本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及通式(Ⅰ)所示嘌呤類化合物及其組合物，其中通式(Ⅰ)的各取代基如說(shuō)明書(shū)中的定義。本發(fā)明還涉及所述嘌呤類化合物、組合物通過(guò)抑制蛋白酪氨酸激酶治療腫瘤的用途。

背景技術(shù)：

蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTKs)通過(guò)控制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等一系列生理生化過(guò)程。蛋白酪氨酸激酶功能的失調(diào)，特別是它們的異常表達(dá)不但導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，而且還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，腫瘤新生血管的生成，腫瘤的放化療抗性密切相關(guān)。受體型酪氨酸激酶是一類橫跨細(xì)胞膜相對(duì)較大的激酶，其具有配體結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和起激酶作用—在磷酸化特定酪氨酸殘基并且由此影響細(xì)胞增殖的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。在一般人類癌癥中(如乳腺癌、胃腸道癌癥、血癌、卵巢癌、支氣管癌癥或者肺癌)蛋白酪氨酸激酶均異常表達(dá)，其已成為抗腫瘤藥物研發(fā)的重要靶點(diǎn)之一。

表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase，EGFR)是最早發(fā)現(xiàn)的蛋白酪氨酸激酶之一，EGFR的胞內(nèi)區(qū)有ATP結(jié)合位點(diǎn)，EGFR抑制劑可以競(jìng)爭(zhēng)性與ATP結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，從而抑制EGFR的磷酸化過(guò)程，阻斷下游信號(hào)的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和轉(zhuǎn)移。EGFR作為抗腫瘤靶點(diǎn)的生化過(guò)程已被闡明，其晶體結(jié)構(gòu)和活性部位也已比較清楚，以此為靶點(diǎn)的藥物吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)等已經(jīng)應(yīng)用于臨床，且隨著EGFR結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系的深入研究，許多效果更佳優(yōu)秀的EGFR抑制劑(EP0566226、WO9961428、WO0051587、WO0375947、WO0132651、WO9633980、WO9630347、US7709479、US6716847、US6593333、US6251912、CN201080060451.4、CN201110191525.4等)已被發(fā)現(xiàn)。然而這些藥物不可避免地存在著抗耐藥性差的問(wèn)題。研究表明：氨基酸The790到Met790的突變是此類藥物產(chǎn)生耐藥性的主要誘因。有臨床案例數(shù)據(jù)顯示，大約有50％的患者獲得性耐藥都源于T790M位點(diǎn)的突變所致。因此開(kāi)發(fā)抗耐藥性更強(qiáng)、毒性更小、活性更強(qiáng)的新型EGFR抑制劑具有非常重要現(xiàn)實(shí)價(jià)值。本發(fā)明以喹唑啉類EGFR抑制劑為基本骨架，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在喹唑啉母核的4-苯胺基部分引入疏水性金剛烷基，顯著增強(qiáng)了與EGFR靶酶Met790位點(diǎn)的相互作用，因此設(shè)計(jì)合成了通式(Ⅰ)所示金剛烷基化合物。抗腫瘤活性篩選顯示，大部分此類化合物具有較強(qiáng)的抑制非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞增殖能力，部分化合物顯示出比吉非替尼更加優(yōu)良的抗EGFR活性，且部分化合物對(duì)EGFR產(chǎn)生的耐藥性(T790M突變)也表現(xiàn)出了一定的效果。作為一類結(jié)構(gòu)新穎的分子，本發(fā)明中的化合物具有開(kāi)發(fā)成新型高效EGFR抑制劑的潛力，對(duì)治療相關(guān)的腫瘤疾病有較大的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供嘌呤類化合物、組合物，提供療效更好的治療腫瘤、癌癥的藥物和治療方法。

10.本發(fā)明的目的是提供通式(Ⅰ)所示的化合物及其所有可能的異構(gòu)體或其可藥用的鹽或水合物：

其中：

R1選自氫、甲氧基、甲基、氯、氟、氰基；

R2選自嗎啡啉、1-甲基哌嗪、1-乙基哌嗪、1-乙酰基哌嗪、1-甲磺?；哙夯蛘呦率龅腁、B、C三種基團(tuán)；

其中，上述A、B、C結(jié)構(gòu)中R3選自嗎啡啉、1-甲基哌嗪、1-乙基哌嗪、1-乙?；哙?、1-甲磺?；哙?。

進(jìn)一步的，本發(fā)明公開(kāi)了優(yōu)選的通式(Ⅰ)化合物：

(1)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-嗎啡啉苯基氨基)]丙烯酰胺；

(2)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-嗎啡啉苯基氨基)]丙烯酰胺；

(3)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-甲基哌嗪苯基氨基)]丙烯酰胺；

(4)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-甲基哌嗪苯基氨基)]丙烯酰胺；

(5)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-乙基哌嗪苯基氨基)]丙烯酰胺；

(6)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-乙基哌嗪苯基氨基)]丙烯酰胺；

(7)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[4-(1-甲磺?；?哌嗪苯基氨基]]丙烯酰胺；

(8)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[2-甲氧基-4-(1-甲磺?；?哌嗪苯基氨基]]丙烯酰胺；

(9)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[4-(2-甲基-1-甲磺酰基)哌嗪苯基氨基]]丙烯酰胺；

(10)N-[9-(2-苯基氨基-8-苯胺基)嘌呤-2-(4-甲基哌嗪苯基氨基)]丙烯酰胺；

(11)N-[9-(2-苯基氨基-8-苯胺基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-甲基哌嗪苯基氨基)]丙烯酰胺；

(12)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[4-(1-嗎啡啉)甲基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(13)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[2-甲氧基-4-(1-嗎啡啉)甲基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(14)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[3-氯-4-(1-嗎啡啉)甲基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(15)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[4-(1-甲基哌嗪)甲基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(16)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[2-甲氧基-4-(1-甲基哌嗪)甲基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(17)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[3-氯-4-(1-甲基哌嗪)甲基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(18)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[4-(1-乙基哌嗪)甲基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(19)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[2-甲氧基-4-(1-乙基哌嗪)甲基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(20)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[3-氯-4-(1-乙基哌嗪)甲基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(21)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[4-(1-嗎啡啉)丙氧基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(22)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[3-甲氧基-4-(1-嗎啡啉)丙氧基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(23)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[2-甲基-4-(1-嗎啡啉)丙氧基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(24)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[4-(1-甲基哌嗪)丙氧基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(25)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[3-甲氧基-4-(1-甲基哌嗪)丙氧基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(26)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[2-甲基-4-(1-甲基哌嗪)丙氧基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(27)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[4-(1-乙基哌嗪)丙氧基]苯基氨基]]丙烯酰胺；

(28)N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[3-甲氧基-4-(1-乙基哌嗪)丙氧基] 苯基氨基]]丙烯酰胺；

及其上述化合物所有可能的異構(gòu)體或其可藥用的鹽或水合物。

進(jìn)一步的，本發(fā)明的還公開(kāi)了一種由通式(Ⅰ)所述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體組成的組合物；

本發(fā)明公開(kāi)的通式(Ⅰ)的所述化合物為堿，其中所需鹽形式通過(guò)本領(lǐng)域已知的合適方法制備，包括用無(wú)機(jī)酸處理游離堿、有機(jī)酸處理游離堿。

進(jìn)一步的，所述無(wú)機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸、硫酸；所述有機(jī)酸包括乙酸、三氟乙酸、馬來(lái)酸、琥珀酸、扁桃酸、富馬酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、羥基乙酸、水楊酸，例如天冬氨酸或谷氨酸，芳香酸，例如苯甲酸或肉桂酸，磺酸，例如p-甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸等。藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)施例包括硫酸鹽、焦硫酸鹽、硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽、磷酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸鹽、丙酸鹽、癸酸鹽、辛酸鹽、丙烯酸鹽、甲酸鹽、異丁酸鹽、己酸鹽、庚酸鹽、丙酸鹽(propiolates)、草酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、氯苯甲酸鹽。

進(jìn)一步的，本發(fā)明公開(kāi)的藥物組合物含有至少一種前述公開(kāi)的通式(Ⅰ)所示的化合物及其所有可能的異構(gòu)體或其可藥用的鹽或水合物。

本文所用的“可藥用賦形劑”是指包含在所給定形式中的或與所述組合物相容的原料、組合物或載體。當(dāng)混合時(shí)，各種賦形劑必須與藥物組合物的其它成分相容，使得給予患者時(shí)可能基本降低本發(fā)明的化合物的有效性的相互作用以及可能導(dǎo)致藥物組合物不可藥用的相互作用得以避免。另外，各種賦形劑必須當(dāng)然具有足夠高的純度，以使之可藥用。

進(jìn)一步的，所述的藥物組合物還包括賦形劑，所述賦形劑包括稀釋劑、填充劑、粘合劑、崩解劑、懸浮劑、乳化劑、甜味劑、調(diào)味劑、味道掩蔽劑、著色劑、抗結(jié)塊劑、濕潤(rùn)劑、螯合劑、増塑劑、粘度増加劑、抗氧化劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑和緩沖劑中至少一種。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解一些可藥用賦形劑可適用于多于一種功能，并且可取決于所述賦形劑在所述制劑中的存在量以及其它成分存在于所述制劑中而適用于其它功能。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種所述的藥用組合物的用途：用于治療BTK酪氨酸激酶引起的疾病。

優(yōu)選的，所述的藥用組合物用于治療彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤或慢性淋巴細(xì)胞白血病。

本發(fā)明的有益效果在于提供一種新的嘌呤類化合物、組合物，提供療效更好的治療腫瘤的藥物和治療方法。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述，以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)實(shí)施例，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

化合物的結(jié)構(gòu)是通過(guò)核磁共振(NMR)或/和質(zhì)譜(MS)來(lái)確定的。NMR位移以δ(ppm)的單位給出。NMR的測(cè)定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測(cè)定溶劑為氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(TMS)。

MS的測(cè)定用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(生產(chǎn)商：AB SCIEX，型號(hào)：API3200)。

HPLC的測(cè)定使用安捷倫12OODAD高壓液相色譜儀(SunfireC1815O×4.6mm色譜柱)和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀(GiminiC1815O×4.6mm色譜柱)。

激酶平均抑制率及IC50值的測(cè)定用多功能酶標(biāo)儀(生產(chǎn)商：Perkin Elmer，型號(hào)：Enspire2300)。

薄層層析硅膠板使用煙臺(tái)黃海HSGF254或青島GF254硅膠板，薄層色譜法(TLC)使用的硅胺板采用的規(guī)格是0.15mm-0.2mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm-0.5mm。

柱層析一般使用煙臺(tái)黃海硅膠200-300目硅膠為載體。

本發(fā)明使用的原料主要購(gòu)自可購(gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，北京偶合科技有限公司、阿拉丁化學(xué)試劑有限公司、達(dá)瑞化學(xué)品等公司。

實(shí)施例中無(wú)特殊說(shuō)明，溶液是指水溶液。

實(shí)施例中無(wú)特殊說(shuō)明，反應(yīng)的溫度為室溫，為20℃-30℃。

本發(fā)明采用的技術(shù)實(shí)施例如下：

實(shí)施例1

以N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-嗎啡啉苯基氨基))丙烯酰胺來(lái)闡明此類2-苯基氨基嘌呤類化合物的合成方法。

反應(yīng)路徑如下：

步驟A:

取1(13.81g,0.1mol)和碳酸氫鈉(12.6g,0.15mol)于30ml乙腈中，攪拌下緩慢滴加丙烯酰氯(9.5g,0.105mol)，滴加完畢后室溫反應(yīng)5分鐘，待反應(yīng)結(jié)束后加入400ml水，析出白色固體，抽濾，得產(chǎn)物18g。(產(chǎn)率:93.8％)

步驟B:

取3(6g,31.23mmol)和氯化銨(3.3g,62.46mmol)于反應(yīng)瓶，加入MeOH20ml和水20ml，攪拌下加入鐵粉(7g,125mmol)，升溫60℃反應(yīng)2小時(shí)，趁熱抽濾，濾渣用乙酸乙酯洗滌，濾液乙酸乙酯萃取(150ml x3)，有機(jī)層飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓蒸干，得黃色固體4.5g。(產(chǎn)率:88％)

步驟C:

將5-硝基尿嘧啶(6.28g,0.040mol)與三氯氧磷(26ml)混合，攪拌下慢慢加入N,N-二甲基苯胺(8ml)，然后升溫至110℃反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后，蒸除多余的三氯氧磷，加入硅膠，拌樣至呈膨松狀，硅膠柱層析，濃縮，得黃色油狀液體6.2g。(產(chǎn)率:94％)

步驟D:

取6(10.96g,59.75mmol)溶于10ml的二氧六環(huán)中，加入DIPEA(11.58g,89.63mmol)，于冰浴下攪拌，取4(9.19g,59.75mmol)溶于20ml的二氧六環(huán)中，緩慢滴加到反應(yīng)體系，室溫?cái)嚢?0分鐘。反應(yīng)結(jié)束加入400ml水，析出紅色固體，抽濾，烘干，得產(chǎn)物17.5g。(產(chǎn)率:94.8％)

步驟E:

取8(7g,49.65mmol)和9(8.65g,99.29mmol)溶于20ml的二氧六環(huán)中，升溫100℃反應(yīng)10小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束冷卻室溫，加入300ml水，析出黃色固體，抽濾，得產(chǎn)物7.13g。(產(chǎn)率:69％)

步驟F:

取10(7.13g,34.26mmol)和氯化銨(3.66g,68.52mmol)于反應(yīng)瓶，加入MeOH 30ml和水30ml，攪拌下加入鐵粉(7.67g,137.04mmol)，升溫60℃反應(yīng)2小時(shí)，趁熱抽濾，濾渣用正丁醇洗滌，濾液正丁醇萃取(150mlx3)，有機(jī)層飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓蒸干，得黑褐色固體4.15g。(產(chǎn)率:68％)

步驟G:

取7(4.15g,23.30mmol)和DIPEA(4.52g,34.95mmol)溶于20ml二氧六環(huán)中，慢慢加入11(7.45g,23.3mmol)，室溫下攪拌5小時(shí)，反應(yīng)完畢加水200ml，析出紅褐色固體，抽濾，烘干，得固體10g。(產(chǎn)率:93％)

步驟H:

取12(5.0g,10.83mmol)和氯化銨(1.16g,21.67mmol)于反應(yīng)瓶，加入MeOH 20ml和水20ml，攪拌下加入鋅粉(2.83g,43.32mmol)，升溫60℃反應(yīng)1小時(shí)，趁熱抽濾，水相析出白色固體，用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)至堿性，抽濾，烘干，得固體3.08g。(產(chǎn)率:66％)

步驟I:

取13(450.00mg,1.04mmol)和無(wú)水硫酸鈉(296.60mg,2.08mmol)于1.5ml原甲酸三乙酯中，升溫130℃反應(yīng)4小時(shí)，80℃過(guò)夜反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束，硅膠拌樣，柱層析(DCM:MeOH＝25:1)，得白色固體121mg。(產(chǎn)率:26.8％)

實(shí)施例2

以N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[4-(1-嗎啡啉)丙氧基]苯基氨基]]丙烯酰胺來(lái)闡明此類化合物的合成方法。

反應(yīng)路徑如下：

根據(jù)下文所述方案，步驟和中間物制備標(biāo)題化合物。

步驟A-D與實(shí)例1方案中的中間物制備步驟相同。

步驟E:

取8(10g,72mmol)溶于30ml乙腈中，加入碳酸鉀(14.9g,108mmol)和碘化鉀(1.2g,7.2mmol)，緩慢滴加1-溴-3-氯丙烷(13.6g,86mmol)，升溫70℃反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完畢后抽干溶劑，加入水400ml，析出黃白色固體，抽濾，得固體14g。(產(chǎn)率:90％)

步驟F:

取10(4g,18.56mmol)溶于20mlDMF中，加入碳酸鉀(3.8g,27.84mmol)和碘化鉀(309mg,1.9mmol)，慢慢加入嗎啡啉(1.9g,22.27mmol)，升溫100℃反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，加入水200ml，加入少許食鹽，析出白色絮狀固體，抽濾，得固體3.7g。(產(chǎn)率:75％)

步驟G、H、I、J與實(shí)例1方案中的步驟F、G、H、I的中間物制備步驟相同，

實(shí)施例3

以N-[9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-[[4-[(1-嗎啡啉)乙?；鵠苯氧基]氨基]]丙烯酰胺來(lái)闡明此類的合成方法。

反應(yīng)路徑如下：

根據(jù)下文所述方案，步驟和中間物制備標(biāo)題化合物。

步驟A-D與實(shí)例1方案中的中間物制備步驟相同。

步驟E:

取8(20g,143.88mmol)溶于150ml乙腈中，加入碳酸鉀(29g,215.83mmol),碘化鉀(2.4g,14.39mmol)，緩慢滴加溴乙酸乙酯(24g,143.88 mmol)，升溫70℃反應(yīng)2小時(shí)，反應(yīng)完畢后抽干溶劑，水洗抽濾得黃白色固體27g。(產(chǎn)率:85％)

步驟F:

取10(6g,26.67mmol)于50ml水中，慢慢加入氫氧化鉀(3g,53.3mmol)，升溫50℃反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用5mmol/l的稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至弱酸性，析出白色固體，抽濾，80℃烘干2小時(shí)，得固體3.3g。(產(chǎn)率:63％)。

步驟G:

取11(3.3g,16.75mmol)于15ml氯化亞砜中，升溫80℃回流2小時(shí)，反應(yīng)完畢抽干氯化亞砜，得白色固體2.1g。(產(chǎn)率:58％)

步驟H:

取12(2.1g,9.7mmol)溶于20ml乙腈中，加入碳酸氫鈉(1.6g,19.4mmol)，慢慢加入嗎啡啉(1.01g,11.64mmol)，升溫60℃反應(yīng)5小時(shí)，反應(yīng)完畢后抽干溶劑，加水200ml，未析出固體，水相用乙酸乙酯萃取(100mlx3)，飽和食鹽水洗滌有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓蒸干得黃白色半固體1.81g。(產(chǎn)率:70％)

步驟I與實(shí)例1方案中的步驟F的中間物制備步驟相同。

步驟J與實(shí)例1方案中的步驟G的中間物制備步驟相同。

步驟K與實(shí)例1方案中的步驟H的中間物制備步驟相同。

步驟L與實(shí)例1方案中的步驟I的中間物制備步驟相同。

根據(jù)以上方法制備(1)-(28)化合物，所制備化合物的理化數(shù)據(jù)如下：

(1)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-嗎啡啉苯基氨基))丙烯酰胺(I-1)

產(chǎn)量：121mg；白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.85(br,4H)，3.68(br,4H)，5.65(d,J＝10.0Hz,1H)，6.14(d,J＝16.8Hz,1H)，6.27(m,2H)，6.37(m,2H)，6.45(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.91(m,1H)，7.18(m,1H)，7.57(m,1H)，7.59(m,1H)，8.65(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₄H₂₃N₇O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：442.49，測(cè)量值：442.32。

(2)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-嗎啡啉苯基氨基))丙烯酰胺(I-2)

產(chǎn)量：70mg；白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.87(br,4H)，3.69(br,4H)，3.72(s,3H)，5.70(d,J＝10.0Hz,1H)，5.83(m,1H)，5.91(m,1H)，6.15(d,J＝16.8Hz,1H)，6.18(m,1H)，6.46(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.96(m,1H)，7.19(m,1H)，7.59(m,1H)，7.61(m,1H)，8.00(s,1H)，8.67(s,1H)，8.73(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₅H₂₅N₇O₃，[M+H]⁺計(jì)量值：472.51，測(cè)量值：472.40。

(3)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-甲基哌嗪苯基氨基))丙烯酰胺(I-3)

產(chǎn)量：30mg；黃白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.25(s,3H)，2.57(br,4H)，3.42(br,4H)，5.70(d,J＝10.0Hz,1H)，6.15(d,J＝16.8Hz,1H)，6.26(m,2H)，6.31(m,2H)，6.49(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.97(m,1H)，7.21(m,1H)，7.59(m,1H)，7.61(m,1H)，8.00(s,1H)，8.67(s,1H)，8.70(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₅H₂₆N₈O，[M+H]⁺計(jì)量值：455.53，測(cè)量值：455.38。

(4)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-甲基哌嗪苯基氨基))丙烯酰胺(I-4)

產(chǎn)量：37mg；黃白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.26(s,3H)，2.60(br,4H)，3.44(br,4H)，3.71(s,3H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，5.84(m,1H)，5.92(m,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.18(m,1H)，6.47(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.98(m,1H)，7.20(m,1H)，7.57(m,1H)，7.60(m,1H)，8.07(s,1H)，8.66(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₆H₂₈N₈O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：485.55，測(cè)量值：485.39。

(5)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-乙基哌嗪苯基氨基))丙烯酰胺(I-5)

產(chǎn)量：20mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.0(t,J＝6.8Hz,3H)，2.39(q,2H)，2.57(br,4H)，3.42(br,4H)，5.73(d,J＝10.0Hz,1H)，6.18(d,J＝16.8Hz,1H)，6.26(m,2H)，6.31(m,2H)，6.50(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.97(m,1H)，7.23(m,1H)，7.61(m,1H)，7.62(m,1H)，8.00(s,1H)，8.66(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₆H₂₈N₈O，[M+H]⁺計(jì)量值：469.55，測(cè)量值：469.41。

(6)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-乙基哌嗪苯基氨基))丙烯酰胺(I-6)

產(chǎn)量：20mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.0(t,J＝6.8Hz,3H)，2.41(q,2H)，2.58(br,4H)，3.42(br,4H)，3.72(s,3H)，5.73(d,J＝10.0Hz,1H)，5.84(m,1H)，5.91(m,1H)，6.16(m,1H)，6.18(d,J＝16.8Hz,1H)，6.49(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.98(m,1H)，7.21(m,1H)，7.60(m,1H)，7.61(m,1H)，8.00(s,1H)，8.67(s,1H)，8.71(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₇H₃₀N₈O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：499.58，測(cè)量值：499.42。(7)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-(1-甲磺?；?哌嗪苯基氨基))丙烯酰胺(I-7)

產(chǎn)量：50mg；灰色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.82(s,3H)，2.77(br,4H)，3.45(br,4H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.26(m,2H)，6.32(m,2H)，6.49(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.97(m,1H)，7.21(m,1H)，7.59(m,1H)，7.60(m,1H)，8.00(s,1H)，8.68(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₅H₂₆N₈O₃S，[M+H]⁺計(jì)量值：519.59，測(cè)量值：519.40。

(8)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-(1-甲磺?；?哌嗪苯基氨基))丙烯酰胺(I-8)

產(chǎn)量：53mg；灰色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.82(s,3H)，2.77(br,4H)，3.45(br,4H)，3.72(s,3H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，5.83(m,1H)，5.92(m,1H)，6.16(m,2H)，6.17(d,J＝16.8Hz,1H)，6.49(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.98(m,1H)，7.21(m,1H)，7.58(m,1H)，7.60(m,1H)，8.00(s,1H)，8.69(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₆H₂₈N₈O₄S，[M+H]⁺計(jì)量值：549.62，測(cè)量值：549.43。

(9)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-(2-甲基-1-甲磺?；?哌嗪苯基氨基))丙烯酰胺(I-9)

產(chǎn)量：72mg；灰色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.18(s,3H)，2.83(s,3H)，2.77(m,2H)，3.02(m,1H)，3.45(m,2H)，3.51(m,2H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，6.17(d,J＝16.8Hz,1H)，6.27(m,2H)，6.32(m,1H)，6.48(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.99(m,1H)，7.19(m,1H)，7.59(m,1H)，7.61(m,1H)，8.00(s,1H)，8.67(s,1H)，8.70(s,1H)；HRMS(ESI) for C₂₆H₂₈N₈O₃S，[M+H]⁺計(jì)量值：533.62，測(cè)量值：533.38。

(10)N-(9-(2-苯基氨基-8-苯胺基)嘌呤-2-(4-甲基哌嗪苯基氨基))丙烯酰胺(I-10)

產(chǎn)量：30mg；灰色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.26(s,3H)，2.56(br,4H)，3.46(br,4H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，6.17(d,J＝16.8Hz,1H)，6.28(m,2H)，6.33(m,2H)，6.45(m,2H)，6.49(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.62(m,1H)，6.99(m,2H)，7.02(m,1H)，7.21(m,1H)，7.61(m,1H)，7.62(m,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₃₁H₃₁N₉O，[M+H]⁺計(jì)量值：546.64，測(cè)量值：546.45。

(11)N-(9-(2-苯基氨基-8-苯胺基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-甲基哌嗪苯基氨基))丙烯酰胺(I-11)

產(chǎn)量：32mg；灰色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.25(s,3H)，2.58(br,4H)，3.47(br,4H)，3.72(s,3H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，5.86(m,1H)，5.91(m,1H)，6.16(m,1H)，6.17(d,J＝16.8Hz,1H)，6.45(m,2H)，6.49(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.62(m,1H)，7.00(m,2H)，7.02(m,1H)，7.22(m,1H)，7.61(m,1H)，7.62(m,1H)，8.70(s,1H)；HRMS(ESI)for C₃₂H₃₃N₉O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：576.66，測(cè)量值：576.50。

(12)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-(1-嗎啡啉)甲基苯基氨基))丙烯酰胺(I-12)

產(chǎn)量：51mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.36(br,4H)，3.63(s,2H)，3.68(br,4H)，5.69(d,J＝10.0Hz,1H)，6.14(d,J＝16.8Hz,1H)，6.32(m,2H)，6.46(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.80(m,2H)，6.99(m,1H)，7.18(m,1H)，7.58(m,1H)，7.60(m,1H)，8.65(s,1H)，8.70(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₅H₂₅N₇O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：456.51，測(cè)量值：456.32。

(13)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-(1-嗎啡啉)甲基苯基氨基))丙烯酰胺(I-13)

產(chǎn)量：55mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.35(br,4H)，3.61(s,2H)，3.66(br,4H)，3.72(s,3H)，5.70(d,J＝10.0Hz,1H)，6.15(d,J＝16.8Hz,1H)，6.22(m,1H)，6.32(m,1H)，6.38(m,1H)，6.46(dd,J＝10.0, 16.8Hz,1H)，6.95(m,1H)，7.19(m,1H)，7.59(m,1H)，7.61(m,1H)，8.00(s,1H)，8.66(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₆H₂₇N₇O₃，[M+H]⁺計(jì)量值：486.54，測(cè)量值：486.35。

(14)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(3-氯-4-(1-嗎啡啉)甲基苯基氨基))丙烯酰胺(I-14)

產(chǎn)量：53mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.35(br,4H)，3.61(s,2H)，3.67(br,4H)，5.70(d,J＝10.0Hz,1H)，6.15(d,J＝16.8Hz,1H)，6.21(m,1H)，6.34(m,1H)，6.46(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.76(m,1H)，6.97(m,1H)，7.20(m,1H)，7.59(m,1H)，7.60(m,1H)，8.00(s,1H)，8.67(s,1H)，8.70(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₅H₂₄ClN₇O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：490.96，測(cè)量值：490.62。

(15)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-(1-甲基哌嗪)甲基苯基氨基))丙烯酰胺(I-15)

產(chǎn)量：31mg；黃白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.26(s,3H)，2.45(br,4H)，2.47(br,4H)，3.62(s,2H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.33(m,2H)，6.46(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.80(m,2H)，6.97(m,1H)，7.21(m,1H)，7.60(m,1H)，7.62(m,1H)，8.00(s,1H)，8.68(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₆H₂₈N₈O，[M+H]⁺計(jì)量值：469.55，測(cè)量值：469.35。

(16)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-(1-甲基哌嗪)甲基苯基氨基))丙烯酰胺(I-16)

產(chǎn)量：31mg；黃白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.26(s,3H)，2.45(br,4H)，2.47(br,4H)，3.62(s,2H)，3.74(s,3H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.22(m,1H)，6.31(m,1H)，6.36(m,1H)，6.46(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.97(m,1H)，7.21(m,1H)，7.60(m,1H)，7.62(m,1H)，8.00(s,1H)，8.68(s,1H)，8.71(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₇H₃₀N₈O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：499.58，測(cè)量值：499.41。

(17)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(3-氯-4-(1-甲基哌嗪)甲基苯基氨基))丙烯酰胺(I-17)

產(chǎn)量：28mg；黃白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ2.26(s,3H)，2.46(br,4H)，2.47(br,4H)，3.63(s,2H)，5.70(d,J＝10.0Hz,1H)，6.15(d,J＝16.8Hz,1H)，6.22(m,1H)，6.34(m,1H)，6.47(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.76(m,1H)，6.98(m,1H)，7.19(m,1H)，7.60(m,1H)，7.62(m,1H)，8.00(s,1H)，8.66(s,1H)，8.70(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₆H₂₇ClN₈O，[M+H]⁺計(jì)量值：504.00，測(cè)量值：504.07。

(18)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-(1-乙基哌嗪)甲基苯基氨基))丙烯酰胺(I-18)

產(chǎn)量：41mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.0(t,J＝6.8Hz,3H)，2.39(q,2H)，2.45(br,4H)，2.47(br,4H)，3.62(s,2H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.33(m,2H)，6.46(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.79(m,2H)，6.99(m,1H)，7.22(m,1H)，7.59(m,1H)，7.61(m,1H)，8.00(s,1H)，8.67(s,1H)，8.70(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₇H₃₀N₈O，[M+H]⁺計(jì)量值：483.58，測(cè)量值：483.35。

(19)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲氧基-4-(1-乙基哌嗪)甲基苯基氨基))丙烯酰胺(I-19)

產(chǎn)量：45mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.0(t,J＝6.8Hz,3H)，2.40(q,2H)，2.45(br,4H)，2.46(br,4H)，3.62(s,2H)，3.72(s,3H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，6.18(d,J＝16.8Hz,1H)，6.23(m,1H)，6.33(m,1H)，6.38(m,1H)，6.47(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.99(m,1H)，7.20(m,1H)，7.58(m,1H)，7.60(m,1H)，8.00(s,1H)，8.69(s,1H)，8.71(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₈H₃₂N₈O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：513.61，測(cè)量值：513.50。

(20)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(3-氯-4-(1-乙基哌嗪)甲基苯基氨基))丙烯酰胺(I-20)

產(chǎn)量：40mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.0(t,J＝6.8Hz,3H)，2.40(q,2H)，2.45(br,4H)，2.46(br,4H)，3.62(s,2H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，6.18(d,J＝16.8Hz,1H)，6.23(m,1H)，6.35(m,1H)，6.47(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.76(m,1H)，7.01(m,1H)，7.17(m, 1H)，7.60(m,1H)，7.62(m,1H)，8.00(s,1H)，8.69(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₇H₂₉ClN₈O，[M+H]⁺計(jì)量值：518.03，測(cè)量值：518.10。

(21)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-(1-嗎啡啉)丙氧基苯基氨基))丙烯酰胺(I-21)

產(chǎn)量：20mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.80(q,2H)，2.35(t,J＝6.8Hz,2H)，2.37(br,4H)，3.68(br,4H)，3.93(t,J＝6.8Hz,2H)，5.69(d,J＝10.0Hz,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.34(m,2H)，6.47(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.51(m,2H)，6.98(m,1H)，7.19(m,1H)，7.58(m,1H)，7.60(m,1H)，8.66(s,1H)，8.71(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₇H₂₉N₇O₃，[M+H]⁺計(jì)量值：500.56，測(cè)量值：500.32。

(22)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(3-甲氧基-4-(1-嗎啡啉)丙氧基苯基氨基))丙烯酰胺(I-22)

產(chǎn)量：26mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.80(q,2H)，2.33(s,3H)，2.35(t,J＝6.8Hz,2H)，2.37(br,4H)，3.68(br,4H)，3.94(t,J＝6.8Hz,2H)，5.69(d,J＝10.0Hz,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.22(m,1H)，6.31(m,1H)，6.34(m,1H)，6.46(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.98(m,1H)，7.18(m,1H)，7.59(m,1H)，7.60(m,1H)，8.68(s,1H)，8.71(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₈H₃₁N₇O₄，[M+H]⁺計(jì)量值：530.59，測(cè)量值：530.39。

(23)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲基-4-(1-嗎啡啉)丙氧基苯基氨基))丙烯酰胺(I-23)

產(chǎn)量：17mg；類白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.81(q,2H)，2.35(t,J＝6.8Hz,2H)，2.37(br,4H)，3.67(br,4H)，3.73(s,3H)，3.93(t,J＝6.8Hz,2H)，5.69(d,J＝10.0Hz,1H)，5.84(m,1H)，5.90(m,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.40(m,1H)，6.47(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.98(m,1H)，7.19(m,1H)，7.58(m,1H)，7.59(m,1H)，8.69(s,1H)，8.71(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₈H₃₁N₇O₃，[M+H]⁺計(jì)量值：514.59，測(cè)量值：514.39。

(24)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-(1-甲基哌嗪)丙氧基苯基氨基))丙烯酰胺(I-24)

產(chǎn)量：20mg；灰白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.80(q,2H)，2.26(s,3H)，2.35(t,J＝6.8Hz,2H)，2.47(br,4H)，2.48(br,4H)，3.92(t,J＝6.8Hz,2H)，5.70(d,J＝10.0Hz,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.34(m,2H)，6.48(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.51(m,2H)，6.99(m,1H)，7.19(m,1H)，7.58(m,1H)，7.60(m,1H)，8.66(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₈H₃₂N₈O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：513.61，測(cè)量值：513.42。

(25)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(3-甲氧基-4-(1-甲基哌嗪)丙氧基苯基氨基))丙烯酰胺(I-25)

產(chǎn)量：23mg；灰白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.80(q,2H)，2.28(s,3H)，2.35(t,J＝6.8Hz,2H)，2.43(br,4H)，2.45(br,4H)，3.74(s,3H)，3.95(t,J＝6.8Hz,2H)，5.69(d,J＝10.0Hz,1H)，5.87(m,1H)，5.93(m,1H)，6.18(d,J＝16.8Hz,1H)，6.40(m,1H)，6.46(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.98(m,1H)，7.20(m,1H)，7.58(m,1H)，7.60(m,1H)，8.69(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₉H₃₄N₈O₃，[M+H]⁺計(jì)量值：543.63，測(cè)量值：543.51。

(26)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(2-甲基-4-(1-甲基哌嗪)丙氧基苯基氨基))丙烯酰胺(I-26)

產(chǎn)量：18mg；灰白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.80(q,2H)，2.28(s,3H)，2.34(s,3H)，2.36(t,J＝6.8Hz,2H)，2.44(br,4H)，2.45(br,4H)，3.94(t,J＝6.8Hz,2H)，5.69(d,J＝10.0Hz,1H)，6.18(d,J＝16.8Hz,1H)，6.22(m,1H)，6.33(m,1H)，6.34(m,1H)，6.45(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.98(m,1H)，7.21(m,1H)，7.59(m,1H)，7.61(m,1H)，8.69(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₉H₃₄N₈O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：527.63，測(cè)量值：527.51。

(27)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(4-(1-乙基哌嗪)丙氧基苯基氨基))丙烯酰胺(I-27)

產(chǎn)量：30mg；灰白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.0(t,J＝6.8Hz,3H)，1.80(q,2H)，2.35(t,J＝7.5Hz,2H)，2.41(q,2H)，2.47(br,4H)，2.48(br,4H)，3.93(t,J＝6.8Hz,2H)，5.71(d,J＝10.0Hz,1H)，6.16(d,J＝16.8Hz,1H)，6.34(m,2H)，6.49(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.53(m,2H)，6.99(m,1H)，7.19(m,1H)，7.58(m,1H)，7.60(m,1H)，8.67(s,1H)，8.72(s,1H)；HRMS(ESI)for C₂₉H₃₄N₈O₂，[M+H]⁺計(jì)量值：527.63，測(cè)量值：527.47。

(28)N-(9-(2-苯基氨基)嘌呤-2-(3-甲氧基-4-(1-嗎啡啉)丙氧基苯基氨基))丙烯酰胺(I-28)

產(chǎn)量：23mg；灰白色固體；¹H NMR(DMSO-d₆)：δ1.0(t,J＝6.8Hz,3H)，1.80(q,2H)，2.35(t,J＝7.5Hz,2H)，2.41(q,2H)，2.43(br,4H)，2.45(br,4H)，3.72(s,3H)，3.95(t,J＝6.8Hz,2H)，5.69(d,J＝10.0Hz,1H)，5.87(m,1H)，5.91(m,1H)，6.18(d,J＝16.8Hz,1H)，6.40(m,1H)，6.46(dd,J＝10.0,16.8Hz,1H)，6.98(m,1H)，7.21(m,1H)，7.58(m,1H)，7.60(m,1H)，8.69(s,1H)，8.73(s,1H)；HRMS(ESI)for C₃₀H₃₆N₈O₃，[M+H]⁺計(jì)量值：557.66，測(cè)量值：557.41。

活性測(cè)試

1.體外對(duì)受體酪氨酸激酶抑制活性測(cè)試方法

(1)制備激酶檢測(cè)緩沖液

①在室溫融解Kinase Detection Buffer，觀察是否有沉淀。

②如果出現(xiàn)沉淀，就在37℃孵育Kinase Detection Buffer 15分鐘并經(jīng)常搖動(dòng)，溶解沉淀?；蛘?，小心吸走上清，去除沉淀。

(2)制備激酶檢測(cè)試劑

①使用前在室溫平衡Kinase Detection Buffer和Kinase Detection Substrate。

②將Kinase Detection Buffer全部倒進(jìn)裝有Kinase Detection Substrate的棕色瓶中，使凍干粉底物溶解。這樣就制成了激酶檢測(cè)試劑。

③輕輕震蕩、渦旋或顛倒混勻，成為均質(zhì)溶液。底物應(yīng)在1分鐘內(nèi)溶解。

④激酶檢測(cè)試劑配好后應(yīng)立即使用，或分裝存于-20℃。我們認(rèn)為配好的試劑經(jīng)過(guò)幾次凍融后循環(huán)信號(hào)活性都沒(méi)有損失。

(3)制作ATP轉(zhuǎn)化成ADP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

①用1x kinase reaction buffer稀釋試劑盒提供的Ultra Pure ATP和ADP，制成90 0μL 50μM ATP和500μL 50μM ADP。

②將上一步配好的50μM ATP和50μM ADP溶液按表1所示在384孔板K1-12中混合，模擬每個(gè)轉(zhuǎn)化百分比的ATP和ADP的濃度?；旌虾?。

表1.制備50μM系列ATP+ADP標(biāo)準(zhǔn)品

③每孔加入5μL的ADP-Glo^TM試劑來(lái)終止激酶反應(yīng)。在室溫孵育40分鐘。

④每孔加入10μL Kinase Detection Reagent將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，并引進(jìn)螢光素酶和螢光素來(lái)檢測(cè)ATP。

⑤在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量螢光并記錄螢光值。

⑥繪制ATP轉(zhuǎn)化成ADP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(4)確定激酶抑制物的IC₅₀值

①按照promega試劑盒說(shuō)明書(shū)配制1x kinase reaction buffer，2.5x50ng/μL激酶和2.5x0.5μg/μL底物和125μM ATP。

②在無(wú)酶對(duì)照孔中加入3μL 1x kinase reaction buffer，2μL 2.5x0.5μg/μL底物和125μM ATP。在陰性對(duì)照孔中加入1μL 1x kinase reaction buffer，2μL 2.5x 50ng/μL激酶，2μL 2.5x0.5μg/μL底物和125μM ATP。在測(cè)試孔中加入1μL 5x待測(cè)藥物，2μL 2.5x50ng/μL激酶，2μL 2.5x0.5μg/μL底物和125μM ATP。

③混合好平板，孵育60分鐘。

④每孔加入5μL的ADP-Glo^TM試劑來(lái)終止激酶反應(yīng)。在室溫孵育40分鐘。

⑤每孔加入10μL Kinase Detection Reagent將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，并引進(jìn)螢光素酶和螢光素來(lái)檢測(cè)ATP。在室溫孵育30-60分鐘，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)量螢光并記錄螢光值。

⑥結(jié)果分析

2.抑制BTK高表達(dá)細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)(CCK-8檢測(cè)法)

(1)細(xì)胞類型及選擇：Ramos細(xì)胞(人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞)、Raji細(xì)胞(人Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞)。

(2)細(xì)胞接種：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以每孔4x10³個(gè)細(xì)胞，每孔體積90μL接種到96孔板，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔(邊緣孔用無(wú)菌PBS填充)；

(3)細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞接種后，對(duì)照組用10％FBS RPMI-1640培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別用10μL不同濃度梯度的AVL-292(1.25-40μmol/L)、各不同藥物(1.25-40μmol/L)干預(yù)，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(按實(shí)驗(yàn)要求分別培養(yǎng)不同時(shí)間)；

(4)呈色：兩組細(xì)胞分別于培養(yǎng)48h后加入10μL CCK-8溶液(5mg/ml)，2h后終止培養(yǎng)，于搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解；

(5)比色：在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光度值(OD值)，選擇450nm波長(zhǎng)，以無(wú)細(xì)胞的即RPMl-1640培養(yǎng)液空白孔調(diào)零，測(cè)各孔的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次；

(6)記錄結(jié)果：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率＝(對(duì)照組吸光度值一實(shí)驗(yàn)組吸光度值)/對(duì)照組吸光度值x 100％，細(xì)胞增殖率＝(實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值)x 100；

(7)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：以時(shí)間為橫坐標(biāo)，抑制率/增殖率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

結(jié)果與討論

表1嘌呤類化合物抑制BTK激酶活性和抗淋巴細(xì)胞增殖活性^a

^a數(shù)據(jù)代表至少三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均值。^b根據(jù)5個(gè)濃度繪制的量效曲線，IC₅₀值在納摩爾或微摩爾級(jí)達(dá)到至少抑制50％的細(xì)胞生長(zhǎng)。

以上活性結(jié)果表明，本發(fā)明中的化合物對(duì)BTK激酶具有強(qiáng)的抑制效果，大多數(shù)化合物的有效抑制濃度IC₅₀值在100nmol以下，化合物I-4，9，10,18,19，21，22,23,27,28，30對(duì)BTK激酶的活性均低于10nmol，且化合物I-28的IC₅₀值達(dá)到0.4nmol,優(yōu)于上市藥物依魯替尼。對(duì)JAK3激酶的抑制效果顯示：此類化合物能夠在100nmol/L濃度抑制JAK3激酶，化合物I-28對(duì)JAK3的IC₅₀值最小，達(dá)到72.6nmol，揭示此分子通過(guò)雙靶點(diǎn)途徑達(dá)到治療相關(guān)疾病的效果。抑制淋巴瘤白血病細(xì)胞的活性也表明：此類能夠抑制多個(gè)淋巴瘤白血病細(xì)胞，IC₅₀值在5-20微摩爾之間，大部分化合物達(dá)到了臨床Ⅲ期分子AVL292的效果水平，且部分化合物如：I-21和I-28明顯優(yōu)于上市藥物依魯替尼，具有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成臨床使用治療淋巴細(xì)胞白血病的用途。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)先實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。