(nèi)通常使用的任何方法，包括但不限于，PCR擴(kuò)增驗(yàn)證法、酶切驗(yàn)證法、免疫驗(yàn)證法以及酶活性驗(yàn)證法等。從驗(yàn)證準(zhǔn)確性角度，優(yōu)選測序驗(yàn)證法。具體地，在轉(zhuǎn)化后通過抗性篩選出陽性重組子，提取質(zhì)粒，并測序質(zhì)?；蛐蛄衼磉M(jìn)行驗(yàn)證。
本發(fā)明中，優(yōu)選通過接合轉(zhuǎn)化的方法將基因引入類球紅細(xì)菌。優(yōu)選地，通過使用大腸桿菌(例如，E.coli S17-1)作為供體菌與作為受體菌的類球紅細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)化來進(jìn)行導(dǎo)入，其具有導(dǎo)入效率高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明中，供體菌和受體菌的混合比例可為1:2至1:50，優(yōu)選1:2.5至1:25，更優(yōu)選1:3至1:20，進(jìn)一步優(yōu)選1:4至1:15，更進(jìn)一步優(yōu)選1:6至1:10。例如，1:3、1:6、1:10等。
本發(fā)明中，供體菌和受體菌的培養(yǎng)優(yōu)選在同一種培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選LB培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)基的形式，可采用液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基等。本發(fā)明中，優(yōu)選液體培養(yǎng)基。另外，作為培養(yǎng)方式并不限定，可采用間歇培養(yǎng)方式(分批培養(yǎng)方式)、連續(xù)培養(yǎng)方式、搖瓶培養(yǎng)方式等。
本發(fā)明中，類球紅細(xì)菌優(yōu)選用接合專用培養(yǎng)基(溶液1)進(jìn)行培養(yǎng)或接合，其成分、含量或性質(zhì)如下：
每升培養(yǎng)基含有2.0g琥珀酸，0.8g(NH4)2SO4，0.10g谷氨酸鈉，0.04g天冬氨酸，1.0mg尼克酸，0.50mg維生素B1，0.010mg生物素，2.44g MgCl2·6H2O或3.0gMgSO4·7H2O，0.344g CaCl2·H2O，0.02g FeSO4·7H2O，0.2ml(NH4)6MO7O24(1％Solution)，pH調(diào)至4.5～4.9。
本發(fā)明中，對(duì)于供體菌，其對(duì)數(shù)生長期的濃度為OD600＝0.4～0.6)；對(duì)于受體菌，其對(duì)數(shù)生長期的濃度為OD600:0.3～0.6。對(duì)于供體菌和/或受體菌的培養(yǎng)溫度通常為32℃至38℃，優(yōu)選35℃至36℃，更優(yōu)選37℃。
本發(fā)明的類球紅細(xì)菌菌株可通過低溫例如液氮低溫保藏。在使用時(shí)，例如在生產(chǎn)類球紅細(xì)菌輔酶Q10時(shí)活化保藏的菌株。本發(fā)明的生產(chǎn)類球紅細(xì)菌輔酶Q10的方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的類球紅細(xì)菌菌株的步驟。其中，所述培養(yǎng)可以直接采用活化狀態(tài)的菌株，也可由保藏狀態(tài)的菌株活化而來。在生產(chǎn)類球紅細(xì)菌輔酶Q10的方法中，優(yōu)選在培養(yǎng)基中加入對(duì)羥基苯甲酸，其濃度范圍優(yōu)選0.1至2.0mol/L，更優(yōu)選0.2至1.8mol/L，進(jìn)一步優(yōu)選0.3至1.5mol/L，最優(yōu)選0.5至1mol/L。
本發(fā)明中，優(yōu)選進(jìn)一步收集類球紅細(xì)菌菌株，例如，可通過以下步驟來進(jìn)行：7000～9000rpm離心，收集菌體，用濃度為15～25mM，pH＝6.5～7的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，再次離心收集菌體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，以8000rpm離心，收集菌體，用20mM，pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，再次離心收集菌體。
實(shí)施例
1.菌種與實(shí)驗(yàn)材料
本實(shí)施例中的所有菌種及材料均通過市場購賣得到。例如，類球紅細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides 2.4.1購自ATCC(菌種編號(hào)ATCC-17023)，乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)購自ATCC(菌種編號(hào)ATCC-31926)。質(zhì)粒、基因組提取試劑盒購自TIANGEN公司。PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自美國Omega公司。T4連接酶購自美國NEB公司?；瘜W(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。
2.pBBR1MCS-2-pcaK載體的構(gòu)建：
從乙酸鈣不動(dòng)桿菌的基因組中克隆得到對(duì)羥基苯甲酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(pcaK)基因：
將乙酸鈣不動(dòng)桿菌接種在含LB培養(yǎng)基的50mL三角瓶中過夜培養(yǎng)8h，離心收集菌體，使用基因組提取試劑盒(TIANGEN公司，北京)提取乙酸鈣不動(dòng)桿菌的基因組；用引物pcaK-F(EcoRI酶切位點(diǎn))(SEQ ID NO:2)和pcaK-R(BamHI酶切位點(diǎn))(SEQ ID NO:3)從乙酸鈣不動(dòng)桿菌的基因組中克隆得到pcaK基因(SEQ ID NO:1)。PCR的條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)。
使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(Omega公司，美國)將克隆得到的pcaK基因回收，用EcoRI和BamHI分別雙酶切pcaK基因和質(zhì)粒pBBR1MCS-2，酶切后用T4連接酶(美國NEB公司)16℃連接3h，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1細(xì)胞，在含有濃度為50mg/ml卡納霉素抗性的LB平板上進(jìn)行篩選，將具有Kan抗性的菌株挑選出來培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN公司，北京)提取陽性克隆質(zhì)粒pBBR1MCS-2備用。
pBBR1MCS-2-pcak轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli S17-1(供體菌)：
從-80℃冰箱取1管大腸桿菌S17-1感受態(tài)，冰浴20min后加入0.5μl重組質(zhì)粒pBBR1MCS-2-pcaK，再次共同冰浴10min，42℃熱激60s，再次冰浴10min，加入650μl LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)45min后5000r/min離心5min，棄300μl上清液，將剩余液體涂布到50mg/ml Kan抗性平板上，挑取能夠生長的陽性重組子，提取質(zhì)粒測序驗(yàn)證。
接合轉(zhuǎn)化pBBR1MCS-2-pcaK至類球紅細(xì)菌(受體菌)：
(1)類球紅細(xì)菌2.4.1購自ATCC(菌種編號(hào)ATCC17023)，供體菌S17-1(含質(zhì)粒pBBR1MCS-2-pcaK)在含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中37℃搖瓶過夜培養(yǎng)，次日以1:10的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至新鮮的LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約1～2h左右，保證供體菌完全達(dá)到對(duì)數(shù)生長期(OD600:0.4～0.6)；
(2)受體菌類球紅細(xì)菌在LB液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)而后轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直至受體菌完全處于對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)(OD600:0.3～0.6)。分別取2～5μl的菌于無菌EP管中，8000rpm離心3～5min，然后用新鮮的LB培養(yǎng)基洗滌2次，后用供體菌和受體菌分別取50μl及100μl LB培養(yǎng)基稀釋重懸。供體菌和受體菌混合比例為1:3、1:6、1:10；
(3)將混勻的菌涂布到固體無抗性LB平板上，預(yù)培養(yǎng)20～24h，將平板上的菌用預(yù)冷的1ml溶液1(細(xì)菌接合培養(yǎng)基)培養(yǎng)基洗脫至EP管中；
(4)4℃、8000rpm離心2min，棄上清液，加入500μl冰預(yù)的溶液1培養(yǎng)基，吹吸混勻，重復(fù)步驟洗滌1次；
(5)用0.1ml的溶液1重懸細(xì)菌后涂布在含有終濃度為200mg/L K2TeO3和50mg/ml Kan抗性的溶液1平板上，32℃培養(yǎng)3～5d長出黑色接合子，即為pcaK重組類球紅細(xì)菌。
(溶液1的成分：每升培養(yǎng)基含有2.0g琥珀酸，0.8g(NH4)2SO4，0.10g谷氨酸鈉，0.04g天冬氨酸，1.0mg尼克酸，0.50mg維生素B1，0.010mg生物素，2.44g MgCl2·6H2O或3.0gMgSO4·7H2O，0.344g CaCl2·H2O，0.02g FeSO4·7H2O，0.2ml(NH4)6MO7O24(1％Solution)，pH調(diào)至4.5～4.9)
pcaK重組類球紅細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)：
使用質(zhì)粒提取試劑盒(TIANGEN公司，北京)提取類球紅細(xì)菌陽性克隆胞內(nèi)的質(zhì)粒，測序驗(yàn)證陽性克隆，得到多株pcaK重組菌株。隨機(jī)取其中兩株作為本發(fā)明的重組菌株進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。
將本發(fā)明的重組菌株從保種管中取500μl至25ml的LB種子培養(yǎng)基，32℃，220rpm培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)后的菌液按20％接種量轉(zhuǎn)接至含有45ml的類球紅細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基，32℃，220rpm培養(yǎng)培養(yǎng)48h。
類球紅細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分為每1升培養(yǎng)基含有：葡萄糖7g，蛋白胨3.2g，谷氨酸鈉1.2g，NH4Cl 3.8g，F(xiàn)eCl30.25g/L，MgSO46g/L，玉米漿1.2g，Na2HPO41.8g，NaH2PO42g，ZnCl20.0015g，KCl2.4g，CuSO40.06g，Ca(HCO3)27.2g，鹽酸硫胺20g，核黃素3g，葉酸1g，煙酸胺25g。通過外加不同濃度的對(duì)羥基苯甲酸來檢測重組類球紅細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)羥基苯甲酸和合成輔酶Q10的能力。
輔酶Q10的提取與分析：
取1ml發(fā)酵培養(yǎng)液，加入200μl的6mol/L的鹽酸，震蕩混勻；加入2ml丙酮，震蕩混勻；加入100μl的30％過氧化氫，震蕩混勻；用無水乙醇定容至10mL，震蕩混勻；充分混勻后超聲提取45min(全過程溫度控制在30℃以下)將超聲后的溶液搖勻，靜置10min，取上層有機(jī)相經(jīng)0.22μm的有機(jī)微孔濾膜過濾除去細(xì)菌碎片，用高效液相HPLC分析。HPLC的分析條件為：液相分析儀器為Thermo公司的高效液相色譜儀DAD3000，色譜柱型號(hào):SunFireTM，C18反相柱(4.6×150mm，1.7μm)，流動(dòng)相為甲醇：乙醇＝3:7，柱溫箱30℃流速1ml/min，檢測波長275nm，進(jìn)樣量10μl。
表1pcaK重組菌株與原始菌株的比較
表1顯示原始菌株和經(jīng)過pcaK重組改造的菌株在不同濃度的對(duì)羥基苯甲酸存在條件下輔酶Q10的產(chǎn)量，從結(jié)果可以看出原始菌株添加對(duì)羥基苯甲酸并不能增加輔酶Q10的產(chǎn)量，而pcaK重組菌株在外加對(duì)羥基苯甲酸的條件下輔酶Q10的產(chǎn)量增加了8.5％～12.6％，說明pcaK重組類球紅細(xì)菌可以利用對(duì)羥基苯甲酸從而增加輔酶Q10的產(chǎn)量。而當(dāng)對(duì)羥基苯甲酸的添加量過大(2mol/L)，反而會(huì)抑制輔酶Q10的合成以及菌體的正常代謝生長。
本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式，在不背離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的任何變形、改進(jìn)、替換均落入本發(fā)明的范圍。