相關(guān)申請的交叉參考本申請要求于2009年2月13日遞交的美國臨時申請No.61/207,684的優(yōu)先權(quán)，其為所有目的以參閱的方式并入于此。
背景技術(shù)：
：脫落酸(ABA)自從二十世紀(jì)六十年代被證實作為內(nèi)源小分子生長抑制劑和植物逆境(stressphysiology)生理調(diào)節(jié)劑之后，一直以來都是深入研究的熱點(K.Ohkuma,J.L.Lyon,F.T.Addicott,O.E.Smith,Science142,1592(1963)；C.F.Eagles,P.E.Wareing,PhysiologiaPlantarum17,697(1964)；J.W.Cornforth,B.V.Milborrow,G.Ryback,Nature206,715(1965)；J.W.Cornforth,B.V.Milborrow,G.Ryback,P.F.Wareing,Nature205,1269(1965)；D.Imber,M.TaI,Science169592(1970)。事實上，只要提高植物ABA敏感性，就會導(dǎo)致增強的耐旱性及另外的抗逆性。例如，參見Wang等人,PlantJ.43:413-424(2005)；Pei等人Science282:287-290(1998)；美國專利公開No.2004/0010821。遺傳分析已表明ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及許多因子，包括2型蛋白磷酸酶(PP2C)ABI1、ABI2及形成密切相關(guān)的ABI1/AHG1進化枝(clade)的相關(guān)物質(zhì)，該進化枝作為ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的冗余負(fù)調(diào)節(jié)子(R.R.Finkelstein,S.S.L.Gampala,C.D.Rock,ThePlantCell14,S15(2002)；P.McCourt,AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology50,219(1999)；A.Schweighofer,H.Hirt,I.Meskiene,TrendsinPlantScience9,236(2004))。已報道了幾種ABA結(jié)合蛋白，然而，尚不清楚它們是如何調(diào)控ABA的多種效應(yīng)，因為它們不通過已知的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)子發(fā)揮作用(X.Liu等人,Science315,1712(Mar23,2007)；F.A.Razem,A.El-Kereamy,S.R.Abrams,R.D.Hill,Nature439,290(2006)；Y.Y.Shen等人,Nature443,823(Oct19,2006))。另外，特征受體表現(xiàn)出與非天然立體異構(gòu)體(-)-ABA1可忽略的結(jié)合，其濃度高于它們的(+)-ABA2Kds約1000倍。(-)-ABA在大多數(shù)ABA檢測中是有生物活性的(B.-L.Lin,H.-J.Wang,J.-S.Wang,L.I.Zaharia,S.R.Abrams,JournalofExperimentalBotany56,2935(2005)；D.Huang等人,ThePlantJournal50,414(2007))，且通過相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以(+)-ABA發(fā)揮作用(E.Nambara等人,Genetics161,1247(Jul,2002))，表明識別(-)和(+)-ABA的受體仍有待發(fā)現(xiàn)。發(fā)明簡述本發(fā)明提供含有異源表達盒的植物(或這類植物的植物細(xì)胞、種子、花、葉、果實或其它植物部位)，該表達盒包括與編碼PYR/PYL受體多肽的核苷酸可操作連接的啟動子，其中所述植物與缺少該表達盒的植物相比，抗逆性增強。在一些實施方案中，PYR/PYL受體多肽包括SEQIDNOs:1、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107和/或138中的一個或多個。在一些實施方案中，PYR/PYL受體多肽與SEQIDNOs:2-90或108-137中的任一序列具有至少70％(例如，至少70％、80％、90％、95％)的同源性。在一些實施方案中，PYR/PYL受體多肽為組成型活性(constitutively-active)形式，使得受體在不存在脫落酸或ABA激動劑的酵母雙雜交檢測中，可以結(jié)合2型蛋白磷酸酶(PP2C)。在一些實施方案中，PYR/PYL受體多肽在存在而非缺乏脫落酸或ABA激動劑的酵母雙雜交檢測中結(jié)合2型蛋白磷酸酶(PP2C)。在一些實施方案中，所述植物與缺少該表達盒的植物相比，耐旱性增強。在一些實施方案中，啟動子為根特異性啟動子。在一些實施方案中，啟動子對植物的地上部分具有特異性。在一些實施方案中，啟動子是可誘導(dǎo)的。本發(fā)明還提供增強上述植物的抗逆性的方法。在一些實施方案中，該方法包括，使植物接觸足量的化合物，從而與不接觸該化合物的植物相比，增強其抗逆性，其中所述化合物選自下式：其中，R1選自由可任選被1-3個R1a基團取代的芳基和雜芳基組成的組；各R1a獨立選自下組：H、鹵素、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C1-6鹵代烷氧基、C1-6羥烷基、-NR'R"、-SR'、-OH、-CN、-NO2、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R"、-N(R')C(O)R"、-N(R')C(O)OR"、-N(R')C(O)NR'R"、-OP(O)(OR')2、-S(O)2OR'、-S(O)2NR'R"、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基，其中芳基基團可任選被-NO2取代，且雜芳基可任選被C1-6烷基取代；可選擇地，相鄰R1a基團可結(jié)合形成選自下組中的成員：環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基，其中芳基基團可任選被-OH取代；R'和R"各自獨立選自由H和C1-6烷基組成的組；R2選自下組：C2-6烯基、環(huán)烯基、芳基和雜芳基；R3為H或任選與R2和各自連接的原子結(jié)合形成可任選被1-3個R1a基團取代的雜環(huán)烷基；R4為可任選被1-3個R1a基團取代的雜芳基；R5選自由C1-6烷基和芳基組成的組，其中所述芳基可任選被1-3個R1a基團取代；各R6和R7獨立選自由芳基和雜芳基組成的組，各自可任選被1-3個R1a基團取代；R8選自由環(huán)烷基和芳基組成的組，各自可任選被1-3個R1a基團取代；R9為H或任選與R8的R1a基團和各自連接的原子結(jié)合形成雜環(huán)烷基；下標(biāo)n為0-2；X不存在或選自由-O-和-N(R')-組成的組；Y不存在或選自由-C(O)-和-C(R',R")-組成的組；Z不存在或選自由-N＝和-C(S)-N(R')-組成的組，使Y和Z之一不存在；各R10和R11獨立選自由H、C1-6烷基、-C(O)OR'和C1-6烯基-C(O)OH組成的組，其中R10和R11基團中至少兩個為C1-6烷基，R10和R11基團中至少一個為C1-6烯基-C(O)OH；可選擇地，連接于同一碳原子上的兩個R10或R11基團結(jié)合形成＝O；可選擇地，一個R10基團和一個R11基團結(jié)合形成具有3至6個環(huán)成員的環(huán)烷基；各下標(biāo)k和m為整數(shù)1-3，使k和m之和為3-4；各下標(biāo)p和r為整數(shù)1-10；其中位于相鄰碳原子上的R10或R11基團兩者結(jié)合形成鍵；R12為被＝O取代的C1-6烷基；R13為C1-6烯基-C(O)OH；R14選自由H和C1-6烷基組成的組；以及下標(biāo)r為整數(shù)1-10；條件是，當(dāng)R1為4-溴-萘-1-基，且n為1時，R2為除未取代的吡啶-2-基以外的基團。本發(fā)明還提供含有與編碼PYR/PYL受體多肽的核苷酸可操作連接的啟動子的表達盒，其中將該表達盒引入植物中使得該植物與缺少該表達盒的植物相比，抗逆性增強。在一些實施方案中，PYR/PYL受體多肽包括SEQIDNOs:1、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107和/或138中的一個或多個。在一些實施方案中，PYR/PYL受體多肽與SEQIDNOs:2-90或108-137中的任一序列具有至少70％(例如，至少70％、80％、90％、95％)的同源性。在一些實施方案中，PYR/PYL受體多肽為組成型活性形式，使受體在不存在脫落酸或ABA激動劑的酵母雙雜交檢測中，可以結(jié)合2型蛋白磷酸酶(PP2C)。在一些實施方案中，PYR/PYL受體多肽在存在而非缺乏脫落酸或ABA激動劑的酵母雙雜交檢測中結(jié)合2型蛋白磷酸酶(PP2C)。在一些實施方案中，所述植物與缺少該表達盒的植物相比，耐旱性增強。在一些實施方案中，啟動子為根特異性啟動子。在一些實施方案中，啟動子對植物的地上部分具有特異性。在一些實施方案中，啟動子是可誘導(dǎo)的。本發(fā)明還提供含有本發(fā)明表達盒(例如，上述的表達盒)的表達載體。本發(fā)明還提供制備抗逆性增強的植物的方法。在一些實施方案中，該方法包括：將本發(fā)明表達盒(例如，以上描述的表達盒)引入多株植物中；以及篩選含有所述表達盒的且與缺少該表達盒的植物相比抗逆性增強的植株。本發(fā)明還提供用于接觸植物而配制的農(nóng)用化學(xué)制劑，該制劑包括選自下式的化合物：其中，R1選自由可任選被1-3個R1a基團取代的芳基和雜芳基組成的組；各R1a獨立選自下組：H、鹵素、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C1-6鹵代烷氧基、C1-6羥烷基、-NR'R"、-SR'、-OH、-CN、-NO2、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R"、-N(R')C(O)R"、-N(R')C(O)OR"、-N(R')C(O)NR'R"、-OP(O)(OR')2、-S(O)2OR'、-S(O)2NR'R"、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基，其中所述芳基可任選被-NO2取代，且所述雜芳基可任選被C1-6烷基取代；可選擇地，相鄰R1a基團可結(jié)合形成選自下組中的成員：環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基，其中芳基可任選被-OH取代；R'和R"各自獨立選自由H和C1-6烷基組成的組；R2選自下組：C2-6烯基、環(huán)烯基、芳基和雜芳基；R3為H或任選與R2和各自連接的原子結(jié)合形成可任選被1-3個R1a基團取代的雜環(huán)烷基；R4為可任選被1-3個R1a基團取代的雜芳基；R5選自由C1-6烷基和芳基組成的組，其中所述芳基可任選被1-3個R1a基團取代；各R6和R7獨立選自由芳基和雜芳基組成的組，各自可任選被1-3個R1a基團取代；R8選自由環(huán)烷基和芳基組成的組，各自可任選被1-3個R1a基團取代；R9為H或任選與R8的R1a基團和各自連接的原子結(jié)合形成雜環(huán)烷基；下標(biāo)n為0-2；X不存在或選自由-O-和-N(R')-組成的組；Y不存在或選自由-C(O)-和-C(R',R")-組成的組；Z不存在或選自由-N＝和-C(S)-N(R')-組成的組，使Y和Z之一不存在；各R10和R11獨立選自由H、C1-6烷基、-C(O)OR'和C1-6烯基-C(O)OH組成的組，其中R10和R11基團中至少兩個為C1-6烷基，R10和R11基團中至少一個為C1-6烯基-C(O)OH；可選擇地，連接于相同碳原子上的兩個R10或R11基團結(jié)合形成＝O；可選擇地，一個R10基團和一個R11基團結(jié)合形成具有3至6個環(huán)成員的環(huán)烷基；各下標(biāo)k和m為整數(shù)1-3，使k和m之和為3-4；各下標(biāo)p和r為整數(shù)1-10；其中位于相鄰碳原子上的兩個R10或R11基團結(jié)合形成鍵；R12為被＝O取代的C1-6烷基；R13為C1-6烯基-C(O)OH；R14選自由H和C1-6烷基組成的組；以及下標(biāo)r為整數(shù)1-10；條件是，當(dāng)R1為4-溴-萘-1-基，且n為1時，R2為除未取代的吡啶-2-基以外的基團。在一些實施方案中，所述制劑進一步包括除草劑、殺菌劑、殺蟲劑或肥料中的至少一種。在一些實施方案中，所述制劑進一步包括表面活性劑。本發(fā)明還提供增強植物抗逆性的方法，該方法包括，使植物接觸足夠量的上述制劑，從而與不接觸化合物的植物相比，增強其抗逆性。在一些實施方案中，所述接觸步驟包括通過飛機空灑或灌溉向植物施用制劑。本發(fā)明還提供鑒定激動PYR/PYL多肽的試劑的方法。在一些實施方案中，該方法包括：使一種或多種試劑接觸PYR/PYL多肽；以及測定一種或多種試劑是否結(jié)合和/或激活PYR/PYL受體多肽，其中結(jié)合或激活表明該試劑為PYR/PYL多肽的激動劑。在一些實施方案中，測定步驟包括：使試劑接觸含有雙雜交系統(tǒng)的細(xì)胞，其中所述雙雜交系統(tǒng)檢測PYR/PYL多肽和2型蛋白磷酸酶(PP2C)的相互作用，其中PYR/PYL多肽和PP2C的試劑依賴型相互作用表明該試劑為PYR/PYL多肽的激動劑。附圖說明圖1、帕雷巴克汀(Pyrabactin)是種子選擇性ABA激動劑。(A)本研究中所述的分子結(jié)構(gòu)。(B)帕雷巴克汀活性被abi1-1抑制。將上方所示基因型的種子浸泡于含有25μM帕雷巴克汀的培養(yǎng)基中，層積處理(stratification)后4天給種子萌發(fā)打分。底部所示為IC50值，用于評價帕雷巴克汀作用于所述基因型種子的萌發(fā)效果。(C)帕雷巴克汀和ABA處理的種子的微陣列比較。Y軸為探針對25μM帕雷巴克汀(相對于未處理的對照)響應(yīng)的log2轉(zhuǎn)換值，X軸為探針對1μMABA響應(yīng)的log2轉(zhuǎn)換值。繪圖所用數(shù)據(jù)為去除萌發(fā)響應(yīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(germinationresponsivetranscripts)后，針對ABA或帕雷巴克汀具有顯著響應(yīng)的探針組(probesets)。(D)種子對放線菌酮和ABA響應(yīng)的微陣列比較。該圖表示對在C組(panel)中分析的相同探針組的響應(yīng)，但比較的是經(jīng)放線菌酮處理的種子的mRNA(y軸)。(E)幼苗對帕雷巴克汀和ABA響應(yīng)的微陣列比較。將7天大的幼苗轉(zhuǎn)移到含有10μMABA或50μM帕雷巴克汀的平板中24h，然后繪制mRNA樣本。各分散圖中插入的是每個比較的皮爾遜(Pearson)相關(guān)系數(shù)。詳細(xì)的微陣列方法描述于實施例部分。圖2、PYR1編碼ABA響應(yīng)的START-結(jié)構(gòu)域(domain)蛋白。(A)Pyr1等位基因。示出了等位基因名稱、植株名稱(括號內(nèi))及通過篩選帕雷巴克汀抗性突變鑒定得到的，由Pyr1突變等位基因引起的氨基酸變化。(B)圖示為公開的微陣列數(shù)據(jù)庫中包括的Pyr1和Pyr1-Pyr4表達值。右上方熱圖(heatmap)所示為首批上面的三個組(firstupperthreepanels)，底部熱圖為保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)據(jù)。繪圖使用的是eFP瀏覽器(D.Winter等人,PLoSONE2,e718(2007))。(C)35S:：GFP-PYR1互補pyr1-1。所示基因型種子在25μM帕雷巴克汀培養(yǎng)基上層積處理4天，然后在室溫(RT)、90％相對濕度(RH)下置于黑暗處萌發(fā)3天。Columbia野生型在這些條件下不能萌發(fā)，但pyr1-1由于其抗帕雷巴克汀，所以能夠萌發(fā)。將35S:：GFP-PYRl構(gòu)建體引入pyr1-1遺傳背景中，能夠恢復(fù)帕雷巴克汀敏感性，表明GFP融合蛋白能夠起作用。(D)Pyr/Pyls對于正常幼苗中ABA誘導(dǎo)的基因表達是必需的。圖示為ABA響應(yīng)基因RD29的qRT-PCR結(jié)果。L表示Ler，C表示對照，Q表示四倍體突變。(E)Pyr/Pyls基因?qū)τ谡Ｓ酌缰蠥BA誘導(dǎo)的逆境誘導(dǎo)的(stress-induced)基因表達是必需的。圖示為實施例部分所述的兩個ABA響應(yīng)taqman探針的qRT-PCR結(jié)果。L＝Ler,C＝對照,Q＝四倍體突變。圖3、ABA促進PYR/PYL與PP2Cs結(jié)合。(A)PYR/PYL蛋白與HAB1相互作用的特點。圖示為生長于含有上方所示化合物的平板上的酵母菌落X-gal染色。擬南芥基因組全序列測序(ArabidopsisGenomeInitiative，AGI)對每個PYR/PYL基因的注釋示于圖的右側(cè)。PYL8(AT5G53160)和PYL13(AT4G18620)未被檢測。每個測試株表達了AD-HAB1融合蛋白，BD融合示于左側(cè)。除了表油菜素內(nèi)酯(50nM)外，化學(xué)物質(zhì)測試為10μM。(B)PYR1突變蛋白不能與HAB1發(fā)生相互作用。測試了在擬南芥種子中顯示出帕雷巴克汀高敏感性的3個PYR1氨基酸替換突變與HAB1在Y2H中發(fā)生的相互作用。(C)PYR1與ABI1和ABI2發(fā)生相互作用，而不與abi2-1編碼的突變蛋白發(fā)生作用。圖4、GFP-PYRl定位于細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)中。共聚焦圖象顯示為在pyr1-1突變體背景中的35S:：GFP-PYR1構(gòu)建體。該構(gòu)建體補足了(complement)pyr1-1突變體的帕雷巴克汀不敏感表型。圖5、Pyr1以及Pyr1、2和4在ABA敏感中發(fā)揮冗余功效。(A)三倍體和四倍體突變系中的ABA響應(yīng)在萌發(fā)期間改變。上方所示基因型的種子在含有0.9μM(+)-ABA的培養(yǎng)基中層積處理4天，然后在黑暗處萌發(fā)3天后拍照。由于與pyl2-1插入等位基因緊密相關(guān)的erecta突變的存在，在(+)-ABA上萌發(fā)的四倍體突變上觀察到短下胚軸。(B)三倍體和四倍體突變系中的ABA響應(yīng)在根生長期間改變。上方所示基因型的種子層積處理4天，然后轉(zhuǎn)移至暗處(常溫，90％相對濕度)。30小時后，將出現(xiàn)幼根的種子轉(zhuǎn)移至含有10μM(+)-ABA的平板上，在黑暗處再生長3天后對它們的根拍照。圖6、PYR1為調(diào)節(jié)PP2C活性的ABA受體。(A)體外ABA感受重建。采用GST-HAB1和6xHis-PYR1(或突變體)對純化的重組蛋白(左側(cè))進行轉(zhuǎn)蛋白試驗(Pull-downassays)。另外采用純化的6xHis-PYR11(或突變體)及含有所示PP2C的粗細(xì)胞裂解物在轉(zhuǎn)蛋白試驗中測試GST-ABI1和ABI2。使用10μM(+)-ABA。(B)在ABA存在下，PYR1抑制PP2C活性。在PYR1或PYR1P88S存在下，以不同的ABA濃度，用底物pNPP測試GST-HAB1的PP2C活性。(C)HAB1PP2C活性的ABA/PYL4型抑制。重組的PYL4(由包涵體重新折疊)和HAB1用于所述的PP2C檢測。使用磷酸酶底物pNPP測定GST-HAB1活性。采用酶標(biāo)儀(platereader)監(jiān)測一段時間的反應(yīng)(3次)，計算磷酸酶的起始反應(yīng)速率(3次)，用于計算活性。上圖顯示為所研究的整個濃度范圍；下圖顯示為所測試的較低濃度的放大部分。這些試驗中的GST-HAB1特異活性為452.4±12.3μmol/min/mg。繪圖使用±SD誤差線(errorbar)。圖7、預(yù)測的PYR/PPYL調(diào)節(jié)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模型。不限于本發(fā)明范圍，我們設(shè)計了以下模型：在無ABA時(左側(cè))，PYR/PYL蛋白與PP2Cs結(jié)合弱，因此PP2C活性高，防止了SnRK2s以及下游因子(DFs)的磷酸化和激活。在ABA存在時，PYR/PYL結(jié)合并抑制PP2Cs。使磷酸化的下游因子和ABA轉(zhuǎn)錄響應(yīng)得到積累。PYR/PYLs對SnRK2s的調(diào)節(jié)可能是間接的，或可能涉及其它因子。圖8、ABA激動劑小分子的活性。該表概括了來自于篩選的小分子對于PYR1、PYL1、PYL2、PYL3和PYL4受體活性的數(shù)據(jù)。圖9、在PP2C酵母雙雜交檢測中鑒定的一些化合物的IC50值。左欄中所列化合物編號對應(yīng)于表9中概括的檢測時確定的化合物；化合物7653159對應(yīng)于圖9中的化合物7；化合物6655097對應(yīng)于圖9中的化合物6；以及化合物7561035對應(yīng)于圖9中的化合物9。對于每個化合物，以pNPP為底物采用磷酸酶試驗檢測該化合物拮抗PYR/PYL抑制PP2CHAB1的能力。圖10、PYL4過表達系中的ABA相關(guān)基因表型列表。檢測了PYU4過表達以及pyr1；py11；py12；py14四倍體突變擬南芥植株對于脅迫響應(yīng)的相關(guān)性狀，包括開花時間、株高、葉綠素含量和萎蔫相對于對照擬南芥植株的變化。突變植株構(gòu)建的詳細(xì)描述由實施例部分提供。圖11、來自擬南芥的PYR1及同系物的比對。該圖提供了擬南芥PYR/PYL蛋白序列的比對。比對顯示了，例如絕對保守氨基酸以及處于通常的保守位置的氨基酸。圖中序列包括以下PYR/PYL多肽：PYL12(SEQIDNO:77)、PYL8(SEQIDNO:78)、PYL7(SEQIDNO:79)、PYL9(SEQIDNO:80)、PYL11(SEQIDNO:81)PYL10(SEQIDNO:82)、PYL13(SEQIDNO:83)、PYL5(SEQIDNO:84)、PYL4(SEQIDNO:85)、PYL6(SEQIDNO:86)、PYL2(SEQIDNO:87)、PYL3(SEQIDNO:88)、PYRl(SEQIDNO:89)和PYLl(SEQIDNO:90)。來自特定成員的一致性序列列于比對下方。ALL_Con＝SEQIDNOs:93-95；l_12_Con＝SEQIDNOs:96-99；l_6_Con＝SEQIDNOs:100、139和102；7_10_Con＝SEQIDNOs:103和140；11_13_Con＝SEQIDNOs:106和107。圖12、其它ABA激動劑的活性。所列化合物包括天然產(chǎn)生的植物化合物青蒿酸及其類似物。定義本文中使用的術(shù)語“啟動子”是指能夠啟動細(xì)胞中編碼序列進行轉(zhuǎn)錄的多核苷酸序列。因此，本發(fā)明中使用的啟動子的多核苷酸結(jié)構(gòu)中包括順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和涉及調(diào)控或調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄時間和/或速率的調(diào)控序列。例如，啟動子可以是順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，包括涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控的增強子、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、復(fù)制起始位點、染色體整合序列、5'和3'非翻譯區(qū)或內(nèi)含序列。這些順式作用序列一般與蛋白或其它分子作用實現(xiàn)(開啟/關(guān)閉、調(diào)控、調(diào)節(jié)等)基因轉(zhuǎn)錄?！爸参飭幼印笔侵改軌蛟谥参锛?xì)胞中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子?！敖M成型啟動子”是指能夠在幾乎所有組織中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子，而“組織特異性啟動子”僅在一種或幾種特定組織中起始轉(zhuǎn)錄。術(shù)語“植物”包括整個植株、枝條的營養(yǎng)器官和/或結(jié)構(gòu)(例如，葉、莖和塊莖)、根、花和花器官(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花藥)、胚珠(包括卵細(xì)胞和中央細(xì)胞)、種子(包括受精卵、胚胎、胚乳和種皮)、果實(例如，成熟的子房)、種苗、植物組織(例如，維管組織、基本組織等)、細(xì)胞(例如，保衛(wèi)細(xì)胞、卵細(xì)胞、毛狀體等)及其子代?？捎糜诒景l(fā)明方法中的植物種類一般是指可廣泛適合于轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等和低等植物種類，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物和多細(xì)胞藻類植物。它包括多種倍性水平的植物，包括非整倍體、多倍體、二倍體、單倍體和半合子。如果多核苷酸序列來自外源物種，或如果來自經(jīng)過修飾的相同物種的原始形式，則它對于有機體是“異源的”或者是第二多核苷酸序列(asecondpolynucleotidesequence)。例如，當(dāng)說到啟動子與外源編碼序列可操作連接時，是指所述編碼序列來自一個物種，而啟動子來自另一不同物種；或如果二者來自相同物種，所述編碼序列不是與該啟動子天然連接的(例如，遺傳工程編碼序列，如來自相同物種的不同基因或來自不同生態(tài)型或品種的等位基因)。某株植物的“外源的”多核苷酸，是指通過除了有性雜交以外的任何方法將核苷酸引入該植株中的多核苷酸?？刹捎玫姆椒ǖ膶嵗缦拢ㄞr(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法、電穿孔等。這類含有外源核酸的植物此處稱為T1(例如，通過真空滲透得到的擬南芥)或R0(從體外轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生的植物)代轉(zhuǎn)基因植物。本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”描述了非天然存在的含有人工修飾的基因組的植物，其中植物基因組中包括來自相同或不同植物物種的外源核酸分子。所述外源核酸分子可以是基因調(diào)控元件，如啟動子、增強子或其它調(diào)控元件，或可含有可與異源基因調(diào)控元件連接的編碼序列。這類植物通過有性雜交或自交產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的后代，也被稱為“轉(zhuǎn)基因的”?！氨磉_盒”是指核酸構(gòu)建體，當(dāng)引入至宿主細(xì)胞中時，分別導(dǎo)致RNA或多肽的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。不能被翻譯的反義或正義構(gòu)建體特別地包括在該定義內(nèi)。在轉(zhuǎn)基因表達且內(nèi)源基因抑制(例如，通過反義或正義抑制)的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道插入的多核苷酸序列不必相同，但可以僅與衍生該多核苷酸序列的基因序列“大體相同”。如下面所解釋的，這些大體相同的變體(variants)通過引用被特定核酸序列專門涵蓋?！疤岣叩摹被颉霸鰪姷摹盤YR/PYL表達或活性是指蛋白表達或活性增強的變化。這種增強的活性或表達的實例包括，例如使PYR/PYL的表達高于對照水平，和/或其在對照中不表達的例如某個位置或時間上異位(ectopically)表達。在一些實施方案中，PYR/PYL表達或活性高于其在野生型、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏械乃?即，PYR/PYL的活性或PYR/PYL基因的表達增強)。在一些實施方案中，PYR/PYL的表達或活性可存在于，例如，野生型、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏型ǔz測不到的器官、組織或細(xì)胞中(即，PYR/PYL表達或活性在某些組織中增強)。在一些實施方案中，當(dāng)存在于器官、組織或細(xì)胞中的PYR/PYL表達或活性的時間比在野生型、非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参镏械臅r間長(即，PYR/PYL表達或活性的時間增加了)，PYR/PYL的表達或活性增強。如果在進行下述最大對應(yīng)的比對時，核苷酸或氨基酸殘基序列中兩條序列中分別相同，則稱兩個核酸序列或多肽是“相同的”。兩條或多條核酸或多肽序列中的術(shù)語“相同的”或“相同”百分?jǐn)?shù)，是指在比較窗口中進行最大對應(yīng)的比較和比對時，兩條或多條序列或子序列(subsequence)是相同的或有特定百分?jǐn)?shù)的氨基酸或核苷酸是相同的，測定采用的是以下一種序列比較算法或人工比對和目測比對。當(dāng)序列相同百分?jǐn)?shù)被用于蛋白或多肽時，應(yīng)認(rèn)識到不同的殘基位置通常由于保守氨基酸的替換而不同，氨基酸殘基被替換成其它具有相似化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的氨基酸殘基，因此不改變該分子的功能。由于保守替換導(dǎo)致序列不同，針對替換的保守性質(zhì)可上調(diào)序列相同百分?jǐn)?shù)予以糾正。調(diào)整的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。一般包括給部分而不是全部錯配的保守替換打分，從而提高序列相同百分?jǐn)?shù)。因此，例如，相同的氨基酸給定分值為1，非保守替換給定分值為0，保守替換給定分值為0-1。保守替換分值的計算根據(jù)，例如Meyers&Miller,ComputerApplic.Biol.ScL4:11-17(1988)的算法，例如，執(zhí)行程序PC/GENE(Intelligenetics,MountainView,California,USA)。本文中使用的短語“大體相同”是指兩條核酸或多肽，與對照序列至少25％序列相同?；蛘?，相同百分?jǐn)?shù)可以是25％-100％之間的整數(shù)。采用上述程序，與對照序列比較，一些實施方案包括至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％；優(yōu)選BLAST采用下述標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。本發(fā)明提供核酸編碼的、與SEQIDNO:2-90或108-137之一大體相同的多肽。在進行序列比較時，一般以一條序列作為參考序列，待測序列與其比較。當(dāng)采用序列比較算法時，將待測序列和參考序列輸入計算機，進行序列匹配，如有必要，可設(shè)定序列算法程序參數(shù)。可使用默認(rèn)程序參數(shù)或可設(shè)定另外的參數(shù)。然后基于所述程序參數(shù)，序列比較算法計算出待測序列相對于參考序列的序列相同百分?jǐn)?shù)。本文中使用的“比較窗口”包括在兩條序列進行最優(yōu)比對后，參考任一選自由20-600，通常約50-約200，更通常為約100-約150個組成的組的連續(xù)位置數(shù)目的區(qū)域，使序列與相同數(shù)目的連續(xù)位置的參考序列相比較。比較序列的比對方法為本領(lǐng)域熟知。序列最優(yōu)比對的比較可按照Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法進行，按照Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對算法進行，按照Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.ScLUSA85:2444(1988)搜索相似性的方法進行，利用這些算法的計算機運行(GAP,BESTFIT,FASTA,andTFASTAintheWisconsinGenetics.SoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)，或通過人工比對和目測比對。適合于測定序列相同百分?jǐn)?shù)和序列相似百分?jǐn)?shù)的算法的實例是BLAST和BLAST2.0算法，分別描述于Altschul等人(1990)/.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1977)NucleicAcidsRes.25:3389-3402中。用于進行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站公開獲得。所述算法包括首先通過在查詢序列(querysequence)中確定長度W的短詞，從而確定高分序列配對(HSPs)，當(dāng)與數(shù)據(jù)庫中的相同長度序列的詞比對時，該查詢序列或者匹配或者達到滿意的正閾分值T。T是指相鄰詞的分值閾值(Altschul等人,同上)。以這些起始相鄰詞采樣數(shù)(wordhits)作為種詞用于起始搜索找到更長的含有它們的HSPs。然后，所述詞采樣數(shù)沿每條序列的兩個方向延伸，只要累計的比對分能夠增加。采用參數(shù)M(匹配殘基對則加分；總是>0)和N(不匹配殘基則罰分；總是<0)計算核苷酸序列的累計分。對于氨基酸序列，分值矩陣用于計算累計分。當(dāng)累計比對分X量落入其最大獲取值以外時；由于一個或多個負(fù)分殘基比對的積累，當(dāng)累計分趨于零或更低時；或達到任一條序列的末端時，每個方向上詞采樣數(shù)的延伸停止。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的敏感性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸)使用默認(rèn)的詞大小(W)為28，期望值(E)為10，M＝1，N＝2，比較兩條鏈。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用默認(rèn)的詞大小(W)為3，期望值(E)為10，BLOSUM62分值矩陣(見Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.ScLUSA89:10915(1989))。BLAST算法還可進行兩條序列間相似性的統(tǒng)計分析(見，例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.ScLUSA90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一種相似性測定是最小總和概率(P(N))，其根據(jù)兩條核苷酸或氨基酸序列之間隨機產(chǎn)生的匹配提供概率的指示。例如，如果待測核酸與參考核酸比較中，最小總和概率≤約0.01，更優(yōu)選≤約10-5，最優(yōu)選≤約10-20，則認(rèn)為核酸與參考序列相似。“保守修飾的變體”適用于氨基酸和核苷酸序列。對于特定的核酸序列，保守修飾的變體是指那些編碼相同或基本相同氨基酸序列的核苷酸，或所述核苷酸不編碼基本相同的氨基酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，大量功能相同的核苷酸編碼任何給定的蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼丙氨酸。因此，在每個位置，丙氨酸由密碼子限定，密碼子可改變?yōu)槿魏嗡鱿嚓P(guān)密碼子而不改變所編碼的多肽。這類核苷酸變化為“沉默變化(silentvariation)”，是一種保守修飾變化。本文中每條編碼多肽的核苷酸序列還描述了各種可能的核苷酸的沉默變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道每個核苷酸密碼子(除AUG之外，其通常僅編碼甲硫氨酸)可被修飾以產(chǎn)生功能相同的分子。因此，每個編碼多肽的核苷酸的沉默變化在各所述序列中是隱含的。至于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，核苷酸、肽、多肽或蛋白序列的單個替換改變單個氨基酸或編碼序列中的少量氨基酸，其為“保守修飾變體”，該變化導(dǎo)致氨基酸被替換成化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域熟知的。以下六組，各含有彼此保守替換成另一氨基酸的氨基酸：1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天門冬氨酸(D),谷氨酸(E)；3)天門冬酰胺(N),谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R),賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),纈氨酸(V)；以及6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W)。(見，例如Creighton,Proteins(1984))。本文中使用的術(shù)語“抗旱性”或“耐旱性”，包括任何其變體，是指植物從干旱脅迫期(即，很少水或沒有水的天數(shù))恢復(fù)的能力。一般地，干旱脅迫至少為5天，也可長達例如18或20天或更長(例如，至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天)，取決于例如植物的物種。發(fā)明詳述Ⅰ.介紹本發(fā)明部分基于對小有機分子選擇性脫落酸(ABA)激動劑以及需要ABA激動劑活性的PYR1蛋白的發(fā)現(xiàn)。還進一步發(fā)現(xiàn)PYR1是PYR/PYL受體蛋白家族的一個成員。待測植物表達≥一種PYR/PYL受體蛋白家族成員，且具有至少某些冗余活性。增強一種或多種PYR/PYL蛋白在植物中的表達或活性，將導(dǎo)致ABA敏感性增強以及相應(yīng)提高的脅迫(例如，冷、熱、鹽或旱)響應(yīng)和耐受以及其它期望的ABA介導(dǎo)的表型。脫落酸是一種多功能的植物激素，參與各種植物的保護功能，包括芽休眠、種子休眠和/或成熟，葉片和果實的脫落，以及各種各樣的生物脅迫(例如冷、熱、鹽和旱)響應(yīng)。通過一個獨立于CO2濃度的機制，ABA還負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉。因此，由于PYR/PYLABA受體蛋白介導(dǎo)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些表型可通過調(diào)節(jié)PYR/PYL的表達進行調(diào)節(jié)。植物中ABA誘導(dǎo)的表型可以通過增加的PYR/PYL表達來增加或加速，而這樣的植物表型，可以通過減少PYR/PYL的表達來減少或減緩。PYR/PYL介導(dǎo)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作為例如，種子發(fā)芽、發(fā)芽后生長、氣孔運動和植物對脅迫的耐受性，包括但不限于干旱的正調(diào)節(jié)子。因此，當(dāng)通過過表達PYR/PYL使脫落酸敏感性增強時，可獲得期望的植物特點，如增加的脅迫(例如，干旱)耐受和延遲的種子發(fā)芽。其它可在本發(fā)明的植物中產(chǎn)生的期望的特點包括，例如，開花時間的變化和/或增加的葉綠素含量。Ⅱ.ABA激動劑本發(fā)明提供小分子ABA激動劑，即激活PYR/PYL蛋白的化合物。示例ABA激動劑包括，例如，選自下式的化合物：其中，R1選自由可任選被1-3個R1a基團取代的芳基和雜芳基組成的組；各R1a獨立選自下組：H、鹵素、C1-6烷基、C1-6鹵代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C1-6鹵代烷氧基、C1-6羥烷基、-NR'R"、-SR'、-OH、-CN、-NO2、-C(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NR'R"、-N(R')C(O)R"、-N(R')C(O)OR"、-N(R')C(O)NR'R"、-OP(O)(OR')2、-S(O)2OR'、-S(O)2NR'R"、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基，其中芳基可任選被-NO2取代，且雜芳基可任選被C1-6烷基取代；可選擇地，相鄰R1a基團可結(jié)合形成選自下組中的成員：環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基和雜芳基，其中芳基可任選被-OH取代；R'和R"各自獨立選自由H和C1-6烷基組成的組；R2選自下組：C2-6烯基、環(huán)烯基、芳基和雜芳基；R3為H或任選與R2和各自連接的原子結(jié)合形成可任選被1-3個R1a基團取代的雜環(huán)烷基；R4為可任選被1-3個R1a基團取代的雜芳基；R5選自由C1-6烷基和芳基組成的組，其中所述芳基可任選被1-3個R1a基團取代；各R6和R7獨立選自由芳基和雜芳基組成的組，各自可任選被1-3個R1a基團取代；R8選自由環(huán)烷基和芳基組成的組，各自可任選被1-3個R1a基團取代；R9為H或任選與R8的R1a基團和各自連接的原子結(jié)合形成雜環(huán)烷基；下標(biāo)n為0-2；X不存在或選自由-O-和-N(R')-組成的組；Y不存在或選自由-C(O)-和-C(R',R")-組成的組；Z不存在或選自由-N＝和-C(S)-N(R')-組成的組，使Y和Z之一不存在；各R10和R11獨立選自由H、C1-6烷基、-C(O)OR'和C1-6烯基-C(O)OH組成的組，其中R10和R11基團中至少兩個為C1-6烷基，R10和R11基團中至少一個為C1-6烯基-C(O)OH；可選擇地，連接于相同碳原子上的兩個R10或R11基團結(jié)合形成＝O；可選擇地，一個R10基團和一個R11基團結(jié)合形成3至6元的環(huán)烷基；各下標(biāo)k和m為整數(shù)1-3，使k和m之和為3-4；各下標(biāo)p和r為整數(shù)1-10；其中位于相鄰碳原子上的兩個R10或R11基團結(jié)合形成鍵；R12為被＝O取代的C1-6烷基；R13為C1-6烯基-C(O)OH；R14選自由H和C1-6烷基組成的組；以及下標(biāo)r為整數(shù)1-10；條件是，當(dāng)R1為4-溴-萘-1-基，且n為1時，R2為除未取代的吡啶-2-基以外的基團。示例化合物進一步描述于實施例和附圖中。參見，例如圖9、10和13。本發(fā)明的ABA激動劑化合物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法制備得到。例如，磺胺化合物可由磺酰氯和胺反應(yīng)以制備得到磺胺。本發(fā)明的酰胺化合物可通過類似的方式，采用?；忍娲酋Ｂ然虮绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的碳二亞胺耦合試劑來制備。其它制備本發(fā)明化合物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，例如，描述于ComprehensiveOrganicTransformations,2ded.,RichardC.Larock,1999的方法。上述方法的起始原料為市售獲得(Sigma-Aldrich)，或采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行制備。植物(或植物部位如種子)中ABA誘導(dǎo)的表型可通過使植物與足量的本發(fā)明ABA激動劑接觸以誘導(dǎo)ABA誘導(dǎo)型表型來增加或加速。本發(fā)明的ABA激動劑是有益的，用作例如正增強劑，例如延遲種子發(fā)芽、發(fā)芽后生長、氣孔運動和植物抗逆性包括但不限于干旱。Ⅲ.ABA激動劑制劑本發(fā)明提供用于接觸植物而配制的農(nóng)用化學(xué)制劑，其中該制劑包括本發(fā)明的ABA激動劑。在一些實施方案中，與激動劑接觸的植物不含有或表達異源PYR/PYL多肽(例如，植物不是轉(zhuǎn)基因植物，或植物是轉(zhuǎn)基因植物但表達異源蛋白而不是異源PYR/PYL蛋白)。在一些實施方案中，與激動劑接觸的植物含有或表達本文中所述的異源PYR/PYL多肽。根據(jù)本發(fā)明，例如在載體中，所述制劑適合用于處理植物或植物繁殖材料，如種子。適合的添加劑包括緩沖劑、潤濕劑、包膜劑、多糖和研磨劑。示例載體包括水、水溶液、漿料、固體和干燥粉末(例如泥炭、小麥、麩皮、蛭石、粘土、消毒的土壤、多種形式的碳酸鈣、白云石、各種檔次的石膏、膨潤土和其它粘土礦物、磷礦石和其它磷化合物、二氧化鈦、腐殖質(zhì)、滑石、藻酸鹽和活性炭。任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的農(nóng)業(yè)上適合的載體是可接受的，且可用于本發(fā)明中。任選地，所述制劑還可包括至少一種表面活性劑、除草劑、殺菌劑、殺蟲劑或肥料。處理可采用已知的各種方法，例如，通過在繁殖材料上噴灑、噴霧、噴粉或播撒該組合物，或涂刷或潑灑或以其它方式使植物接觸組合物，如果是種子，則通過涂布、包裹或以其它方式處理種子。另一種在種植前直接處理植物或種子的方法，還可將本發(fā)明的制劑引入土壤或其它待播種種子的培養(yǎng)基。在一些實施方案中，還可使用載體。所述載體可以是如上所述的固態(tài)、液態(tài)。在一些實施方案中，泥炭懸浮于水中，作為ABA激動劑的載體，在種植種子時，將這種混合物噴灑入土壤或種植介質(zhì)中和/或噴灑于種子表面。IV.新ABA激動劑和拮抗劑的篩選本發(fā)明還提供篩選ABA激動劑和拮抗劑的方法，其通過篩選在激動劑情況下能夠誘導(dǎo)PYR/PYL-PP2C結(jié)合的分子，或在拮抗劑情況下能夠破壞ABA和其它激動劑促進PYR/PYL-PP2C結(jié)合的能力的分子?？墒褂迷S多不同的篩選方案以鑒定激動(agonize)或拮抗(antagonize)PYR/PYL多肽的試劑。篩選可使用分離的、純化的或部分純化的試劑進行。在一些實施方案中，可使用純化的或部分純化的PYR/PYL多肽?；蛘?，可使用基于細(xì)胞的方法。例如，可使用天然表達PYR/PYL多肽的細(xì)胞或重組表達PYR/PYL多肽的細(xì)胞。在一些實施方案中，可使用植物細(xì)胞，動物細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞，真菌細(xì)胞，包括但不限于酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。概括地，篩選方法包括篩選多種試劑以鑒定能夠調(diào)節(jié)PYR/PYL多肽活性的試劑，例如，通過結(jié)合PYR/PYL多肽，或激活PYR/PYL多肽，或提高PYR/PYL多肽的表達，或增加編碼PYR/PYL多肽的轉(zhuǎn)錄物。1、PYR/PYL多肽結(jié)合檢測任選地，初級篩選可通過篩選能夠結(jié)合PYR/PYL多肽的試劑來進行，因為至少其中一些這樣鑒定出的試劑可能是PYR/PYL多肽調(diào)節(jié)劑。結(jié)合檢測可包括用一種或多種檢測試劑接觸PYR/PYL多肽，用足夠長的時間使蛋白質(zhì)和檢測試劑形成結(jié)合復(fù)合物?？刹捎萌魏我环N已建立的分析技術(shù)檢測任何形成的結(jié)合復(fù)合物。蛋白結(jié)合檢測方法包括，但不限于，在非變性SDS聚丙烯酰胺凝膠上測定共沉淀或共遷移，以及在蛋白印跡(Westernblots)上檢測共遷移(見，例如Bennet,J.P.和Yamamura,H.I.(1985)"Neurotransmitter,HormoneorDrugReceptorBindingMethods,"inNeurotransmitterReceptorBinding(Yamamura,H.L,等人,eds.),pp.61-89)。其它結(jié)合檢測包括使用質(zhì)譜或NMR技術(shù)鑒定結(jié)合PYR/PYL多肽的分子或標(biāo)記底物的置換(例如，標(biāo)記的ABA)。檢測中使用的PYR/PYL多肽蛋白可以是天然表達的、克隆的或合成的。2、活性可通過篩選能夠激活或增強PYR/PYL多肽活性的試劑來鑒定PYR/PYL多肽激動劑。可通過降低活性來鑒定拮抗劑。一種活性檢測包括測試候選激動劑是否能夠誘導(dǎo)PYR/PYL蛋白與2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽以激動劑特異的方式結(jié)合。哺乳動物或酵母雙雜交法(見，例如，Bartel,P.L.等人MethodsEnzymol,254:241(1995))可用于鑒定當(dāng)共同表達于細(xì)胞中時，發(fā)生相互作用或結(jié)合的多肽或其它分子。在一些實施方案中，在酵母雙雜交檢測中，在PYR/PYL多肽和2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽之間鑒定激動PYR/PYL多肽的試劑，其中能夠激活或能夠使PYR/PYL多肽與PP2C多肽結(jié)合的試劑被鑒定為ABA激動劑。因此，兩種多肽在該試劑存在時結(jié)合，而在無該試劑的條件下不結(jié)合。在一些實施方案中，在酵母雙雜交檢測中，在PYR/PYL多肽和2型蛋白磷酸酶(PP2C)多肽之間鑒定拮抗PYR/PYL多肽的試劑，其中能夠降低PYR/PYL多肽與PP2C多肽結(jié)合的試劑被鑒定為ABA拮抗劑，任選在ABA或PYR/PYLABA激動劑存在的條件下。因此，拮抗劑阻斷在通常情況下受到ABA或其它激動劑促進的兩種多肽的正常結(jié)合，或者，觀察到其與PYR/PYL蛋白發(fā)生的結(jié)構(gòu)性相互作用。3、表達檢測本發(fā)明還提供對能夠增強PYR/PYL多肽表達的化合物的篩選。篩選方法一般包括進行基于細(xì)胞的或基于植物的檢測，受試化合物與一種或多種表達PYR/PYL多肽的細(xì)胞接觸，然后檢測PYR/PYL表達(或轉(zhuǎn)錄物或翻譯產(chǎn)物)的增加。可采用天然表達PYR/PYL的細(xì)胞或經(jīng)重組改造的表達PYR/PYL的細(xì)胞，或經(jīng)重組改造在PYR/PYL啟動子的控制下表達報告基因的細(xì)胞進行檢測?？蛇M行各種對照試驗以確保檢測到的活性是真實的，包括用不含該報告構(gòu)建體的細(xì)胞，或通過使含有該報告構(gòu)建體的細(xì)胞不與受試化合物接觸而設(shè)置平行反應(yīng)。4、驗證通過任一種前述篩選方法最初鑒定得到的試劑可進一步進行測試以驗證該試劑顯著的活性和/或確定該試劑的其它生物學(xué)效果。在一些實例中，測試所鑒定得到的試劑作用于植物逆境(plantstress)(例如，耐旱性)、種子發(fā)芽或其它受ABA影響的表型的能力。許多這類檢測方法和表型是本領(lǐng)域已知的，且可用于本發(fā)明的方法中。5、固相和可溶性高通量檢測在本發(fā)明的高通量檢測中，一天中可篩選高達數(shù)千個不同的調(diào)節(jié)劑或配體。特別是，每一個微孔板可用于單獨檢測所選的潛在調(diào)節(jié)劑，或如果算上檢測濃度或孵育時間的影響，每5-10孔可測試一個調(diào)節(jié)劑。因此，一個標(biāo)準(zhǔn)的微孔板可檢測約100(例如96)個調(diào)節(jié)劑。如果使用1536個微孔板，然后每一個微孔板可容易地檢測出約100-約1500個不同的化合物。每天可以檢測幾個不同的微孔板，使用本發(fā)明的集成系統(tǒng)，可檢測篩選出高達約6,000-20,000個或更多的不同的化合物。此外，試劑操作可使用微流體法(microfluidicapproaches)。目標(biāo)分子(例如，PYR/PYL或表達PYR/PYL多肽的細(xì)胞)可以直接或間接地，通過共價或非共價鍵結(jié)合于固相組分。本發(fā)明提供高通量下在體外進行檢測而鑒定能夠調(diào)節(jié)PYR/PYL表達或活性的化合物。Ⅴ.PYR/PYL受體多肽本發(fā)明的多肽，當(dāng)表達于植物中時，介導(dǎo)ABA和ABA類似物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在一些實施方案中，PYR/PYL多肽與PP2C多肽(例如，ABI1或2或它們的直系同源物，例如來自PP2Cs亞家族A組)以ABA、帕雷巴克汀、或本發(fā)明所述的其它ABA激動劑依賴的方式發(fā)生作用(例如，在酵母雙雜交檢測中)。多種PYR/PYL多肽序列是本領(lǐng)域已知的，且可用于本發(fā)明的方法和組合物。此處應(yīng)注意的是，雖然PYR1起初在擬南芥中被鑒定為ABA受體，實際上PYR1是擬南芥中相同蛋白家族的至少14個蛋白(PYR/PYL蛋白)的組的成員，并且也介導(dǎo)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。該蛋白家族還存在于其它植物中(見，例如序列表(SEQUENCELISTING))，其部分特征為存在一個或多個或全部的聚酮環(huán)化酶(polyketidecyclase)結(jié)構(gòu)域2(PF10604)、聚酮環(huán)化酶結(jié)構(gòu)域1(PF03364)和BetⅤⅠ結(jié)構(gòu)域(PF03364)。START/Betv1超家族結(jié)構(gòu)域描述于，例如，Radauer,BMCEvol.Biol.8:286(2008)。在想獲得上述序列的變體或直系同源物的情況下，可進行序列比對以鑒定保守的氨基酸或基序(motif)(即，序列的變化可改變蛋白功能)以及比對序列中發(fā)生變化的區(qū)域(即，序列的變化不顯著影響蛋白的活性)。SEQIDNO:1、91和92提供一致性序列用于鑒定PYR/PYL多肽。其它有用的一致性序列包括，例如EXLXXXDXXXXXXXXXXXGGXHXL(SEQIDNO:138)；CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxxxxFxxxC(SEQIDNO:93),GxxRxVxxxSxxPAxxSxExLxxxD(SEQIDNO:94)和/或GGxHRLxNYxS(SEQIDNO:95)。此外，更多特定的一致性序列可通過比對擬南芥PYR/PYL蛋白14個成員的亞型(subsets)而呈現(xiàn)。這些一致性序列的實例包括，例如，PYRl-PYL12CxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxxKxFxxxC(SEQIDNO:96)GxxRxVxxxSxLPAxxSxExLxxxD(SEQIDNO:97)GGxHRLxNYxS(SEQIDNO:98)ESxxVDxPxGNxxxxTxxFxxxxxxxNLxxL(SEQIDNO:99)PYR1-PYL6HxxxxxxxxCxSxxxxxxxAPxxxxWxxxxxFxxPxxYKxFxxxC(SEQIDNO:100)VGRxVxVxSGLPAxxSxExLxxxDxxxxxxxFxxxGGxHRLxNYxSVT(SEQIDNO:101)VxESYxVDxPxGNxxxxTxxFxDxxxxxNLQxL(SEQIDNO:102)PYL7-PYL10HxHxxxxxQCxSxLVKxIxAPxHxVWSxVRRFDxPQKYKPFxSRCxVxGx(SEQIDNO:103)ExGxxREVxxKSGLPATxSTExLExLDDxEHILxIxIxGGDHRLKNYSSxxxxHxExIxGxxGTx(SEQIDNO:104)xxESFVVDVPxGNTKxxTCxFVExLIxCNLxSLAxxxERL(SEQIDNO:105)PYL11-PYL13CxSxxVxTIxAPLxLVWSILRxFDxPxxxxxFVKxCxxxSGxGG(SEQEDNO:106)GSVRxVTxVSxxPAxFSxERLxELDDESHVMxxSπGGxHRLVNYxSKT(SEQIDNO:107)因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的PYR/PYL多肽包括一種或多種上述一致性序列或它們的保守變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，上述一致性序列的變化位置可基于它們在特定PYR1多肽(例如，在SEQIDNOs:2-90中任一序列內(nèi)出現(xiàn))中的相關(guān)位置所出現(xiàn)的氨基酸進行選擇，或者也可以是它們的保守取代。在一些實施方案中，本發(fā)明的PYR/PYL多肽與以下任一條序列大體相同(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％相同)，SEQIDNO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136或137。本發(fā)明提供上述蛋白和/或編碼所述多肽的核酸序列在本發(fā)明方法和組合物(例如，表達盒、植物等)中的應(yīng)用?？刹捎枚喾N技術(shù)，分離編碼植物PYR/PYL(例如，從尚未鑒定的植物PYR/PYL序列中)的多核苷酸序列。例如，基于本文中公開的PYR/PYL編碼序列(例如，序列表中列出的序列)的寡核苷酸探針，可用于鑒定cDNA或基因組DNA文庫中想要的PYR/PYL基因。為了構(gòu)建基因組文庫，通過隨機片段化，例如，用限制性內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生大的基因組DNA片段，并與DNA載體連接形成串聯(lián)體(concatemer)，其可被包裝于適合的載體中。為了制備cDNA文庫，從想要的組織如特定植物物種的葉片中分離mRNA，由該mRNA制備得到含有目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄物的cDNA文庫。或者，cDNA可由從其它表達PYR/PYL基因的組織中提取的mRNA制備得到。然后用基于本文中公開的PYR/PYL基因序列設(shè)計的探針篩選cDNA或基因組文庫。探針可用于與基因組DNA或cDNA序列雜交以分離相同或不同植物物種中的同源基因?；蛘?，針對多肽設(shè)計的抗體可用于篩選mRNA表達文庫?；蛘?，編碼PYR/PYL的核酸可采用擴增技術(shù)由核酸樣品擴增得到。例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)可用于直接從基因組DNA、cDNA、基因組文庫或cDNA文庫擴增得到編碼PYR/PYL的序列。PCR及其它體外擴增方法還可用于，例如克隆編碼表達PYR/PYL的核苷酸序列，制備用作探針的核酸用于檢測樣品中目的mRNA存在，用于核酸測序或用于其它目的。有關(guān)PCR的綜述見PCR手冊(PCRProtocols)：AGuidetoMethodsandApplications.(Innis,M,Gelfand,D.,Sninsky,J.andWhite,T.,eds.),AcademicPress,SanDiego(1990)。用于鑒定植物組織序列的適合的引物和探針，通過將本文中提供的序列與其它相關(guān)基因進行比較而產(chǎn)生。在一些實施方案中，許多植物的部分或全部基因組已經(jīng)進行了測序，且確定了開放閱讀框。通過BLAST搜索，人們可以確定各種植物中編碼PYR/PYL的序列。術(shù)語PYR/PYL多肽包括天然產(chǎn)生的PYR/PYL多肽(或編碼此類多肽的核酸)變體。變體包括，例如融合蛋白、仍保留活性的缺失或突變。在一些實施方案中，PYR/PYL多肽在ABA(或ABA激動劑)存在下激活(例如，以PP2C進行雙雜交檢測或其它受體檢測來測定)，但在無ABA或激動劑時不具有顯著活性。另外，在一些實施方案中，本發(fā)明的PYR/PYL多肽為組成型活性，即在ABA或ABA激動劑存在時具有活性。如實施例中描述的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)擬南芥中PYR1的H60P、M158T、M158I、M158S或M158V突變將蛋白變?yōu)榻M成型活性蛋白。由于這些位置(H60和M158)存在于PYR/PYL蛋白二聚體的表面，可以認(rèn)為通過在其它二聚體表面位置上(例如，F(xiàn)61、K63、I84、S85、L87、P88、A89、S152、D155、T156、F159、T162、L166和/或K170)引入氨基酸變化可以產(chǎn)生其它組成型突變。盡管上述位置是參考擬南芥PYR1蛋白設(shè)定的，然而其它PYR/PYL多肽中的相關(guān)位置也包含于上述說明中。用標(biāo)準(zhǔn)比對軟件如BLAST可以容易地確定其它PYR/PYL多肽中的相關(guān)位置。盡管以上描述了特定的氨基酸變化，本發(fā)明旨在包括上述特定氨基酸旁側(cè)的其它氨基酸的突變。在一些實施方案中，例如，保守氨基酸可包括在內(nèi)取代上述突變。有趣的是，本發(fā)明人觀察到一些天然出現(xiàn)的PYR/PYL蛋白在H60相關(guān)位置上天然具有一個P。例如，擬南芥PYL9在該位置上具有一個P。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)PYL9為組成型活性。在一些實施方案中，通過將“H60”位(參考擬南芥PYR1中的位置)上的脯氨酸改變?yōu)榻M氨酸或其它非脯氨酸的氨基酸，使組成型活性PYR/PYL蛋白轉(zhuǎn)化為受ABA或ABA激動劑激活的蛋白。因此，本發(fā)明提供組成型活性的且含有上述突變的PYR/PYL多肽。在一些實施方案中，所述組成型多肽包括一條或多條上述一致性序列和/或與SEQIDNOs:2-90之一大體相同的序列。VI.本發(fā)明PYR/PYL核酸和多肽的應(yīng)用本發(fā)明提供了通過改變PYR/PYL表達或活性，調(diào)節(jié)植物中ABA敏感性的方法，例如，通過向植物中引入含有與PYR/PYL核苷酸可操作連接的調(diào)控元件(例如，啟動子)的重組表達盒，所述PYR/PYL核苷酸即編碼PYR/PYL的核酸或含有PYR/PYLmRNA或其互補序列一部分的序列。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括增加和/或異位表達編碼植物中PYR/PYL多肽的一個或多個PYR/PYL多核苷酸。這種實施方案可用于提高植物的ABA敏感性，并導(dǎo)致例如增強的脅迫(例如，干旱)耐受和/或延遲的種子發(fā)芽(以避免過早萌發(fā)，例如可發(fā)生在潮濕的環(huán)境中或因其它暴露在濕氣中)。針對脅迫耐受，一般可選擇組成型且表達于大多數(shù)植物組織中，或者是葉或根特異的啟動子。為了影響種子發(fā)芽，一般使用能夠?qū)е略诜N子中，在一些實施方案中在花器官或胚中表達的啟動子。在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括降低植物中內(nèi)源PYR/PYL表達，從而降低植物中ABA敏感性。此類方法包括，例如植物中PYR/PYL序列的遺傳突變(例如，化學(xué)、輻射、轉(zhuǎn)座子或其它誘變)，以降低PYR/PYL表達或活性，或引入與PYR/PYLcDNA序列或其互補序列(例如，“RNAi構(gòu)建體”)至少部分大體相同的多核苷酸以降低PYR/PYL表達。下降的(或增強的)PYR/PYL表達可用于調(diào)控葉柄脫落區(qū)的形成，從而控制葉片脫落，即如果葉片脫落區(qū)中的表達降低，則延緩葉片脫落，如果葉子脫落區(qū)中的表達增加，則加速葉片脫落A.增加PYR/PYL表達或活性本文中制備的分離的序列還可用于制備能夠增強或提高PYR/PYL基因表達的表達盒。當(dāng)期望過表達目的基因時，可使用來自相同物種或不同物種(或與來自另一個物種的編碼PYR/PYL多肽的基因或核苷酸大體相同)的目的基因(或至少編碼PYR/PYL多肽的多核苷酸)。在一些實施方案中，為了降低潛在的正義抑制影響，可使用來自不同物種(或與來自另一個物種的編碼PYR/PYL多肽的基因或多核苷酸大體相同)的編碼PYR/PYL多肽的多核苷酸。可采用本領(lǐng)域熟知的眾多方法中的任何一種來增強植物中PYR/PYL活性。任何器官或植物部位可作為靶標(biāo)，如枝條的營養(yǎng)器官/結(jié)構(gòu)(例如葉、莖和塊莖)、根、花和花器官/結(jié)構(gòu)(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花藥和胚珠)、種子(包括胚、胚乳和種皮)、果實、脫落區(qū)等?；蛘?，一個或幾個PYR/PYL基因可組成型地表達(例如，使用CaMV35S啟動子或其它組成型啟動子)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道由本發(fā)明基因編碼的多肽，像其它蛋白一樣，具有行使不同功能的不同結(jié)構(gòu)域。因此，過表達或異位表達的多核苷酸序列不必是全長，只需表達想要的蛋白的結(jié)構(gòu)域?；蛘撸虼送?，活性PYR/PYL蛋白可以是在不必大大改變PYR/PYL活性下的融合表達。融合表達參與者(partners)的實例包括，但不限于，多組氨酸或其它標(biāo)簽序列。B.降低PYR/PYL表達或活性可采用許多方法抑制植物中基因表達。各種抑制基因表達的方法是已知的，并可用于抑制多個PYR/PYL基因之一的表達。見，例如美國專利Nos.5,759,829、5,107,065、5,231,020、5,283,184、6,506,559、6,573,099,6,326,193、7,109,393。例如，可方便地使用反義技術(shù)。為了實現(xiàn)該技術(shù)，克隆來自目的基因的一段核酸，并與啟動子可操作地連接，使RNA的反義鏈能夠被轉(zhuǎn)錄。然后將表達盒轉(zhuǎn)入植物中并生產(chǎn)RNA的反義鏈。在植物細(xì)胞中，已表明反義RNA通過阻止編碼目的酶的mRNA的累積而抑制基因表達，見，例如Sheehy等人,Proc.Nat.Acad.ScLUSA,85:8805-8809(1988)；Pnuelietal.,ThePlantCell6:175-186(1994)；andHiattetal,U.S.PatentNo.4,801,340。轉(zhuǎn)入植物中的反義核酸序列應(yīng)與內(nèi)源基因或被抑制的基因至少部分大體相同。然而，該序列不必與被抑制表達的基因完全相同。因此，僅編碼PYR/PYL多肽的一部分或PYR/PYLcDNA的一部分的反義或正義核酸分子，可用于生產(chǎn)PYR/PYL表達受到抑制的植物?？稍O(shè)計本發(fā)明的載體，使抑制效果可應(yīng)用于顯示出與靶基因同源或基本同源的基因家族中的其它蛋白。在一些實施方案中，可使用一種或多種反義或正義或其它siRNA核酸分子同時抑制多于一個PYR/PYL多肽的表達。用于反義抑制，相對于初級轉(zhuǎn)錄物或完全加工的mRNA而言，所引入的序列可不必是全長。一般地，更高的同源性可用于補償短序列的使用。而且，所引入的序列不必具有相同的內(nèi)含子或外顯子結(jié)構(gòu)，且非編碼區(qū)的同源性可同樣有效。例如，可使用約30或40個核苷酸之間的序列，在一些實施方案中，盡管可以使用至少約20、50、100、200或500個核苷酸的序列，然而應(yīng)當(dāng)使用約全長的核苷酸。還可使用催化RNA分子或核酶抑制PYR/PYL的表達?？稍O(shè)計與幾乎任何靶RNA特異配對的核酶，并在特定位置切斷磷酸二酯骨架，從而功能性滅活靶RNA。在進行切割時，核酶本身不發(fā)生變化，因此能夠循環(huán)使用并切割其它分子，使其成為真正的酶。反義RNA中含有的核酶序列使其具有RNA切割活性，從而提高了該構(gòu)建體的活性。已確定了許多類別的核酶。一類核酶衍生自植物中能夠自切割并復(fù)制的許多小環(huán)狀RNA。RNA或者單獨復(fù)制(類病毒RNA)或者隨輔助病毒(衛(wèi)星mRNA)一起復(fù)制。具體實例包括來自鱷梨日斑類病毒的RNA和來自煙草環(huán)斑病毒、盧塞恩瞬態(tài)條紋病毒、煙草絨斑駁病毒、茛菪斑駁病毒和地下三葉草斑駁病毒的衛(wèi)星RNA。靶RNA特異核酶的設(shè)計和使用描述于Haseloff等人Nature，334:585-591(1988)。抑制的另一種方法為正義抑制(又稱為共抑制)。引入含有沿啟動子正向上配置的核酸的表達盒，已證明是一種有效的阻斷靶基因轉(zhuǎn)錄的方法。采用該方法調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達的實例見，Napoli等人,ThePlantCell2:279-289(1990)；Flavell,Proc.Natl.Acad.ScI,USA91:3490-3496(1994)；KooterandMol,CurrentOpin.Biol.4:166-171(1993)；以及美國專利Nos.5,034,323、5,231,020和5,283,184.。一般地，只要抑制基因表達，就會出現(xiàn)一些引入序列的轉(zhuǎn)錄。該效果可能出現(xiàn)于本身不含編碼序列、而僅含有內(nèi)含子或與內(nèi)源序列的初級轉(zhuǎn)錄物中存在的序列同源的非翻譯序列的引入序列。一般引入序列與要被抑制的內(nèi)源序列大體相同。最小同源性一般高于約65％，更高的同源性能夠更有效地抑制內(nèi)源序列的表達。在一些實施方案中，使用具有較高同源的序列，例如，使用具有至少約80％，至少約95％或100％同源性的序列。根據(jù)反義調(diào)控，可設(shè)定并檢測效果，應(yīng)用于顯示出同源或大體同源的相似基因家族中的任何其它蛋白中。用于正義抑制，表達盒中所引入的序列相對于初級轉(zhuǎn)錄物或完全加工的mRNA而言，不需要完全一致，也不需要全長一致。優(yōu)選避免同時產(chǎn)生一些過表達的植物。比全長序列短的同源性更高的序列補償了長的、同源性較低的序列。而且，引入序列不必含有相同的內(nèi)含子或外顯子結(jié)構(gòu)，且非編碼區(qū)的同源性同等有效。在一些實施方案中，使用上述提到的用于反義調(diào)控的序列大小范圍，即30-40，或至少約20、50、100、200、500或更多核苷酸。還可以通過RNA干擾(RNAi)(事實上可以認(rèn)為共抑制是RNAi的一種類型)抑制內(nèi)源基因表達，其使用具有與靶基因序列相同或近似序列的雙鏈RNA。在RNAi現(xiàn)象中，當(dāng)具有與靶基因相同或近似序列的雙鏈RNA被引入細(xì)胞中時，插入的外源基因和靶內(nèi)源基因都受到抑制。所述雙鏈RNA可由兩條互補的RNA形成，或可以是一條具有內(nèi)部互補序列的RNA所形成的雙鏈RNA。盡管RNAi機制的詳情還不完全清楚，可以認(rèn)為引入的雙鏈RNA起始切割成小片段，然后以某些方式成為靶基因的指示(indexes)，從而降解靶基因。已知RNAi在植物中也是有效的(見，例如Chuang,C.F.&Meyerowitz,E.M.,Proc.Natl.Acad.ScLUSA97:4985(2000)；Waterhouse等人,Proc.Natl.Acad.ScLUSA95:13959-13964(1998)；Tabara等人Science282:430-431(1998)；Matthew,CompFunctGenom5:240-244(2004)；Lu等人,NucleicAcidsResearch32(21):el71(2004))。例如，為了抑制編碼蛋白的DNA的表達，采用RNAi，其具有編碼蛋白的DNA序列的雙鏈RNA，或使用其大體相同的序列(包括那些通過基因工程改造而不翻譯蛋白的序列)或其片段，被引入到目標(biāo)植物中。然后從所得植物中篩選與靶蛋白相關(guān)的表型和/或通過監(jiān)測編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)態(tài)RNA水平。盡管用于RNAi的基因不必完全與靶基因相同，它們可以與靶基因序列(例如，PYR/PYL)具有至少70％、80％、90％、95％或更高的同源性，見，例如美國專利公開No.2004/0029283。與靶基因不相關(guān)且位于目的基因的特異性序列遠(yuǎn)端、帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的編碼RNA分子的構(gòu)建體也可用于抑制靶基因表達。參見，例如美國專利公開No.2003/0221211。RNAi多核苷酸可包括全長靶RNA或與靶RNA的片段相對應(yīng)。在一些實例中，所述片段含有不到100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個與靶序列對應(yīng)的核苷酸。此外，在一些實施方案中，這些片段至少為，例如50、100、150、200或更長的核苷酸。在一些實例中，用于RNAi的片段應(yīng)至少與在有機體的其它蛋白中不出現(xiàn)的靶蛋白區(qū)大體相似，或可選擇與其它有機轉(zhuǎn)錄物盡可能不相似，例如，通過分析公眾可獲得的序列數(shù)據(jù)庫而比較序列進行選擇。將瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中不斷表達siRNA的表達載體改造成表達小發(fā)夾RNA，其在體內(nèi)加工成為能夠?qū)崿F(xiàn)基因特異沉默的siRNA分子(Brummelkamp等人,Science296:550-553(2002),以及Paddison等人,Genes&Dev.16:948-958(2002))。由雙鏈RNA引起的轉(zhuǎn)錄后基因沉默進一步詳細(xì)論述于Hammond等人,NatureRevGen2:110-119(2001),Fire等人,Nature391:806-811(1998)以及Timmons和FireNature395:854(1998)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，使用基于特定核苷酸序列的技術(shù)(例如，反義或正義抑制技術(shù))，同源基因家族可被一條正義或反義轉(zhuǎn)錄物抑制。例如，如果將正義或反義轉(zhuǎn)錄物設(shè)計成含有基因家族中保守的序列，那么基因家族中的眾多成員可被抑制。反之，如果目標(biāo)僅為抑制同源基因家族中的一個成員，那么正義或反義轉(zhuǎn)錄物應(yīng)靶向家族成員之間差異最大的序列。另一種抑制植物中PYR/PYL功能的方法是通過產(chǎn)生顯性負(fù)突變(dominantnegativemutation)。在該方法中，將仍保留與野生型亞單位發(fā)生作用的能力的非功能性PYR/PYL多肽突變引入植物中。顯性負(fù)構(gòu)建體還可用于抑制植物中PYR/PYL表達。本發(fā)明中使用的顯性負(fù)構(gòu)建體通常含有完整PYR/PYL編碼序列的一部分，其足以，例如，用于DNA結(jié)合或用于蛋白-蛋白相互作用，如同源二聚體或異源二聚體蛋白-蛋白相互作用，但其缺少野生型蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。VII.重組表達載體一旦獲得了PYR/PYL的編碼或cDNA序列，還可將它用于制備在轉(zhuǎn)基因植物中由異源啟動子指導(dǎo)的表達PYR/PYL蛋白的表達盒。增加的PYR/PYL多核苷酸表達是有益的，例如，生產(chǎn)抗旱性增強的植物。或者，如上所述，表達載體也可用于表達PYR/PYL多核苷酸及其能夠抑制內(nèi)源PYR/PYL表達的變體。任何本領(lǐng)域熟知的方法可用于提高或降低植物中PYR/PYL活性或表達。任何器官可被靶定位，如枝條營養(yǎng)器官/結(jié)構(gòu)(例如葉、莖和塊莖)、根、花和花器官/結(jié)構(gòu)(例如苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花藥和胚珠)、種子(包括胚、胚乳、種皮)和果實?；蛘?，PYR/PYL基因可以組成型表達(例如，用CaMV35S啟動子)。為了在上述技術(shù)中使用PYR/PYL編碼或cDNA序列，制備適用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重組DNA載體。用于轉(zhuǎn)化多種高等植物物種的技術(shù)是眾所周知的，并描述于技術(shù)和科學(xué)文獻中。參見，例如，Weising等人Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)。編碼PYR/PYL多肽的DNA序列優(yōu)選與轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)控序列結(jié)合，該調(diào)控序列指導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物的目標(biāo)組織中基因序列的轉(zhuǎn)錄。例如，植物啟動子片段可用于指導(dǎo)PYR/PYL基因在再生植株所有組織中的表達。本文中所指的這類啟動子為“組成型”啟動子，且在大多數(shù)環(huán)境條件下以及發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下具有活性。組成型啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，來自根癌農(nóng)桿菌T-DNA的1'-或2'-啟動子，以及來自本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種植物基因的其它轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。另外，植物啟動子可指導(dǎo)PYR/PYL蛋白在特定組織(組織特異性啟動子)中或在更嚴(yán)格的環(huán)境控制下(誘導(dǎo)型啟動子)的表達。受到發(fā)育控制的組織特異性啟動子包括僅在特定組織，如葉子或保衛(wèi)細(xì)胞(包括但不限于所描述于WO/2005/085449；美國專利No.6,653,535；Li等人，SciChinaCLifeSci.2005Apr；48(2):181-6；Husebye等人，PlantPhysiol,April2002,Vol.128,pp.1180-1188；以及Plesch等人，Gene,Volume249,Number1,16May2000,pp.83-89(7))中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。可影響誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件實例包括缺氧條件、升高的溫度或有光照。如果想要得到正確的蛋白表達，應(yīng)包括編碼區(qū)3'末端的多腺苷酸區(qū)。多腺苷酸區(qū)可來自天然基因，來自其它植物基因或來自T-DNA。含有所述序列(例如，啟動子或PYR/PYL編碼區(qū))的載體一般包括植物細(xì)胞中具有選擇表型的標(biāo)記基因。例如，標(biāo)記基因可編碼抗微生物劑(biocide)抗性，特別是抗生素抗性，如卡那霉素、G418、博萊霉素、潮霉素或除草劑抗性，如綠黃隆(chlorosluforon)或Basta抗性，在一些實施方案中，PYR/PYL核酸序列在植物細(xì)胞中重組表達以增強或提高總PYR/PYL多肽的水平?？芍苽涠喾N不同的表達構(gòu)建體，如表達盒及適于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體。用于轉(zhuǎn)化多種高等植物物種的技術(shù)是眾所周知的，并描述于技術(shù)和科學(xué)文獻中。見，例如，Weising等人Ann.Rev.Genet.22:421-477(1988)。編碼PYR/PYL蛋白的DNA序列可與順式作用(啟動子)和反式作用(增強子)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列結(jié)合以指導(dǎo)轉(zhuǎn)化植物目標(biāo)組織中轉(zhuǎn)錄的時間、組織類型和轉(zhuǎn)錄水平。還可以使用翻譯調(diào)控元件。本發(fā)明提供可以與在一些實施方案中能夠驅(qū)動植物中PYR/PYL編碼序列轉(zhuǎn)錄的啟動子可操作連接的PYR/PYL核酸。所述啟動子可以是，例如來自植物或病毒。所述啟動子可以是，例如，組成型活性、誘導(dǎo)型或組織特異性。在構(gòu)建本發(fā)明的重組表達盒、載體、轉(zhuǎn)基因時，可選擇不同啟動子，并用于差異指導(dǎo)基因表達，例如，在植物或動物的一些或全部組織中。A.組成型啟動子啟動子片段可以用來指導(dǎo)PYR/PYL核酸在所有轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織，例如，那些再生植物中的表達。術(shù)語“組成型調(diào)控元件”表示能夠使可操作連接的核酸分子，其相對獨立于該組成型調(diào)控元件表達的細(xì)胞或組織類型，具有表達水平的調(diào)控元件。表達于植物中的組成型調(diào)控元件一般廣泛表達于大量細(xì)胞和組織類型中。在生理條件下驅(qū)動連續(xù)表達的啟動子是指“組成型”啟動子，且在大多數(shù)環(huán)境條件下以及發(fā)育或細(xì)胞分化狀態(tài)下具有活性。用于轉(zhuǎn)基因植物中異位表達的多種組成型調(diào)控元件是本領(lǐng)域熟知的。例如，花椰菜花葉病毒35S(CaMV35S)啟動子，是一種很有特點的的組成型調(diào)控元件，其能夠在所有植物組織中產(chǎn)生高水平的表達(Odell等人，Nature313:810-812(1985))。由于CaMV35S啟動子在許多不同的植物物種中具有活性，因此它是特別有益的(Benfey和Chua,Science250:959-966(1990)；Futterer等人，Physiol.Plant79:154(1990)；Odell等人，同上,1985)。串聯(lián)35S啟動子(其中內(nèi)部啟動子元件被復(fù)制)與未修飾的35S啟動子相比具有更高的表達水平(Kay等人，Science236:1299(1987))。其它有用的組成型調(diào)控元件包括，例如花椰菜花葉病毒19S啟動子、玄參花葉病毒啟動子以及胭脂堿合酶(nos)基因啟動子(Singer等人，PlantMolBiol.14:433(1990)；An,PlantPhysiol.81:86(1986))。其它組成型調(diào)控元件包括那些本領(lǐng)域已知的在單子葉植物中有效表達的調(diào)控元件，例如pEmu啟動子和基于水稻肌動蛋白-1(Actin-1)5'區(qū)的啟動子(Last等人,Theor.ApplGenet.81:581(1991)；Mcelroy等人,MolGen.Genet.231:150(1991)；Mcelroy等人,PlantCell2:163(1990))。結(jié)合來自不同基因的元件的嵌合型調(diào)控元件，也可以用于異位表達編碼PYR/PYL蛋白的核酸分子(Comai等人,PlantMol.Biol.15:373(1990))。其它組成型啟動子的實例包括衍生自根癌農(nóng)桿菌T-DNA的1'-或2'-啟動子(見，例如Mengiste(1997)同上；O'Grady(1995)PlantMol.Biol.29:99-108)；肌動蛋白啟動子，如擬南芥肌動蛋白基因啟動子(見，例如Huang(1997)PlantMol.Biol.199733:125-139)；乙醇脫氫酶(Adh)基因啟動子(見，例如Millar(1996)PlantMol.Biol31:897-904)；來自擬南芥的ACT11(Huang等人,PlantMolBiol.33:125-139(1996))，來自擬南芥的Cat3(GenBankNo.U43147,Zhong等人，MolGen.Genet.251:196-203(1996)),來自甘藍型油菜的編碼硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶的基因(GenbankNo.X74782,Solocombe等人，PlantPhysiol.104:1167-1176(1994)),來自玉米的Gpc1(GenBankNo.X15596,Martinez等人J.Mol.Biol208:551-565(1989)),來自玉米的Gpc2(GenBankNo.U45855,Manjunath等人,PlantMol.Biol.33:97-112(1997))，其它來自各種植物基因的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。還參見HoltorfPlantMol.Biol.29:637-646(1995)。B.誘導(dǎo)型啟動子另外，植物啟動子可指導(dǎo)PYR/PYL基因在改變的環(huán)境條件或發(fā)育條件的影響下的表達?？捎烧T導(dǎo)型啟動子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實例包括缺氧條件、升高的溫度、干旱或有光照。這類啟動子在本文中是指“誘導(dǎo)型”啟動子。例如，本發(fā)明可以整合干旱特異啟動子如玉米的干旱誘導(dǎo)型啟動子(Busk(1997)同上)；或其它來自馬鈴薯的寒冷、干旱及高鹽誘導(dǎo)型啟動子(Kirch(1997)PlantMol.Biol.33:897-909)。另外，暴露于植物激素，如植物生長激素的誘導(dǎo)型植物啟動子可用于表達PYR/PYL基因。例如，本發(fā)明可以使用大豆(GlycinemaxL)中的植物生長激素響應(yīng)元件E1啟動子片段(AuxREs)(Liu(1997)PlantPhysiol.115:397-407)；植物生長激素響應(yīng)擬南芥GST6啟動子(也對水楊酸和過氧化氫有響應(yīng))(Chen(1996)PlantJ.10:955-966)；來自煙草的植物生長激素誘導(dǎo)型parC啟動子(Sakai(1996)37:906-913)；植物生物素響應(yīng)元件(Streit(1997)Mol.PlantMicrobeInteract.10:933-937)；以及對逆境激素(stresshormone)脫落酸響應(yīng)的啟動子(Sheen(1996)Science274:1900-1902)。暴露于可用于植物的化學(xué)試劑，如除草劑或抗生素的植物誘導(dǎo)型啟動子，也可用于表達PYR/PYL基因。例如，可以使用由苯磺酰胺除草安全劑(benzenesulfonamideherbicidesafeners)激活的玉米In2-2啟動子(DeVeylder(1997)PlantCellPhysiol.38:568-577)；應(yīng)用不同的除草安全劑誘導(dǎo)不同的基因表達模式，包括在根、排水孔以及芽分生組織中的表達。PYR/PYL編碼序列還可以在例如四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子的控制下，例如所述含有燕麥L.(燕麥)精氨酸脫羧酶基因(Masgrau(1997)PlantJ.11:465-473)的轉(zhuǎn)基因煙草；或水楊酸響應(yīng)元件(Stange(1997)PlantJ.11:1315-1324；Uknes等人,PlantCell5:159-169(1993)；Bi等人,PlantJ.8:235-245(1995))。有用的誘導(dǎo)型調(diào)控元件的實例包括銅誘導(dǎo)型調(diào)控元件(Mett等人,Proc.Natl.Acad.ScLUSA90:4567-4571(1993)；Furst等人,Cell55:705-717(1988))；四環(huán)素和氯四環(huán)素誘導(dǎo)型調(diào)控元件(Gatz等人,PlantJ.2:397-404(1992)；Roder等人,Mol.Gen.Genet.243:32-38(1994)；Gatz,Meth.CellBiol.50:411-424(1995))；蛻皮激素誘導(dǎo)型調(diào)控元件(Christopherson等人,Proc.Natl.Acad.ScLUSA89:6314-6318(1992)；Kreutzweiser等人,Ecotoxicol.Environ.Safety28:14-24(1994))；熱休克誘導(dǎo)型調(diào)控元件(Takahashi等人,PlantPhysiol.99:383-390(1992)；Yabe等人,PlantCellPhysiol.35:1207-1219(1994)；Ueda等人,Mol.Gen.Genet.250:533-539(1996))；以及l(fā)ac操縱子元件，其用于與組成型表達的lac阻遏劑結(jié)合以實現(xiàn)，例如IPTG誘導(dǎo)型表達(Wilde等人,EMBOJ.11:1251-1259(1992))。用于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物中的誘導(dǎo)型調(diào)控元件還可以是，例如來自菠菜亞硝酸鹽還原酶基因的硝酸鹽誘導(dǎo)型啟動子(Back等人,PlantMol.Biol.17:9(1991))或光誘導(dǎo)型啟動子，例如與RuBP羧化酶的小亞單位或LHCP基因家族結(jié)合的調(diào)控元件(Feinbaum等人,Mol.Gen.Genet.226:449(1991)；Lam和Chua,Science248:471(1990))。C.組織特異性啟動子另外，植物啟動子可指導(dǎo)特異組織中(組織特異啟動子)PYR/PYL基因的表達。組織特異啟動子是僅在植物發(fā)育的特定時期的特定細(xì)胞或組織，如營養(yǎng)組織或生殖組織中具有活性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。發(fā)育調(diào)控下的組織特異啟動子的實例包括僅(或主要僅)起始特定組織中的轉(zhuǎn)錄，如營養(yǎng)組織，例如根或葉，或繁殖組織，如果實、胚珠、種子、花粉、柱頭(pistol)、花或任何胚組織(embryonictissue)或表皮或葉肉。繁殖組織特異啟動子可以是，例如，胚珠特異、胚特異、胚乳特異、珠被特異、種子及種皮特異、花粉特異、花瓣特異、萼片特異或一些它們的組合。在一些實施方案中，所述啟動子為細(xì)胞型特異，例如保衛(wèi)細(xì)胞特異。其它組織特異啟動子包括種子啟動子。適合的種子特異啟動子來自以下基因：玉米MAC1基因(Sheridan(1996)Genetics142:1009-1020)；玉米Cat3基因(GenBankNo.L05934,Abler(1993)PlantMol..Biol.22:10131-1038)；擬南芥vivparous-1基因(GenbankNo.U93215)；擬南芥atmyc1基因(Urao(1996)PlantMol.Biol.32:571-57；Conceicao(1994)Plant5:493-505)；甘藍型油菜napA基因(GenBankNo.J02798,Josefsson(1987)JBL26:12196-1301)；以及甘藍型油菜napin基因家族(Sjodahl(1995)Planta197:264-271)。在營養(yǎng)組織，如葉、莖、根和塊莖中具有特異活性的多種啟動子也可用于表達編碼PYR/PYL多肽的多核苷酸(或RNAi或反義或正義構(gòu)建體)。例如，可使用控制馬鈴薯塊莖中主要貯藏蛋白patatin的啟動子，見，例如Kim(1994)PlantMol.Biol.26:603-615；Martin(1997)PlantJ.11:53-62。還可以使用來自毛根農(nóng)桿菌，在根中顯示高活性的ORF13啟動子(Hansen(1997)Mol.Gen.Genet.254:337-343)。其它有用的營養(yǎng)組織特異啟動子包括：來自主要的芋頭(ColocasiaesculentaL.Schott)球莖蛋白家族的編碼球蛋白的基因的tarin啟動子，tarin(Bezerra(1995)PlantMol.Biol.28:137-144)；芋頭球莖發(fā)育期間有活性的仙茅甜蛋白啟動子(deCastro(1992)PlantCell4:1549-155)以及馬鈴薯根特異基因TobRB7啟動子，其表達位于根分生組織和未成熟的中軸區(qū)(Yamamoto(1991)PlantCell3:371-382)。可以使用葉特異啟動子，如核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS)啟動子。例如，馬鈴薯RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因表達于葉子和光種植苗中，僅RBCS1和RBCS2表達于發(fā)育的馬鈴薯果實(Meier(1997)FEBSLett.415:91-95)中?？梢允褂脦缀鮾H在葉片的葉肉細(xì)胞和葉鞘中高水平表達的核酮糖二磷酸羧化酶啟動子，描述于Matsuoka(1994)PlantJ.6:311-319。另一種葉特異啟動子是集光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因啟動子，見，例如Shiina(1997)PlantPhysiol.115:477-483；Casal(1998)PlantPhysiol.116:1533-1538。擬南芥myb相關(guān)基因啟動子(Atmyb5)，描述于Li(1996)FEBSLett.379:117-121，是葉特異啟動子。Atmyb5啟動子表達于發(fā)育的葉毛、托葉及叢生(rosette)和莖生(cauline)嫩葉邊緣的表皮細(xì)胞中，并表達于未成熟的種子中。Atmyb5mRNA出現(xiàn)在受精和胚發(fā)育的16細(xì)胞階段并持續(xù)至心形期(heartstage)之后?？梢允褂糜葿usk(1997)PlantJ.11:1285-1295，在玉米中鑒定的葉啟動子。另一類有用的營養(yǎng)組織特異啟動子是分生組織(根尖和莖尖)啟動子。例如，可以使用由DiLaurenzio(1996)Cell86:423-433；以及Long(1996)Nature379:66-69描述的“SHOOTMERISTEMLESS”和“SCARECROW”啟動子，其在發(fā)育的莖尖或根尖分生組織中具有活性。另一種有用的啟動子可以控制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶HMG2基因，其表達限于分生組織和花(氣孔的分泌區(qū)、成熟花粉粒、雌蕊群的維管組織和受精的胚珠)組織中(見，例如Enjuto(1995)PlantCell.7:517-527)。還可以使用的是玉米kn-1相關(guān)基因以及具有分生特異表達的其它物種，見，例如Granger(1996)PlantMol.Biol.31:373-378；Kerstetter(1994)PlantCell6:1877-1887；Hake(1995)Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci350:45-51。例如，擬南芥KNAT1啟動子(見，例如Lincoln(1994)PlantCell6:1859-1876)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道組織特異啟動子可以促使可操作連接序列在組織中表達，而不僅僅是在靶組織中表達。因此，本文中使用的組織特異啟動子是能夠優(yōu)先促使在靶組織表達的啟動子，但是也可以導(dǎo)致在其它組織中的一些表達。在另一實施方案中，PYR/PYL多核苷酸通過轉(zhuǎn)座元件表達。這允許組成型活性多肽的組成性、然而是周期性和不頻繁的表達。本發(fā)明還提供衍生自病毒的組織特異啟動子的應(yīng)用，所述啟動子包括例如煙草花葉病毒亞基因組啟動子(Kumagai(1995)Proc.Natl.Acad.ScLUSA92:1679-1683)；水稻東格魯桿狀病毒(RTBV)，其僅在感染的水稻植株的韌皮細(xì)胞中復(fù)制，它的啟動子驅(qū)動韌皮特異報告基因的高表達；木薯脈花葉病毒(CVMV)啟動子，其在維管元件、葉子的葉肉細(xì)胞和根尖中具有高活性(Verdaguer(1996)PlantMol.Biol.31:1129-1139)。VIII.轉(zhuǎn)基因植株的生產(chǎn)如本文中詳細(xì)描述的，本發(fā)明提供含有用于在植物中表達PYR/PYL蛋白或用于抑制或降低內(nèi)源PYR/PYL表達的重組表達盒的轉(zhuǎn)基因植物。因此，在一些實施方案中，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，其含有內(nèi)源PYR/PYL編碼多核苷酸的完整或部分序列，用于增強或降低PYR/PYL表達及活性。在一些實施方案中，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，其含有與內(nèi)源PYR/PYL編碼多核苷酸基本上同源的多核苷酸的完整或部分序列，用于增強或降低PYR/PYL表達及活性。在一些實施方案中，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，其含有來自物種而不僅僅是轉(zhuǎn)基因植物物種的多核苷酸的完整或部分序列。應(yīng)理解的是，轉(zhuǎn)基因植物包括引入表達盒的植物或植物細(xì)胞以及這些植物或植物細(xì)胞的含有所述表達盒的后代，包括表達盒已穩(wěn)定整合至染色體中的后代。含有由異源啟動子驅(qū)動的PYR/PYL編碼序列的重組表達載體可以通過各種常規(guī)技術(shù)引入目的植物宿主的基因組中。例如，采用技術(shù)如電穿孔以及植物細(xì)胞原生質(zhì)的基因槍法，可以將DNA構(gòu)建體直接引入植物細(xì)胞的基因組DNA中，或采用轟擊的方法，如DNA粒子轟擊，將DNA構(gòu)建體直接引入植物組織中。或者，DNA構(gòu)建體可以與適合的T-DNA旁側(cè)區(qū)結(jié)合并轉(zhuǎn)入常規(guī)的根癌農(nóng)桿菌宿主載體中。根癌農(nóng)桿菌宿主的侵入功能將指導(dǎo)構(gòu)建體和相鄰標(biāo)記，在當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)菌侵染時，插入到植物細(xì)胞DNA中。本發(fā)明還包括PYR/PYL的瞬時表達，一般本發(fā)明構(gòu)建體的表達是將表達盒插入植物基因組中，例如，使至少一些植物后代也含有整合的表達盒。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，還可以使用基因槍技術(shù)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，且完整地描述于文獻中。采用聚乙二醇沉淀的方法引入DNA構(gòu)建體描述于Paszkowski等人EMBOj.3:2717-2722(1984)中。電穿孔技術(shù)描述于Fromm等人Proc.Natl.Acad.ScLUSA82:5824(1985)。轟擊轉(zhuǎn)化技術(shù)描述于Klein等人Nature327:70-73(1987)。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，包括解毒(disarming)和使用雙元載體，詳細(xì)地描述于科學(xué)文獻中。見，例如Horsch等人Science233:496-498(1984),和Fraley等人Proc.Natl.Acad.ScLUSA80:4803(1983)。由上述轉(zhuǎn)化技術(shù)得到的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可培養(yǎng)再生成為具有轉(zhuǎn)化的基因型的整株植物，因此獲得了想要的表型如增強的抗旱性。此類在再生技術(shù)有賴于組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中含有的特定的植物激素，一般有賴于與目的核苷酸序列一起引入的抗微生物劑和/或除草劑標(biāo)記。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生的植物描述于Evans等人,ProtoplastsIsolationandCulture,HandbookofPlantCellCulture,pp.124-176,MacMillilanPublishingCompany,NewYork,1983；以及Binding,RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,pp.21-73,CRCPress,BocaRaton,1985。再生還可以由植物愈傷組織、外植體、器官或它們的部位獲得。這種再生技術(shù)一般描述于Klee等人Ann.Rev.ofPlantPhys.38:467-486(1987)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，在表達盒穩(wěn)定地整合至轉(zhuǎn)基因植物并確定是可操作的之后，可通過有性雜交引入其它植物中?？筛鶕?jù)待雜交的物種，使用任何一種標(biāo)準(zhǔn)的繁殖技術(shù)。本發(fā)明的表達盒可用于賦予幾乎任何植物抗旱性。因此，本發(fā)明使用了大量植物，包括以下屬的物種，天門冬屬、顛茄屬、燕麥屬、蕓薹屬、柑桔屬、西瓜屬、辣椒屬、黃瓜屬、南瓜屬、胡蘿卜屬、草莓屬、大豆屬、棉花屬、向日葵屬、萱草屬、大麥屬、天仙子屬、萵苣屬、亞麻屬、黑麥草屬、番茄屬、蘋果屬、木薯屬、墨角蘭屬、苜蓿屬、煙草屬、稻屬、稷屬、狼尾草屬、鱷梨屬、豌豆屬、犁屬、李屬、蘿卜屬、黑麥屬、千里光屬、白芥屬、茄屬、高梁屬、胡蘆巴屬、小麥屬、葡萄屬、豇豆屬和玉蜀黍?qū)?。在一些實施方案中，所述植物選自下組：水稻、玉米、小麥、大豆、棉花、油菜、草坪草和苜蓿。在一些實施方案中，所述植物為觀賞植物。在一些實施方案中，所述植物為蔬菜型或產(chǎn)果實的植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，許多植物品種可用作模型來預(yù)測在其它植物中的轉(zhuǎn)基因表達的表型效果。例如，應(yīng)知道煙草(煙草屬)和擬南芥是很有用的轉(zhuǎn)基因表達模型，特別是在其它雙子葉植物中。本發(fā)明的植物具有增強的或降低的脫落酸敏感性，與其它植物相比除表達PYR/PYL外，別的方面是一樣的。脫落酸敏感性的監(jiān)測可通過觀察或測定由ABA介導(dǎo)的任何表型。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道，ABA是經(jīng)過了深入研究的植物激素，ABA介導(dǎo)了許多特征的變化，可監(jiān)測任何一種特征的變化以確定ABA敏感性是否已被調(diào)節(jié)。在一些實施方案中，被調(diào)節(jié)的ABA敏感性是通過改變的種子發(fā)芽時間及改變的脅迫(例如，干旱)耐受呈現(xiàn)出來的?？梢愿鶕?jù)任何一種眾所周知的技術(shù)檢測抗旱性。例如，植物能夠在低于最適供給植物水分的條件下生長。可采用任何一種標(biāo)準(zhǔn)方法測定抗旱性，包括膨脹壓力、長勢、產(chǎn)量等。在一些實施方案中，所述方法描述于實施例部分，以下方法可被方便地使用。實施例以下提供的實施例用于說明，但不限制所要保護的發(fā)明。實施例1：PYR/PYL調(diào)節(jié)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與針對ABA結(jié)合蛋白的生物化學(xué)篩選不同，集中于ABA感知的遺傳分析尚未鑒定出蛋白組裝受體，這表明受體可能功能性冗余，具有重疊功能或不能突變產(chǎn)生活配子或種苗(P.McCourt,AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology50,219(1999))。作為補充的方法，我們在植物中采取了化學(xué)遺傳策略(Y.Zhao等人,NatChemBiol3,716(2007))。該方法適用于具有高冗余基因組的有機體，由于小分子可變的選擇性能夠產(chǎn)生單個基因突變所不能顯現(xiàn)的表型(N.Raikhel,M.Pirrung,PLANTPHYSIOLOGY138,563(2005)；S.Cutler,P.McCourt,PlantPhysiol.138,558(2005))。例如，低敏感性的拮抗劑能夠干擾整個蛋白家族的功能(如采用微管拮抗劑觀察到的)，而高敏感性激動劑能夠揭示正常冗余受體的單獨成員的功能，如本文中我們用帕雷巴克汀3描述的(圖1A)。帕雷巴克汀(Pyrabactin)是種子選擇型ABA激動劑作為早期研究的一部分，我們鑒定了稱為帕雷巴克汀的發(fā)芽抑制劑(Y.Zhao等人，NatChemBiol3,716(2007))。通過測定多個野生材料(accessions)對帕雷巴克汀的敏感性，我們發(fā)現(xiàn)ColdSpringHarborLab野生型，其為ABA高敏感并可高度休眠(hyperdormant)，還對帕雷巴克汀高敏感，但不是一種阿帕雷巴克汀(apyrabactin)4滅活類似物(圖1A)。這表明帕雷巴克汀可通過ABA響應(yīng)通路發(fā)生作用。為了驗證這一假設(shè)，我們檢測了ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生物合成或赤霉酸(GA)感知改變的帕雷巴克汀敏感性突變系。我們發(fā)現(xiàn)ABA感知而不是生物合成突變株影響帕雷巴克汀敏感性(圖1B)。此外，rgl2-1突變系，其發(fā)芽期間不需要GA(S.Lee等人,GenesDev.16,646(March1,2002,2002))，具有正常的帕雷巴克汀敏感性(圖1B)?？傊@些觀測表明帕雷巴克汀通過激活A(yù)BA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而不是通過調(diào)節(jié)ABA或GA生物合成來抑制發(fā)芽。接下來我們進行了微陣列試驗以評價由ABA和帕雷巴克汀處理所誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)的相似性。用于微陣列試驗，我們制備了組織以及從播種于0.5XMS培養(yǎng)基(每個150mm直徑平板約2500個種子)的Columbia野生型種子中提取RNA，所述培養(yǎng)基或者含有1μMABA、25μM帕雷巴克汀、25μM2,4-二硝基苯酚(DNP)、1μM放線菌酮、2μM甲氨喋呤或含有1％DMSO的對照平板(所有化學(xué)物質(zhì)溶于DMSO中)。根據(jù)劑量曲線分析，將這些實驗使用的濃度進行標(biāo)準(zhǔn)化用于發(fā)芽抑制活性，即當(dāng)抑制后3天打分，所需的兩種化合物的量確保100％發(fā)芽抑制。ABA(±立體異構(gòu)體)、DNP、放線菌酮和甲氨喋呤均購自SigmaAldrich。將種子層積處理4天，置于黑暗處于室溫培養(yǎng)24小時。收集種子，在液氮中冷凍，然后用冷凍的研缽和研杵將種子研磨成細(xì)粉末，然后用RNAqueous試劑盒(Ambion；Austin,USA)提取總RNA用于第一套重復(fù)樣品。隨后RNA提取物用酚氯仿提取法進行提取，其描述于(Y.Suzuki,T.Kawazu,H.Koyama,Biotechniques,37,542(Oct,2004))。對于每一份總RNA樣品，根據(jù)GeneQuantRNA/DNACalculator(定量儀)(GEHealthcareBio-SciencesCorp.；NewJersey,USA)，將1μlRNA定量于99μl10mMTris-Cl(pH7.4)中，在260nm和280nm下測定吸收值。根據(jù)OD260/OD280比測定RNA純度(比值在1.7和2.2之間才可以使用)，通過凝膠電泳測定RNA的量。根據(jù)制造商(Enzokit；Affymetrix；SantaClara,USA)的描述，采用寡dT引物將總RNA樣品轉(zhuǎn)化為生物素標(biāo)記的cRNA，并與22KATHlAffymetrix微陣列在CAGEF(UniversityofToronto)中雜交。雙份生物復(fù)制樣品用于DNP、放線菌酮和甲氨喋呤雜交，三份用于對照，四份樣品用于帕雷巴克汀和ABA處理雜交。通過如GCOS/MAS5.0算法(Affymetrix；SantaClara,USA)所述的用于微陣列的統(tǒng)計算法，將帶有表達信號的探針組稱為表達(present)或臨界表達(marginal)。微陣列的顯著性分析用于鑒定主要由處理所調(diào)節(jié)的探針組，采用未取對數(shù)的數(shù)據(jù)(unloggeddata)，錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)約5％。將平均轉(zhuǎn)錄水平與對照值比較以計算倍數(shù)的變化，依次進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，用于計算各實驗之間的Pearson相關(guān)系數(shù)。我們首先檢查了用兩種化合物處理24小時的種子。由于對幼苗發(fā)育的抑制效應(yīng)，任何兩種發(fā)芽抑制劑都會有某些共同的響應(yīng)；因此我們使用之前定義的一套發(fā)芽響應(yīng)轉(zhuǎn)錄物(G.W.Bassel等人,PlantPhysiol147,143(2008))使比較中的發(fā)育影響最小化。采用SAM分析(V.G.Tusher,R.Tibshirani,G.Chu,Proc.Nat'I.Acad.ScLUSA98,5116(2001))，在去掉403個發(fā)芽調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄物后，鑒定出1225個探針組對ABA或帕雷巴克汀有響應(yīng)。比較探針對帕雷巴克汀和ABA響應(yīng)的分散圖顯示出高相關(guān)響應(yīng)(r＝0.98；圖1C)，與帕雷巴克汀激活A(yù)BA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的假設(shè)一致。作為對照，我們還繪制了三種發(fā)育抑制劑(G.W.Bassel等人，PlantPhysiol147,143(2008))放線菌酮、甲氨喋呤和2,4-二硝基苯酚的效果，與ABA處理(r＝0.36、0.73和0.81；放線菌酮示于圖1D)相比，觀察到微弱的轉(zhuǎn)錄物響應(yīng)。這表明間接的發(fā)育影響不足以解釋(accountfor)帕雷巴克汀的類ABA轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。為了證實帕雷巴克汀是否為一般的ABA激動劑，我們檢測了其在用任何一種化合物處理24小時的幼苗中的活性，顯示出帕雷巴克汀誘導(dǎo)了幼苗組織中(圖1E)極其沉默的ABA響應(yīng)(r＝0.72)。為了進行幼苗微陣列實驗，將Columbia野生型種子進行表面殺菌并播種于0.5XMS,0.6％(w/v)瓊脂平板(15mg種子，每個150mm直徑大小的平板含有25ml培養(yǎng)基)中，然后于4℃層級處理4天，并在24小時光照下于室溫生長9天。然后將40株幼苗轉(zhuǎn)移至DMSO對照、10μMABA或33μM帕雷巴克汀平板中并返回至生長環(huán)境24小時，然后采用上述方法提取總RNA。每種處理進行三份樣品雜交。用于幼苗實驗的濃度是基于所需抑制初生根生長相等量的ABA或帕雷巴克汀濃度，即它們是根據(jù)測定的生物活性而標(biāo)準(zhǔn)化的濃度，在這些實驗中，57個轉(zhuǎn)錄物對帕雷巴克汀和ABA顯著響應(yīng)，這表明帕雷巴克汀可誘導(dǎo)幼苗中ABA響應(yīng)的各個方面。然而，由于實驗中3021個轉(zhuǎn)錄物對ABA而不是帕雷巴克汀顯示出顯著的響應(yīng)，我們推論與ABA相比，帕雷巴克汀對于種子途徑(seedpathway)更具有選擇性。帕雷巴克汀確實能激活(agonize)植物組織中的ABA響應(yīng)。PYR1，一種START蛋白，對于帕雷巴克汀發(fā)揮作用是必要的為了分析帕雷巴克汀的作用機制，我們從篩選的約450,000EMS誘變處理的M2種子中共分離出16株帕雷巴克汀不敏感突變系。將表面殺菌的EMS種子播種于含有25μM帕雷巴克汀的0.33XMS培養(yǎng)基(每個150mm直徑大小的平板50mg種子)中。種子置于4℃層積處理4天，在持續(xù)光照下室溫生長4天，然后給平板打分，得到對帕雷巴克汀的發(fā)芽抑制效應(yīng)具有抗性的突變。完全展開子葉的幼苗被認(rèn)為是具有抗性的，然后對所有被鑒定為具有抗性的突變再檢測它們的下一代以鑒定真正的突變。用約400株植物群體(來自與Ler雜交產(chǎn)生的后代)以強pyr1-7等位基因繪制Pyr1圖譜。這將Pyr1限定為含有12個基因的約150Kb大小的間隔。對該間隔的12個基因進行測序并在At4g17870(Pyr1)鑒定出終止密碼子后，首次證明了Pyr1的一致性。然后，對分離的16株突變中的14株的Pyr1編碼序列進行測序，通過基于克隆以及對在相同座位,抗帕雷巴克汀1(PYRABACTINRESISTANCE1)(Pyr1)上含有突變的進行測序而繪制的圖譜來確定12株獨立的植株。Pyr1編碼的蛋白是START/Betv1超家族中的一個成員，該家族中的成員共同具有一個保守的配體結(jié)合螺旋夾結(jié)構(gòu)(helix-griparchitecture)(L.M.Iyer,E.V.Koonin,L.Aravind,Proteins:Structure,Function,andGenetics43,134(2001)；C.Radauer,P.Lackner,H.Breiteneder,BMCEvolBiol8,286(2008))。PYR1位于與細(xì)菌聚酮合成酶/環(huán)化酶以及其它非酶蛋白相似的Betv1亞家族中(C.Radauer,P.Lackner,H.Breiteneder,BMCEvolBiol8,286(2008))。通過BLAST搜索，在擬南芥基因組中有13個基因顯示出與Pyr1具有顯著的相似性，將它們命名為PYL1-PYL13(對于類PYL1；它們的AGI列于表1中)。推測我們分離出的帕雷巴克汀不敏感pyr1等位基因在PYR1中產(chǎn)生多種缺陷，包括截短和非保守氨基酸替換(圖2A)。將35S:：GFP-PYR1表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至強pyr1-1突變系中，恢復(fù)種子的帕雷巴克汀敏感性(圖2C)，其進一步支持了PYR1對于帕雷巴克汀發(fā)揮作用是必須的。沒有一個分離出的pyr1等位基因顯示出高的ABA不敏感性，其如以下所述，解釋為由于冗余的Pyr1相關(guān)物(包括但不限于Pyr1、2、4)的作用。通過查詢公開的微陣列數(shù)據(jù)庫(M.Schmid等人,NatGenet37,501(2005)；K.Nakabayashi,M.Okamoto,T.Koshiba,Y.Kamiya,E.Nambara,PlantJ41,697(Mar,2005)；H.Goda等人,PlantJ55,526(Aug,2008)；D.Winter等人,PLoSONE2,e718(2007)；Y.Yang,A.Costa,N.Leonhardt,R.S.Siegel,J.I.Schroeder,PlantMethods4,6(2008))，可清楚地知道Pyr1mRNA在種子和保衛(wèi)細(xì)胞中高表達，且對ABA響應(yīng)(圖2B)，與PYR1在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用一致。表1：PYR/PYL家族成員及相應(yīng)的擬南芥基因組測序計劃(AGI)注釋GeneAGIPyr1AT4G17870Py11AT5G46790Py12AT2G26040Py13AT1G73000Py14AT2G38310Py15AT5G05440Py16AT2G40330Py17AT4G01026Py18AT5G53160Py19AT1G01360Py110AT4G27920Py111AT5G45860Py112AT5G45870Py113AT4G18620PYR/PYL蛋白結(jié)合PP2Cs響應(yīng)ABA假設(shè)PYR1對于帕雷巴克汀發(fā)揮作用是必須的，并推測其為配體結(jié)合蛋白，我們假定帕雷巴克汀通過誘導(dǎo)PYR1和下游效應(yīng)物之間的蛋白-蛋白相互作用激活A(yù)BA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了驗證這種假設(shè)，在含有10μM帕雷巴克汀的培養(yǎng)基上，篩選約兩百萬作用于PYR1Y2H誘餌構(gòu)建體的cDNA克隆。為了制備PYR1Y2H誘餌構(gòu)建體，通過PCR從基因組DNA中擴增Pyr1開放閱讀框，將其克隆至pGem-Teasy載體(Promega)上。進行測序確認(rèn)后，然后將Pyr1ORF框內(nèi)(in-frame)克隆至pBD-GAL4Cam載體(Stratagene)的EcoRI和SalI位點之間，并轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y190中。使用黃化苗cDNA文庫(J.Kim,K.,Harter,A.,Theologis,ProcNatlAcadSciUSA94,11786(Oct28,1997))(ABRCstockCD4-22)進行篩選。首先將該cDNA文庫從噬菌體轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒DNA，產(chǎn)生7.6x107個轉(zhuǎn)化子。然后用由文庫制備的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化Y190，如GAL4雙雜交系統(tǒng)手冊(Stratagene)中所描述。用于每個篩選，將40μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至1ml帶有誘餌構(gòu)建體的感受態(tài)Y190細(xì)胞中，然后在不含有His、Leu和Trp,但含有15mM3-AT和10μM帕雷巴克汀的SD瓊脂平板上生長。于30℃培養(yǎng)4天后，收獲長勢好的菌落并采用濾膜分析檢測(filterliftassay)或氯仿瓊脂覆蓋法以及X-Gal染色，進行交互驗證。鑒定出兩株帕雷巴克汀依賴型樣本(hits)，經(jīng)測序確定其編碼PP2CHAB1的cDNA，與特點明顯的ABA響應(yīng)因子ABI1具有很近的親緣關(guān)系(A.Saez等人,ThePlantJournal37,354(2004)；N.Leonhardt等人,THEPLANTCELL16,596(2004))。然后，使表達AD-HAB1融合蛋白和BD-PYR1融合蛋白的Y2H菌株生長于平板中，并測試它們與各種化合物的相互作用，除了表油菜素內(nèi)酯(50nM)和二甲基亞砜(DMSO)(載體溶劑，1％)之外，其它化合物為10μM。當(dāng)在(+)-ABA測試帕雷巴克汀響應(yīng)PYRl-HABlY2H菌株時，通過X-gal染色觀察到強烈的相互作用，但是在(-)-ABA、激動素、2,4-D、赤霉酸(GA)、表油菜素內(nèi)酯(BR)、茉莉酸甲酯(meJA)或阿帕雷巴克汀(apyrabactin)中都沒有顯示出活性(圖3A)。因此，PYRl與HABl作用是以(+)-ABA依賴的方式。為了驗證ABA及帕雷巴克汀響應(yīng)對于PYR1是否是唯一的，我們采用表達AD-HAB1融合蛋白和BD-PYR/PYL融合蛋白(列于圖3A左側(cè))的Y2H菌株測試了上述13個PYL蛋白中的11個。以與對于上述BD-PYR1相同方式構(gòu)建BD-PYR/PYL融合蛋白。該檢測表明PYL1-PYL4與HAB1以ABA激活方式發(fā)生作用(圖3A)。還觀察到帕雷巴克汀的配體選擇作用，其促進了HAB1和PYR1、PYL1或PYL3之間的相互作用(圖3A)。其中僅Pyr1在種子中高轉(zhuǎn)錄，這很好地解釋了Pyr1中的突變引起種子對帕雷巴克汀不敏感的原因。PYL2-PYL4對(+)-ABA和(-)-ABA都有響應(yīng)(圖3A)，這表明它們可能參與了(+)-ABA和(-)-ABA響應(yīng)。值得注意的是，余下的在酵母雙雜交檢測中測試的PYL顯示出與HAB1的組成型相互作用，這表明它們可能與來自PYR1和PYLs1-4的PP2Cs的相互作用具有不同的閾值。然而，PYLs5-12與PP2Cs的相互作用表明，整個蛋白家族很可能與我們以下描述的PP2C調(diào)節(jié)具有相似的作用機制。因此，我們推論整個家族通過PP2C作用調(diào)節(jié)ABA響應(yīng)。為了進一步研究ABA/帕雷巴克汀響應(yīng)，我們采用上述的Y2H檢測以測定引起植物中高的帕雷巴克汀不敏感表型的三種取代的突變蛋白。受試突變中的兩個，PYRIS152L和PYR1P88S，顯著降低了ABA誘導(dǎo)的PYR1-HAB1相互作用，而PYR1R157H突變不影響該相互作用(圖3B)。HAB1具有ABI1、ABI2和其它相關(guān)PP2Cs的基因冗余(T.Yoshida等人,PLANTPHYSIOLOGY140,115(2006))。因此，我們采用ABI1和ABI2的公開可獲得的已確定的cDNAs(分別為C104649和U24491)，在Y2H檢測中測試了ABI1和ABI2。我們觀察到PYR1與野生型ABI1和ABI2發(fā)生作用，而與由abi2-l編碼的ABA不敏感蛋白ABI2G168D不發(fā)生作用(圖3C)。因此，植物中對于PYR1和PP2C的功能起重要作用的殘基對于重組酵母中的ABA響應(yīng)是重要的。這些PYR1和PP2C之間的體內(nèi)相互作用易于出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)和核質(zhì)中，正像觀察到的GFP-PYR1定位模式所表明的(圖4)。PYR/PYL蛋白在ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的冗余作用為了檢測ABA響應(yīng)PYL蛋白是否與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的PYR1發(fā)生冗余作用，我們從公開的插入等位基因庫(publicinsertion-allelecollections)中分離出純合型插入等位基因PYL1、2和4(種子品種分別＝Salk_054640、GT_2864、Sail_517_C08)(J.M.Alonso等人,Science301,653(2003)；A.Sessions等人,THEPLANTCELL14,2985(2002)；V.Sundaresan等人,GenesandDevelopment9,1797(1995))。純合型插入系與pyr1-1雜交產(chǎn)生pyrl-1:pyl2-1和pyll-1:pyl4-1雜合系，然后它們彼此雜交。對約70株雜交后代通過PCR進行基因型分析，鑒定全部4個突變的雜合系，鑒定出2株。為了評價這些系是否分離出ABA不敏感植株，使源自四倍體雜合植株的F2代種子在0.7μM(+)-ABA上發(fā)芽。觀察發(fā)芽及生長的廣泛變化，從約1000個種子中選出ABA抗性最強的幼苗，并通過PCR和測序進行基因型分析。單獨的純合型突變親本不具有顯著的ABA不敏感性，但三倍體(pyrl-1、pyll-1、pyl4～l)和四倍體(pyrl-1、pyll-1、pyl2-l、pyU-1)突變系具有ABA不敏感性。通過與abi1-1比較，分離并確定為ABA最不敏感型突變比較，檢測四倍體和三倍體突變系的根和發(fā)芽響應(yīng)。為了發(fā)芽檢測，將種子在含有(+)-ABA的0.33XMS平板上于4℃層積處理4天，然后在黑暗處于23℃、90％相對濕度發(fā)芽3天。將根部伸長為1/2種子長度或更長的種子打分為陽性發(fā)芽。為了研究根生長，允許種子在層積處理后4天，首先在MS平板上發(fā)芽，然后轉(zhuǎn)移至23℃、90％相對濕度的黑暗處發(fā)芽。吸脹48小時后，將出現(xiàn)根部的幼苗轉(zhuǎn)移至含有(+)-ABA或?qū)φ掌桨逯?，再于黑暗處垂直生長4天，然后測定長出的新根。在發(fā)芽檢測中，四倍體突變比三倍體突變更不敏感，但二者均比abi1-1顯示出更弱的表型(圖5A)。在根生長檢測中，四倍體和三倍體突變系均比abi1-1顯示出更高的ABA不敏感性(圖5B)。四倍體突變系還顯示出ABA誘導(dǎo)的基因表達缺陷。采用與Fujii等所描述的相同的taqman探針，如前所述(H.Fujii,等人,PlantCell,19,485(2007))進行定量RT-PCR實驗。簡要地，將在連續(xù)光照下在0.3XMS平板上生長7天大的幼苗轉(zhuǎn)移至含有載體溶劑(0.1％DMSO)或100μM(+)-ABA的0.3XMS培養(yǎng)基中5小時，然后用QiagenplantRNeasy分離試劑盒分離總RNA。用Superscript反轉(zhuǎn)錄酶，每20μLcDNA第一鏈合成反應(yīng)使用5μg總RNA。用TE將反應(yīng)物稀釋至100μl，取1.5μl用于15μLqRT-PCR反應(yīng)，使用前述(6)的taqman探針。顯示的數(shù)值為三份測定的平均值。在(+)-ABA存在下，四倍體突變顯示出ABA響應(yīng)基因RD29(圖2D)、NCED3(圖2E)和P5CS1(圖2E)轉(zhuǎn)錄下降。這些實驗表明PYL1、PYL2和PYL4在ABA誘導(dǎo)的基因表達的控制下與PYL1發(fā)生冗余作用，以及發(fā)芽和根對ABA響應(yīng)。ABA感知的體外重組：ABA和PYR1抑制PP2C活性為了研究PYR1-PP2C相互作用的功能含義，我們檢測ABA響應(yīng)是否能夠在體外重組。重組GST-HABl、GST-ABIl和GST-ABI2表達于E.coli中，并在轉(zhuǎn)蛋白試驗(pull-downassays)中測試與6xHis-PYRl的配體依賴型相互作用。將純化的6xHis-PYRl和GST-HABl(分別為20和100μg，8μMPYRl終濃度)結(jié)合于含有10μM(+)-ABA或1％DMSO的100μlTBS中作為陰性對照。于室溫孵育該反應(yīng)物90分鐘，加入5μlPrepΕase(USB)His-標(biāo)簽蛋白純化樹脂。將樹脂和反應(yīng)混合物于室溫孵育30min，每隔5min輕輕搖動。用含有10μM(+)-ABA的TBS洗滌五次。洗完后，結(jié)合的蛋白被洗脫于20μlSDS-PAGE緩沖液中，煮沸5分鐘并離心。在SDS-PAGE上分析5μl洗脫物。用ABI1和ABI2進行轉(zhuǎn)蛋白檢測，除了將純化的PP2C替換為澄清的E.coli裂解物，以相似的方法使用粗裂解物。加入的裂解物的量通過SDS-PAGE分析測定以產(chǎn)生約100μgPP2C，使其所用化學(xué)計量法與采用純化蛋白的檢測中所用方法相同。我們發(fā)現(xiàn)(+)-ABA和帕雷巴克汀均促進PP2C與PYR1的相互作用；然而，PYR1P88S在該檢測中是不敏感的(圖6A)。由于ABI1及其相關(guān)物是ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)節(jié)子，我們假設(shè)ABA促進的PYR1-PP2C相互作用的功能是，抑制磷酸酶活性并去除該通路的負(fù)輸入(input)，然后將促進信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了驗證該假設(shè)，我們用重組GST-HABl、6xHis-PYRl或6xHis-PYRlP88S，以磷酸酶底物pNPP檢測(+)-ABA對PP2C酶動力學(xué)的影響。通過PCR從來自ABRC的pUni克隆中擴增出擬南芥HAB1的ORF，并克隆至pGex-2T中產(chǎn)生GST-HABl融合蛋白。將兩個構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至BL21[DE3]pLysS中。用于表達，使含有pGex-GST-HAB1的細(xì)胞在20mlLB中過夜生長，然后接著于含有1mMMnCl2的700ml培養(yǎng)基中于室溫繼續(xù)振蕩培養(yǎng)8hr。然后通過加入IPTG至終濃度0.5mM誘導(dǎo)蛋白表達，細(xì)胞于室溫過夜培養(yǎng)。然后4500rpm離心20min收集細(xì)胞，重懸于含有10mMMnCl2的10mlTBS中。將細(xì)胞貯存于-80℃。為了制備澄清的裂解液，將細(xì)胞冷凍-解凍兩次并通過剪切降低裂解物的粘度。然后裂解物于12000Xg旋轉(zhuǎn)(spun)10min，最后得到澄清的裂解液。將裂解液加入1ml固定化的谷胱甘肽柱中，用20mlTBS洗滌，然后結(jié)合的蛋白用20mM還原的谷胱甘肽洗脫。洗脫液在含有10mMMnCl2的TBS中透析。在純化步驟中使用MnCl2，發(fā)現(xiàn)對于高活性HAB1蛋白的復(fù)性是關(guān)鍵的，如前述用于其它的PP2C(C.C.Fjeld,J.M.Denu,JBiolChem,21A,20336(JuI16,1999))。通過PCR，分別從野生型基因組DNA或pyrl-3突變中擴增PYRl和PYR1P88S編碼序列，并克隆至pET28中，產(chǎn)生各種6xHis-PYRl蛋白，并通過測序確定。用于6xHis-PYRl和6xHis-PYRlp88S蛋白表達，將20ml過夜培養(yǎng)物接種于700mlLB中，于37℃振蕩再生長3小時。通過加入IPTG至1mM誘導(dǎo)蛋白表達。5hr后收集細(xì)胞，于5000xg離心15min，沉淀重懸于5ml含有10mM咪唑(pH8.0)的緩沖液A(50mMNaH2PO4,300mMNaCl)中。純化前，將細(xì)胞貯存于-80℃。解凍后，將細(xì)胞置于冰上超聲破碎五次，每次30sec，超聲間隔為30sec。12,000xg離心10min后得到澄清的裂解液，加入1mlNi-NTA柱(Qiagen)中，用20個柱體積的含有30mM咪唑的緩沖液A洗柱。結(jié)合的蛋白用10ml含有100mM咪唑的緩沖液A洗脫。將洗脫液置于TBS中透析。用于pNPP檢測，采用合成的磷酸酶底物pNPP測定GST-HAB1的起始反應(yīng)速度。反應(yīng)物中含有1μMGST-HABl、1.5μM6xHis-PYRl或6xHis-PYRlp88S，反應(yīng)緩沖液由33mMTris-OAc,pH7.9,66mMKOAc,0.1％BSA,25mMMg(OAc)2,50mMpNPP和不同濃度的(+)-ABA組成。通過向蛋白/ABA混合物中加入檢測緩沖液起始反應(yīng)?；旌虾罅⒓从肳allac酶標(biāo)儀(platereader)在A405t下每隔約10秒，監(jiān)測pNPP的水解，共監(jiān)測20分鐘。繪制反應(yīng)進程曲線，計算起始反應(yīng)速度并用4-硝基酚標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化為具體的活性，該標(biāo)準(zhǔn)曲線以相同的緩沖體系體積/用于測定酶反應(yīng)的酶標(biāo)儀制作。這些實驗表明(+)-ABA在PYRl存在下，而不是PYR1P88S存在下，作為潛在的HAB1磷酸酶活性抑制劑(ICsO＝0.18μM)(圖6B)。近似地，ABA在重組PYL4存在下具有飽和HAB1PP2C活性抑制作用。用公開的pUni克隆構(gòu)建PYL46xHis-標(biāo)簽(SEQIDNO:141)蛋白。將其重組至His-標(biāo)簽表達載體pHB3。該構(gòu)建體表達于BL21[DE3]pLysS，如以上對于PYRl所述，但是蛋白形成包涵體，純化前將其溶解于緩沖液B+8M尿素中。采用Ni-NTA樹脂，根據(jù)制造商的說明在變性條件下純化蛋白。蛋白結(jié)合至樹脂后，用20個柱體積的緩沖液B(pH6.3)洗柱，并用緩沖液A(pH4.5)洗脫蛋白。洗脫的蛋白置于含有2M尿素的TBS中緩慢透析，將10mMDTT加入含有1mMDTT的TBS中透析三天，期間逐漸降低尿素濃度。用測定PYR1的體外轉(zhuǎn)蛋白試驗確定重新折疊的PYL4的活性，表明PYL4結(jié)合HABl響應(yīng)ABA。用于PP2C檢測，使用重組的PYL4(由包涵體重新折疊)和HABl。采用磷酸酶底物pNPP，測定GST-HABl的磷酸酶活性，我們發(fā)現(xiàn)在PYL4存在下，(+)-ABA抑制HAB1磷酸酶活性(圖6C)。因此，PP2C抑制為主要的ABA響應(yīng)，其可在體外僅對蛋白進行重組。討論我們已經(jīng)證明PYR1具有期望的ABA受體性質(zhì)，在配體存在時，其結(jié)合并抑制PP2C活性。與之前鑒定的ABA結(jié)合蛋白(P.McCourt,R.Creelman,CurrentOpinioninPlantBiology11,474(2008))相比，PYR1直接與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心組成發(fā)生作用。ABI1與ABA響應(yīng)通路中的至少一種正向作用因子發(fā)生作用(R.Yoshida等人,JournalofBiologicalChemistry281,5310(2006)))。因此，在無信號時，ABI1/AHG1類PP2C的作用是抑制正向作用因子的作用。在該模型中，ABA作用于負(fù)調(diào)節(jié)通路的頂端，PP2C通過它們直接的靶標(biāo)控制信號輸出。這使PP2C在控制信號輸出的選擇性中起到關(guān)鍵作用，這可以解釋PP2C基因家族在植物中的相對于在動物中的廣泛多樣化(A.Schweighofer,H.Hirt,I.Meskiene,TrendsinPlantScience9,236(2004))?；赑P2Cs與SnRK2蛋白的相互作用，以及SnRK2對ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵作用(圖7)，我們提出以下ABA作用模型，其中ABA和PYR/PYLs抑制PP2C，其反過來緩解了正向因子，如SnRK2的抑制。這依次使陽性SnRK2激酶能夠通過磷酸化調(diào)節(jié)下游因子的活性。我們的實驗表明PYR/PYL基因家族14個成員中的至少12個結(jié)合PP2C，以下成員如PYL2s、3和4能夠使酵母細(xì)胞對非天然立體異構(gòu)體(-)-ABA響應(yīng)。我們認(rèn)為整個家族為ABA受體，且一些還可以是(-)-ABA受體。這一假設(shè)與較早的推論相一致，即兩種立體異構(gòu)體均通過相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生作用(E.Nambara等人,Genetics161,1247(JuI,2002))。PYR1不能結(jié)合由abil-1和abi2-l編碼的蛋白，二者在兩個保守的PP2C金屬結(jié)合位點之一附近的甘氨酸處均含有突變。這些突變降低了但不消除PP2C活性(F.Gosti等人,ThePlantCell11,1897(1999)；N.Robert,S.Merlot,V.N'Guyen,A.Boisson-Dernier,J.ISchroeder,FEBSLetters580,4691(2006))，完全消除abil-1的催化活性的第二個突變位點抑制了它的顯性表型(F.Gosti等人,ThePlantCell11,1897(1999))。連同我們對缺陷PYR1相互作用的觀察，這些數(shù)據(jù)表明abil-1和abi2-l突變主導(dǎo)的模型，是由它們逃避PYR/PYL蛋白負(fù)調(diào)節(jié)的能力所引起的。在該模型中，ABA的主要功能是通過PYR/PYL蛋白降低ABI1/AHG1類PP2C活性，但這沒有恰當(dāng)?shù)爻霈F(xiàn)于abil-1和abi2-l突變系中，其在ABA感知到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)干擾后，保留了足夠的PP2C活性。還不清楚有關(guān)其它磷酸酶類的PP2C調(diào)節(jié)，鑒于它們在哺乳動物、蠕蟲、蒼蠅和酵母中的重要作用這點令人吃驚(G.Lu,Y.Wang,ClinicalandExperimentalPharmacologyandPhysiology35,107(2008))。我們的觀察提供了一個PP2C活性的受體介導(dǎo)調(diào)節(jié)的新機制。盡管PYR1抑制PP2C的精確機制是未知的，PYR1R157H突變能夠從體內(nèi)下游功能中分離出配體感知。因此該殘基在感知信號后導(dǎo)致抑制PP2PC活性的步驟中起到關(guān)鍵作用。無論PP2C抑制的精確細(xì)節(jié)如何，發(fā)現(xiàn)的新調(diào)節(jié)機制表明值得在其它模型中研究受體介導(dǎo)的PP2C調(diào)控，假定缺少這些重要磷酸酶的調(diào)節(jié)因子。ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路成為遺傳分析的課題已近30年，但是在遺傳篩選中，PYR/PYL蛋白從未作為ABA響應(yīng)的必須因子出現(xiàn)。回想起來，明顯是由于必須用三倍體突變來觀察ABA不敏感表型。當(dāng)使用帕雷巴克汀作為通路合成的激動劑時，然而，可容易地鑒定出Pyr1。其原因是由于帕雷巴克汀對整個受體家族亞型的選擇性，使我們能夠繞過基因冗余，其在單獨的突變系中模糊了ABA表型。因此，我們的結(jié)果證實了化學(xué)遺傳法揭示正常冗余基因表型的能力。由于植物基因組是高度冗余的，我們希望小分子方法能夠?qū)Ψ诸愡z傳分析提供有力的補充。實施例2：PYR/PYL激動劑的篩選我們接著研究除了ABA和帕雷巴克汀之外的其它化合物是否可以作為PYR/PYL蛋白的激動劑。在適合的載體中表達ABA受體和2型C蛋白磷酸酶的酵母雙雜交菌株可用于監(jiān)測ABA受體的活性。因此，這些酵母菌株產(chǎn)生方便的篩選系統(tǒng)用于鑒定作為ABA激動劑的滲透化合物，即促進PYR/PYL家族成員與它們的靶蛋白磷酸酶結(jié)合的化合物。當(dāng)PYR/PYL蛋白結(jié)合于酵母雙雜交中的靶PP2C時，報告基因被激活，這取決于使用的菌株，能夠?qū)е聢蟾鏄?gòu)建體如LacZ/β半乳糖苷酶標(biāo)記的表達或?qū)е履軌蚴咕暝跔I養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長的營養(yǎng)報告基因的表達。為了進行這些激動劑檢測，將篩選化合物加入微孔板中并加入適合的酵母生長培養(yǎng)基。然后將孔播種PYR/PYL-PP2C菌株，待菌株生長于含有化學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)基之后，監(jiān)測激動劑的活性?？刹捎枚喾N方法檢測激活，包括X-gal檢測的簡單生長(通過營養(yǎng)報告基因表達的恢復(fù))比色法，其為本領(lǐng)域熟知的。另一種篩選方法，稱為“Halo檢測”，也可用于鑒定激動劑。在該檢測中，酵母菌可被包埋于適合的含有瓊脂糖的生長培養(yǎng)基中，然后用加樣槍(pinreplicator)將化學(xué)物質(zhì)點于平板上。缺少生長必需營養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基阻止了酵母生長，除非一種篩選的化學(xué)物質(zhì)進入酵母細(xì)胞中并激活了PYR/PYL受體，導(dǎo)致在酵母雙雜交菌株中該營養(yǎng)標(biāo)記基因的表達。激活的細(xì)胞顯示出細(xì)胞生長區(qū)域，并能夠容易地通過目測鑒定。采用常規(guī)方法和上述halo檢測的結(jié)合，檢測到65,000個激活酵母雙雜交菌株表達PYR1、PYL2、PYL3或PYL4的篩選化合物。激活任一酵母菌的目標(biāo)化合物(hitcompounds)在全部4株酵母菌上再次測試，采用X-gal染色檢測對活性進行定量。這導(dǎo)致鑒定出圖8所示的化合物。這些化合物作用于PYR/PYL受體PYR1、PYL1、PYL2、PYL3和PYL4的相關(guān)活性評價列于圖8中。我們注意到用于這些篩選檢測中的PYL3酵母菌對ABA尤其敏感，因此ABA或其它化合物對PYL3受體的相關(guān)活性將在隨后的體外磷酸酶檢測中進一步驗證，描述如下。為了進一步確定在酵母雙雜交檢測中鑒定的目標(biāo)化合物，在重組PYR/PYL受體蛋白PYR1、PYL1、PYL2或PYL3以及PP2CHAB1存在下，我們進行體外PP2C檢測。如實施例1所述制備重組蛋白。如實施例1所述，用磷酸酶底物pNPP進行磷酸酶檢測。根據(jù)IC50值所示，我們發(fā)現(xiàn)化合物7653159，與圖8中化合物7為同一化合物，是潛在的HAB1的PYR1和PYL1抑制的激動劑，但不是PYL2或PYL3的激動劑(圖9)。近似地，化合物6655097，與圖8中化合物6為同一化合物，是潛在的HAB1的PYR1和PYL1抑制的激動劑，但不是PYL2或PYL3的激動劑(圖9)?；衔?561035，與圖8中化合物9為同一化合物，是潛在的HAB1的PYL2和PYL3抑制的激動劑，但不是PYR1或PYL1的激動劑(圖9)。實施例3：PYR/PYL過表達的表型分析以及突變株的功能缺失脫落酸是多功能植物激素，其參與了多種植物保護功能，包括芽休眠、種子休眠和/或成熟、葉片及果實的脫落，并響應(yīng)各種生物脅迫(例如，冷、熱、鹽和旱)。根據(jù)獨立于CO2濃度的機制，ABA還負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉。由于PYR/PYL受體蛋白調(diào)節(jié)ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些表型可通過調(diào)節(jié)PYR/PYL的表達進行調(diào)節(jié)。然而，如以上討論的，用單獨的、三倍體和四倍體Pyr/Pyl突變株進行試驗，表明PYL受體PYL1、2和4在發(fā)芽的控制下與PYR1發(fā)生功能冗余，且根對ABA響應(yīng)。在這些試驗中，我們想知道其它PYR/PYL受體在植物保護功能，如開花時間、株高、葉綠素含量及萎蔫的控制下是否與PYR1發(fā)生功能冗余。我們用實施例1中所述的pyrl；pyll；pyl2；pyl4四倍體突變檢測多倍PYR/PYL受體對這些植物保護功能的功能缺失的影響。我們發(fā)現(xiàn)pyrl；pyll；pyl2；pyl4四倍體突變在開花時間、株高及萎蔫中顯示出缺陷(圖10)。相對于對照擬南芥，pyrl；pyll；pyl2；pyl4四倍體突變開花早，植株矮小且非常萎蔫。我們還檢測了過表達PYR/PYL受體PYL4對植物保護功能的影響。我們生產(chǎn)了在高表達啟動子Rbcs的控制下表達GFP-PYL4的轉(zhuǎn)基因擬南芥，發(fā)現(xiàn)過表達PYL4的植株在植物的開花時間、株高、萎蔫及葉綠素含量中顯示出缺陷；相對于對照植株，這些PYL4過表達植株開花晚，為深綠色且較少萎蔫(圖10)。這些結(jié)果表明PYR/PYL受體調(diào)節(jié)植物中多種ABA介導(dǎo)的活性。實施例4：用于PYR/PYL激動劑的植物提取物的篩選還使用表達PYR/PYL受體和2型C蛋白磷酸酶的酵母菌篩選HPLC分離的植物提取物，以獲得激活PYR/PYL受體PYR1、PYL2、PYL3和/或PYL4的內(nèi)源化合物。采用提取物的HPLC分離鑒定不同于脫落酸(已知激動劑)的化合物。據(jù)此鑒定出來自貫葉連翹(Hypericumperforatum)地上部分組織提取物的PYL3/PYL4選擇性激動劑。結(jié)合酵母雙雜交通過多輪色譜分離純化該激動劑，使該組分在純化的每一步向前移。根據(jù)純化的激動劑晶體的X-射線晶體學(xué)推斷該純化的激動劑的結(jié)構(gòu)，揭示了該化合物為已知的化合物青蒿酸。該化合物除了在蒿屬(菊科)之外，沒有從其它屬分離的報道，我們從金絲桃屬(藤黃科)分離出該化合物，表明該化合物廣泛存在于植物中，在植物生理中發(fā)揮重要的功能性作用。從商業(yè)來源得到的幾種相關(guān)化合物，也發(fā)現(xiàn)具有PYL3/PYL4選擇性激動劑活性(圖12)。按照與所述的青蒿酸相似的方法，從Colaaccumulata種子中鑒定出第二種天然存在的ABA激動劑，并根據(jù)2D-NMR確定為未知的α-可巴烯(α-copaene)、copaenoicacid(圖12)。應(yīng)理解本文中的實施例和實施方案僅用于說明目的，各種改進和變化對于本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員而言均應(yīng)包括在本申請的精神和范圍內(nèi)以及所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文中引用的所有出版物、專利和專利申請以參閱的方式全文并入于此。當(dāng)前第1頁1 2 3