本發(fā)明涉及環(huán)境分析、生物分析檢測技術領域，具體涉及一種反應型汞離子熒光分子探針的制備方法和該熒光分子探針在檢測汞離子方面的應用。

背景技術：

汞具有很強的生物毒性，對人的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等都有不良影響。人體吸收汞的途經(jīng)有三種，分別是消化道、呼吸道和皮膚。汞在生物體內(nèi)有累積效應，不能通過代謝過程排出體外，進入人體后直接沉入肝臟，對大腦、神經(jīng)、視力破壞極大。長期接觸并攝入汞會出現(xiàn)很明顯的病癥，如嚴重的惡心、嘔吐、腹痛以及腎功能損傷等，通過水俁病患者的肢體表現(xiàn)、精神狀態(tài)就能看出汞對人體的危害程度。根據(jù)《中華人民共和國環(huán)境保護法》規(guī)定，生活飲用水和農(nóng)田灌溉水汞含量不得超過0.001mg/L。汞在水體中產(chǎn)生毒性的范圍大約是0.01-0.001mg/L，而汞在水體中通過積累后的毒性遠大于此，生活在受汞污染水域的魚體內(nèi)甲基汞的含量可比水中的高上萬倍，經(jīng)食物鏈積累后受到最大危害的還是我們?nèi)祟?。汞對農(nóng)作物有害而無利，但農(nóng)作物卻能輕易的吸收，土壤中汞的含量影響農(nóng)作物的生長發(fā)育，直接關系到農(nóng)作物的產(chǎn)量與質(zhì)量。土壤中的微生物非但不能將汞降解，有的甚至可以通過生物甲基化作用轉(zhuǎn)化為更具毒害性的化合物，這些東西經(jīng)食物鏈富集后最終還是進入人的體內(nèi)?？梢?，汞對土壤的污染與危害也是不可小覷。因此重金屬汞的分析與檢測也便成為了當今化學分析領域的一個重要課題。目前檢測汞離子離子的方法有很多種，其中熒光分析法具有快速響應與高靈敏度的特點，因此利用熒光探針來定性與定量檢測汞離子己成為研究的熱點（CN201410555700.7，CN201410369075.7，CN201010166304.7，CN201410768327.3，CN201110122460.8，CN201410207062.X，CN201110421734.3，CN201210047116.1，CN201310273704.1，CN201210526466.6，CN201410400848.3等）。探針類型主要分為絡合汞離子熒光探針和反應型汞離子熒光探針。其中由于汞離子具有非常強的嗜硫性，以嗜硫性為基礎的反應型熒光探針具有高度專一性和環(huán)境適應性，可以更好的應用于汞離子的檢測。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種苯并咪唑并苯并異喹啉酮類汞離子反應熒光探針及其制備方法，是以1，8-萘酐、3,4-二氨基苯甲酸、正丁胺和勞森試劑為原料，合成對汞離子具有高選擇性、特異性識別的新型汞離子熒光探針。

本發(fā)明的目的通過如下技術方案實現(xiàn)。

一種汞離子熒光探針及其制備方法，其特征在于：

（1）一種反應型汞離子熒光探針，其特征是具有以下化學分子結(jié)構(gòu)式：

圖1化合物分子結(jié)構(gòu)

（2）汞離子熒光探針其制備方法如下：

a. 苯并咪唑并苯并異喹啉酮-11-羧酸的制備：將1,8-萘二甲酸酐和3,4-二氨基苯溶于醋酸溶液中，加熱回流12h；反應結(jié)束后，冷卻到室溫，抽濾并用醋酸進行洗滌，干燥得粗產(chǎn)品；粗產(chǎn)品溶解于5%的氫氧化鈉溶液，過濾不溶物，使用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值在2～3之間，析出黃綠色固體，抽濾，沸水洗滌，干燥得產(chǎn)品。

b. 苯并咪唑并苯并異喹啉酮-11-酰氯的制備：將苯并咪唑并苯并異喹啉酮-11-羧酸懸浮于二氯甲烷中，體系中加入草酰氯，室溫攪拌5h，產(chǎn)生大量黃色懸浮物，將固體抽濾，二氯甲烷洗滌數(shù)次，干燥得黃色產(chǎn)品。

c. N-丁基-苯并咪唑并苯并異喹啉酮-11-羧酰胺的制備：將苯并咪唑并苯并異喹啉酮-11-酰氯懸浮于二氯甲烷中，體系中依次加入正丁胺，縛酸劑三乙胺，室溫攪拌過夜；反應結(jié)束后，反應液5% NaOH洗滌，無水NaSO₄干燥，無水乙醇重結(jié)晶得黃色產(chǎn)品。

d. 汞離子熒光探針的制備：將N-丁基-苯并咪唑并苯并異喹啉酮-11-羧酰胺和勞森試劑溶于甲苯溶劑中，氮氣保護下回流12 h，反應結(jié)束后冷卻至室溫，濃縮溶劑，柱層析分離得到汞離子熒光探針。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種選擇性好、靈敏度高、水溶性好和熒光增強的檢測汞離子的熒光探針：在緩沖溶液CH₃CN-HEPES (0.02 M，pH=7.4) (7/3，v/v) 中，熒光探針的濃度為1μM，激發(fā)波長為367nm，進行汞離子檢測測定。

本發(fā)明的優(yōu)點及效果是：

（1）本發(fā)明獲得高選擇性汞離子熒光分子探針，以化學性質(zhì)穩(wěn)定的苯并咪唑并苯并異喹啉酮為熒光分子母體，硫代羧酰胺為汞離子識別基團。

（2）本發(fā)明所述的探針分子原料易得，制備過程簡單，條件易于控制合成產(chǎn)率較高，光學性能穩(wěn)定。

（3）本發(fā)明獲得高選擇性汞離子熒光分子探針，通過硫原子可以與汞離子的發(fā)生特異性反應，使熒光探針分子中的C=S雙鍵轉(zhuǎn)變?yōu)镃=O雙鍵，產(chǎn)生強熒光（熒光增強39.6倍）。該探針分子具有靈敏度較高，水溶性較好，對汞離子識別能力強，響應速度較快。因此該類型探針在生物化學、環(huán)境科學等領域具有實際的應用價值。

附圖說明

圖1化合物分子結(jié)構(gòu)

圖2 中間體1的合成路線

圖3 中間體2的合成路線

圖4 中間體3的合成路線

圖5 化合物A的合成路線

圖6圖7中，本發(fā)明的熒光探針的測試均在緩沖溶液CH₃CN-HEPES (0.02 M, pH=7.4) (7/3, v/v) 中體系中進行。

圖6為本發(fā)明的熒光探針（1uM）在加入不同濃度汞離子后熒光發(fā)射光譜變化隨濃度的關系，橫坐標為波長，縱坐標為熒光強度。

圖7為本發(fā)明的熒光探針（1uM）分別加入10當量的不同金屬離子Ni²⁺、Ba²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Pb²⁺、K⁺、Hg²⁺后的熒光光譜，橫坐標為波長，縱坐標熒光強度。

具體實施方式

實施例1：中間體1的合成

圖2 中間體1的合成路線

稱取0.99g 1,8-萘二甲酸酐和0.76g 3,4-二氨基苯甲酸懸浮于50mL醋酸中，氮氣保護下回流10h。待反應完全后冷卻至室溫，生成的草綠色化合物經(jīng)減壓抽濾并用醋酸洗滌數(shù)次，置于空氣中晾干并溶解于100 mL 5%的氫氧化鈉溶液中。將溶液中不溶物濾掉，在濾出液中加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值在2～3之間，溶液中有固體生成，抽濾并用沸水洗滌數(shù)次得黃綠色體1.1g(中間體1)，產(chǎn)率63%。核磁質(zhì)譜表征如下：¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.77 (s, 1H), 8.47 (dd, J = 15.1, 7.6 Hz, 4H), 8.35 (dd, J = 7.8, 5.0Hz, 4H), 8.22 (dd, J = 17.6, 8.8Hz, 4 H), 8.14 (s, 1H), 7.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.85-7.65 (m, 5H).

中間體2的合成

圖3 中間體2的合成路線

稱取中間體1(1.0g，3.2mmol)懸浮于40 mL二氯甲烷中，加入8mL草酰氯并滴入3-4滴DMF作為催化劑，室溫攪拌5h，產(chǎn)生大量黃色懸浮物，將固體抽濾并用二氯甲烷洗滌數(shù)次，得黃色粗品1.02g，未經(jīng)純化直接用于下一步。

中間體3的合成

圖4 中間體3的合成路線

稱取0.66 g（2mmol)中間體2懸浮于20mL二氯甲烷中，依次加入0.83mL(8mmol)三乙胺和0.3mL(3mmol)正丁胺，三乙胺作為縛酸劑,室溫攪拌過夜。用5% NaOH洗滌三次，再用水洗滌一次，最后用NaSO₄干燥，旋干得黃色固體，用無水乙醇重結(jié)晶，得純凈黃色固體0.71g（中間體3),產(chǎn)率97.2%。¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.93 (s, H), 8.73 (d, J = 4 Hz, 2H), 8.53 (d, J = 8 Hz, 1H), 8.38-8.45 (m, 2H), 7.89-7.92 (m, 3H), 2.52 (t, J= 4 Hz, 2H), 1.54-1.61 (m, 2H), 1.34-1.43 (m, 2H), 0.95 (t, J = 6 Hz, 3H). ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167.35, 160.53, 150.95, 145.84, 135.57, 135.48, 132.76, 132.35, 132.17, 132.13, 132.00, 131.91, 131.81, 131.42, 127.60, 127.45, 127.35, 127.06, 126.95, 126.88, 125.59, 124.31, 122.72, 120.13, 119.89, 118.55, 115.67, 113.89, 40.03, 31.86, 20.16, 13.87 HRMS-ESI (m/z) [M+H]⁺計算值370.1556, 實測值370.1535.

化合物A的合成

圖5 化合物A的合成路線

稱取中間體3(0.36g， 1mmol)，勞森試劑（0.44g，1.1mmol）和10mL甲苯置于50mL圓底燒瓶中，氮氣保護下回流12h。反應結(jié)束后冷卻至室溫，濃縮，柱層析(V_二氯甲烷:V_丙酮=10:1)分離得0.23g目標產(chǎn)物，產(chǎn)率60%。¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 9.42 (s, 1H), 8.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.44-8.52 (m, 3H), 8.02-8.08 (m, 4H), 7.82-7.93 (m, 4H), 7.49-7.65 (m, 6H), 3.93-3.97 (m, 4H), 1.87-1.93 (m, 4H), 1.53-1.64 (m, 4H), 1.09 (q, J = 8.0 Hz, 6H),. ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 198.38, 160.17, 150.53, 148.03, 145.97, 145.23, 138.79, 135.58, 135.43, 134.79, 133.27, 131.89, 131.63, 131.44, 128.71, 127.86, 127.30, 127.12, 127.04, 126.69, 126.50, 126.14, 123.21, 120.20, 119.33, 119.26, 115.20, 112.69, 46.82, 30.31, 20.46, 13.93.5, 115.67, 113.89, 40.03, 31.86, 20.16, 13.87. HRMS-ESI (m/z) [M+H]⁺計算值386.1327, 實測值386.1312.

實施例2

在緩沖溶液CH₃CN-HEPES (0.02 M，pH=7.4) (7/3，v/v) 中，熒光探針的濃度為1μM，激發(fā)波長為367nm。

在緩沖溶液中，以367nm光激發(fā)，熒光探針分子在400-700nm處無熒光發(fā)射峰當向溶液中滴加Hg²⁺(0-13equiv)，體系在400-700nm處產(chǎn)生了強的熒光發(fā)射峰，且隨Hg²⁺濃度的增加，熒光強度一直在增強，直到Hg²⁺濃度是探針濃度的12equiv時，熒光強度不再增強（如圖6），很顯然，這樣的熒光增強是由于Hg²⁺與探針中的S原子反應，生成HgS，探針的C=S雙鍵變?yōu)镃=O雙鍵。

實施例3

配置1μM熒光探針溶液，然后向溶液中分別加入10equiv的不同金屬離子Ni²⁺、Ba²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Pb²⁺、K⁺，測定在各金屬離子存在下，熒光探針分子的熒光發(fā)射光譜；

參照汞離子對探針分子的熒光光譜滴定實驗，本發(fā)明通過競爭金屬離子實驗來判定探針對汞離子的選擇性，在溶液中分別加入10equiv的不同金屬離子Ni²⁺、Ba²⁺、Ag⁺、Cd²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Pb²⁺、K⁺后，熒光光譜沒有明顯變化，在同樣條件下，加入Hg²⁺（10equiv)后，熒光發(fā)射強度明顯增強，通過對熒光發(fā)射強度的監(jiān)測表明：本發(fā)明十分適合作為汞離子熒光探針（圖7）。