交叉引用的申請

本申請要求2010年9月3日提交的美國臨時申請?zhí)?1/380,181和2011年7月21日提交的美國臨時申請?zhí)?1/510,413在35U.S.C.119(e)下的權(quán)益，所述文獻(xiàn)各自通過引用以其全文結(jié)合在此。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及細(xì)胞或細(xì)胞亞群，尤其是源自各種腫瘤的腫瘤起始細(xì)胞的鑒定、表征、以及任選地分離或富集。在選擇的多個方面，本發(fā)明也涉及分離腫瘤起始細(xì)胞的方法和所得到的制劑，以及使用腫瘤起始細(xì)胞和細(xì)胞群用于藥物研究與開發(fā)和用于診斷、治療和其他臨床與非臨床應(yīng)用中的各種方法。

發(fā)明背景

干細(xì)胞與祖細(xì)胞分化和細(xì)胞增殖是共同作用以支持器官發(fā)生期間的組織生長和所有活生物的生命期間的細(xì)胞替代及大多數(shù)組織的修復(fù)的正常持續(xù)過程。分化和增殖決定經(jīng)常受到經(jīng)平衡以維持細(xì)胞命運(yùn)決定和組織結(jié)構(gòu)的眾多因素和信號的控制。正常組織結(jié)構(gòu)由于應(yīng)答于調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂和組織成熟的微環(huán)境線索的細(xì)胞而被維持。因此，細(xì)胞增殖和分化通常只在必要時因替換受損或垂死細(xì)胞或因生長而出現(xiàn)。遺憾的是，可以因許多因素而引起細(xì)胞增殖和/或分化的破壞，這些因素包括例如，在各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)化學(xué)物質(zhì)下或其過于豐富、存在改變的微環(huán)境、基因突變或其某種組合。當(dāng)正常的細(xì)胞增殖和/或分化被擾亂或以某種方式被破壞時，這可能導(dǎo)致各種疾病或失調(diào)，包括癌癥。

癌癥的常規(guī)治療包括化學(xué)療法、放射療法、手術(shù)、免疫療法(例如，生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑、疫苗或靶向治療)或其組合。糟糕的是，太多種類的癌癥對于這些常規(guī)療法是不應(yīng)答或最低地應(yīng)答的，留給患者的選擇很少。而且，取決于癌癥的類型，一些可用的療法(如手術(shù))可能不是可行的替代方案。當(dāng)試圖護(hù)理已經(jīng)經(jīng)歷過先前治療并且隨后已經(jīng)再發(fā)的患者時，在護(hù)理治療的當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)中固有的局限是特別明顯的。在這些情況下，失敗的治療方案和所產(chǎn)生的患者惡化可能促成難治性腫瘤，這些難治性腫瘤經(jīng)常自我表現(xiàn)為最終證明為不可治的更為侵襲性的疾病。在癌癥的診斷和治療方面雖然多年來已經(jīng)有巨大改進(jìn)，許多實(shí)體瘤的總生存率仍然保持基本上不變，原因在于現(xiàn)有療法防止再發(fā)、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的失敗。因此，開發(fā)更為靶向和有效的療法仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

有希望的研究領(lǐng)域包括使用靶向療法來追蹤顯得奠定許多癌癥的基礎(chǔ)的致瘤性“種子”細(xì)胞。為此目的，現(xiàn)在已知大部分實(shí)體組織含有成體組織居民干細(xì)胞群，這些干細(xì)胞群產(chǎn)生了構(gòu)成這種組織的大部分的分化細(xì)胞類型。在這些組織中產(chǎn)生的腫瘤類似地由異質(zhì)細(xì)胞群組成，這些異質(zhì)細(xì)胞群也從干細(xì)胞中產(chǎn)生，但是在它們的總體增殖和機(jī)化方面明顯不同。雖然越來越認(rèn)識到大多數(shù)腫瘤細(xì)胞具有有限的增殖能力，少數(shù)癌細(xì)胞群(常稱作癌干細(xì)胞或CSC)具有廣泛我更新的專有能力，從而使它們具有腫瘤再起始能力。更具體地說，癌干細(xì)胞假設(shè)提出，在每種腫瘤內(nèi)存在著能夠無限自我更新和能夠產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的不同細(xì)胞子集(即CSC)(大約0.1％-10％)，這些腫瘤細(xì)胞在它們的復(fù)制能力方面由于其分化成腫瘤祖細(xì)胞并隨后分化成終末分化腫瘤細(xì)胞而被逐步限制。

近年來，已經(jīng)變得更明顯的是，這些CSC(也稱作腫瘤永存細(xì)胞或TPC)對于傳統(tǒng)的化學(xué)治療劑或放射可能是更抵抗的，并且因此在標(biāo)準(zhǔn)的護(hù)理臨床療法之后存留，從而隨后促進(jìn)再發(fā)性腫瘤、繼發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移的增長。而且，存在著越來越多的證據(jù)，表明調(diào)節(jié)器官發(fā)生和/或正常組織居民干細(xì)胞的自我更新的途徑在CSC中解除管制或改變，導(dǎo)致自我更新癌細(xì)胞的連續(xù)擴(kuò)張和腫瘤形成。通常參見Al-Hajj等人，2004，PMID:15378087；和Dalerba等人，2007，PMID:17548814；所述文獻(xiàn)各自通過引用以其全文結(jié)合在此。因此，傳統(tǒng)的以及更為新近的靶向治療方法的有效性已經(jīng)因抗性癌細(xì)胞的存在和/或出現(xiàn)而明顯受到限制，這些抗性癌細(xì)胞能夠使癌癥即使在面臨這些多樣的治療方法的情況下永存。Huff等人，《歐洲癌癥雜志》(European Journal of Cancer)42:1293-1297(2006)和Zhou等人，《自然評論：藥物發(fā)現(xiàn)》(Nature Reviews Drug Discovery)8:806-823(2009)，所述文獻(xiàn)各自通過引用以其全文結(jié)合在此。這樣的觀察結(jié)果通過傳統(tǒng)的減瘤劑(debulking agent)始終不能實(shí)質(zhì)性地增加患者在患有實(shí)體瘤時的存活、以及通過產(chǎn)生關(guān)于腫瘤怎樣生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的日益復(fù)雜的理解而證實(shí)。因此，用于治療腫瘤性疾病的最近策略已經(jīng)認(rèn)識到消除、耗盡、沉默或促進(jìn)腫瘤永存細(xì)胞的分化，從而減少腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或患者再發(fā)可能性的重要性。

產(chǎn)生這樣的策略的努力已經(jīng)結(jié)合到最近的涉及非傳統(tǒng)異種移植(NTX)模型的工作中，其中原發(fā)性人實(shí)體瘤標(biāo)本被植入免疫低下小鼠中并且專有地傳代。這樣的技術(shù)證實(shí)，存在這樣的細(xì)胞亞群，其具有產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤并促進(jìn)它們無限生長的獨(dú)特能力。如先前假設(shè)，在NTX模型中的工作已經(jīng)證實(shí)，鑒定的腫瘤細(xì)胞CSC亞群顯得更抵抗減瘤方案如化學(xué)療法和放射，這可能解釋在臨床緩解率與總生存期之間的不一致。此外，在CSC研究中采用NTX模型已經(jīng)在藥物發(fā)現(xiàn)和候選藥物的臨床前評估中激起根本變化，這可能導(dǎo)致對腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重大影響從而提高患者存活率的CSC靶向療法。

遺憾的是，這樣的技術(shù)和相關(guān)的方法學(xué)在很大程度上依賴于高效而可靠地鑒定、表征和/或劃分、分離或富集然后可以被有效分析的腫瘤永存細(xì)胞亞群的能力。為了最終進(jìn)行這樣的工作，允許細(xì)胞層次的剖析和機(jī)化的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記的鑒定和關(guān)聯(lián)是關(guān)鍵的。與腫瘤永存細(xì)胞(即CSC)相關(guān)的可靠標(biāo)記的鑒定因此提供了對于在臨床環(huán)境和基礎(chǔ)研究環(huán)境中的多種應(yīng)用有用的有價(jià)值的信息。來自特定腫瘤或轉(zhuǎn)移病灶的腫瘤永存細(xì)胞的鑒定以及隨后的分離在例如在用于診斷失調(diào)的病理學(xué)基礎(chǔ)和/或開發(fā)合理的治療處理中是有用的。在其他情況下，就針對生理機(jī)制和分子機(jī)制實(shí)施體外實(shí)驗(yàn)或就植入用于腫瘤產(chǎn)生、進(jìn)展和/或治療的體內(nèi)研究的動物中而言，鑒定、表征、分離、劃分或富集TPC是必要的。

通過提供促進(jìn)理解、治療、預(yù)防和/或管理過度增生性失調(diào)的新穎的組合物、模型和方法，本發(fā)明著手解決了若干這些問題。

發(fā)明概述

這些目標(biāo)和其他目標(biāo)由本發(fā)明提供，本發(fā)明在廣義上是針對可以用來鑒定或表征并且任選地用來分離、劃分、分開或富集與過度增生性失調(diào)或腫瘤性疾病相關(guān)的某些致瘤細(xì)胞或細(xì)胞亞群的方法、化合物、組合物和制造品。在優(yōu)選的實(shí)施例中，受試者細(xì)胞或細(xì)胞亞群將包含腫瘤起始細(xì)胞和/或腫瘤永存細(xì)胞和/或腫瘤祖細(xì)胞。

更具體地說，根據(jù)在此的教導(dǎo)，諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列可以獨(dú)立或共同地用來精確鑒定、分選富集和/或和表征來自多種腫瘤的癌干細(xì)胞的標(biāo)記。使用選擇的生物化學(xué)技術(shù)，披露的標(biāo)記與腫瘤結(jié)構(gòu)中的特異性、自我更新的惡性細(xì)胞的新穎的關(guān)聯(lián)提供了對表型不同的能夠永存自我更新和腫瘤重演(tumor recapitulation)的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞亞群的富集、分離或純化。與現(xiàn)有技術(shù)相反并且如由以下實(shí)例所證明，這些披露的標(biāo)記能夠識別或鑒定來自多種腫瘤的腫瘤起始細(xì)胞。這些標(biāo)記定義的、相對同質(zhì)的細(xì)胞群的富集或分離轉(zhuǎn)而允許構(gòu)成性癌干細(xì)胞的廣泛表征，包括潛在治療靶標(biāo)的闡明和藥物化合物的篩選。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的細(xì)胞和組合物可以與動物模型如非傳統(tǒng)異種移植模型一起使用以便促進(jìn)研究和藥物開發(fā)努力。而且，披露的標(biāo)記可以進(jìn)一步在臨床環(huán)境和非臨床環(huán)境中使用，用于過度增生性失調(diào)的診斷、分類、監(jiān)測和管理以及提供相關(guān)的試劑盒或其他制造品。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，通過如在此所陳述的選擇標(biāo)記或標(biāo)記組合的新穎用途，本發(fā)明提供了分別對腫瘤起始細(xì)胞(TIC)、腫瘤永存細(xì)胞(TPC)和腫瘤祖細(xì)胞(TProg)的鑒定、表征、富集和/或分離。就癌干細(xì)胞范例而言，每一種上述細(xì)胞亞群是或大或小程度致瘤的，并且正因如此是造成腫瘤生長、維持、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的原因。顯著地，本發(fā)明允許這樣的細(xì)胞亞群被鑒定并且任選地源自許多種不同的腫瘤類型和癌癥階段。也就是說，通過鑒定特異性癌干細(xì)胞標(biāo)記，包括腫瘤起始細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(TICAM)、腫瘤永存細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(TPCAM)和腫瘤祖細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(TProgAM)，除其他方面外，本發(fā)明提供了高純致瘤細(xì)胞亞群的一致且可重復(fù)的識別、表征和分選或分離，這轉(zhuǎn)而允許鑒定用于前瞻性診斷的癌干細(xì)胞特異性治療靶標(biāo)和蛋白質(zhì)。在這方面，可以在藥物研究與開發(fā)活動中有效地采用如由單獨(dú)或組合的披露的標(biāo)記所定義的這些細(xì)胞或富集的細(xì)胞亞群來鑒定新穎的治療靶標(biāo)，這些治療靶標(biāo)被優(yōu)化以便抑制或耗盡腫瘤飼養(yǎng)癌干細(xì)胞。

因此，在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了由于表達(dá)至少一種TICAM而被富集的一種分離的致瘤細(xì)胞群。在相關(guān)的方法中，本發(fā)明將包括用于富集致瘤細(xì)胞群的方法，該方法包括以下步驟：

使腫瘤細(xì)胞群與結(jié)合劑接觸，該結(jié)合劑優(yōu)選地與至少一種TICAM結(jié)合；并且

分選與所述至少一種TICAM結(jié)合的所述細(xì)胞以提供富集的致瘤細(xì)胞群。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，分選步驟包括熒光激活細(xì)胞分選、磁輔助細(xì)胞分選、底物輔助細(xì)胞分選、激光介導(dǎo)切割、熒光測定法、流式細(xì)胞術(shù)或顯微技術(shù)。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，分選步驟將包括使腫瘤細(xì)胞群與多種結(jié)合劑接觸。

還由本發(fā)明提供的是源自異質(zhì)性腫瘤塊的富集的致瘤細(xì)胞群以及源自這些腫瘤的腫瘤起始細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解的是，所披露的腫瘤起始細(xì)胞分選方法連同體內(nèi)細(xì)胞傳代技術(shù)及體外培養(yǎng)技術(shù)以及所產(chǎn)生的純化細(xì)胞群提供了多種用途，如下文進(jìn)一步描述。

本發(fā)明的另一個方面包括患有腫瘤的受試者的個人化治療方法，所述方法通過使用根據(jù)本發(fā)明的方法的源自該受試者的自身腫瘤的致瘤細(xì)胞的容易可獲得性和可操作性而變得可能。

在這個方面，本發(fā)明的另一個實(shí)施例包括治療或診斷對其有需要的受試者的方法，該方法包括以下步驟：

從受試者獲得腫瘤樣品；并且

使該腫瘤樣品與至少一種結(jié)合劑接觸，該結(jié)合劑優(yōu)選地與TICAM結(jié)合。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，腫瘤樣品將包括實(shí)體瘤樣品。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，這種方法將進(jìn)一步包括表征或評定與所述腫瘤樣品結(jié)合的致瘤細(xì)胞的步驟。

本發(fā)明的又另一個方面將包括確定從腫瘤樣品獲得的細(xì)胞是否為致瘤的方法，所述方法包括使腫瘤細(xì)胞與至少一種TICAM接觸的步驟。

本發(fā)明的又另一個方面提供治療患有癌癥的受試者的方法，其中該方法包括評定從受試者獲得的樣品中的TICAM陽性細(xì)胞。任選地，這種評定可以在受試者的治療之后進(jìn)行并且，在其他實(shí)施例中，這種評定將在受試者已經(jīng)用一種或多種抗癌劑治療之后進(jìn)行。仍然在其他實(shí)施例中，將在患者被治療之前進(jìn)行這種評定。

本發(fā)明的另一個實(shí)施例涉及確定受試者是否處于復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中這種方法包括通過引入優(yōu)選結(jié)合TICAM的結(jié)合劑而評定TICAM陽性細(xì)胞的存在，其中檢測到腫瘤起始細(xì)胞表明該受試者處于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。在這樣的實(shí)施例中，可以向受試者給予如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的抗癌劑或療法。

類似地，本發(fā)明還提供了用于診斷和監(jiān)測腫瘤起始細(xì)胞相關(guān)失調(diào)如癌癥的試劑盒。為此目的，本發(fā)明優(yōu)選地提供了用于診斷或治療這樣的失調(diào)的制造品，所述制造品包括包含一種或多種結(jié)合劑的一個容器或多個容器以及使用所述容器的的指導(dǎo)材料，其中該結(jié)合劑優(yōu)選地與腫瘤起始細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記結(jié)合。

本發(fā)明的再另一個實(shí)施例包括進(jìn)行基因型或表型分析的方法，該方法包括以下步驟：

提供包含一種或多種TICAM的致瘤細(xì)胞或富集的致瘤細(xì)胞群；

處理所述細(xì)胞或細(xì)胞群以提供遺傳物質(zhì)或蛋白質(zhì)組物質(zhì)；并且

分析所述遺傳物質(zhì)或蛋白質(zhì)組物質(zhì)。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，這種分析將包括轉(zhuǎn)錄組的至少一部分的下一代(Next-Gen)測序。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明將包括質(zhì)譜分析。

在又另一個實(shí)施例中，本發(fā)明將包括篩選潛在藥物化合物的方法，該方法包括以下步驟：

使致瘤細(xì)胞或致瘤細(xì)胞群暴露于候選化合物；并且

使所述致瘤細(xì)胞或致瘤細(xì)胞群與至少一種TICAM接觸。

在選擇的實(shí)施例中，暴露步驟將在體內(nèi)進(jìn)行。在其他優(yōu)選的實(shí)施例中，暴露步驟將在體外進(jìn)行。仍然在其他優(yōu)選實(shí)施例中，該方法將進(jìn)一步包括表征致瘤細(xì)胞或致瘤細(xì)胞群。

在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)癌癥的方法，該方法包括以下步驟：

提供針對一種或多種TICAM而富集的致瘤細(xì)胞群；并且

將該致瘤細(xì)胞群引入受試者中。

在又另一個優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明包括誘導(dǎo)癌癥的方法，該方法包括以下步驟：

分離展示一種或多種TICAM的致瘤細(xì)胞；并且

將分離的致瘤細(xì)胞引入受試者中。

優(yōu)選地，通過使所述細(xì)胞與一種或多種結(jié)合劑接觸而分離這種細(xì)胞，其中該結(jié)合劑優(yōu)選地與一種或多種TICAM結(jié)合。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了產(chǎn)生腫瘤樣品的方法，該方法包括以下步驟：

提供包含一種或多種TICAM的致瘤細(xì)胞或富集的致瘤細(xì)胞群；

將所述致瘤細(xì)胞或富集的致瘤細(xì)胞群引入受試者中；

等待所述致瘤細(xì)胞或細(xì)胞群產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤；并且

收獲所述異質(zhì)性腫瘤。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，將使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)冷凍和保存收獲的腫瘤。仍然在其他優(yōu)選實(shí)施例中，將源自收獲的腫瘤的細(xì)胞植入受試者中。還有本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施例將包括腫瘤庫，該腫瘤庫包含這些收獲的腫瘤。

仍然在另一個特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了用于分析藥物化合物的動物模型，所述動物模型包括植入有針對一種或多種TICAM而純化或富集的致瘤細(xì)胞或細(xì)胞群的受試者。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，受試者將包括免疫低下小鼠。相關(guān)的優(yōu)選實(shí)施例包括產(chǎn)生用于分析藥物化合物的動物模型的方法，該方法包括引入針對一種或多種TICAM而純化或富集的致瘤細(xì)胞或細(xì)胞群的步驟。

除了前述方面之外，本發(fā)明的所選實(shí)施例提供了體內(nèi)分析癌癥進(jìn)展和/或發(fā)病機(jī)制的方法，該方法包括以下步驟：

將包含一種或多種TICAM的一個或多個腫瘤起始細(xì)胞引入受試者中；并且

分析在受試者中的癌癥進(jìn)展和/或發(fā)病機(jī)制。

在優(yōu)選的實(shí)施例中，在引入一個或多個腫瘤起始細(xì)胞后，將用一種或多種抗癌劑治療動物。

符合本發(fā)明的優(yōu)選TICAM將包括CD9、CD13、CD15、CD24、CD26、CD29、CD46、CD49a、CD49b、CD49c、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD58、CD63、CD66a、CD66c、CD66e、CD71、CD73、CD81、CD82、CD91、CD98、CD99、CD104、CD105、CD108、CD111、CD130、CD136、CD151、CD155、CD157、CD164、CD166、CD172a、CD186、CD221、CD230、CD262、CD273、CD275、CD295、CD298、CD317、CD318、CD324、CD340、CCR10、c-Met、Eph-B2、Eph-B4、FLOR1、Glut-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、HER3、IL-20Ra、整連蛋白a9b1、整連蛋白b5、LDL-R、Mer、腦信號蛋白(semaphorin)4B、TROP-2和Vb9。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，如在此所陳述富集或分離的細(xì)胞和細(xì)胞群應(yīng)當(dāng)包含標(biāo)記表型，該標(biāo)記表型包括一種或多種TICAM。如下文廣泛討論并且由所附實(shí)施例展示的，可以根據(jù)在此的教導(dǎo)使用每一種前述標(biāo)記來鑒定、表征和任選地分開或富集致瘤細(xì)胞群。

關(guān)于所有前述實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)理解的是，特別優(yōu)選的TICAM包括選自下組的TICAM，該組由以下各項(xiàng)組成：CD46、CD324和CD66c。在這個方面，應(yīng)當(dāng)理解的是，選擇的特別優(yōu)選的致瘤細(xì)胞或富集的細(xì)胞群將包含CD46^hi表型。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，披露的細(xì)胞或細(xì)胞群將包含CD324⁺表型。仍然在其他特別優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明的細(xì)胞或細(xì)胞組合物將包含CD46^hiCD324⁺表型。仍然在其他優(yōu)選的實(shí)施例中，披露的細(xì)胞將具有CCD46^hi CD324⁺CD66c^-表型，而仍然在其他實(shí)施例中，這些細(xì)胞將展示CD46^hi CD324⁺CD66c⁺。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解的是，使用與特定標(biāo)記的每一種發(fā)生反應(yīng)的結(jié)合劑，可以衍生包含前述表型的細(xì)胞群。

前述內(nèi)容是概述并且因此必要地含有細(xì)節(jié)的簡化、泛化和省略；因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解這種概述僅僅是說明性的并且不是旨在以任何方式是限制性的。通過參考在此陳述的附圖和教導(dǎo)內(nèi)容，在此所述的方法、組合物和/或裝置和/或其他主題的其他方面、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得明顯。

附圖簡要說明

圖1A和圖1B所示為CD46異質(zhì)地在實(shí)體瘤細(xì)胞上表達(dá)，描述了各個腫瘤細(xì)胞的展示為柱狀圖的基于流式細(xì)胞術(shù)的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)，其中同種型對照抗體的背景染色以灰色填充的柱狀圖顯示，并且CD46表達(dá)由粗黑線展示；

圖2所示為CD324異質(zhì)地在實(shí)體瘤細(xì)胞上表達(dá)，顯示了各個腫瘤細(xì)胞的展示為柱狀圖的基于流式細(xì)胞術(shù)的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)的圖示，其中同種型對照抗體的背景染色以灰色填充的柱狀圖顯示，并且CD324表達(dá)由粗黑線展示；

圖3A和圖3B所示為CD24和CD34在實(shí)體瘤細(xì)胞上總體顯示同質(zhì)表達(dá)，描述了各個腫瘤細(xì)胞的展示為柱狀圖的基于流式細(xì)胞術(shù)的表達(dá)數(shù)據(jù)，其中同種型對照抗體的背景染色以灰色填充的柱狀圖顯示，并且CD24或CD34表達(dá)由粗黑線展示；

圖4A和4B是散點(diǎn)圖，所示為結(jié)直腸致瘤性與CD46^hi CD324⁺腫瘤細(xì)胞亞群相關(guān)，并且是顯示來自代表性結(jié)直腸腫瘤的富集的CD46^hi CD324⁺細(xì)胞群的致瘤性的圖示；

圖5A和5B是散點(diǎn)圖，所示為胰腺致瘤性與CD46^hi CD324⁺腫瘤細(xì)胞亞群相關(guān)，并且是顯示來自代表性胰腺腫瘤的富集的CD46^hi CD324⁺細(xì)胞群的致瘤性的圖示；

圖6A和6B是散點(diǎn)圖，所示為非小細(xì)胞肺致瘤性與CD46^hi CD324⁺腫瘤細(xì)胞亞群相關(guān)，并且是顯示來自代表性肺腫瘤的富集的CD46^hi CD324⁺細(xì)胞群的致瘤性的圖示；

圖7A和7B是散點(diǎn)圖，所示為乳腺致瘤性與CD46^hi CD324⁺腫瘤細(xì)胞亞群相關(guān)，并且是顯示來自代表性三陰性乳腺腫瘤的富集的ESA+(CD46^hi)CD324⁺細(xì)胞群的致瘤性的圖示；

圖8所示為CD46^hi CD324⁺細(xì)胞亞群就不同癌癥而言是高致瘤性的，是使用表達(dá)CD46和CD324的各種組合的分離的腫瘤細(xì)胞亞群的代表性結(jié)直腸腫瘤、非小細(xì)胞肺腫瘤、胰腺腫瘤和三陰性乳腺腫瘤細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)的表格概述；

圖9A和9B所示為選擇的蛋白質(zhì)與CD46共表達(dá)并且與腫瘤起始細(xì)胞群相關(guān)，提供了標(biāo)記的表格概述，觀察到這些標(biāo)記共表達(dá)于所示的對應(yīng)實(shí)體瘤類型中的CD46^hi CD324⁺細(xì)胞上；

圖10所示為選擇的蛋白質(zhì)與結(jié)直腸腫瘤起始細(xì)胞群相關(guān)，顯示了各個結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的基于流式細(xì)胞術(shù)的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)的圖示，其展示為散點(diǎn)圖(上方)或柱狀圖(下方)，其中在柱狀圖中，同種型對照抗體的背景染色以灰色填充的柱狀圖顯示，并且所示蛋白質(zhì)抗原的細(xì)胞表面表達(dá)由粗黑線展示；

圖11所示為選擇的蛋白質(zhì)與胰腺腫瘤起始細(xì)胞群相關(guān)，顯示了各個胰腺腫瘤細(xì)胞的基于流式細(xì)胞術(shù)的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)的圖示，其展示為等值線圖(上方)或柱狀圖(下方)，其中在柱狀圖中，同種型對照抗體的背景染色以灰色填充的柱狀圖顯示，并且所示蛋白質(zhì)抗原的細(xì)胞表面表達(dá)由粗黑線展示；

圖12所示為選擇的蛋白質(zhì)與非小細(xì)胞肺腫瘤起始細(xì)胞群相關(guān)，顯示了各個非小細(xì)胞肺腫瘤細(xì)胞的基于流式細(xì)胞術(shù)的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)的圖示，其展示為散點(diǎn)圖(上方)或柱狀圖(下方)，其中在柱狀圖中，同種型對照抗體的背景染色以灰色填充的柱狀圖顯示，并且所示蛋白質(zhì)抗原的細(xì)胞表面表達(dá)由粗黑線顯示；

圖13A-C所示為CD46^hi CD324⁺CD66c^-富集的細(xì)胞群重建異質(zhì)性結(jié)直腸腫瘤，是描述結(jié)直腸腫瘤衍生的CD46^hi CD324⁺CD66c^-富集細(xì)胞群重建異質(zhì)性腫瘤的能力的圖示，所述異質(zhì)性腫瘤反映從中獲得它們的親本腫瘤；

圖14A和圖14B所示為結(jié)直腸CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞重建原發(fā)性和二次移植物中的異質(zhì)性腫瘤，是顯示經(jīng)原發(fā)性移植物中的不同結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞亞群的CD66c^-細(xì)胞重建的柱狀圖和經(jīng)二次移植物中的所示腫瘤細(xì)胞亞群的致瘤性的圖示；

圖15A-C提供了散點(diǎn)圖和表格概述，所示為CD46^hi CD324⁺CD66c^-富集的細(xì)胞群顯示強(qiáng)大的致瘤性，其顯示了通過連續(xù)移植由CCD46^hi CD324⁺CD66c^-富集的細(xì)胞群展示的強(qiáng)大的致瘤性；

圖16A-D所示為CD46、CD324和CD66c的差異表達(dá)指示增殖和分化潛能，以圖形方式展示了表達(dá)各種水平的CD46、CD324和CD66c的不同腫瘤細(xì)胞亞群在體外形成集落、分化和產(chǎn)生可溶性CD66c的能力；

圖17A-D所示為化學(xué)治療劑增加殘余腫瘤中的CD46^hi CD324⁺CD66-細(xì)胞的相對頻率，提供了通過顯示在治療的腫瘤中的CD46^hi CD324⁺CD66-細(xì)胞的相對頻率增加而展示化學(xué)治療劑對結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞亞群的影響的數(shù)據(jù)；

圖18A和圖18B所示為化學(xué)治療劑增加殘余胰腺腫瘤中的CD46^hi致瘤細(xì)胞的相對頻率，提供了通過顯示在治療的腫瘤中的CD46^hi細(xì)胞的相對頻率增加而展示化學(xué)治療劑對胰腺腫瘤細(xì)胞亞群的影響的數(shù)據(jù)；

圖19A是反映如本發(fā)明描述的細(xì)胞層次的示意圖；圖19B所示為如由本發(fā)明定義的在結(jié)直腸癌中的細(xì)胞層次的示意圖；

圖20A-20D所示為在腫瘤細(xì)胞亞群中選擇標(biāo)記的基因表達(dá)，代表在結(jié)直腸異種移植腫瘤內(nèi)分別與NTG細(xì)胞、TProg細(xì)胞和TPC結(jié)合的NOTUM(圖20A)、APCDD1(圖20B)、示例性胰腺蛋白(圖20C)和MUC20(圖20D)的代表性基因表達(dá)的圖示。

發(fā)明詳細(xì)說明

I引言

在以下詳細(xì)說明中，陳述了眾多具體細(xì)節(jié)，以便提供對本發(fā)明的徹底理解。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，可以在沒有這些具體細(xì)節(jié)的情況下實(shí)施本發(fā)明的多個方面。在其他情況下，沒有詳細(xì)說明的熟知方法、程序和組分，以便不使本發(fā)明難于理解。

已經(jīng)證明表征腫瘤起始和生長的在治療上有意義的方面以確定治療策略并且提供有效治療靶標(biāo)是極其困難的。在過去，不能開發(fā)用于治療各種癌癥的成功治療方案可能至少部分地歸因于缺乏對驅(qū)動腫瘤生長和復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)力量的理解以及研究技術(shù)和工具的局限性。隨著癌干細(xì)胞范例在過去幾年內(nèi)的開發(fā)和驗(yàn)證以及由日益有效的研究方法帶來對腫瘤生理學(xué)的錯綜復(fù)雜事物的理解增強(qiáng)，如由患者存活所展示的重大臨床進(jìn)展應(yīng)當(dāng)是不證自明的。遺憾的是，并且具有一些引人矚目的例外，未曾公認(rèn)預(yù)期的改善，特別在某些實(shí)體瘤的情況下。

部分地，臨床成功的這種相對缺乏可以歸因于將總體上精確的和啟發(fā)性的研究技術(shù)誤用于構(gòu)思欠佳的或不正確定義的通常被認(rèn)為是致瘤性的細(xì)胞群。例如，雖然差異性基因表達(dá)已經(jīng)廣泛用來鑒定癌相關(guān)基因活性和鑒定具有潛在治療價(jià)值或診斷價(jià)值的表達(dá)的蛋白質(zhì)，該技術(shù)在改善患者存活方面價(jià)值有限。這是因?yàn)榻?jīng)常使用遺傳信息進(jìn)行這種分析，其中遺傳信息從利用非特異性或不恰當(dāng)?shù)陌└杉?xì)胞標(biāo)記所分選的腫瘤細(xì)胞或亞群的復(fù)雜混合物中獲得。

雖然這些方法可以提供某種關(guān)于一般的、同質(zhì)表達(dá)的腫瘤相關(guān)基因產(chǎn)物的了解，它們幾乎一點(diǎn)也沒有鑒定到可以被開發(fā)以產(chǎn)生用于預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的靶向療法的特異性的癌干細(xì)胞的有關(guān)標(biāo)記。也就是說，因?yàn)樵系馁|(zhì)量不良，這樣的差異表達(dá)研究經(jīng)常提示來自表型多樣的分化細(xì)胞的無關(guān)或相對不重要的基因和蛋白質(zhì)(從病理學(xué)觀點(diǎn)來看)，在進(jìn)一步研究之后，這些基因和蛋白質(zhì)被證明作為癌干細(xì)胞標(biāo)記是總體上無效的。相反，通過鑒定特異性癌干細(xì)胞標(biāo)記，包括腫瘤起始細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(TICAM)、腫瘤永存細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(TPCAM)和腫瘤祖細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(TProgAM)，除了其他方面外，本發(fā)明提供了高純致瘤細(xì)胞亞群的一致且可重復(fù)的識別、表征和分選或分離，這轉(zhuǎn)而允許鑒定用于前瞻性診斷的癌干細(xì)胞特異性治療靶標(biāo)和蛋白質(zhì)。

更一般地說，根據(jù)在此的教導(dǎo)，諸位發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列標(biāo)記，這些標(biāo)記可以獨(dú)立或共同地用來精確鑒定、分選富集和/或和表征來自多種腫瘤的癌干細(xì)胞。使用選擇的生物化學(xué)技術(shù)，披露的標(biāo)記與腫瘤結(jié)構(gòu)中的特異性、自我更新的惡性細(xì)胞的新穎的關(guān)聯(lián)提供了對表型不同的能夠永存自我更新和腫瘤重演的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞亞群的富集、分離或純化。與現(xiàn)有技術(shù)相反并且如由以下實(shí)例所證明，這些披露的標(biāo)記能夠識別或鑒定來自多種腫瘤的腫瘤起始細(xì)胞。這些標(biāo)記定義的、相對同質(zhì)的細(xì)胞群的富集或分離轉(zhuǎn)而允許構(gòu)成性癌干細(xì)胞的廣泛表征，包括潛在治療靶標(biāo)的闡明和藥物化合物的篩選。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的細(xì)胞和組合物可以與動物模型如非傳統(tǒng)異種移植模型一起使用以便促進(jìn)研究和藥物開發(fā)努力。而且，披露的標(biāo)記可以進(jìn)一步在臨床環(huán)境和非臨床環(huán)境中使用，用于過度增生性失調(diào)的診斷、分類、監(jiān)測和管理以及提供相關(guān)的試劑盒或其他制造品。

雖然已經(jīng)展示和描述了本發(fā)明的某些特征，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將想到許多修改、替換、變化和等同物。因此，將被理解的是，所附權(quán)利要求書旨在覆蓋所有這樣的修改和變化，因?yàn)樗鼈兟湓诒景l(fā)明的真實(shí)精神范圍之內(nèi)。

II選擇的縮寫

CSC，癌干細(xì)胞；ETP，早期腫瘤祖細(xì)胞；FACS，熒光激活細(xì)胞分選；LTP，晚期腫瘤祖細(xì)胞；MACS，磁輔助細(xì)胞分選；TIC，腫瘤起始細(xì)胞；TICAM，腫瘤起始細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記；TPC，腫瘤永存細(xì)胞；TPCAM，腫瘤永存細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記；TProg，腫瘤祖細(xì)胞；TProgAM，高度增殖性腫瘤祖細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記；NTX，非傳統(tǒng)異種移植物；

III定義

為方便，這里收集了在整個申請(包括本說明書、實(shí)例和所附權(quán)利要求書)中使用的某些術(shù)語。除非另有定義，在此使用的所有技術(shù)與科學(xué)術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

如在此使用的，術(shù)語“腫瘤起始細(xì)胞”(TIC)應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是表示當(dāng)移植時能夠至少顯著增殖并且能夠在免疫低下小鼠中起始腫瘤的致瘤細(xì)胞或其群體。在這方面，腫瘤起始細(xì)胞群將包含腫瘤永存細(xì)胞和高度增殖性腫瘤祖細(xì)胞兩者。

為了本披露的目的，“腫瘤永存細(xì)胞”或“癌干細(xì)胞”(TPC或CSC)可以可互換地使用并且被定義為可以經(jīng)歷自我更新以及異常增殖和分化以形成腫瘤的細(xì)胞。腫瘤永存細(xì)胞的功能特征在于它們是致瘤的；它們可以通過自我更新產(chǎn)生另外的致瘤細(xì)胞；并且它們可以通過產(chǎn)生非致瘤性腫瘤細(xì)胞而完全重演異質(zhì)性腫瘤塊。

就本發(fā)明而言，術(shù)語“腫瘤祖細(xì)胞”(TProg)是指致瘤細(xì)胞或其群體，它們是TPC的子代并且當(dāng)體外培養(yǎng)或通過相容性動物宿主傳代時擁有至少某種腫瘤重演和有限的自我更新的能力。某些TProg細(xì)胞或群體可以在此處稱為高度增殖性的。如下文更詳細(xì)地討論的，TProg細(xì)胞群包括可以通過表型(例如，細(xì)胞表面標(biāo)記)和重演腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同能力加以區(qū)分的“早期腫瘤祖細(xì)胞”(ETP)和“晚期腫瘤祖細(xì)胞”(LTP)兩者。

在本申請中，“腫瘤起始細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記”(TICAM)應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是包括與腫瘤起始細(xì)胞或細(xì)胞亞群相關(guān)并且允許對其鑒定、表征和任選的分離或富集的任何標(biāo)記。

如在此使用的，“腫瘤永存細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記”(TPCAM)應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是包括與腫瘤永存細(xì)胞或細(xì)胞亞群相關(guān)并且允許對其鑒定、表征和任選的分離或富集的任何標(biāo)記。應(yīng)當(dāng)理解的是，TICAM和TPCAM并不相互排斥并且單獨(dú)的標(biāo)記可以同時包含兩者。

出于本申請的目的，“腫瘤祖細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記”(TProgAM)包括與腫瘤祖細(xì)胞或細(xì)胞亞群相關(guān)并且允許對其鑒定、表征和任選的分離或富集的任何標(biāo)記。應(yīng)當(dāng)理解的是，TICAM和TProgAM并不相互排斥并且單獨(dú)的標(biāo)記可以同時包含兩者。

如在此使用的，尤其是關(guān)于分離的細(xì)胞或分離的細(xì)胞群時，術(shù)語“致瘤的”是指源自腫瘤的當(dāng)脫離并移植入適合的動物模型如免疫低下小鼠時能夠形成腫瘤的細(xì)胞。

在本申請中，“非致瘤細(xì)胞”(NTG)是指從腫瘤起始細(xì)胞產(chǎn)生的、但是本身不具有自我更新或產(chǎn)生構(gòu)成腫瘤的腫瘤細(xì)胞異質(zhì)譜系的能力的腫瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)上，NTG細(xì)胞不能在免疫低下小鼠中可重復(fù)地形成腫瘤，甚至當(dāng)以過量細(xì)胞數(shù)移植時也是如此。

出于本申請的目的，術(shù)語“選擇”、“分選”、“劃分”“剖分”或“分離”所選擇的細(xì)胞、細(xì)胞群或細(xì)胞亞群可以互換地使用，并且除非上下文另外表明，表示將所選擇的細(xì)胞或定義的細(xì)胞子集從組織樣品中移出并且與不在定義這種細(xì)胞或細(xì)胞群的參數(shù)內(nèi)的其他細(xì)胞和污染物分離。分離的癌干細(xì)胞將通常不被他細(xì)胞類型污染通過并且具有允許產(chǎn)生分化子代的自我更新和腫瘤重演的能力。然而，當(dāng)該過程或治療產(chǎn)生細(xì)胞群時，應(yīng)當(dāng)理解的是，提供具有絕對純度的組合物是不切實(shí)際的。在這樣的情況下，將細(xì)胞群針對選擇的細(xì)胞“富集”，其中這些選擇的細(xì)胞然后在不實(shí)質(zhì)干擾所選擇的細(xì)胞亞群的功能或特性的各種污染物(包括其他細(xì)胞類型)存在的情況下存在。

如在此使用并且適用于細(xì)胞或細(xì)胞群的，術(shù)語“富集”可以寬泛地解釋并且被認(rèn)為是表示任何加工或處理的細(xì)胞群，其中所述細(xì)胞群含有比發(fā)現(xiàn)于未處理的、另外地等同的細(xì)胞群或樣品中更高百分比的所選擇的細(xì)胞類型。在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，富集細(xì)胞群是指與起始細(xì)胞群相比增加細(xì)胞群中的一種細(xì)胞類型的大約10％、大約20％、大約30％、大約40％、大約50％或大于50％的百分比。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的富集細(xì)胞群將包括至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％所選擇的細(xì)胞類型。仍然在其他實(shí)施例中，可以將富集的腫瘤永存細(xì)胞制劑描述為包含在制劑中所含的總細(xì)胞群的大約1％或更多或大約0.5％至大約40％。通過比較，非富集的示例性腫瘤細(xì)胞制劑將僅包括大約0.2％至大約2.0％或更少的腫瘤永存細(xì)胞，這些腫瘤永存細(xì)胞能夠在體內(nèi)產(chǎn)生形成細(xì)胞球的次級集落或使異質(zhì)性腫瘤永存。在一些實(shí)施例中，富集的制劑包含100倍、200倍、500倍、1,000倍或高達(dá)2,000倍或10,000倍至20,000倍富集的癌干細(xì)胞制劑，所述癌干細(xì)胞制劑能夠以低細(xì)胞數(shù)開始在體內(nèi)產(chǎn)生次級集落或使異質(zhì)性腫瘤永存。

在本發(fā)明的其他方面，就特定細(xì)胞群而言，術(shù)語“基本上純的”是指相對于構(gòu)成總細(xì)胞群的細(xì)胞，具有至少大約75％、優(yōu)選至少大約85％、更優(yōu)選至少大約90％、并且最優(yōu)選至少大約95％純度的細(xì)胞群。類似地，就一個或多個部分和/或終末分化的細(xì)胞類型的制劑而言，術(shù)語“基本上純的”或“基本上純化的”，是指含有少于大約20％、更優(yōu)選少于大約15％、10％、8％、7％、最優(yōu)選少于大約5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的不是腫瘤起始細(xì)胞的細(xì)胞的細(xì)胞群。

如在此在細(xì)胞或組織的背景下所使用的，“標(biāo)記”或“細(xì)胞標(biāo)記”表示處于化學(xué)或生物實(shí)體形式的任何性狀或特征，所述實(shí)體與特定細(xì)胞、細(xì)胞群或組織可鑒定地相關(guān)或特異性地發(fā)現(xiàn)于其中或其上，包括在受疾病或失調(diào)影響的組織或細(xì)胞群中或其上鑒定到的那些實(shí)體。標(biāo)記可以在性質(zhì)上是形態(tài)的、功能的或生物化學(xué)的。在優(yōu)選的實(shí)施例中，標(biāo)記是差異性或優(yōu)先地由特定細(xì)胞類型(例如，TPC)表達(dá)(或不表達(dá))或由細(xì)胞在某些條件(例如，在細(xì)胞生活周期的特定時點(diǎn)期間或在特定小生境中的細(xì)胞)下表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。在此構(gòu)思的標(biāo)記具體地被認(rèn)為是陽性或陰性的并且可以借助其存在(陽性)或不存在(陰性)指示細(xì)胞或細(xì)胞亞群。

類似地，在組織、細(xì)胞或細(xì)胞群(例如，穩(wěn)定的TPC表型)的背景下，術(shù)語“標(biāo)記表型”表示可以用來表征、鑒定、定量、分開、分離、純化或富集特定細(xì)胞或細(xì)胞群的任何標(biāo)記或標(biāo)記組合。在具體的優(yōu)選實(shí)施例中，標(biāo)記表型是可以通過檢測或鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記組合的表達(dá)來確定的細(xì)胞表面表型。

當(dāng)其適用于標(biāo)記或標(biāo)記表型時，“陽性”、“低”和“陰性”表達(dá)水平如下所定義。具有陰性表達(dá)(即“-”)的細(xì)胞在此處定義為在另外的熒光發(fā)射通道中存在用于其他感興趣的蛋白質(zhì)的完全抗體染色混合物標(biāo)記的情況下，表達(dá)小于或等于熒光通道中用同種型對照抗體所觀察到的第95個百分位數(shù)表達(dá)的那些細(xì)胞。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，這種用于定義陰性事件的方法稱作“熒光減一”或“FMO”染色法。在此將其表達(dá)大于使用上述FMO染色程序的用同種型對照抗體所觀察到的第95百分位數(shù)表達(dá)的細(xì)胞定義為“陽性”(即“+”)。如在此定義的，存在著寬泛定義為“陽性”的各種細(xì)胞群。首先，具有低表達(dá)(即“l(fā)o”)的細(xì)胞通常定義為具有下述觀察到的表達(dá)的那些細(xì)胞，其中所述觀察到的表達(dá)高于使用FMO染色的用同種型對照抗體所確定的第95百分位數(shù)并且處于使用上述FMO染色程序的用同種型對照抗體所觀察到的第95百分位數(shù)表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)。具有“高”表達(dá)(即“hi”)的細(xì)胞可以定義為具有下述觀察到的表達(dá)的那些細(xì)胞，其中所述觀察到的表達(dá)高于使用FMO染色的用同種型對照抗體所確定的第95百分位數(shù)并且大于使用上述FMO染色程序的用同種型對照抗體所觀察到的第95百分位數(shù)表達(dá)以上的一個標(biāo)準(zhǔn)偏差。在其他實(shí)施例中，第99百分位數(shù)可以優(yōu)選地用作在陰性與陽性FMO染色之間的分界點(diǎn)并且在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，這個百分位數(shù)可以大于99％。

如在此使用的的術(shù)語“譜系”描述了具有共同祖先的細(xì)胞。例如，源自相同腫瘤起始細(xì)胞的細(xì)胞可以屬于相同譜系，雖然子代已經(jīng)分化成各種細(xì)胞類別。

出于本披露的目的，除非由情況另外決定，術(shù)語“結(jié)合劑”、“結(jié)合分子”和“結(jié)合實(shí)體”是同義的，并且可以互換地使用。在本發(fā)明的上下文中，結(jié)合劑結(jié)合、識別在定義的細(xì)胞或細(xì)胞亞群上的選擇標(biāo)記，與之相互作用、反應(yīng)或以別的方式優(yōu)選地與之相關(guān)。示例性結(jié)合劑可以包括但不限于抗體或其片段、抗原、適配體、核酸(例如DNA和RNA)、蛋白質(zhì)(例如受體、酶、酶抑制劑、酶底物、配體)、肽、凝集素、脂肪酸或脂質(zhì)和多糖。例如，在選擇的實(shí)施例中，相容性結(jié)合劑可以包括麻疹病毒的血凝素蛋白或其CD46結(jié)合片段。在其他特別優(yōu)選的實(shí)施例中，結(jié)合劑或?qū)嶓w包括抗體或其片段。

如在此陳述的，術(shù)語“抗體”以最寬泛的意義而被使用并且具體地涵蓋合成抗體、單克隆抗體、寡克隆或多克隆抗體(polyclonal antibody)、多克隆抗體(multiclonal antibody)、重組產(chǎn)生的抗體、胞內(nèi)抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價(jià)抗體、多價(jià)抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、靈長類化抗體、Fab片段、F(ab')片段、單鏈FvFc(scFvFc)、單鏈Fv(scFv)、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體和任何其他免疫活性抗體片段，只要它們展示出所希望的生物活性(即，標(biāo)記相關(guān)或結(jié)合)即可。在更廣的意義上，本發(fā)明的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(即，含有抗原結(jié)合部位的分子)的免疫活性片段，其中這些片段可以或可以不與另一個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(包括但不限于Fc區(qū)或其片段)融合。此外，如在此更詳細(xì)地概述的，術(shù)語抗體和多種抗體具體地包括Fc變體或其片段，包括全長抗體和包含F(xiàn)c區(qū)的變體Fc-融合物，其任選地包含至少一個氨基酸殘基修飾并且與免疫球蛋白的免疫活性片段融合。

如在此使用的，術(shù)語“表位”是指能夠被特定抗體識別和特異性結(jié)合的靶標(biāo)記或抗原的部分。當(dāng)標(biāo)記是多肽(如細(xì)胞表面受體)時，表位可以從連續(xù)氨基酸和由蛋白質(zhì)的三級折疊而靠近的非連續(xù)氨基酸兩者形成。從連續(xù)氨基酸形成的表位典型地在蛋白質(zhì)變性時保留，而由三級折疊形成的表位典型地在蛋白質(zhì)變性時喪失。表位典型地包含至少3個并且更常見地至少5個或8-10個處于獨(dú)特空間構(gòu)象的氨基酸。更具體地說，技術(shù)人員將理解的是，術(shù)語“表位”包括能夠與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合或以別的方式與分子相互作用的任何蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)如氨基酸或碳水化合物或糖側(cè)鏈組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。另外，表位可以是線性或構(gòu)象性的。在線性表位中，在蛋白質(zhì)與相互作用分子(如抗體)之間的所有相互作用點(diǎn)沿該蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列線性地存在。在構(gòu)象表位中，相互作用點(diǎn)跨越蛋白質(zhì)上彼此線性分離的氨基酸殘基存在。

如在此使用的的術(shù)語“衍生物”是指這樣的分子，包括已經(jīng)通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法或以化學(xué)方式修飾(例如但不限于通過多項(xiàng)技術(shù)如遍在蛋白化、標(biāo)記(熒光團(tuán))、聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生)或添加其他分子)的蛋白質(zhì)和核酸。

術(shù)語“功能衍生物”和“模擬物”可互換使用并且是指擁有生物活性(功能的或結(jié)構(gòu)的)的化合物，所述生物活性與其功能衍生物的實(shí)體或分子的生物活性基本上相似。術(shù)語功能衍生物旨在包括分子的片段、變體、類似物或化學(xué)衍生物。

如在此使用的，關(guān)于多核苷酸或多肽的“變體”是指分別與參考多核苷酸或多肽相比(例如，與野生型多核苷酸或多肽相比)可以在一級、二級或三級結(jié)構(gòu)方面變化的多核苷酸或多肽?？贵w的“變體”例如意思是指在結(jié)構(gòu)和功能方面基本上相似的分子，例如，其中這些變體保留與選擇的抗原或其片段結(jié)合的能力，然而具有改變的生物化學(xué)作用。

如果兩種分子具有基本上相似的結(jié)構(gòu)物或如果兩種分子擁有相似的生物活性，則將一種分子稱為與另一種分子“基本上相似”。因此，假定兩種分子擁有相似的活性，則如這個術(shù)語在此處所使用的，將它們視為變體，即使這些分子之一的結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)于另一種分子中、或如果氨基酸殘基的序列不相同。

分子的“片段”意思是指分子的任何連續(xù)多肽或核苷酸子集。例如跨膜蛋白的片段可以包括僅包含胞外結(jié)構(gòu)域或其某個部分的構(gòu)建體。就本發(fā)明而言，標(biāo)記片段或衍生物可以包括選擇擇標(biāo)記的任何免疫反應(yīng)性或免疫活性部分。

分子(如標(biāo)記)的“類似物”意思是指在功能上與整個分子或與其片段相似的分子。如在此使用的，當(dāng)分子含有通常不是該分子的一部分的另外的化學(xué)部分時，將所述分子稱為另一種分子的“化學(xué)衍生物”。這樣的部分可以改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期，等等。這些部分可以替代地降低分子的毒性、消除或減弱分子的任何不良副作用，等等。能夠介導(dǎo)這樣的作用的部分披露于《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(第18次編輯，A.R.Gennaro編著，MackPubl.,Easton,Pa.(1990))中。

如在此使用的，當(dāng)用來描述多核苷酸時，“同源的”表示當(dāng)兩個多核苷酸或其指定的序列在最佳比對和比較時至少70％的核苷酸、通常從大約75％至99％、并且更優(yōu)選至少大約98％至99％的核苷酸是一致的，伴有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔АＨ缭诖耸褂玫牡男g(shù)語“同源物”或“同源的”也指就結(jié)構(gòu)和/或功能而言的同源性。就序列同源性而言，如果多個序列是至少50％、至少60至少70％、至少80％、至少90％、至少95％相同、至少97％相同、或至少99％相同的，則它們是同源物。術(shù)語“基本上同源的”是指至少90％、至少95％相同、至少97％相同或至少99％相同的序列。同源序列可以是在不同種類中的相同功能基因。

如在此使用的，在多肽序列的背景下，術(shù)語“實(shí)質(zhì)相似性”表示這種多肽包含在大約10-100個氨基酸殘基的比較窗(例如，抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū))范圍內(nèi)與參考序列具有至少60％序列一致性或與參考序列具有70％、或80％、或85％序列一致性、或最優(yōu)選90％一致性的序列。在氨基酸序列的背景下，“實(shí)質(zhì)相似性”進(jìn)一步包括氨基酸的保守性置換。因此，例如，在兩個肽以一個或多個保守性置換而不同的情況下，一個多肽與第二個多肽是基本上相似的。術(shù)語“實(shí)質(zhì)一致性”表示當(dāng)最佳比對(如通過使用默認(rèn)空位權(quán)重的程序GAP或BESTFIT)時，兩個肽序列共享至少百分之65序列一致性，優(yōu)選至少百分之80或90序列一致性，更優(yōu)選至少百分之95或更高的序列一致性(例如，百分之99或更高的序列一致性)。優(yōu)選地，不相同的殘基位置因保守性氨基酸置換而不同。

本發(fā)明的基因或多肽的同源物的確定可以由技術(shù)人員容易地確定。術(shù)語“同源性”或“一致性”或“相似性”在此處可互換地使用并且是指在兩個肽之間或在兩個核酸分子之間的序列相似性?？梢酝ㄟ^比較在每個序列中可以用于比較目的比對的位置各自確定同源性和一致性。當(dāng)所比較的序列中的等同位置被相同的堿基或氨基酸占據(jù)時，則這些分子在這個位置是一致的；當(dāng)?shù)韧课槐幌嗤蛳嗨?例如，在立體和/或電子性質(zhì)方面相似)的氨基酸殘基占據(jù)時，則可以將這些分子稱為在這個位置同源(相似)。作為同源性/相似性或一致性百分比的表述是指在被比較的序列共享的位置處的一致或相似氨基酸的數(shù)目的函數(shù)?！安幌嚓P(guān)”或“非同源的”序列共享小于40％的一致性，雖然優(yōu)選地與本申請的序列共享小于25％的一致性。

如在此使用的，術(shù)語“受試者”或“患者”可以互換地使用并且是指可以向其施用本發(fā)明的任何衍生藥物組合物和其中癌癥或增生性失調(diào)可能出現(xiàn)的任何活生物。該術(shù)語包括，但不限于人、非人類動物，例如非人靈長類如黑猩猩和其他猿類和猴種類；農(nóng)場動物如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養(yǎng)受試者如狗和貓；實(shí)驗(yàn)室動物，包括嚙齒類如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。該術(shù)語不指示具體的年齡或性別。因此，預(yù)期涵蓋成體和新生的受試者以及胎兒，無論雄性或雌性。術(shù)語“受試者”也包括易感于如貫穿本說明書的通常披露(但不限于此)的病癥或疾病狀態(tài)的活生物。受試者的實(shí)例包括人、狗、貓、牛、山羊和小鼠，包括轉(zhuǎn)基因種類。術(shù)語“非人類動物”和“非人哺乳動物”在此可互換地使用，并且包括所有脊椎動物，例如哺乳動物，如非人靈長類(尤其高等靈長類)、綿羊、狗、嚙齒類(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、豬、貓、兔、牛、以及非哺乳動物如雞、兩棲類、爬行類，等等。在一個實(shí)施例中，受試者是人。在另一個實(shí)施例中，受試者是作為疾病模型的實(shí)驗(yàn)動物或動物替代物。

如在此使用的術(shù)語“有效量”是指為延緩、減輕或改善疾病或失調(diào)的至少一種癥狀所需要的藥劑和/或藥物組合物的量。例如，潛在藥物化合物的有效量是降低植入試驗(yàn)動物中的腫瘤起始細(xì)胞的生長速率所需要的量。因此，有效量也是足以防止疾病癥狀產(chǎn)生或減少癥狀或降低癥狀進(jìn)展速率的量。

術(shù)語“惡性腫瘤”、“腫瘤”和“癌癥”在此可互換地使用并且是指以細(xì)胞的不受控制、過度增生性或異常生長或轉(zhuǎn)移為特征的疾病或失調(diào)。在其他方面，該術(shù)語也旨在包括哺乳動物中的器官或組織(例如，結(jié)直腸、胰腺、乳腺，等等)的任何疾病以及它對作為整體的身體的影響，其中所述疾病以正常細(xì)胞或異常細(xì)胞在這種組織中控制不良或不受控制的增殖為特征。在該定義范圍內(nèi)的失調(diào)包括良性腫瘤、異型增生(dysplasia)、增生以及顯示轉(zhuǎn)移性生長的腫瘤或任何其他轉(zhuǎn)化例如經(jīng)常在癌癥發(fā)作或復(fù)發(fā)之前的白斑。

如在此使用的，術(shù)語“難治性”最經(jīng)常地通過未能達(dá)到臨床終點(diǎn)(例如，緩解、延長的緩解持續(xù)時間、延長的無疾病、存活、無再發(fā)存活、無進(jìn)展存活期和總生存期)確定。定義對于療法的抵抗的另一種方式在于患者未能實(shí)現(xiàn)針對療法的反應(yīng)，從而確定該療法不是治療有效的。

如在此使用的，短語“診斷劑”是指用于診斷疾病或失調(diào)目的的任何分子、化合物、和/或物質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，診斷劑應(yīng)當(dāng)包含與報(bào)道分子結(jié)合的結(jié)合劑。診斷劑的其他非限制性實(shí)例包括抗體、抗體片段、或其他蛋白質(zhì)，包括與檢測試劑結(jié)合的那些。如在此使用的，術(shù)語“檢測試劑”或“報(bào)道子”是指通過本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何方法學(xué)可檢測的任何分子、化合物、和/或物質(zhì)。檢測試劑或報(bào)道子的非限制性實(shí)例包括染料、熒光標(biāo)記、氣體、金屬、或放射性同位素。如在此陳述的，“診斷劑”、“成像劑”和“報(bào)道子”或“報(bào)道分子”是等同的并且可以互換地使用，除非由上下文另外指示。

如在此使用的，術(shù)語“治療”包括防止與例如像癌癥中的細(xì)胞的不適當(dāng)增殖相關(guān)的病癥、疾病或失調(diào)的至少一種副作用或癥狀的進(jìn)展和/或使其減輕或逆轉(zhuǎn)。

如在此使用的，術(shù)語“給予”和“引入”在此可互換地使用并且是指將在此披露的藥物組合物通過方法或途徑置于受試者中，導(dǎo)致這種藥物組合物至少局部定位于所希望的部位?？梢酝ㄟ^在受試者中產(chǎn)生有效治療的任何適當(dāng)途徑給予本發(fā)明的化合物。

如在此使用的，短語“腸胃外給藥”和“腸胃外給予”表示除了腸內(nèi)和局部給藥之外的給藥方式，通常通過注射給藥，并且包括，而不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、椎管內(nèi)、腦脊髓內(nèi)(intracerebrospinal)、以及胸骨內(nèi)注射和輸注。如在此使用的短語“全身給藥”、“經(jīng)全身給藥”、“外周給藥”和“經(jīng)外周給藥”表示給予包含吡唑蒽酮和任選地其他藥劑或物質(zhì)的本發(fā)明藥物組合物并非直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，使得它進(jìn)入動物的全身并且因此經(jīng)受代謝和其它相似的過程，例如皮下給藥。

短語“藥學(xué)上可接受的”在此用來指這些化合物、材料、組合物和/或劑型，它們在合理的醫(yī)學(xué)判斷力范圍內(nèi)適合用于與人和動物的組織接觸而沒有過多毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥，與合理利益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。

如在此使用的短語“藥學(xué)上可接受的載體”表示涉及從身體的一個器官或部分?jǐn)y帶或轉(zhuǎn)運(yùn)主題藥劑到身體的另一個器官或部分的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)、組合物或載體，如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包囊材料。每種載體在與制劑的其他成分相容的意義上必須是“可接受的”或是生物惰性的。

IV.致瘤細(xì)胞和細(xì)胞亞群

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，通過在此陳述的選擇標(biāo)記或標(biāo)記組合的新穎用途，本發(fā)明提供了分別對腫瘤起始細(xì)胞(TIC)、腫瘤永存細(xì)胞(TPC)和腫瘤祖細(xì)胞(TProg)的鑒定、表征、富集和/或分離。就癌干細(xì)胞范例而言，每一種上述細(xì)胞亞群是或大或小程度致瘤的，并且正因如此是造成腫瘤生長、維持、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的原因。顯著地，本發(fā)明允許這樣的細(xì)胞亞群被鑒定并且任選地源自許多種不同的腫瘤類型和癌癥階段。就這一點(diǎn)而論，消滅和消除這些細(xì)胞可能對于有效管理和治療多種不同的腫瘤是關(guān)鍵的。在這方面，可以在藥物研究與開發(fā)活動中有效地采用單獨(dú)或組合的這些細(xì)胞或富集的細(xì)胞亞群來鑒定新穎的治療靶標(biāo)，這些治療靶標(biāo)被優(yōu)化以便抑制或耗盡腫瘤飼養(yǎng)癌干細(xì)胞。

如已經(jīng)對血液疾病和造血系統(tǒng)疾病所展示的，細(xì)胞層次可能存在于許多實(shí)體瘤內(nèi)，其中不同的腫瘤細(xì)胞亞群擁有不同的增殖和分化潛能。更具體地說，如在圖19中所展示的，使用在此披露的標(biāo)記所分離的細(xì)胞群支持以下假設(shè)，在其中存在顯著分化能力和參與這些分化程序的能力的腫瘤中，腫瘤永存細(xì)胞(即CSC)位于癌癥中的細(xì)胞層次的頂部。這些細(xì)胞展示出限定干細(xì)胞的經(jīng)典特征，而腫瘤祖細(xì)胞展示相似的特征，沒有自我更新能力，如通過定義和高度純化的細(xì)胞的連續(xù)移植所展示的。

如先前所提到的，腫瘤起始細(xì)胞群包括腫瘤永存細(xì)胞和高度增生性腫瘤祖細(xì)胞，它們通常共同包含本體腫瘤或腫塊的獨(dú)特亞群(即0.1％-40％)。出于本披露的目的，術(shù)語腫瘤永存細(xì)胞和癌干細(xì)胞是等同的，并且可以在此可互換地使用。相反，TPC不同于TProg，在于它們可以完全重演存在于腫瘤內(nèi)的腫瘤細(xì)胞的組成并且具有無限的自我更新能力，如通過低數(shù)目的分離細(xì)胞的連續(xù)移植(經(jīng)小鼠兩次或更多次傳代)所展示的。如下文將更詳細(xì)地討論的，使用適當(dāng)細(xì)胞表面標(biāo)記的熒光激活細(xì)胞分選(FACS)是分離高度富集的腫瘤細(xì)胞亞群(>99％純度)的可靠方法，這至少部分地歸因于其在單個細(xì)胞與細(xì)胞塊(即，雙聯(lián)體，等等)之間進(jìn)行區(qū)分的能力。

使用這樣的技術(shù)已經(jīng)顯示，當(dāng)將低細(xì)胞數(shù)目的高度純化的TProg細(xì)胞移植入免疫低下小鼠時，它們可以促進(jìn)原發(fā)性移植物中的腫瘤生長。然而，不同于純化的TPC亞群，產(chǎn)生TProg的腫瘤并不在表型細(xì)胞異質(zhì)性方面完全反映親本腫瘤和/或在后續(xù)移植物中再起始連續(xù)腫瘤形成方面是可證明無效的。相反，TPC(或CSC)亞群完全重建親本腫瘤的細(xì)胞異質(zhì)性并且可以在連續(xù)分離和移植時高效地起始腫瘤。因此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到盡管TPC和TProg均可以是在原發(fā)性移植物中產(chǎn)生腫瘤，但是二者之間的明確差異是TPC以低細(xì)胞數(shù)目連續(xù)移植后永存地促進(jìn)異質(zhì)性腫瘤生長的獨(dú)特能力。表征TPC的其他常見途徑包括形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面標(biāo)記的檢驗(yàn)，使用集落形成細(xì)胞測定法展示體外差異性增殖/分化能力、轉(zhuǎn)錄譜和抗藥性的表征，雖然標(biāo)記表達(dá)可以隨培養(yǎng)條件和隨體外細(xì)胞系傳代而變化。

因此，出于本發(fā)明的目的，像支持正常組織中的細(xì)胞層次的正常干細(xì)胞那樣，腫瘤永存細(xì)胞優(yōu)選地由它們的無限自我更新的能力同時維持多譜系分化的能力定義。腫瘤永存細(xì)胞因此能夠產(chǎn)生致瘤子代(即，腫瘤起始細(xì)胞：TPC和TProg)和非致瘤(NTG)子代。如上文定義，“非致瘤細(xì)胞”是指從腫瘤起始細(xì)胞產(chǎn)生的、但是本身不具有自我更新或產(chǎn)生構(gòu)成腫瘤的腫瘤細(xì)胞異質(zhì)譜系的能力的腫瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)上，NTG細(xì)胞不能在小鼠中可重復(fù)地形成腫瘤，甚至當(dāng)以過量細(xì)胞數(shù)移植時也是如此。

出于本披露的目的，也將TProg歸類為腫瘤起始細(xì)胞，原因在于它們在小鼠中產(chǎn)生腫瘤的能力有限。TProg是TPC的子代并且典型地能夠進(jìn)行有限數(shù)目的非自我更新性細(xì)胞分裂。而且，如將在下文實(shí)例中看出，TProg細(xì)胞群可以進(jìn)一步分裂成早期腫瘤祖細(xì)胞(ETP)和晚期腫瘤祖細(xì)胞(LTP)，這些細(xì)胞各自可以通過表型(例如，細(xì)胞表面標(biāo)記)和重演腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同能力加以區(qū)分。盡管這樣的技術(shù)差異，ETP和LTP兩者在功能上不同于TPC，在于以低細(xì)胞數(shù)目移植時，它們通常更不能夠連續(xù)地重建腫瘤，并且典型地不反映親本腫瘤的異質(zhì)性。盡管前述區(qū)分，但是在個別情況下也已經(jīng)顯示，各種TProg群體可以贏得自我更新能力，這通常歸因于干細(xì)胞并且它們自身變成TPC。無論如何，兩種類型的腫瘤起始細(xì)胞可能呈現(xiàn)于單個患者的典型腫瘤塊中并且如將在下文實(shí)例中所示，將經(jīng)受如在此陳述的鑒定、表征、分開和/或富集或分離。

更一般地說，TPC比構(gòu)成腫瘤本體的TProg(ETP和LTP兩者)、NTG細(xì)胞和源自腫瘤浸潤性非TPC的細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞/基質(zhì)、內(nèi)皮及造血細(xì)胞)更有致瘤性、相對更靜止并且經(jīng)常更有化學(xué)治療抵抗性。鑒于常規(guī)療法和方案在很大程度上已經(jīng)設(shè)計(jì)成縮減腫瘤體積并攻擊快速增殖的細(xì)胞，TPC可能比較快增殖的TProg和其他本體腫瘤細(xì)胞群更抵抗常規(guī)療法和方案。此外，TPC經(jīng)常表現(xiàn)使其對常規(guī)療法相對更具有化學(xué)治療抵抗性的其他特征，如增加的多藥抗藥轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)、增強(qiáng)的DNA修復(fù)機(jī)制和抗凋亡蛋白。這些特性(其中每一個有助于TPC的耐藥性)構(gòu)成了標(biāo)準(zhǔn)腫瘤學(xué)治療方案失敗(即未能充分靶向并且根除促進(jìn)腫瘤持續(xù)生長和復(fù)發(fā)的那些細(xì)胞(即TPC或CSC))的關(guān)鍵原因，所述標(biāo)準(zhǔn)腫瘤學(xué)治療方案旨在確保大多數(shù)患有晚期腫瘤的患者的長期益處。鑒定、表征和分開或富集如在此披露的這些不同細(xì)胞亞群的能力在了解腫瘤病因?qū)W并隨后鑒定新穎的化合物或調(diào)節(jié)劑中是關(guān)鍵的，其中所述新穎的化合物或調(diào)節(jié)劑可以形成更有效的治療處理的基礎(chǔ)。

如下文更詳細(xì)地解釋的，幾乎所有結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞、胰腺腫瘤細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞和三陰性乳腺腫瘤細(xì)胞為ESA⁺CD24⁺CD34^-，并且因此這些標(biāo)記很少用于鑒定腫瘤細(xì)胞亞群。出人意料地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)所披露的TICAM、TPCAM和TProgAM是用于鑒定、表征和任選分離或富集所選擇的致瘤細(xì)胞群的特別有效的標(biāo)記。例如，在包括結(jié)直腸癌的一個特別優(yōu)選的實(shí)施例中，已經(jīng)證明CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞能夠產(chǎn)生完全異質(zhì)的腫瘤，所述腫瘤部分地由CD46^hi CD324⁺CD66c^-和CD66c⁺細(xì)胞組成。這是有意義的，因?yàn)殡m然CD46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞是致瘤性的，但是它們不具有產(chǎn)生CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞的能力并且不能通過連續(xù)移植高效地促進(jìn)腫瘤生長。這些數(shù)據(jù)聯(lián)合以下觀察結(jié)果：具有a)連續(xù)移植后一致地產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤的能力；b)大部分集落形成潛能；和c)體外產(chǎn)生CD66c細(xì)胞和蛋白質(zhì)的潛能的細(xì)胞是CD46^hi CD324⁺CD66c^-，支持以下假設(shè)：CD46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞是具有受限增殖能力和潛能的CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞的子代。

體內(nèi)致瘤性和體外集落形成潛能的總體降低連同當(dāng)細(xì)胞喪失CD324表達(dá)時產(chǎn)生CD66c的能力的降低，支持以下假設(shè)：CD46^hi CD324^-CD66+細(xì)胞代表具有某種殘余增殖能力、但是通常沒有自我更新能力的晚期腫瘤祖細(xì)胞群(LTP)。最后，支持在圖19A中展示的細(xì)胞層次，CD46^-細(xì)胞也是CD324^-的并且通常也是CD66c^-的。這些NTG細(xì)胞可能代表終末分化的子代，所述子代在結(jié)腸中包括分泌譜系的杯狀細(xì)胞(G)和腸內(nèi)分泌(eE)細(xì)胞或者吸收譜系的腸細(xì)胞(E)。分離的細(xì)胞亞群的基因表達(dá)支持這種假設(shè)，因?yàn)镃D46^-細(xì)胞表達(dá)許多基因，這些基因歸屬于典型的結(jié)直腸組織的終末分化的分泌性和/或吸收性細(xì)胞類型。

不同于許多常規(guī)的現(xiàn)有技術(shù)治療劑，根據(jù)本發(fā)明鑒定和開發(fā)的新穎化合物和組合物在給予受試者之后優(yōu)選地降低腫瘤起始細(xì)胞的頻率，無論選擇的調(diào)節(jié)劑的形式或特異性靶標(biāo)(例如，遺傳物質(zhì)、細(xì)胞表面蛋白，等等)是什么。應(yīng)當(dāng)理解的是，腫瘤起始細(xì)胞頻率的降低可以因以下情況出現(xiàn)：a)腫瘤起始細(xì)胞的消除、耗盡、敏化、沉默或抑制；b)控制腫瘤起始細(xì)胞的生長、擴(kuò)張或復(fù)發(fā)；c)中斷腫瘤起始細(xì)胞的起始、增殖、維持或增殖；或d)以別的方式阻礙致瘤細(xì)胞的存活、再生和/或轉(zhuǎn)移。采用選擇的調(diào)節(jié)劑，由于在一條或多條生理途徑方面的變化而出現(xiàn)腫瘤起始細(xì)胞頻率的降低。途徑介入或調(diào)節(jié)，無論通過減少或消除腫瘤起始細(xì)胞或通過調(diào)節(jié)它們的潛能(例如，誘導(dǎo)的分化、小生境破壞)或以別的方式干擾它們對腫瘤環(huán)境或其他細(xì)胞發(fā)揮作用的能力，轉(zhuǎn)而允許通過抑制腫瘤形成、腫瘤維持和/或轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)而更有效地治療腫瘤性疾病。

如下文將更詳細(xì)地討論和在實(shí)例中所顯示，用來評定這樣的腫瘤起始細(xì)胞頻率的降低的優(yōu)選方法包括使用根據(jù)本發(fā)明表征和分離的本體腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞亞群的體外或體內(nèi)有限稀釋分析。優(yōu)選地，這項(xiàng)評定采用泊松分布統(tǒng)計(jì)分析或者以別的方式評定可測量事件(如體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤的能力或不產(chǎn)生腫瘤)的頻率。雖然這樣的有限稀釋分析包括計(jì)算腫瘤起始細(xì)胞頻率降低的優(yōu)選方法，其他較低要求的方法也可以用來有效地確定希望值，盡管精度略微較低，并且完全符合在此的教導(dǎo)。也可能通過基于其標(biāo)記表達(dá)譜評定對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞亞群的熟知的流式細(xì)胞手段或免疫組織化學(xué)手段來確定頻率的降低，如在本發(fā)明中所展示。關(guān)于所有前述方法，參見例如Dylla等人，2008，PMCID:PMC2413402和Hoey等人，2009，PMID:19664991；所述文獻(xiàn)各自通過引用以其全文結(jié)合在此。

V.腫瘤起始細(xì)胞的來源

除非在另外要求的情況下，可以用任何脊椎動物種類的腫瘤起始細(xì)胞實(shí)施本發(fā)明。包括來自人以及非人靈長類、家養(yǎng)動物(包括典型地在研究中使用的那些)、家畜、以及其他非人哺乳動物的癌干細(xì)胞。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，可以從處在不同臨床或病理期的多種腫瘤獲得前述細(xì)胞和細(xì)胞亞群。而且，如在下文實(shí)例中所展示，起始異源細(xì)胞群可以從直接取自患者或取自已經(jīng)在體內(nèi)傳代或在體外培養(yǎng)的繼發(fā)性腫瘤的原發(fā)性腫瘤樣品或活組織檢查樣品獲得。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，待分析、表征和/或富集的腫瘤細(xì)胞群衍生自腫瘤，所述腫瘤源自含有TIC的本體腫瘤物質(zhì)或已經(jīng)在免疫低下小鼠中植入的富集的TIC群。在其他實(shí)施例中，將從非傳統(tǒng)異種移植物(NTX)腫瘤庫獲得腫瘤樣品。無論選擇哪種腫瘤來源，優(yōu)選地根據(jù)良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范處置這些腫瘤并且可以在表征、分開和/或分離之前使用本領(lǐng)域公認(rèn)的機(jī)械和酶促解離技術(shù)將其解離成單細(xì)胞懸液。

可以通過體內(nèi)或體外培養(yǎng)或傳代而直接或間接用作細(xì)胞源的示例性腫瘤包括但不限于肉瘤和癌瘤，如但不限于：纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、間皮瘤、尤因瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、星形細(xì)胞腫瘤(例如，彌散、浸潤性膠質(zhì)瘤、間變性星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤、毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤、多形性黃色星形細(xì)胞瘤)、少枝膠質(zhì)腫瘤和混合型膠質(zhì)瘤(例如，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、間變性少突星形細(xì)胞瘤)、室管膜腫瘤(例如，室管膜瘤、間變性室管膜瘤、黏液乳頭型室管膜瘤、室管膜下瘤)、脈絡(luò)叢腫瘤、起源未確定的神經(jīng)上皮腫瘤(星形母細(xì)胞瘤、脊索樣膠質(zhì)瘤、大腦膠質(zhì)瘤病)、神經(jīng)元腫瘤和混合性神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤(例如，神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、嬰兒多纖維性星形細(xì)胞瘤和神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)瘤、胚胎發(fā)育不良性神經(jīng)上皮瘤、中樞神經(jīng)細(xì)胞瘤、小腦脂肪神經(jīng)細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)瘤(paraganglioglioma))、松果體實(shí)質(zhì)腫瘤、胚胎瘤(髓上皮瘤、室管膜母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、原始神經(jīng)外胚層腫瘤、非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤)、外周神經(jīng)母細(xì)胞性腫瘤、顱神經(jīng)和外周神經(jīng)腫瘤(例如，神經(jīng)鞘瘤、神經(jīng)纖維瘤、神經(jīng)束膜瘤、惡性外周神經(jīng)鞘腫瘤)、腦膜腫瘤(例如，腦膜瘤、間充質(zhì)腫瘤、非腦膜上皮瘤、血管外皮細(xì)胞瘤、黑素細(xì)胞病變)、生殖細(xì)胞腫瘤、鞍區(qū)腫瘤(例如，顱咽管瘤、神經(jīng)垂體顆粒細(xì)胞瘤)、血管母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，將從人結(jié)直腸腫瘤、乳腺腫瘤、非小細(xì)胞肺腫瘤、小細(xì)胞肺腫瘤、胰腺腫瘤、黑色素瘤、卵巢腫瘤或頭頸部腫瘤獲得腫瘤樣品。

此外，如上文所提到的，本發(fā)明的富集細(xì)胞群可以源自從患有腫瘤性疾病的受試者直接獲得的原發(fā)性腫瘤。然而，在其他實(shí)施例中，分離的細(xì)胞群從患者衍生的腫瘤獲得，所述腫瘤已經(jīng)在體外培養(yǎng)或通過非人類動物傳代。就本發(fā)明而言并且如以更多細(xì)節(jié)和在下文實(shí)例中描述，使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)開發(fā)并維護(hù)NTX腫瘤庫。包含大量離散的腫瘤細(xì)胞系的NTX腫瘤庫在免疫低下小鼠中通過異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的多次傳代而增殖，其中所述異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞最初從罹患多種實(shí)體瘤惡性腫瘤的眾多癌癥患者獲得。具有良好定義的譜系的大量離散早期傳代NTX腫瘤的持續(xù)可獲得性大大促進(jìn)了如在此陳述的TPC的鑒定和分離，因?yàn)樗鼈冊试S可重復(fù)和反復(fù)地表征從這些細(xì)胞系中純化的細(xì)胞。

更具體地說，這樣的模型的存在允許一致地驗(yàn)證所鑒定或分離的細(xì)胞或細(xì)胞亞群(如通過標(biāo)記表型定義的)實(shí)際上是TIC，因?yàn)楦鶕?jù)TPC組分在小鼠中產(chǎn)生表型上和形態(tài)上異質(zhì)的腫瘤的能力，將它們以回顧的方式最精確地定義，它們重演了這些細(xì)胞從其中起源的患者腫瘤樣品。也就是說，使用小群富集或分離的細(xì)胞在小鼠中產(chǎn)生完全異質(zhì)性腫瘤的能力強(qiáng)烈地指示了分離的細(xì)胞包含TPC的事實(shí)并且驗(yàn)證了相關(guān)標(biāo)記和假定的治療靶標(biāo)。在這樣的工作中，使用傳代最少的NTX細(xì)胞系大大簡化了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并且提供了易于證實(shí)的結(jié)果。而且，早期傳代NTX腫瘤也對常規(guī)治療劑如依立替康有反應(yīng)，這為驅(qū)動腫瘤生長、對現(xiàn)有療法的抵抗性和腫瘤復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)機(jī)制提供了臨床有關(guān)的了解。VI.定義致瘤細(xì)胞群

在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了所選擇的腫瘤起始細(xì)胞或細(xì)胞亞群的鑒定、表征和任選地富集或分離。使用就不同細(xì)胞群而言在表型上異質(zhì)的一種或多種標(biāo)記(即，TICAM、TPCAM和TProgAM)，通過差異性細(xì)胞分析完成癌干細(xì)胞群的這種分析和/或物理富集。如先前討論的，應(yīng)當(dāng)理解的是，允許區(qū)分各種細(xì)胞群的任何性狀或可辨別特征或其組合構(gòu)成了根據(jù)在此的教導(dǎo)內(nèi)容可以使用的標(biāo)記。因此，雖然在優(yōu)選的實(shí)施例中這樣的標(biāo)記是細(xì)胞表面蛋白，其他特征或性狀可以發(fā)揮區(qū)分細(xì)胞亞群的作用并且被明確地構(gòu)思為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，除細(xì)胞表面表型分型之外，基于某些腫瘤永存細(xì)胞特征定量或表征細(xì)胞亞群可能是有用的?？梢岳缤ㄟ^測量細(xì)胞在培養(yǎng)下自我更新和增殖的能力；或通過確定在這些細(xì)胞中存在特定的激活途徑來確定這些屬性。例如，在優(yōu)選的實(shí)施例中，可以將核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞或細(xì)胞群中，其中所述構(gòu)建體包含編碼可檢測標(biāo)記的序列，并且其中所述標(biāo)記與轉(zhuǎn)錄反應(yīng)元件可操作地連接，所述轉(zhuǎn)錄反應(yīng)元件受選擇的途徑(例如，涵蓋細(xì)胞表面蛋白TICAM表達(dá)的一條途徑)調(diào)節(jié)或與其相關(guān)。當(dāng)該途徑被激活時，可檢測標(biāo)記被表達(dá)并且指示這種細(xì)胞或細(xì)胞亞群包含腫瘤永存細(xì)胞。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，可檢測標(biāo)記是熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(GFP)及其變體?？梢苑诌x表達(dá)GFP的活細(xì)胞，以便分離或富集感興趣的細(xì)胞亞群。在本發(fā)明的這個方面，所披露的方法可以用來富集腫瘤永存細(xì)胞。

如在此披露的，本發(fā)明的某些方面是針對鑒定或表征和任選地富集或分離腫瘤起始細(xì)胞或其細(xì)胞亞群(例如，TPC和/或TProg)。在這個方面，諸位發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)了選擇標(biāo)記和/或標(biāo)記組合，它們允許快速并有效地鑒定、表征和任選地富集或分離腫瘤起始細(xì)胞或其群體。如上文簡要討論的，如在此在細(xì)胞或組織的背景下所使用的，“標(biāo)記”表示處于化學(xué)或生物實(shí)體形式的任何特征，所述實(shí)體與特定細(xì)胞、細(xì)胞群或組織可鑒定地相關(guān)或特異性地發(fā)現(xiàn)于其中或其上，包括在受疾病或失調(diào)影響的組織或細(xì)胞群中或其上鑒定到的那些實(shí)體。如所示，標(biāo)記可以在性質(zhì)上是形態(tài)的、功能的或生物化學(xué)的。在優(yōu)選的實(shí)施例中，標(biāo)記是差異性或優(yōu)選地由特定細(xì)胞類型(例如，TPC)表達(dá)或由細(xì)胞在某些條件(例如，在細(xì)胞生活周期的特定時點(diǎn)期間或在特定小生境下的細(xì)胞)下表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。

應(yīng)當(dāng)理解的是，標(biāo)記、標(biāo)記組合或標(biāo)記表型可以相對于特定細(xì)胞或細(xì)胞亞群或相對于細(xì)胞生活周期或?qū)哟味儎印Ｔ谝恍?shí)施例中，標(biāo)記將包括穩(wěn)定或短暫的特征，無論是否為特定細(xì)胞類型或群體特有的表型、形態(tài)、功能或生物化學(xué)特征(例如，酶促特征)。

在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，相容性標(biāo)記是蛋白質(zhì)或多肽，并且更優(yōu)選地?fù)碛性试S結(jié)合分子結(jié)合的一個或多個表位或活性部位，所述結(jié)合分子包括但不限于抗體或其免疫反應(yīng)性片段、配體、底物或酶。然而，出于本申請的目的，標(biāo)記可以由與細(xì)胞相關(guān)的任何分子或代謝物組成，其包括但不限于蛋白質(zhì)(肽和多肽)、脂質(zhì)、多糖、核酸和類固醇。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，感興趣的標(biāo)記將在適當(dāng)?shù)臅r間位于細(xì)胞表面上，但是在其他實(shí)施例中，標(biāo)記可以位于或定位于細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)(例如，在胞核上)。形態(tài)標(biāo)記特征或性狀的實(shí)例包括但不限于形狀、大小和核/質(zhì)比。功能性標(biāo)記特征或性狀的實(shí)例包括但不限于粘附于特定底物的能力、結(jié)合或排出特定染料(例如但不限于排出親脂性染料)的能力、在特定條件下遷移的能力、以及沿特定譜系分化的能力。如在此討論的，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，可以通過本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可獲得的任何方法檢測相容性標(biāo)記。標(biāo)記也可以是從報(bào)道基因(例如作為將編碼報(bào)道基因的核酸序列引入細(xì)胞中及其轉(zhuǎn)錄的結(jié)果，由細(xì)胞表達(dá)的報(bào)道基因)表達(dá)的蛋白質(zhì)，其中所述結(jié)果導(dǎo)致產(chǎn)生可以用作標(biāo)記的報(bào)道蛋白?？梢杂米鳂?biāo)記的這類報(bào)道基因例如是但不限于熒光蛋白、酶、染色粒蛋白(chromomeric protein)、抗性基因，等等。

具體的優(yōu)選標(biāo)記將在下文更詳細(xì)地討論。如此源自這類標(biāo)記的信息用于預(yù)后和診斷，包括對病情加速的易感性、患病狀態(tài)的情況和對環(huán)境中的變化(如傳代次數(shù)，用藥物或其他模式治療)的反應(yīng)。也可以就它們應(yīng)答于治療劑和治療的能力而將細(xì)胞分類、分離用于研究目的、針對基因表達(dá)進(jìn)行篩選，等等?？梢酝ㄟ^遺傳分析、蛋白組學(xué)、細(xì)胞表面染色或其他手段進(jìn)一步表征臨床樣品，以便確定在分類中有用的標(biāo)記的存在。例如，遺傳性異?？梢允羌膊∫赘行曰蛩幬锓磻?yīng)性的原因或可以是這樣的表型連鎖。

無論最終選擇哪種標(biāo)記來鑒定或表征所選擇的細(xì)胞亞群，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的許多標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)中的任何一種來實(shí)施實(shí)際監(jiān)測或分析。例如，可以通過免疫測定來分析細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)，所述免疫測定包括但不限于蛋白質(zhì)印跡法、免疫組織化學(xué)、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、凝集測定、補(bǔ)體結(jié)合測定、免疫放射測定、熒光免疫測定、免疫熒光法、蛋白A免疫測定、激光捕獲顯微切割、大規(guī)模多參數(shù)質(zhì)量細(xì)胞計(jì)量術(shù)(massively multiparametric mass cytometry)、流式細(xì)胞術(shù)、以及FACS分析。在某些實(shí)施例中，癌干細(xì)胞在來自受試者的測試樣品中的量可以通過將結(jié)果與參考樣品中的癌干細(xì)胞的量(例如，來自未患有可檢測癌癥的受試者的樣品)或與預(yù)定參考范圍或與較早時間點(diǎn)(例如，在治療之前或期間)的患者他/她本人比較來確定。

在特定的實(shí)施例中，癌干細(xì)胞群從來自患者的腫瘤樣品獲得并且通過流式細(xì)胞術(shù)表征。如本領(lǐng)域熟知并且在所附實(shí)例中展示，這種方法利用某些表面標(biāo)記相對于本體腫瘤在癌干細(xì)胞上的差異表達(dá)。出于通過任何數(shù)目的方法(包括磁性分離或FACS)富集或分離細(xì)胞的目的，標(biāo)記抗體(例如，熒光抗體)可以用來與樣品中的細(xì)胞上的標(biāo)記反應(yīng)，或使識別其他結(jié)合劑(即，第二結(jié)合劑)的結(jié)合劑識別這些標(biāo)記。在一些實(shí)施例中，利用細(xì)胞表面標(biāo)記的組合，以便進(jìn)一步以原位方式(例如通過免疫熒光法或免疫組織化學(xué))或使用腫瘤解離后分析單個細(xì)胞的方法(例如流式細(xì)胞術(shù)或大規(guī)模多參數(shù)質(zhì)量細(xì)胞計(jì)量術(shù))限定或量化樣品中的癌干細(xì)胞。例如，陽性和陰性細(xì)胞分選兩者都可以用來評定各種TPC亞群或量化樣品中的癌干細(xì)胞的量。也可能通過以下方式確定癌干細(xì)胞在樣品中的數(shù)目或頻率：將有限稀釋的未富集的腫瘤細(xì)胞移植到免疫低下小鼠中，隨后使用泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)，通過不同的稀釋度分析腫瘤形成頻率(獨(dú)立于速率)。而且，如下文實(shí)例中展示的，可以通過評定表達(dá)腫瘤永存細(xì)胞標(biāo)記和/或腫瘤祖細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞的頻率和性質(zhì)來表征特定的腫瘤類型。優(yōu)選地，腫瘤包含使用在此披露的標(biāo)記所鑒定的腫瘤起始細(xì)胞，所述標(biāo)記包括經(jīng)證實(shí)與對應(yīng)的TIC群(如在此所述的并且可以通過分離和在免疫低下小鼠中移植證實(shí)其存在的那些)共表達(dá)的那些標(biāo)記(即，TICAM)。

在其他選擇的實(shí)施例中，使用免疫組織化學(xué)或免疫熒光技術(shù)鑒定和表征樣品(例如，組織樣品，如實(shí)體瘤活組織檢查樣品)中的腫瘤起始細(xì)胞。如本領(lǐng)域已知的，這些方法利用某些表面標(biāo)記相對于本體腫瘤在腫瘤起始細(xì)胞上的差異表達(dá)。抗體(例如，與熒光團(tuán)結(jié)合的抗體)可以用來與感興趣的細(xì)胞亞群反應(yīng)。這些抗體可以被直接標(biāo)記，或用檢測第一抗體的第二結(jié)合劑檢測。在優(yōu)選的實(shí)施例中，將某些細(xì)胞表面標(biāo)記的組合用來進(jìn)一步限定和(如果需要)量化未解離的樣品(即原位)中的癌干細(xì)胞。此外，通過評定區(qū)分感興趣的癌干細(xì)胞或祖細(xì)胞的某些標(biāo)記的表達(dá)，這樣的染色技術(shù)允許將選擇的腫瘤細(xì)胞亞群的可視化。這樣的技術(shù)促進(jìn)癌干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞在腫瘤背景中的定位，允許建立空間特征如距血管的距離。

使用本領(lǐng)域公認(rèn)的用于細(xì)胞與細(xì)胞群識別和表征的前述技術(shù)連同在此的教導(dǎo)內(nèi)容，人們可以容易地鑒定所披露的致瘤細(xì)胞亞群。更具體地說，如在此廣泛地討論的，本發(fā)明至少部分地基于迄今未知的在某些腫瘤起始細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記(TICAM)與腫瘤起始細(xì)胞或細(xì)胞亞群之間的關(guān)聯(lián)。這些標(biāo)記，無論是否因?yàn)樗鼈冊谙嚓P(guān)細(xì)胞群上不存在或存在，允許有效鑒定或表征腫瘤起始細(xì)胞以及它們的對應(yīng)TPC和TProg組分亞群。而且，在優(yōu)選的實(shí)施例(如下文實(shí)例中陳述的那些)中，這些相同的標(biāo)記允許快速和高效地鑒定、分開、劃分、剖分、分離或富集限定的腫瘤起始細(xì)胞群或它們的對應(yīng)TPC和/或TProg細(xì)胞亞群。如上文并且根據(jù)本發(fā)明陳述的，TICAM應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是表示允許鑒定、表征和任選地分離和富集腫瘤起始細(xì)胞或細(xì)胞群的任何標(biāo)記或標(biāo)記表型。同樣，可以通過它們的存在或不存在而用來鑒定或表征和任選地分離或富集TPC或TProg或細(xì)胞亞群的標(biāo)記或標(biāo)記表型包括如先前定義的TPCAM或TProgAM。如上文明確指出的，應(yīng)當(dāng)理解的是三組標(biāo)記不是相互排斥的并且單獨(dú)的標(biāo)記可以與不同的細(xì)胞亞群(例如，單標(biāo)記可以是TICAM和TPCAM)相關(guān)。優(yōu)選地，這樣的標(biāo)記是蛋白質(zhì)和甚至更優(yōu)選地是細(xì)胞表面蛋白。

出于本申請的目的，特別優(yōu)選的TICAM包括CD9、CD13、CD15、CD24、CD26、CD29、CD46、CD49a、CD49b、CD49c、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD58、CD63、CD66a、CD66c、CD66e、CD71、CD73、CD81、CD82、CD91、CD98、CD99、CD104、CD105、CD108、CD111、CD130、CD136、CD151、CD155、CD157、CD164、CD166、CD172a、CD186、CD221、CD230、CD262、CD273、CD275、CD295、CD298、CD317、CD318、CD324、CD340、CCR10、c-Met、Eph-B2、Eph-B4、FLOR1、Glut-2、磷脂酰肌醇蛋白聚糖5、HER3、IL-20Ra、整連蛋白a9b1、整連蛋白b5、LDL-R、Mer、腦信號蛋白4B、TROP-2和Vb9。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，標(biāo)記將包括CD46。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，標(biāo)記將包括CD324。仍然在其他優(yōu)選實(shí)施例中，標(biāo)記將包括CD66c。仍然在其他優(yōu)選實(shí)施例中，CD46標(biāo)記和CD324標(biāo)記的組合將被用來鑒定和任選地富集或分離致瘤細(xì)胞亞群。

就列出的TICAM而言，圖9A和圖9B以表格形式提供了腫瘤表達(dá)信息，而圖10-12顯示了如源自定義的腫瘤起始細(xì)胞群的單獨(dú)的標(biāo)記的表達(dá)數(shù)據(jù)。在這個方面，應(yīng)當(dāng)理解的是，雖然最常見地使用TICAM標(biāo)記CD46和CD324例證或證實(shí)本發(fā)明的原理，對于特定的腫瘤，可以輕易地確定所列出的其他標(biāo)記與在此的教導(dǎo)內(nèi)容的相容性，無需過度實(shí)驗(yàn)。也就是說，盡管癌癥的病因?qū)W和其中這些腫瘤出現(xiàn)的對應(yīng)組織的生物學(xué)不同，圖10-12顯示可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)容易地辨別列出的標(biāo)記的相容性和效用。鑒于這些教導(dǎo)內(nèi)容和相關(guān)數(shù)據(jù)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠容易地確定最佳TICAM或TICAM組合以便用來分析或分開來自特定腫瘤類型的致瘤細(xì)胞亞群。所披露的標(biāo)記在很多腫瘤上是有用的意外發(fā)現(xiàn)僅僅強(qiáng)調(diào)了本發(fā)明的新穎性。

根據(jù)本披露應(yīng)當(dāng)理解的是，前述TICAM可以單獨(dú)或組合地使用，以便使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)鑒定、表征或任選地純化、分開、富集或分離定義的致瘤細(xì)胞群。在優(yōu)選的實(shí)施例中，細(xì)胞群將包含腫瘤永存細(xì)胞。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，使用選擇的TICAM所鑒定或富集的細(xì)胞群應(yīng)當(dāng)包含腫瘤永存細(xì)胞和腫瘤祖細(xì)胞。關(guān)于后面的這些實(shí)施例并且如所附實(shí)例中顯示，可以通過使TICAM富集的群體與提供對應(yīng)的致瘤細(xì)胞亞群的分離的TPCAM和/或TProgAM接觸而進(jìn)一步表征和/或分開TIC組分。

例如，在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，已經(jīng)證明可以通過CD46和CD324的組合鑒定和表征TIC并且其展示出CD46^hi CD324⁺標(biāo)記表型。因此，在其他特別優(yōu)選的實(shí)施例中，通過使TIC與CD324和CD46的結(jié)合劑接觸獲得分離或富集的腫瘤細(xì)胞亞群，其中這些結(jié)合劑可以與TIC以任何順序或同時接觸。相關(guān)的優(yōu)選實(shí)施例包含分離或富集的TIC群，所述TIC群包含CD46^hiCD324⁺標(biāo)記表型。

在結(jié)直腸癌中包含TIC的另一個選擇的實(shí)施例中，已經(jīng)顯示CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞能夠產(chǎn)生完全異質(zhì)的腫瘤，這些腫瘤部分地由CD46^hi CD324⁺CD66c^-和CD66c⁺細(xì)胞組成。這是有意義的，因?yàn)殡m然CD46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞是致瘤性的，但是它們不具有產(chǎn)生CD46^hiCD324⁺CD66c^-細(xì)胞的能力并且不能通過連續(xù)移植高效地促進(jìn)腫瘤生長。因此，本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施例包含分離或富集的TIC群，所述TIC群包含CD46^hi CD324⁺CD66c^-標(biāo)記表型。

如在此披露的，與致瘤細(xì)胞相關(guān)的特別優(yōu)選標(biāo)記是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)作為TICAM有利地發(fā)揮作用的CD46。如貫穿下文實(shí)例中顯示的，CD46標(biāo)記可以單獨(dú)或與其他標(biāo)記組合地使用，以便鑒定、表征、探查、識別或區(qū)分腫瘤起始細(xì)胞、腫瘤永存細(xì)胞或其離散的細(xì)胞亞群。此外，在其他優(yōu)選實(shí)施例中，CD46標(biāo)記可以單獨(dú)或與其他標(biāo)記組合地使用，以便有效地剖析、劃分、分離、純化或富集致瘤細(xì)胞或其亞群。優(yōu)選地，將采用與全長CD46或其剪接變體或同種型發(fā)生免疫特異性反應(yīng)的結(jié)合劑實(shí)施癌干細(xì)胞或細(xì)胞亞群的鑒定、表征或分離。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，CD46結(jié)合劑將包括抗體或其免疫反應(yīng)性片段。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，CD46結(jié)合劑將與可檢測的報(bào)道子實(shí)體結(jié)合。

CD46也稱作膜輔蛋白或MCP。它是被廣泛表達(dá)但因可變外顯子剪接和糖基化而具有許多同種型的I型跨膜蛋白。最近Karosi等人，《喉鏡》(Laryngoscope)118:1669-1676(Sept.2008)報(bào)道了檢測到該分子的十四種同種型，所述文獻(xiàn)通過引用以其全文結(jié)合在此。mRNA從位于染色體1q32的單基因中轉(zhuǎn)錄并且經(jīng)歷廣泛的可變剪接以產(chǎn)生編碼多種蛋白質(zhì)同種型的多種轉(zhuǎn)錄物。在構(gòu)成該基因的14個外顯子中，外顯子1-6在所有CD46蛋白同種型中顯得是保守的，而外顯子7至9編碼可變利用的富絲氨酸-蘇氨酸-脯氨酸(“STP”)區(qū)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)同種型中的主要高變性。外顯子11和12編碼CD46的跨膜區(qū)，而外顯子13和14編碼該蛋白質(zhì)的胞質(zhì)尾區(qū)。最長的mRNA轉(zhuǎn)錄物，變體A(NM_002389)，含有來自該基因的所有十四個外顯子的序列。外顯子7、8、9和13的可變剪接被認(rèn)為產(chǎn)生CD46的十四個同種型的大多數(shù)，其中優(yōu)勢的觀察到的蛋白質(zhì)同種型66和56kDa從外顯子8的可變納入或排除中產(chǎn)生。外顯子13的可變納入/排除導(dǎo)致該分子的胞質(zhì)尾區(qū)的編碼序列變化，提示這些變化影響了該蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞運(yùn)輸、穩(wěn)定性和信號特性。

如Karosi等人陳述，CD46mRNA同種型D包含CD46基因的外顯子1-6、8-12和14(等同于序列NM_153826，其編碼蛋白質(zhì)NP_722548)，同種型F包含外顯子1-6、9-12和14(等同于序列NM_172353，其編碼NP_758863)，并且同種型J包含外顯子1-6、8、10-12和14(等同于序列NM_172356，其編碼NP_758866)。更具體地說，CD46分子包含四個N端短共有重復(fù)序列(SCR)模塊(“Sushi”結(jié)構(gòu)域：處于1-3、2-4連接拓?fù)鋵W(xué)的4個半胱氨酸)，其中這些SCR結(jié)構(gòu)域由該基因的前6個外顯子編碼。SCR2、3和4模塊具有C3b/C4b結(jié)合和調(diào)節(jié)活性(下文討論)，而SCR1模塊和SCR4遠(yuǎn)端的序列對于補(bǔ)充調(diào)節(jié)功能不是必需的。由可變利用的外顯子7-9以及外顯子10編碼的近膜胞外序列主要通過O聯(lián)糖高度糖基化。

出于本披露的目的，除非上下文另外指示，術(shù)語“CD46”應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是表示如上文剛才陳述的任何蛋白質(zhì)，包括任何剪接變體或其免疫反應(yīng)性片段以及編碼這樣的蛋白質(zhì)、剪接變體或片段的任何核酸序列。因此，如上文討論，“CD46標(biāo)記”將寬泛地包括構(gòu)成或編碼CD46抗原的任何可檢測的蛋白質(zhì)、肽或核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施例中，CD46標(biāo)記將包括全長糖蛋白(變體A)或其報(bào)道的剪接變體或免疫反應(yīng)性片段。甚至更優(yōu)選地，CD46蛋白質(zhì)標(biāo)記將呈現(xiàn)于選擇的致瘤細(xì)胞群的細(xì)胞表面上。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，CD46標(biāo)記將包括編碼全長CD46、剪接變體或其片段的核酸序列(例如，DNA或mRNA)。

可以任選地用來根據(jù)在此的教導(dǎo)內(nèi)容表征選擇的腫瘤起始細(xì)胞亞群的另一個優(yōu)選標(biāo)記是人CD324(hCD324)，所述人CD324具有與GenBank登錄號NM_004360相應(yīng)的示例性核酸序列和與GenBank登錄號NP_004351相應(yīng)的示例性前原蛋白氨基酸序列，所述每一個GenBank登錄號通過引用結(jié)合在此。CD324(也稱作E-鈣粘蛋白、桑椹胚粘著蛋白、鈣粘蛋白-1或CAM 120/80)是介導(dǎo)鈣依賴性細(xì)胞粘附的跨膜蛋白。它在上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，其中它涉及維持這些上皮細(xì)胞的表型。E-鈣粘蛋白的胞漿域與β-連環(huán)素蛋白結(jié)合，所述β-連環(huán)素蛋白本身與細(xì)胞骨架的肌動蛋白絲網(wǎng)結(jié)合。這種E-鈣粘蛋白/β-連環(huán)素蛋白結(jié)合在穩(wěn)定上皮組織的細(xì)胞/細(xì)胞粘附中發(fā)揮重要作用。E-鈣粘蛋白的喪失可以因此減少細(xì)胞粘附并且增加癌細(xì)胞的侵襲能力。E-鈣粘蛋白或β-連環(huán)素蛋白的表達(dá)的減少通常與腫瘤的更大侵襲性和去分化相關(guān)，尤其是對于胃腸道癌而言。也已經(jīng)顯示，患有結(jié)直腸癌并且E-鈣粘蛋白表達(dá)不足的患者比具有正常表達(dá)水平的患者具有更不良的預(yù)后。

可以根據(jù)本發(fā)明使用的又另一個優(yōu)選標(biāo)記是CD66c(也稱作或NCA-90或CEACAM6)。人CD66c(hCD66c)核酸序列相應(yīng)于GenBank登錄號NM_002483，而蛋白質(zhì)前體的氨基酸序列(344aa)相應(yīng)于GenBank登錄號NP_002474，所述每一個GenBank登錄號通過引用結(jié)合在此。CD66c糖蛋白屬于免疫球蛋白家族，特征在于該蛋白質(zhì)的N端部分中的可變域和含有二硫鍵的恒定域，所述二硫鍵誘導(dǎo)環(huán)的形成(Hammarstrom和Baranov 2001)。CD66c通常表達(dá)于粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和多核中性粒細(xì)胞的表面，而且由結(jié)腸、肺和脾臟中的上皮細(xì)胞表達(dá)(Audette等人，1987；Kolbinger等人，1989；von Kleist等人，1972；Jantscheff等人，2003)。與正常粘膜相比，CD66c也表達(dá)于增生性結(jié)腸息肉和腺瘤的增殖細(xì)胞中，并且由許多人類癌癥表達(dá)(Scholzel等人，《美國病理學(xué)雜志》(Am J Pathol)157:1051-52，2000；Kuroki等人，《抗癌研究》(Anticancer Res)19:5599-5606，1999)。

VII.結(jié)合劑

如貫穿本申請討論的，優(yōu)選地通過如在此定義的結(jié)合劑檢測、識別或探查所披露的標(biāo)記。出于本發(fā)明目的的寬泛解釋，相容性結(jié)合劑可以基本上包括優(yōu)選地與標(biāo)記結(jié)合并且為可檢測的任何實(shí)體或分子。在這方面，結(jié)合劑可以采取許多形式，包括但不限于小分子、肽、蛋白質(zhì)和核酸(包括DNA和RNA)。更具體地說，本發(fā)明的結(jié)合劑可以包括受體、酶、酶抑制劑、酶底物、配體、凝集素、脂肪酸、適配體、脂質(zhì)或多糖。例如，在選擇的實(shí)施例中，相容性結(jié)合劑可以包括麻疹病毒的血凝素蛋白或其CD46結(jié)合片段。在其他特別優(yōu)選的實(shí)施例中，結(jié)合劑或?qū)嶓w包括抗體或其片段。仍然在其他優(yōu)選實(shí)施例中，結(jié)合劑可以包括標(biāo)記特異性小分子結(jié)合劑，它們可以破壞受體-配體相互作用、受體激活或二聚化/多聚化、輔助受體結(jié)合、或其他眾多的胞內(nèi)過程。就本披露而言，相容性結(jié)合劑的選擇完全在本領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)，無需過度實(shí)驗(yàn)。

如本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施例所提到的，包括處于抗體形式的結(jié)合劑。在此的術(shù)語“抗體”以最寬泛的意義而被使用并且具體地涵蓋合成抗體、單克隆抗體、寡克隆或多克隆抗體(polyclonal antibody)、多克隆抗體(multiclonal antibody)、重組產(chǎn)生的抗體、細(xì)胞內(nèi)抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價(jià)抗體、多價(jià)抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、靈長類化抗體、Fab片段、F(ab')片段、單鏈FvFc(scFvFc)、單鏈Fv(scFv)、抗獨(dú)特型(抗Id)抗體和任何其他免疫活性抗體片段，只要它們展示出所希望的生物活性(即，標(biāo)記相關(guān)或結(jié)合)即可。在更廣的意義上，本發(fā)明的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(即，含有抗原結(jié)合部位的分子)的免疫活性片段，其中這些片段可以或可以不與另一個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(包括但不限于Fc區(qū)或其片段)融合。此外，如在此更詳細(xì)地概述的，術(shù)語“抗體”和“多種抗體”具體地包括如在此所述的Fc變體，包括全長抗體和包含F(xiàn)c區(qū)的變體Fc-融合物、或其片段，其任選地包含至少一個氨基酸殘基修飾并且與免疫球蛋白的免疫活性片段融合。

而且，雖然所有5個類別的抗體(即，IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM)和所有同種型(即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2)以及其變體均在本發(fā)明的范圍內(nèi)，但是僅出于說明目的將相當(dāng)詳細(xì)地討論包含IgG類免疫球蛋白的優(yōu)選實(shí)施例。然而，應(yīng)當(dāng)理解這樣的披露僅說明實(shí)施本發(fā)明的示例性組合物和方法并且不以任何方式限制本發(fā)明或所附權(quán)利要求書的范圍。

在本發(fā)明的背景下應(yīng)當(dāng)理解的是，對披露的TICAM特異的相容性抗體經(jīng)常是可商業(yè)獲得的(例如，從生命技術(shù)公司(Life Technologies)或BioLegend公司獲得)。在任何情況下，抗體或它們的衍生物和/或它們的片段可以通過多種方法提供，所述方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的并且包括在正?；蜣D(zhuǎn)基因小鼠中或在兔中的雜交瘤技術(shù)、或噬菌體展示抗體技術(shù)。在一個實(shí)施例中，使用了基因免疫。這項(xiàng)技術(shù)包含向非人類動物給予編碼至少一種感興趣的抗原的核酸序列或其功能等同物。編碼的抗原由該動物產(chǎn)生，這刺激動物免疫系統(tǒng)抵抗所述抗原。在其他實(shí)施例中，將處于蛋白質(zhì)或肽形式的抗原與佐劑一起(或沒有佐劑)直接注射。無論怎樣引入免疫原，在動物中引出了針對所述抗原的免疫應(yīng)答。隨后，優(yōu)選地從所述動物獲得對感興趣的抗原特異的T細(xì)胞、B細(xì)胞和/或抗體。這些T細(xì)胞、B細(xì)胞和/或抗體任選地進(jìn)一步被加工。在一個優(yōu)選的實(shí)施例中，將獲得的感興趣的B細(xì)胞用于雜交瘤技術(shù)中，其中所述獲得的B細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，以便產(chǎn)生形成雜交體抗體的細(xì)胞。

本發(fā)明的更特別優(yōu)選的實(shí)施例采用單克隆抗體作為結(jié)合劑。在優(yōu)選的實(shí)施例中，從分離自免疫動物的細(xì)胞制備產(chǎn)生抗體的細(xì)胞系。

在免疫之后，將動物處死并且借助于本領(lǐng)域熟知的手段，使淋巴結(jié)和/或脾臟B細(xì)胞永生化。使細(xì)胞永生化的方法包括但不限于，將它們用癌基因轉(zhuǎn)染、用致瘤病毒感染它們并且在選擇永生化細(xì)胞的條件下培養(yǎng)它們、使它們經(jīng)受致癌性或突變化合物、使它們與永生化細(xì)胞(例如，骨髓瘤細(xì)胞)融合、以及使腫瘤抑制基因失活。如果使用與骨髓瘤細(xì)胞融合，骨髓瘤細(xì)胞優(yōu)選地不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌型細(xì)胞系)。使用CD46或其免疫反應(yīng)性部分篩選永生化細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施例中，使用酶聯(lián)免疫測定(ELISA)或放射免疫測定進(jìn)行初期篩選。

更一般地說，可以使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)(包括雜交瘤技術(shù)、重組技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、酵母文庫、轉(zhuǎn)基因動物(例如或HuMAb)或其某種組合)制備符合本發(fā)明的離散的單克隆抗體。例如，可以使用如上文概括地描述的并且在Harlow和Lane等人，《抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》(Antibodies:A Laboratory Manual)中，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988)；Hammerling等人，在《單克隆抗體與T細(xì)胞雜交瘤》(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)，563-681中(Elsevier,N.Y.,1981)中更詳細(xì)描述的雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生單克隆抗體，所述文獻(xiàn)各自通過引用結(jié)合在此。使用披露的操作方案，優(yōu)選地通過多次皮下或腹膜內(nèi)注射相關(guān)抗原和佐劑在哺乳動物中產(chǎn)生抗體。如先前討論的，這種免疫通常引出免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答包括從活化的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原反應(yīng)性抗體(如果免疫動物是轉(zhuǎn)基因的，這些可以是完全人類的)。雖然可以從該動物的血清收獲所生成的抗體以提供多克隆制劑，但是通常更希望的是從脾臟、淋巴結(jié)或外周血分離單獨(dú)的淋巴細(xì)胞以提供同質(zhì)的單克隆抗體制劑。更典型地，從脾臟獲得淋巴細(xì)胞并且使其永生化以提供雜交瘤。

更一般地說，產(chǎn)生多克隆和單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的。參見，例如，Coligan,Current Protocols in Immunology Wiley/Greene,N.Y.，1991；和Harlow和Lane，《抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)指南》，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約，1989；Stites等人，(編著)《基礎(chǔ)與臨床免疫學(xué)》(Basic and Clinical Immunology)(第4版)，蘭格醫(yī)學(xué)出版社(Lange Medical Publications)，洛斯阿爾托斯(Los Altos)，加利福尼亞，及其中引證的參考文獻(xiàn)；Goding,《單克隆抗體：原理與實(shí)踐》(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)(第2版)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，紐約，N.Y.,1986；和Kohler和Milstein，《自然》(Nature)256:495-497，1975。其他適合的用于抗體制備的技術(shù)包括在噬菌體或相似載體中的重組抗體文庫的選擇。參見，Huse等人，《科學(xué)》(Science)246:1275-1281，1989；和Ward等人，《自然》341:544-546，1989。免疫球蛋白及其某些變體是已知的并且許多已經(jīng)在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中制備(例如，參見美國專利號4,745,055；美國專利號4,444,487；WO 88/03565；EP 256,654；EP 120,694；EP 125,023；Faoulkner等人，《自然》298:286,1982；Morrison，《免疫學(xué)雜志》(J.Immunol.)123:793，1979；Morrison等人，《免疫學(xué)年鑒》(Ann Rev.Immunol)2:239，1984)。用于制備嵌合(人源化)抗體的詳細(xì)方法可以在美國專利號5,482,856中找到。關(guān)于人源化和其他抗體產(chǎn)生和工程化技術(shù)的其他細(xì)節(jié)可以在Borrebaeck(編著)，《抗體工程》(Antibody Engineering)，第2版，F(xiàn)reeman and Company,NY,1995；McCafferty等人，《抗體工程，實(shí)踐方法》(Antibody Engineering,A Practical Approach)，IRL at Oxford Press,牛津，英國，1996和Paul,《抗體工程手冊》(Antibody Engineering Protocols)，胡馬納出版社(Humana Press)，Towata，新澤西，1995中找到。前述文獻(xiàn)各自通過引用以其全文結(jié)合在此。

無論怎樣獲得抗體結(jié)合劑或抗體結(jié)合劑采取前述哪種形式(例如，人源化抗體、人抗體，等等)，所披露藥劑的優(yōu)選實(shí)施例可以展示多種特征。在這方面，可以將產(chǎn)生TICAM抗體的細(xì)胞(例如，雜交瘤或酵母菌落)選擇、克隆并且進(jìn)一步篩選所希望的特征，包括例如，穩(wěn)健生長、高抗體產(chǎn)量以及，如下文更詳細(xì)地討論的，所希望的抗體特征如親和力、表位或結(jié)構(gòu)域特異性，等等。雜交瘤可以在體內(nèi)在同系動物和在缺乏免疫系統(tǒng)的動物(例如，裸鼠)中或在體外細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)增。選擇、克隆和擴(kuò)增雜交瘤和/或集落的方法(其中各自產(chǎn)生離散的抗體種類)是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的。

應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，所披露的抗體將與由選擇標(biāo)記所呈現(xiàn)的離散表位或決定簇相關(guān)或與之結(jié)合。如在此使用的，術(shù)語“表位”是指靶抗原的這種部分，所述部分能夠被特定抗體識別和特異性結(jié)合。當(dāng)抗原是多肽(如CD46)時，表位可以從連續(xù)氨基酸和由蛋白質(zhì)的三級折疊而靠近的非連續(xù)氨基酸形成。從連續(xù)氨基酸形成的表位典型地在蛋白質(zhì)變性時保留，而由三級折疊形成的表位典型地在蛋白質(zhì)變性時喪失。表位典型地包含至少3個并且更常見地至少5個或8-10個處于獨(dú)特空間構(gòu)象的氨基酸。更具體地，技術(shù)人員將領(lǐng)會，術(shù)語“表位”包括能夠與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合或否則與分子相互作用的任何蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)如氨基酸或碳水化合物或糖側(cè)鏈組成，并且通常具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征以及特定的電荷特征。另外，表位可以是線性或構(gòu)象性的。在線性表位中，在蛋白質(zhì)與相互作用分子(如抗體)之間的所有相互作用點(diǎn)沿該蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列線性地存在。在構(gòu)象表位中，相互作用點(diǎn)跨越蛋白質(zhì)上彼此線性分離的氨基酸殘基存在。

一旦確定所希望的抗原上的表位，有可能例如使用本發(fā)明中描述的技術(shù)產(chǎn)生針對這個表位的抗體?？商娲?，在發(fā)現(xiàn)過程期間，抗體的產(chǎn)生和表征可以闡明關(guān)于所希望的表位的信息。根據(jù)這種信息，則可能針對與相同表位的結(jié)合競爭性地篩選抗體。實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)的方案將實(shí)施競爭研究，以便找到彼此競爭性地結(jié)合的抗體，即競爭與抗原結(jié)合的抗體。WO 03/48731中描述了基于抗體交叉競爭作用將抗體分級(binning)的高通量方法。

如在此使用的，術(shù)語“分級”是指基于抗體的抗原結(jié)合特征將抗體分組的方法。級數(shù)(bins)的指定多少是有些任意性的，取決于觀察到的所測試抗體的結(jié)合模式的如何不同。因此，雖然這項(xiàng)技術(shù)是將本發(fā)明抗體分類的有用工具，但是級數(shù)并不總是與表位直接關(guān)聯(lián)，并且這樣的初步確定應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步通過本領(lǐng)域公認(rèn)的其他方法證實(shí)。

有了這個警告，人們可以通過使用本領(lǐng)域已知的并且在此陳述的實(shí)例中的方法，確定所選擇的第一抗體(或其片段)是否與相同的表位結(jié)合或交叉競爭與第二抗體結(jié)合。在選擇的實(shí)施例中，允許本發(fā)明的第一抗體與標(biāo)記在飽和條件下結(jié)合并且隨后測量第二抗體與相同標(biāo)記結(jié)合的能力。如果測試抗體能夠與第一標(biāo)記抗體在相同的時間與標(biāo)記結(jié)合，則第二抗體與不同于第一抗體的表位結(jié)合。然而，如果第二抗體不能夠在相同的時間與標(biāo)記結(jié)合，則第二抗體與相同表位、重疊表位或與被第一抗體結(jié)合的表位靠近的表位結(jié)合。如本領(lǐng)域已知的，可以使用固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定、Biacore^TM系統(tǒng)(即，表面等離子體共振-GE Healthcare)、分析儀(即，生物層干涉測量法-ForteBio公司)或流式細(xì)胞方法獲得所希望的數(shù)據(jù)。如在此使用的，術(shù)語“表面等離子體共振”是指允許通過檢測生物傳感器基質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)濃度的改變來分析實(shí)時生物特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，使用Biacore或ForteBio儀器進(jìn)行這種分析。

當(dāng)在競爭相同表位的抗體的背景下使用時，術(shù)語“競爭”表示在抗體之間的由測定法確定的競爭，其中這種抗體或免疫功能性片段在測試時阻止或抑制參考抗體與共同抗原的特異性結(jié)合。典型地，這樣的測定法涉及純化抗原的使用，所述純化抗原與攜帶未標(biāo)記的這些試驗(yàn)免疫球蛋白和標(biāo)記的參考免疫球蛋白中任一種的固體表面或細(xì)胞結(jié)合。通過在試驗(yàn)免疫球蛋白存在的情況下確定與固體表面或細(xì)胞結(jié)合的標(biāo)記物的量而測量競爭性抑制。通常，試驗(yàn)免疫球蛋白以過量存在。通過競爭測定法(競爭性抗體)鑒定的抗體包括結(jié)合與參考抗體相同的表位的抗體以及與相鄰表位結(jié)合的抗體，所述相鄰表位充分鄰近于被參考抗體結(jié)合的表位以便發(fā)生空間位阻。在此的實(shí)施例中提供了另外的關(guān)于確定競爭性結(jié)合的方法的細(xì)節(jié)。通常，當(dāng)競爭性抗體過量存在時，它將抑制參考抗體與共同抗原的特異性結(jié)合的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。在一些情況下，結(jié)合被抑制至少80％、85％、90％、95％、或97％或更多。

除了表位特異性之外，可以使用許多不同的物理特征(例如包括結(jié)合親和力、熔化溫度(T_m)、以及等電點(diǎn))表征所披露的抗體。

在這個方面，本發(fā)明進(jìn)一步包括對選擇標(biāo)記具有高結(jié)合親和力的抗體的使用。當(dāng)解離常數(shù)K_d(k_off/k_on)是≤10^-8M時，將本發(fā)明的抗體稱作特異性結(jié)合其靶抗原。當(dāng)K_d是≤5×10^-9M時，抗體以高親和力特異性結(jié)合抗原，并且當(dāng)K_d是≤5×10^-10M時，抗體以很高親和力特異性結(jié)合抗原。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，抗體具有≤10^-9M的Kd和大約1×10^-4/秒的解離速率。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，解離速率是<1×10^-5/秒。在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，抗體將以10^-8M與10^-10M之間的K_d與CD46結(jié)合，并且在又另一個實(shí)施例中，它將以K_d≤2×10^-10M結(jié)合。還是本發(fā)明的其他選擇的實(shí)施例包括具有小于10^-2M、小于5×10^-2M、小于10^-3M、小于5×10^-3M、小于10^-4M、小于5×10^-4M、小于10^-5M、小于5×10^-5M、小于10^-6M、小于5×10^-6M、小于10^-7M、小于5×10^-7M、小于10^-8M、小于5×10^-8M、小于10^-9M、小于5×10^-9M、小于10^-10M、小于5×10^-10M、小于10^-11M、小于5×10^-11M、小于10^-12M、小于5×10^-12M、小于10^-13M、小于5×10^-13M、小于10^-14M、小于5×10^-14M、小于10^-15M或小于5×10^-15M的解離常數(shù)或K_d(k_off/k_on)的抗體。

在特定的實(shí)施例中，與CD46免疫特異性結(jié)合的本發(fā)明抗體具有至少10⁵M^-ls^-l、至少2×10⁵M^-ls^-l、至少5×10⁵M^-ls^-l、至少10⁶M^-ls^-l、至少5×10⁶M^-ls^-l、至少10⁷M^-ls^-l、至少5×10⁷M^-ls^-l、或至少10⁸M^-ls^-l的結(jié)合速率常數(shù)或k_on速率(CD46(Ab)+抗原(Ag)^k_on←Ab-Ag)。

在另一個實(shí)施例中，與CD46免疫特異性結(jié)合的本發(fā)明抗體具有小于10^-ls^-l、小于5×10^-ls^-l、小于10^-2s^-l、小于5×10^-2s^-l、小于10^-3s^-l、小于5×10^-3s^-l、小于10^-4s^-l、小于5×10^-4s^-l、小于10^-5s^-l、小于5×10^-5s^-l、小于10^-6s^-l、小于5×10^-6s^-l、小于10^-7s^-l、小于5×10^-7s^-l、小于10^-8s^-l、小于5×10^-8s^-l、小于10^-9s^-l、小于5×10^-9s^-l或小于10^-10s^-l的k_off速率(CD46(Ab)+抗原(Ag)^k_off←Ab-Ag)。

在本發(fā)明的其他所選擇的實(shí)施例中，抗CD46抗體將具有至少10²M^-1、至少5×10²M^-1、至少10³M^-1、至少5×10³M^-1、至少10⁴M^-1、至少5×10⁴M^-1、至少10⁵M^-1、至少5×10⁵M^-1、至少10⁶M^-1、至少5×10⁶M^-1、至少10⁷M^-1、至少5×10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少5×10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少5×10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少5×10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少5×10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1、至少5×10¹²M^-1、至少10¹³M^-1、至少5×10¹³M^-1、至少10¹⁴M^-1、至少5×10¹⁴M^-1、至少10¹⁵M^-1或至少5×10¹⁵M^-1的親和常數(shù)或K_a(k_on/k_off)。

一旦已經(jīng)通過重組表達(dá)產(chǎn)生了本發(fā)明的蛋白質(zhì)或免疫球蛋白結(jié)合劑，可以通過本領(lǐng)域已知的用于純化免疫球蛋白分子或更一般地用于純化蛋白質(zhì)的任何方法將其純化，例如通過層析(例如離子交換層析、親和層析(尤其借助在蛋白A之后針對特異性抗原的親和層析)、以及尺寸柱層析(sizing column chromatography)、離心、差別溶解度，或通過用于純化蛋白質(zhì)的任何其他標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。此外，本發(fā)明的結(jié)合劑可以與在此所述的或另外地本領(lǐng)域已知的異源多肽序列融合以促進(jìn)純化。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，將使用蛋白A或蛋白G親和層析至少部分地純化本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑。

在其他優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的結(jié)合劑或其片段或衍生物與診斷或檢測試劑或報(bào)道子結(jié)合、偶聯(lián)或以別的方式與其相關(guān)，其中所述試劑或報(bào)道子可以是生物分子(例如，肽或核苷酸)或小分子或放射性同位素。如此中在別處陳述的，這樣的標(biāo)記的結(jié)合劑可以用于監(jiān)測過度增生性失調(diào)的產(chǎn)生或進(jìn)展或作為臨床檢驗(yàn)程序的部分用來確定包含所披露的調(diào)節(jié)劑的特定療法的功效。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，與報(bào)道子或檢測試劑相關(guān)的所披露的結(jié)合劑可以用于鑒定或表征和任選地富集、分離、剖析、劃分或純化選擇的致瘤細(xì)胞群。這樣的細(xì)胞群可以用于眾多的目的，包括但不限于靶標(biāo)鑒定、藥物研究和開發(fā)、毒理學(xué)研究，等等。

這樣的診斷、檢測和/或分離或富集可以通過使結(jié)合劑與檢測物質(zhì)偶聯(lián)或結(jié)合來實(shí)現(xiàn)，所述檢測物質(zhì)包括但不限于各種酶，例如包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基、如但不限于鏈霉親和素和抗生物素蛋白/生物素；熒光物質(zhì)，如但不限于傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocynate)、羅丹明、二氯三嗪氨基熒光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)，如但不限于魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)，如但不限于螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；放射性物質(zhì)，如但不限于碘(¹³¹I、¹²⁵I、¹²³I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、銦(¹¹⁵In、¹¹³In、¹¹²In、¹¹¹In)和锝(⁹⁹Tc)、鉈(²⁰¹Ti)、鎵(⁶⁸Ga、⁶⁷Ga)、鈀(¹⁰³Pd)、鉬(⁹⁹Mo)、氙(¹³³Xe)、氟(¹⁸F)、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu、¹⁵⁹Gd、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁰La、¹⁷⁵Yb、¹⁶⁶Ho、⁹⁰Y、⁴⁷Sc、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁴²Pr、¹⁰⁵Rh、⁹⁷Ru、⁶⁸Ge、⁵⁷Co、⁶⁵Zn、⁸⁵Sr、³²P、¹⁵³Gd、¹⁶⁹Yb、⁵¹Cr、⁵⁴Mn、⁷⁵Se、¹¹³Sn和¹¹⁷錫；用于各種正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)中的正電子發(fā)射金屬、非放射性順磁金屬離子、以及經(jīng)放射標(biāo)記或與特定放射性同位素結(jié)合的分子。在這樣的實(shí)施例中，適當(dāng)?shù)臋z測方法是本領(lǐng)域熟知的并且容易地從眾多商業(yè)來源可獲得。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，標(biāo)記的結(jié)合劑可以在流式細(xì)胞分析或FACS中使用。

如下文更詳細(xì)地討論的，這些結(jié)合劑可以與標(biāo)記序列(如肽或熒光團(tuán))結(jié)合以促進(jìn)細(xì)胞群的純化或分離或診斷程序，如免疫組織化學(xué)或FACS。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，這樣的標(biāo)記物應(yīng)當(dāng)包含MAXPAR^TM試劑系統(tǒng)(多倫多大學(xué)，Stemspec)。在優(yōu)選的實(shí)施例中，標(biāo)記氨基酸序列是6組氨酸肽，如提供在pQE載體(Qiagen)(連同其他載體)中的標(biāo)簽，它們中的許多是可商業(yè)獲得的。用于純化的其他肽標(biāo)簽包括但不限于，血凝素“HA”標(biāo)簽，其相應(yīng)于源自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984,《細(xì)胞》(Cell)37:767)和“flag”標(biāo)簽(美國專利號4,703,004)。

VIII.致瘤細(xì)胞亞群的分析

如上文剛才討論的，在此披露的標(biāo)記提供了TPC與TProg(例如，在結(jié)直腸癌中)以及在多種其他腫瘤中的TIC與NTG的區(qū)分。雖然活細(xì)胞的分離是證明功能性重建并且因此明確證明腫瘤永存能力(即CSC身份)的前提，如使用披露的標(biāo)記辨別的對TIC、其復(fù)合TPC和TProg細(xì)胞、以及NTG細(xì)胞身份的認(rèn)識促進(jìn)了與這些對應(yīng)的細(xì)胞群相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，從而使得能夠發(fā)現(xiàn)診斷和/或治療靶蛋白。

在使用在此披露的標(biāo)記作為工具來鑒定TIC或TPC群時，可以鑒定從這些細(xì)胞分離的細(xì)胞或遺傳物質(zhì)和/或蛋白質(zhì)組物質(zhì)并且通過使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)(如磁性分離、FACS(實(shí)施例2)、激光捕獲顯微切割或上文描述的其他技術(shù))將它們與NTG細(xì)胞或污染物分離。另外，可以使用微陣列技術(shù)(實(shí)施例1)、下一代測序(實(shí)施例8)、質(zhì)譜法、以及聯(lián)合這些技術(shù)的若干方面的技術(shù)(如大規(guī)模多參數(shù)質(zhì)量細(xì)胞計(jì)量術(shù))來表征和/或量化分離或富集的群體。例如，用來分析在此披露的對應(yīng)腫瘤細(xì)胞亞群時，這樣的技術(shù)可以導(dǎo)致鑒定另外的TIC標(biāo)記，包括蛋白質(zhì)、可以通過熒光原位雜交(FISH)可鑒定的RNA標(biāo)記、可以用生色染料或熒光染料可視化的生物化學(xué)標(biāo)記、物理化學(xué)特性如對基底材料(即玻璃、塑料，等等)的差異粘附、或可以使用熒光或發(fā)光報(bào)道基因構(gòu)建體鑒定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的表達(dá)，其中使用任何數(shù)目的轉(zhuǎn)染方法或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)方法將所述熒光或發(fā)光報(bào)道基因構(gòu)建體插入基因組中。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，可以使用任何單一標(biāo)記、披露的選擇標(biāo)記的任何組合、或與在此披露的那些標(biāo)記(即，TICAM)的表達(dá)相關(guān)的替代標(biāo)記來富集或分離在此披露的細(xì)胞群。如上文剛才陳述的，可以通過使它們與結(jié)合劑接觸并且然后使用磁性分離、FACS或任何其他技術(shù)將腫瘤細(xì)胞亞群富集或分離，其中所述其他技術(shù)能夠基于固有的物理化學(xué)特性(即，它們的電荷或?qū)μ囟ɑ椎牟町愓掣?或經(jīng)由與TICAM結(jié)合的結(jié)合劑對不同腫瘤細(xì)胞亞群賦予的物理化學(xué)特性而分離披露的腫瘤細(xì)胞亞群。雖然磁性分離技術(shù)是常見的并且通常成功富集表達(dá)特定標(biāo)記的細(xì)胞群，但是以這種方式富集的樣品常常被多種死細(xì)胞、非靶細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊污染。同樣，通過耗盡具有除了不表達(dá)于靶細(xì)胞群上的標(biāo)記(例如CD66c)之外的所有標(biāo)記的細(xì)胞群所獲得的細(xì)胞很少是純的。

因此，本申請的特別優(yōu)選的實(shí)施例采用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)用于細(xì)胞富集或分離，因?yàn)榱魇郊?xì)胞術(shù)允許快速詳細(xì)地分析單個細(xì)胞，并且區(qū)分單獨(dú)的細(xì)胞的大小和復(fù)雜性，使得活細(xì)胞與死細(xì)胞、大細(xì)胞與小細(xì)胞、單個細(xì)胞與細(xì)胞團(tuán)塊、以及更多或更少的顆粒狀細(xì)胞能夠相互區(qū)別。除大小和復(fù)雜性參數(shù)之外，還可以通過反射鏡和帶通濾光鏡的陣列測量發(fā)射的熒光，使得可以按這種方式以每秒數(shù)千個細(xì)胞的量級探查來自不同熒光蛋白、細(xì)胞內(nèi)化學(xué)反應(yīng)、滯留染料(retained dye)、或熒光染料結(jié)合抗體的多個光發(fā)射波長。此外，使用具有細(xì)胞分離能力的流式細(xì)胞儀(例如FACSAria；Becton Dickenson)，通常可以按更高的純度(>99％)分離具有不同形態(tài)學(xué)、物理化學(xué)和/或熒光特征的單個細(xì)胞。使用這樣的根據(jù)在此的教導(dǎo)內(nèi)容的技術(shù)，有可能表征從原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤獲得的單個細(xì)胞群的異質(zhì)性，所述單個細(xì)胞群直接從癌癥患者和從在小鼠中生長的NTX腫瘤獲得。而且，可以在這個過程期間維持這些細(xì)胞的生存力，使得在證明使用在此披露的標(biāo)記分離的細(xì)胞群的強(qiáng)大的致瘤性中能夠每只小鼠移植少至3個細(xì)胞。

因?yàn)樵诒景l(fā)明中披露的標(biāo)記能夠精確鑒定和分離例如結(jié)直腸癌中的TPC并且將這些細(xì)胞與TProg細(xì)胞、NTG細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞區(qū)分，所得到的致瘤細(xì)胞群提供了與CSC相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因、微小RNA、長或短的非編碼RNA和/或蛋白質(zhì)的檢測。也就是說，可以如在此討論鑒定由相對同質(zhì)的致瘤細(xì)胞亞群優(yōu)先表達(dá)的自我更新、分化、增殖和/或存活的這些遺傳性和/或蛋白質(zhì)組決定子，它們被評價(jià)用作前瞻性診斷標(biāo)記，所述前瞻性診斷標(biāo)記可以例如基于它們由結(jié)直腸癌中的TPC(即，CSC)優(yōu)先表達(dá)而真實(shí)地預(yù)測病情嚴(yán)重性、對特定治療方案的反應(yīng)或疾病結(jié)局。同樣，在此披露的促進(jìn)從胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌和三陰性乳腺癌分離TIC和NTG細(xì)胞的標(biāo)記使得能夠發(fā)現(xiàn)與TIC相關(guān)的更好診斷標(biāo)記。

由本發(fā)明提供的富集或分離的實(shí)體瘤細(xì)胞亞群進(jìn)一步允許精確闡明細(xì)胞層次和增強(qiáng)的細(xì)胞表型表征。在這個方面，應(yīng)當(dāng)理解的是惡性血液病屬于理解最充分的惡性腫瘤，正是因?yàn)榻M成細(xì)胞容易獲得并且確定這些細(xì)胞的命運(yùn)和潛能的體內(nèi)和體外測定法已經(jīng)詳盡地形成。同樣，腫瘤學(xué)研究已經(jīng)演進(jìn)到這樣的節(jié)點(diǎn)，其中不僅可以鑒定負(fù)責(zé)促進(jìn)腫瘤生長的細(xì)胞，還可以使用在此的方法可靠地分離它們并且在體內(nèi)和體外檢驗(yàn)它們的特征。因?yàn)槟[瘤起始細(xì)胞(TIC)優(yōu)選地因它們在體內(nèi)促進(jìn)腫瘤生長的能力而以回顧方式鑒定，促進(jìn)感受態(tài)TIC的分離的技術(shù)和儀器對于它們的精確鑒定是必需的。在這方面，將腫瘤永存細(xì)胞(即TIC的癌干細(xì)胞子集)基于它們促進(jìn)異質(zhì)性腫瘤生長的能力，通過使用小數(shù)目良好定義的細(xì)胞連續(xù)移植至少兩輪以回顧方式最佳地鑒定，如在此對結(jié)直腸癌所展示的。

雖然原發(fā)性移植物足以給出關(guān)于致瘤性的初始讀數(shù)，因此促進(jìn)TIC和NTG細(xì)胞的回顧性鑒定，但是單一輪次的移植不足以在TPC細(xì)胞與TProg細(xì)胞之間明確區(qū)分，因?yàn)閮蓚€群體均是致瘤的。如在此指示的，如在此針對結(jié)直腸癌所鑒定和披露的TProg細(xì)胞不同于TPC(即CSC)，在于它們不能完全地重建腫瘤異質(zhì)性，但是因?yàn)門PC水平典型地低，異質(zhì)性的這種喪失(即TPC在由TProg細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤中的喪失)可能難以觀察到。需要使用小數(shù)目細(xì)胞的第二輪移植來證明TPC細(xì)胞相對于TProg細(xì)胞的重建能力，因?yàn)楹笠患?xì)胞群缺乏自我更新特性，并且其增殖能力應(yīng)當(dāng)在二次移植之前已經(jīng)耗盡。為了正確完成，這些連續(xù)移植實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)使用非常小數(shù)目的高度純化的細(xì)胞(<200個由FACS分離的細(xì)胞)，并且應(yīng)當(dāng)允許來自原發(fā)性移植物的腫瘤生長至>1,500mm³，在其中為TProg細(xì)胞在二次移植之前在體內(nèi)耗盡其增殖能力提供機(jī)會。通過在此披露的技術(shù)大大促進(jìn)了這樣的分析。

就這樣的情況而言，應(yīng)當(dāng)理解的是，優(yōu)選地使用一組標(biāo)記來精確地鑒定任何定義的干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞群。更一般地說，由某些獨(dú)立標(biāo)記定義的細(xì)胞群可能不是純的，但是含有幾種不同的細(xì)胞類型或具有不同潛能的細(xì)胞，其中需要另外的標(biāo)記來解析剩余的異質(zhì)性。為了確定一組標(biāo)記是否足以精確地鑒定特定細(xì)胞群，優(yōu)選地通過體內(nèi)單個細(xì)胞移植和/或譜系追蹤在單個細(xì)胞水平展示這個特定細(xì)胞群的潛能。上述連續(xù)移植方法使得能夠鑒定包含TIC(TPC和TProg)和NTG細(xì)胞的對應(yīng)腫瘤細(xì)胞亞群。

當(dāng)進(jìn)一步修飾以包括用如在此所述分離的相同細(xì)胞群的稀釋物移植至少3個組的小鼠時，也可以確定在輸入細(xì)胞群中的TIC或其組成TPC或TProg細(xì)胞的實(shí)際頻率。例如，使用泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)確定這種頻率，其中所述泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)通過使用已知的輸入細(xì)胞群的有限稀釋物，經(jīng)驗(yàn)地檢驗(yàn)致瘤性(TIC能力的功能性展示)的頻率(獨(dú)立于腫瘤產(chǎn)生的速率)，使得能夠量化已知細(xì)胞群中的TIC。在輸入細(xì)胞的每個稀釋度所實(shí)現(xiàn)的限定結(jié)果(即，腫瘤)的數(shù)目用來計(jì)算在輸入細(xì)胞群中的TIC的數(shù)目。以這種方式，可以評定具有限定潛能(即，致瘤性)的細(xì)胞的真實(shí)頻率。重要的是要注意，泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)在實(shí)驗(yàn)中評定的稀釋過程范圍內(nèi)從數(shù)目有限的限定事件(即，致瘤性)中贏得效能。如在此對從結(jié)直腸NTX-CR4患者衍生的異種移植系分離的CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞群所展示，TIC顯得在這個細(xì)胞群內(nèi)以1:5頻率呈現(xiàn)(圖15)，而表達(dá)其他標(biāo)記的細(xì)胞是非致瘤的或是致瘤性很差的(圖4和圖8)。作為本發(fā)明新穎性的證據(jù)，如在此披露的，1:5TIC頻率的展示代表勝過現(xiàn)有技術(shù)公認(rèn)的針對其他TIC群標(biāo)記的顯著改善，因?yàn)榫哂羞@些標(biāo)記的細(xì)胞在相似的實(shí)驗(yàn)中展示1:75的致瘤細(xì)胞頻率(Dylla等人，2008，PLoS ONE 3:e2428)。

將進(jìn)一步理解的是，在優(yōu)選的實(shí)施例中，有可能將特定的腫瘤細(xì)胞亞群基于它們的標(biāo)記譜而定量。例如，可以在用有希望的治療劑治療后的腫瘤中檢測和定量CSC和NTG細(xì)胞，然后可以將其與預(yù)治療對照相比較。如上文討論的，可以使腫瘤解離并且與結(jié)合于標(biāo)記的藥劑接觸，所述標(biāo)記定義了對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞亞群，并且可以通過流式細(xì)胞術(shù)評定這些細(xì)胞的相對頻率。根據(jù)在此的教導(dǎo)內(nèi)容，如下文實(shí)例中所述展示這一點(diǎn)，其中當(dāng)暴露于分別涉及依立替康或吉西他濱的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理化學(xué)治療方案后，CSC被富集于結(jié)直腸腫瘤和胰腺腫瘤中(圖17和圖18)。

就有限稀釋法分析而言，可以通過將表征和/或分離的(fractionated)人腫瘤細(xì)胞(例如分別來自治療和未治療的腫瘤)置于促進(jìn)集落形成的體外生長條件中而完成腫瘤起始細(xì)胞頻率的體外計(jì)數(shù)。以這種方式，可以通過集落的簡單計(jì)數(shù)和表征或通過由例如以下組成的分析而計(jì)數(shù)集落形成細(xì)胞：將人腫瘤細(xì)胞以連續(xù)稀釋的方式置入平板中并且在鋪板后至少10天將每個孔針對集落形成評分為陽性或陰性。體內(nèi)有限稀釋實(shí)驗(yàn)或分析(在其確定腫瘤起始細(xì)胞頻率的能力方面通常更精確)包括將例如來自未治療的對照或治療的病癥中的人腫瘤細(xì)胞以連續(xù)稀釋方式移植到免疫低下小鼠中并且隨后在移植后至少60天將每只小鼠針對腫瘤形成評分為陽性或陰性。如上文所提到的，通過體內(nèi)或體外有限稀釋法分析推導(dǎo)細(xì)胞頻率值優(yōu)選地是通過將泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用于陽性事件和陰性事件的已知頻率，從而提供滿足陽性事件定義的事件(在這種情況下，分別是集落或腫瘤形成)的頻率而進(jìn)行的。

就與本發(fā)明相容的可以用來計(jì)算腫瘤起始細(xì)胞頻率的其他方法而言，最常見地包括可定量的流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色程序。雖然不如上文剛才描述的有限稀釋法分析技術(shù)那樣精確，但是這些程序耗費(fèi)人力少得多并且在相對短的時間范圍內(nèi)提供了合理的值。因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，技術(shù)人員可以使用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面標(biāo)記譜測定法并且由此測量來自各種樣品的TIC水平，其中所述測定法使用一種或多種抗體或試劑，所述抗體或試劑結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)公認(rèn)的已知相對于腫瘤起始細(xì)胞富集的細(xì)胞表面蛋白(例如，在下文實(shí)例1中陳述的潛在相容的標(biāo)記)。在再另一種相容性方法中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以使用能夠區(qū)分這些細(xì)胞的結(jié)合細(xì)胞表面蛋白的一種或多種抗體或試劑，通過免疫組織化學(xué)原位計(jì)數(shù)TIC頻率(即，組織切片)。

體外培養(yǎng)條件在它們模擬體內(nèi)遇到的生理環(huán)境之前需要經(jīng)歷較長的過程；然而，體外測定可以用作通過使用細(xì)胞群連續(xù)移植在體內(nèi)展示腫瘤的功能性重建的合適替代物，其中使用在此披露的標(biāo)記富集或分離所述細(xì)胞群。具體而言，可以在可能預(yù)測體內(nèi)行為的體外測定中測試感興趣的細(xì)胞的功能特性，如增殖和/或分化能力。存在著其中定義的無血清培養(yǎng)基能夠在體外維持和擴(kuò)增致瘤細(xì)胞的實(shí)例(Dylla等人，2008，PLoS ONE 3:e2428)，表明致瘤細(xì)胞可以被體外維持持續(xù)至少短暫的時間。這樣的測定典型地已經(jīng)局限于集落形成細(xì)胞(CFC)或細(xì)胞球形成測定，例如，所述測定測量細(xì)胞群引發(fā)集落(附著的細(xì)胞群組總計(jì)≥50個細(xì)胞)或漂浮細(xì)胞球(即，細(xì)胞球)的能力(Bao等人，2006,《自然》444:756)。形成的CFC或細(xì)胞球的數(shù)目可以用作TIC頻率的替代物。而且，在這些集落和/或細(xì)胞球解離后，混合細(xì)胞隨后再引發(fā)集落或細(xì)胞球的能力可以作為自我更新的替代讀出。以這種方式，在任何不同的培養(yǎng)條件下，CFC/細(xì)胞球形成細(xì)胞的頻率和自我更新程度可以用來鑒定和表征腫瘤細(xì)胞亞群(如使用在此披露的標(biāo)記分離的那些)的潛能。

還如本領(lǐng)域中的標(biāo)準(zhǔn)一樣，可能例如通過以下方式促進(jìn)分化：在不同的附著基質(zhì)(例如，膠原蛋白或纖連蛋白)上培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞亞群，添加某些生長因子和/或胎牛血清，從而允許實(shí)驗(yàn)探查所述腫瘤細(xì)胞亞群的分化潛能。此外，影響干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞命運(yùn)決定(如自我更新與分化)的基因、蛋白質(zhì)和/或因子也可以通過將定義的TIC與這樣的因子共培養(yǎng)或在用感興趣的基因和/或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)之后進(jìn)行探查。例如，傳統(tǒng)CFC樣測定可以富有信息，其中這些測定可以與分化能力讀出關(guān)聯(lián)，如NTG細(xì)胞相關(guān)基因產(chǎn)物(例如，CEACAM6)的產(chǎn)生，如在此展示的(圖16B和16C)。更清楚地，可以通過以下方式在體外測量細(xì)胞分化潛能：以定義的細(xì)胞群的輸入為基礎(chǔ)并且監(jiān)測可能受到有利于自我更新或分化的培養(yǎng)條件驅(qū)動的分化過程，隨后表征所得到的細(xì)胞、這些細(xì)胞正在產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、和/或通過體內(nèi)移植探查所得到的群體的潛能。使得能夠鑒定表達(dá)在此披露的標(biāo)記的細(xì)胞群的其他表征方法包括使用高內(nèi)涵成像(high content imaging)技術(shù)。通過利用多種參數(shù)如促進(jìn)鑒定特定標(biāo)記和它們在活細(xì)胞或固定細(xì)胞中定位的多光譜分析，例如，可以分析多種參數(shù)如總集落數(shù)、每集落的細(xì)胞數(shù)和集落內(nèi)的細(xì)胞中的細(xì)胞形態(tài)(例如，核/質(zhì)比)的定量。許多這些分析中也可以手工進(jìn)行。在其中通過高內(nèi)涵、多光譜成像監(jiān)測分別指示TIC、它們的混合TPC或TProg細(xì)胞和/或NTG細(xì)胞的標(biāo)記體外測定中，可以體外確定對應(yīng)腫瘤細(xì)胞亞群的數(shù)目或頻率，并且可以評定這些細(xì)胞對可能影響這些細(xì)胞群的自我更新或分化的各種刺激的反應(yīng)。

如通過本披露證明的，在動物中傳代和分析富集或分離的腫瘤起始細(xì)胞亞群的能力是本發(fā)明的有價(jià)值且重要的方面。在這方面，相容性動物宿主可以包含模式生物，如線蟲、果蠅、斑馬魚；優(yōu)選實(shí)驗(yàn)室哺乳動物，如小鼠(裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、Beige/SCID小鼠、FOX/SCID小鼠)、大鼠、兔、或靈長類。重度免疫缺陷NOD-SCID小鼠是特別適合的移植的人癌干細(xì)胞的動物受體。免疫缺陷小鼠不排斥人組織，并且SCID和NOD-SCID小鼠已經(jīng)被表征為用于體內(nèi)研究人血細(xì)胞生成和組織移植的宿主。McCune等人，《科學(xué)》(Science)241:1632-9(1988)；Kamel-Reid&Dick,《科學(xué)》242:1706-9(1988)；Larochelle等人，《自然醫(yī)學(xué)》(Nat.Med.)2:1329-37(1996)。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，可以使用VP-16，針對asialo-GM1蛋白的抗體、放射療法、化學(xué)療法或其他免疫抑制性生物制劑進(jìn)一步使NOD/SCID或Beige/SCID小鼠免疫抑制。能夠增殖異種移植的人腫瘤的另外的小鼠模型包括裸Beige、NOD/SCID/IL2Rg-/-、RAG2-/-/IL2Rg-/-、RAG1-/-/IL2Rg-/-、NOD/β-2微球蛋白-/-、以及無胸腺裸鼠。這些小鼠模型系統(tǒng)的每一種在適應(yīng)性免疫應(yīng)答方面具有嚴(yán)重缺陷，在天然免疫方面具有其他選擇性缺陷，所述選擇性缺陷允許植入否則將被宿主免疫系統(tǒng)排斥的組織。

典型地，將分離的癌干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液(或具有少許細(xì)胞聚集體，如20,000個細(xì)胞，理想地少于100個，優(yōu)選地少于10個細(xì)胞的懸液)制備在包含1:1比率的細(xì)胞懸液和基質(zhì)載體Matrigel(Invitrogen)的混合物中，并且移植至小鼠中的適當(dāng)解剖部位中。用于配制和注射細(xì)胞的一般技術(shù)可以在《雷明頓藥物科學(xué)》第20版(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.)中找到。適合的途徑可以包括腸胃外遞送，例如包括肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腦內(nèi)、或眼球內(nèi)注射。對于注射劑，可以將本發(fā)明的細(xì)胞配制在水溶液中、優(yōu)選地在生理相容性緩沖液如Hank溶液、Ringer溶液或生理鹽水中。為了經(jīng)粘膜給藥，在制劑中使用了適合于滲透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常是本領(lǐng)域已知的。如在此陳述的，一旦建立致瘤性，則動物模型可以用于廣泛類型的生物測定和分子測定，以便表征致瘤干細(xì)胞和從中產(chǎn)生的腫瘤。

例如，在治療晚期腫瘤情況下，允許腫瘤發(fā)展至所希望的尺寸，其中具有超過所希望的尺寸范圍的腫瘤或那些發(fā)育不充分的腫瘤的動物被剔除。所選擇的動物按隨機(jī)方式分布以經(jīng)歷治療和對照。未荷瘤的動物也可以經(jīng)受與荷瘤動物相同的治療，以便能夠?qū)碜詼y試劑的任何毒性與源自腫瘤相關(guān)物質(zhì)的毒性或?qū)λ鰷y試劑的反應(yīng)分開。化學(xué)治療通常從移植之后21-60天開始，這取決于NTX腫瘤的類型，并且每日觀察動物。可以將靶向的貨物蛋白施用至動物，例如，通過腹膜內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、直接注射至腫瘤中(或具有腫瘤的器官中)、或推注輸注。注射的試驗(yàn)化合物的量可以容易地由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。典型地，將不同的動物組大約每周稱重1或2次直至試驗(yàn)結(jié)束。一旦腫瘤是可觸及的，則測量腫瘤，并且使用電子卡尺或3D掃描一周大約1或2次通過直接測量連續(xù)監(jiān)測，直至腫瘤達(dá)到預(yù)定尺寸和/或重量，或直至動物死亡或如果這在腫瘤達(dá)到預(yù)定尺寸/重量之前出現(xiàn)，將動物進(jìn)行安樂死。隨后處死動物并且不但保存組織用于RNA分析、DNA分析、蛋白質(zhì)分析、IHC分析和其他分析，而且使用在此所述的用于對應(yīng)群體的相似分析的方法富集或分離腫瘤細(xì)胞亞群。

IX.潛在治療性化合物的分析

在此披露的TICAM提供了極其有效的用于鑒定、表征、監(jiān)測和分開或分離致瘤細(xì)胞亞群的方法。應(yīng)當(dāng)理解的是，所披露的觀察技術(shù)和高度定義的細(xì)胞亞群提供了可以用來鑒定和驗(yàn)證治療靶標(biāo)或診斷靶標(biāo)的強(qiáng)有力工具，所述工具也用于鑒定和驗(yàn)證用于治療、預(yù)防或診斷所選擇的失調(diào)的藥物化合物。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，分離的細(xì)胞或細(xì)胞群可以經(jīng)歷基因型或表型分析(例如，下文實(shí)例8)。更具體地說，將使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，處理或制備分離或富集的細(xì)胞以提供遺傳物質(zhì)或蛋白質(zhì)組物質(zhì)(即，信息，如轉(zhuǎn)錄組)。這種制備或處理的材料然后使用現(xiàn)代技術(shù)(如下一代測序法或質(zhì)譜法)進(jìn)行分析，以便提供所選擇的關(guān)于致瘤細(xì)胞或細(xì)胞亞群的信息(如蛋白質(zhì)表達(dá)或形態(tài))。

此外，在此披露的定義的致瘤細(xì)胞亞群可以用來在體外和/或體內(nèi)評價(jià)試驗(yàn)化合物或候選化合物減少癌細(xì)胞和/或癌細(xì)胞的量、或抑制它們增殖的能力。候選化合物穩(wěn)定或減少癌細(xì)胞、癌細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞(例如，淋巴細(xì)胞)的量或抑制其增殖的能力可以通過以下方式評定：檢測在癌細(xì)胞、癌細(xì)胞、以及免疫細(xì)胞上的抗原的表達(dá)；檢測癌細(xì)胞、癌細(xì)胞、以及免疫細(xì)胞的增殖；使用功能測定檢測癌細(xì)胞和癌細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，這種分析將包括致瘤細(xì)胞亞群的鑒定、表征和/或分離和富集?？梢允褂帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員已知的技術(shù)用于測量這些活性。例如，可以通過³H胸苷摻入測定和臺盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)來測定細(xì)胞增殖?？梢岳缤ㄟ^免疫測定來測定抗原表達(dá)，所述免疫測定包括但不限于使用多項(xiàng)技術(shù)的競爭和非競爭測定系統(tǒng)，所述多項(xiàng)技術(shù)例如是蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)、放射免疫測定、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫沉淀測定、沉淀素反應(yīng)、凝膠擴(kuò)散沉淀素反應(yīng)、免疫擴(kuò)散測定、凝集測定，補(bǔ)體結(jié)合測定、免疫放射測定、熒光免疫測定、蛋白A免疫測定、免疫熒光法、流式細(xì)胞術(shù)、以及FACS分析。

在人類中使用之前，優(yōu)選地針對所希望的治療活性或預(yù)防活性在體外和然后在體內(nèi)測試潛在藥物化合物、藥物組合物、或提出的方案。例如，可以用來確定特定化合物的給予是否被指示的測定包括細(xì)胞培養(yǎng)測定，其中患者組織樣品(例如，完整腫瘤或富集的細(xì)胞亞群)在免疫低下小鼠中傳代并且暴露于本發(fā)明的化合物或以別的方式與其接觸，并且觀察這樣的化合物對該組織樣品的作用?？梢酝ㄟ^活組織檢查從患者獲得組織樣品。這項(xiàng)試驗(yàn)允許鑒定針對每位個體患者的治療上最有效的療法(例如，預(yù)防劑或治療劑)。通常，在人類中使用之前，優(yōu)選地針對所希望的治療活性或預(yù)防活性在體外和然后在體內(nèi)測試療法。

更具體地說，標(biāo)記和相關(guān)的細(xì)胞、培養(yǎng)物、群體和包含前者(包括其子代)的組合物可以用來篩選或鑒定影響腫瘤起始細(xì)胞或其子代的功能或活性的化合物或藥劑(例如，藥物)。本發(fā)明因此進(jìn)一步提供了用于評價(jià)或鑒定化合物或藥劑的系統(tǒng)和方法，其中所述化合物或物質(zhì)可能通過干擾如顯示于富集的群體中所選擇的途徑或功能而影響腫瘤起始細(xì)胞或其子代的功能或活性。這樣的化合物或藥劑可以是經(jīng)篩選用于治療例如過度增生性失調(diào)的候選藥物。在一個實(shí)施例中，系統(tǒng)或方法包括富集的腫瘤起始細(xì)胞群以及化合物或藥劑(例如，藥物)，其中所述細(xì)胞以及化合物或藥劑(例如，藥物)彼此接觸。

在另一個優(yōu)選實(shí)施例中，這種方法包括在體內(nèi)或體外使腫瘤起始細(xì)胞或其子代的富集群體與測試劑或化合物接觸；并且確定所述測試劑或化合物是否調(diào)節(jié)了腫瘤起始細(xì)胞的活性或功能?？梢哉{(diào)節(jié)的示例性活性或功能包括神經(jīng)元祖細(xì)胞或其子代的細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)記表達(dá)、分化或去分化、成熟、增殖、生存力、凋亡或細(xì)胞死亡的變化。

在一些實(shí)施例中，將有利的是篩選和選擇可以影響一個以上的致瘤亞群的化合物。因此，如果總生存期受治療方案影響，則將基于這些藥物的靶標(biāo)主要在TPC、而且在TProg上或在其中的表達(dá)而最佳地選擇這些靶標(biāo)。人們可能期望的是，選擇的TPC靶向作用將會導(dǎo)致腫瘤最終消退，但是這可能經(jīng)歷一定的時間而發(fā)生，因?yàn)門Prog在此處被證明在結(jié)直腸癌中具有顯著的增殖能力。不僅由TPC表達(dá)，而且由TProg表達(dá)的治療靶標(biāo)可能是更好的候選藥物，因?yàn)榭赡芷叫械馗[瘤和高度增殖性TProg區(qū)室的兩種自我更新組分，導(dǎo)致令人注目的腫瘤消退和延長的總生存期。這些藥物靶標(biāo)可以例如是基因、蛋白質(zhì)、微小RNA和/或長或短的非編碼RNA。藥物靶標(biāo)也可以包括不被TPC或TProg表達(dá)但是結(jié)合在TPC或TProg上的受體并且對于TPC的自我更新或Tprog的增殖是關(guān)鍵性的配體。

更一般地說，當(dāng)用來指代細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物或方法步驟或治療時，接觸表示在富集或選擇的致瘤細(xì)胞或細(xì)胞亞群與另一個參考實(shí)體之間的直接或間接相互作用。直接相互作用的具體實(shí)例是物理相互作用。而且，這樣的接觸可以在體外或在體內(nèi)(即，試驗(yàn)化合物施用至NTX動物)發(fā)生。間接相互作用的具體實(shí)例是組合物作用于中間分子的情況，所述中間分子轉(zhuǎn)而作用于參考實(shí)體(例如，細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物)。

在本發(fā)明的這個方面，調(diào)節(jié)表示以這樣的方式影響腫瘤起始細(xì)胞或子代細(xì)胞的活性或功能，所述方式相容于檢測對細(xì)胞活性或功能的影響，所述細(xì)胞活性或功能已經(jīng)被確定與本發(fā)明的腫瘤起始細(xì)胞或子代細(xì)胞的特定方面(例如，轉(zhuǎn)移或增殖)有關(guān)。示例性活性和功能包括但不限于測量形態(tài)、發(fā)育標(biāo)記、分化、增殖、生存力、細(xì)胞呼吸、線粒體活性、膜完整性、或與某些狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)記的表達(dá)。因此，可以通過以下方式針對其對腫瘤起始細(xì)胞或子代細(xì)胞的影響而評價(jià)化合物或藥劑(例如，候選藥物)：使這樣的細(xì)胞或子代細(xì)胞與化合物或藥劑接觸并且測量如在此披露或技術(shù)人員將已知的腫瘤起始細(xì)胞或子代細(xì)胞的活性或功能的任何調(diào)節(jié)作用。

篩選和鑒定藥劑和化合物的方法包括適合于高通量篩選的那些方法，這些方法包括任選地在預(yù)定位置或地址安置或放置的細(xì)胞陣列(例如，微陣列)。高通量機(jī)器人或手工處理方法可以探測化學(xué)相互作用并且在短時間內(nèi)確定許多基因的表達(dá)水平。已經(jīng)開發(fā)了利用分子信號(例如，熒光團(tuán))的技術(shù)和以非?？斓乃俾侍幚硇畔⒌淖詣踊治?參見例如，Pinhasov等人，《組合化學(xué)高通量篩選》(Comb.Chem.High Throughput Screen)7:133(2004))。例如，微陣列技術(shù)已經(jīng)廣泛地用來一次探測數(shù)千個基因的相互作用，同時提供特定基因的信息(參見，例如，Mocellin和Rossi,《實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)與生物學(xué)進(jìn)展》(Adv.Exp.Med.Biol.)593:19(2007))。

除復(fù)雜生物制劑之外，候選藥劑包括有機(jī)分子，所述有機(jī)分子包含對于結(jié)構(gòu)相互作用必需的官能團(tuán)，尤其是氫鍵，并且典型地至少包含胺、羰基、羥基或羧基，經(jīng)常至少兩種功能性化學(xué)基團(tuán)。候選藥劑經(jīng)常包含用一個或多個以上官能團(tuán)取代的環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳族或多芳族結(jié)構(gòu)。候選藥劑發(fā)現(xiàn)于以下生物分子中，包括肽、多核苷酸、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或其組合。

包括藥理活性藥物、遺傳活性分子，等等。感興趣的化合物包括化學(xué)治療劑、激素或激素拮抗劑，等等。適合于本發(fā)明的示例藥用劑是在《治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ)》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)(Goodman和Gilman,McGraw-Hill,New York,N.Y.，(1996))第9版中下述章節(jié)下描述的那些：水、鹽和離子(Water,Salts and Ions)；影響腎功能和電解質(zhì)代謝的藥物(Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism)；影響胃腸道功能的藥物(Drugs Affecting Gastrointestinal Function)；微生物疾病的化學(xué)療法(Chemotherapy of Microbial Diseases)；腫瘤病的化學(xué)療法(Chemotherapy of Neoplastic Diseases)；作用于造血器官的藥物(Drugs Acting on Blood-Forming organs)；激素和激素拮抗藥(Hormones and Hormone Antagonists)；維生素與皮膚學(xué)(Vitamins,Dermatology)；和毒理學(xué)(Toxicology)，均通過引用結(jié)合在此。還包括毒素和生物與化學(xué)戰(zhàn)劑，例如參見Somani,S.M.(編著)，《化學(xué)戰(zhàn)劑》(Chemical Warfare Agents),學(xué)術(shù)出版社，紐約，1992)。

這樣的篩選方法(例如，高通量)可以快速和高效地鑒定活性劑和化合物。例如，可以將細(xì)胞安置或置于(預(yù)先接種)培養(yǎng)皿、管、燒瓶、滾瓶或平板(例如，單個多孔板或皿如8、16、32、64、96、384和1536多孔板或皿)上，任選地在限定的位置處，用于鑒定潛在治療性分子。可以篩選的文庫例如包括小分子文庫、噬菌體展示文庫、全人抗體酵母展示文庫(Adimab，LLC)、siRNA文庫、以及腺病毒轉(zhuǎn)染載體。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，該方法包括在包含富集制備的致瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物中篩選感興趣的化學(xué)化合物文庫的活性。這樣的化學(xué)文庫可以包括Spectrum^TMCollection文庫、Lopac^TMCollection文庫、Prestwick和Collection文庫(各自為用于篩選的化合物文庫)。

此外，化合物(包括候選藥劑)從多種來源獲得，所述來源包括合成或天然化合物文庫。例如，眾多手段可用于隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物(包括生物分子)，所述手段包括隨機(jī)化寡核苷酸和寡肽的表達(dá)。可替代地，處于細(xì)菌提取物、真菌提取物、植物提取物和動物提取物形式的天然化合物文庫是可獲得的或容易產(chǎn)生。另外地，通過常規(guī)的化學(xué)、物理和生物化學(xué)手段容易地修飾天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物，并且它們可以用來產(chǎn)生組合文庫。已知的藥理劑可以經(jīng)歷定向或隨機(jī)化學(xué)修飾，如酰化、烷基化、酯化、酰胺化，等等，以便產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。

在這樣的實(shí)施例中，待測量的參數(shù)包括可定量的細(xì)胞組分，尤其是可以合乎需要地在高通量系統(tǒng)中精確測量的組分。參數(shù)可以是任何細(xì)胞組分或細(xì)胞產(chǎn)物，包括細(xì)胞表面決定簇、受體、蛋白質(zhì)或其構(gòu)象性或翻譯后修飾、脂質(zhì)、碳水化合物、有機(jī)或無機(jī)分子、核酸(例如mRNA、DNA，等等)或源自這樣的細(xì)胞組分的部分或其組合。雖然大多數(shù)參數(shù)將提供定量讀出，但是在一些情況下，半定量或定性結(jié)果將是可接受的。讀出可以包括單個確定的值或可以包括均數(shù)、中值或方差，等等。特征性地，將從許多相同的測定獲得一系列參數(shù)讀出值。預(yù)期了變異性并且使用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)方法將獲得檢驗(yàn)參數(shù)組的每一個的一系列值，其中常見統(tǒng)計(jì)方法用來提供單個值。

通過將藥劑添加到至少一個和通常多個細(xì)胞樣品，通常連同缺乏這種藥劑的細(xì)胞而篩選藥劑的生物活性。測量響應(yīng)于這種藥劑的參數(shù)的變化，并且通過與參考培養(yǎng)物(例如在該藥劑存在和不存在的情況下，用其他藥劑所獲得的參考培養(yǎng)物，等等)比較而評價(jià)結(jié)果。

將這些藥劑以溶液或容易溶解的形式方便地添加到培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。可以將這些藥劑以斷續(xù)或連續(xù)的方式添加到流通系統(tǒng)中，或可替代地將大劑量的化合物單次或遞增地添加至另外的靜態(tài)溶液中。在流通系統(tǒng)中，使用兩種流體，其中一種是生理中性溶液，并且另一種是與所添加的試驗(yàn)化合物相同的溶液。第一流體在細(xì)胞上通過，隨后第二流體通過。在單一溶液方法中，將大劑量試驗(yàn)化合物添加至細(xì)胞周圍的培養(yǎng)基體積。培養(yǎng)基組分的總濃度不應(yīng)當(dāng)隨這種大劑量的添加或在流通方法中的兩種溶液之間顯著變化。

各種方法可以用于定量選擇標(biāo)記的存在。為了測量存在的分子的量，一種方便的方法是用可檢測部分標(biāo)記分子，所述可檢測部分可以是熒光部分、發(fā)光部分、放射性部分、酶活性部分，等等，尤其是具有高親和力的對結(jié)合于參數(shù)特異的分子。熒光部分容易地可用于標(biāo)記幾乎任何生物分子、結(jié)構(gòu)、或細(xì)胞類型。免疫熒光部分可以不僅導(dǎo)向與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合，而且導(dǎo)向特定的構(gòu)象、切割產(chǎn)物、或位點(diǎn)修飾如磷酸化。單獨(dú)的肽和蛋白質(zhì)可以被工程化以便自發(fā)熒光，例如通過將它們表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)部的綠色熒光蛋白嵌合體(對于綜述，參見Jones等人，(1999)《生物技術(shù)動向》(Trends Biotechnol.)17(12):477-81)。因此，可以將抗體進(jìn)行基因修飾以提供熒光染料作為它們結(jié)構(gòu)的部分。取決于所選擇的標(biāo)記，除使用熒光標(biāo)記物之外，可以使用這樣的免疫測定技術(shù)如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、均相酶免疫測定、以及有關(guān)非酶促技術(shù)來測量參數(shù)。作為參數(shù)，核酸尤其是信使RNA的定量也是感興趣的?？梢酝ㄟ^依賴于核酸核苷酸序列的雜交技術(shù)測量這些核酸。多項(xiàng)技術(shù)包括聚合酶鏈反應(yīng)方法以及基因陣列技術(shù)。例如參見《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編》(Current Protocols in Molecular Biology)，Ausubel等人(編著)，John Wiley&Sons，紐約，N.Y.，2000；Freeman等人，(1999)《生物技術(shù)》(Biotechniques)26(1):112-225；Kawamoto等人，(1999)《基因組研究》(Genome Res)9(12):1305-12；和Chen等人，(1998)《基因組學(xué)》(Genomics)51(3):313-24。

X.診斷用途

在另一個優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供了診斷癌癥或檢測癌細(xì)胞或前癌細(xì)胞的方法，所述方法包括：獲得從受試者的腫瘤富集或純化的本體腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞亞群(例如TIC、TPC、TProg、NTG細(xì)胞、腫瘤基質(zhì)、或完整腫瘤組織)并且評定這些腫瘤細(xì)胞亞群的頻率和/或來自這些對應(yīng)細(xì)胞群的基因譜和/或蛋白質(zhì)組分子譜(proteomic molecular profile)。也可以基于在此披露的TICAM分離致瘤細(xì)胞，并且從受試者(例如，人)中分離致瘤細(xì)胞的各種方法是相關(guān)領(lǐng)域中已知的。

在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了分析體內(nèi)癌癥進(jìn)展和/或發(fā)病機(jī)制的方法。在另一個實(shí)施例中，分析體內(nèi)癌癥進(jìn)展和/或發(fā)病機(jī)制包括確定腫瘤進(jìn)展的程度。在另一個實(shí)施例中，分析包括腫瘤的鑒定。在另一個實(shí)施例中，對原發(fā)性腫瘤進(jìn)行腫瘤進(jìn)展的分析。在另一個實(shí)施例中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，取決于癌癥類型，隨時間推移進(jìn)行分析。在另一個實(shí)施例中，源自原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移細(xì)胞中的繼發(fā)性腫瘤的進(jìn)一步分析是在體內(nèi)進(jìn)行分析的。在另一個實(shí)施例中，分析了繼發(fā)性腫瘤的尺寸和形狀。在某一實(shí)施例中，進(jìn)行了進(jìn)一步的體外分析。在另一個實(shí)施例中，將患者的腫瘤移植至免疫低下小鼠中并且使其生長為異種移植物，使得進(jìn)行分析癌癥進(jìn)展、發(fā)病機(jī)制的實(shí)施例和/或預(yù)測對有前景或?qū)嶋H的療法的反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施例也利用披露的TIC標(biāo)記和TICAM、或采用使用這些TIC或TICAM富集或分離的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的TIC或TICAM相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)、微小RNA、或短的和長的非編碼RNA的特性，以便基于所述TIC或TICAM相關(guān)基因、蛋白質(zhì)、微小RNA、或短的和長的非編碼RNA的表達(dá)，相對于對照標(biāo)本或在不同時間點(diǎn)獲得的標(biāo)本，定量TIC在給定的標(biāo)本(例如，腫瘤活組織檢查)中的相對數(shù)目或頻率。以這種方式，可以預(yù)測和/或主動評定對療法的反應(yīng)，而不直接評定TIC在如在此所述的樣品內(nèi)的實(shí)際數(shù)目。

可以使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的可以檢測和/或定量致瘤細(xì)胞的任何體內(nèi)或體外測定來監(jiān)測疾病的過程，以便評價(jià)所選擇的治療和/或方案的影響。這些方法可以用來評定在研究環(huán)境以及在臨床環(huán)境中的影響。然后這些測定的結(jié)果可以用來改變給藥、藥物或受試者的治療時間。樣品可以在檢測、分離和/或測量樣品中的癌干細(xì)胞群之前經(jīng)歷一個或多個預(yù)處理步驟。在某些實(shí)例中，通過離心、過濾、沉淀、透析、或?qū)游?，或通過這樣的預(yù)處理步驟的組合來預(yù)處理生物流體。在其他實(shí)例中，通過冷凍、化學(xué)固定、石蠟包埋、脫水、透化、或均質(zhì)化，隨后離心、過濾、沉淀、透析、或?qū)游?，或通過這樣的預(yù)處理步驟的組合來預(yù)處理組織樣品。在某些實(shí)例中，在確定樣品中的癌干細(xì)胞的量之前，通過從樣品中移除致瘤細(xì)胞亞群以外的細(xì)胞、或從樣品中移除碎片來預(yù)處理樣品。

在另一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了分析體內(nèi)癌癥進(jìn)展和/或發(fā)病機(jī)制的方法，所述方法包括確定細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在又另一個實(shí)施例中，細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分析包括確定細(xì)胞在與原發(fā)性腫瘤不連續(xù)的部位處的進(jìn)行性生長。在另一個實(shí)施例中，細(xì)胞轉(zhuǎn)移分析的部位包括腫瘤擴(kuò)散途徑。在一些實(shí)施例中，細(xì)胞可以經(jīng)由血管系統(tǒng)、淋巴管在體腔或其組合之內(nèi)分散。在另一個實(shí)施例中，就細(xì)胞遷移、播散、外滲、增殖或其組合進(jìn)行了細(xì)胞轉(zhuǎn)移分析。在又另一個實(shí)施例中，在靜脈內(nèi)、原位或腎包膜移植入免疫低下小鼠后分析了致瘤細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)移潛能。

在某些實(shí)例中，可以在療法或方案之前評定或表征受試者或來自受試者的樣品中的致瘤細(xì)胞，以便建立基線。在其他實(shí)例中，樣品源自受治療的受試者。在一些實(shí)例中，樣品取自在受試者開始或終止治療之后至少大約1、2、4、6、7、8、10、12、14、15、16、18、20、30、60、90天、6個月、9個月、12個月或>12個月的受試者。在某些實(shí)例中，在某個數(shù)目的劑量之后(例如，在2、5、10、20、30個、或更多個劑量的療法之后)評定或表征致瘤細(xì)胞。在其他實(shí)例中，在接收一次或多次療法1周、2周、1個月、2個月、1年、2年、3年、4年或更多年之后表征或評定致瘤細(xì)胞。

XI.制造品

本發(fā)明也提供了用于鑒定、表征和/或富集、或分離如在此所述的致瘤細(xì)胞或細(xì)胞亞群的試劑盒。這樣的試劑盒可以在臨床環(huán)境中用于患者診斷目的或在研究中用于致瘤細(xì)胞群的表征和/或富集。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒將包括一個或多個容器，所述容器包含TICAM結(jié)合劑和在容器上或與之結(jié)合的標(biāo)簽或包裝說明書。適合的容器例如包括瓶、小瓶、注射器、96孔平板，等等。容器可以從多種材料如玻璃或塑料中形成。這種容器容納一種或多種組合物，所述組合物包含有效用于分析致瘤細(xì)胞和任選地提供如在此所述的富集或分離的細(xì)胞或細(xì)胞亞群的結(jié)合劑。這樣的試劑盒通常將含有在適合的容器中的一種或多種TICAM結(jié)合劑的制劑，在多種結(jié)合劑的情況下，結(jié)合劑可以處于相同或不同的容器中。試劑盒也可以含有其他藥學(xué)上可接受的制劑，用于診斷或用于標(biāo)記或修飾封閉的結(jié)合劑。

更具體地所，這些試劑盒可以具有單個容器，其含有一種或多種TICAM結(jié)合劑，有或沒有另外的組分，或它們可以具有針對每種組分的不同容器。在提供用于結(jié)合的組合報(bào)道子的情況下，可以按摩爾當(dāng)量組合或在一種組分超過其余組分的情況下將單獨(dú)的溶液預(yù)混合?？商娲?，試劑盒的結(jié)合劑和任何任選的標(biāo)記劑可以在施用至受試者或體外使用之前分開地維持在不同容器之內(nèi)。試劑盒也可以包含用于容納無菌的、藥學(xué)上可接受的緩沖液或其他稀釋劑(如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、Ringer溶液和葡萄糖溶液)的第二/第三容器裝置。

當(dāng)試劑盒的組分被提供在一種或多種液體溶液中時，液體溶液優(yōu)選地是水溶液，特別優(yōu)選無菌水溶液。然而，試劑盒的組分可以被提供為干燥粉末。當(dāng)試劑或組分被提供為干燥粉末時，可以通過添加適合的溶劑使粉末復(fù)原。構(gòu)思了也可以將溶劑提供在另一個容器中。

如上文簡要指示的，試劑盒也可以含有借以施用結(jié)合劑和任何任選組分至受試者的裝置，例如，一個或多個針頭或注射器、或甚至點(diǎn)眼器、吸管或其他諸如此類的設(shè)備，從中可以將制劑注射或引入動物中或施加至身體的患病區(qū)域。本發(fā)明的試劑盒還典型地將包括用于容納小瓶或類似物、密閉用于商業(yè)銷售的其他組分的裝置，例如像，將所希望的小瓶和其他設(shè)備置于其中并保留的注射成型或吹塑成型的塑料容器。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，任何標(biāo)簽或包裝說明書指示所述結(jié)合劑組合物用于診斷癌癥，例如結(jié)直腸癌。在其他優(yōu)選實(shí)施例中，附上的說明書指導(dǎo)或指示怎樣在體內(nèi)或體外研究環(huán)境中的一個或多個療法中使用這些組分。

XII.研究試劑

本發(fā)明的其他優(yōu)選實(shí)施例還利用了披露的TICAM的特性作為用于通過多種方法鑒定、分離、劃分或富集腫瘤起始細(xì)胞群或亞群的有用工具，這些方法例如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)、磁性激活細(xì)胞分選(MACS)、或激光介導(dǎo)切割。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可以在用于表征和操作TIC(包括癌干細(xì)胞)的若干相容性技術(shù)中使用調(diào)節(jié)劑(例如，參見美國序列號12/686,359、12/669,136和12/757,649，所述文獻(xiàn)各自通過引用以其全文結(jié)合在此)。

XIII.其他

除非在此另有定義，所使用的與本發(fā)明相關(guān)的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義。此外，除非上下文另外要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，并且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)。更具體地說，如本說明書和所附權(quán)利要求書中所使用的，除非上下文另外清楚地說明，單數(shù)形式“一個/一種(a)”、“一個/一種(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)指代物。因此，例如，對“一個/一種蛋白質(zhì)”的指代包括多種蛋白質(zhì)；對“一個/一種細(xì)胞”的指代包括包括細(xì)胞的混合物，等等。另外，提供在本說明書和所附權(quán)利要求書的范圍包括兩個終點(diǎn)以及在這些終點(diǎn)之間的所有點(diǎn)。因此，2.0至3.0的范圍包括2.0、3.0、以及在2.0與3.0之間的所有點(diǎn)。

通常，與在此所述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)以及雜交一起使用的命名及其技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并且通常使用的那些。除非另有說明，本發(fā)明的方法和技術(shù)通常根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行，這些常規(guī)方法是本領(lǐng)域熟知的并且如貫穿本說明書所引證和討論的在各種一般和更具體的參考文獻(xiàn)中所述。參見，例如，Sambrook J.和Russell D.《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第3版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(2000)；Ausubel等人，《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南：來自當(dāng)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南的方法的概要》(Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley,John&Sons,Inc.(2002)；Harlow和Lane，《抗體使用：實(shí)驗(yàn)手冊》(Using Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1998)；和Coligan等人，《精編蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Short Protocols in Protein Science)，Wiley,John&Sons公司(2003)。根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行酶促反應(yīng)和純化技術(shù)，如本領(lǐng)域中通常所完成或如在此所述的。通常，與在此所述的分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、以及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)的實(shí)驗(yàn)室程序和技術(shù)一起使用的命名及其技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的并且通常使用的那些。

本說明書范圍內(nèi)所披露或引證的所有參考文獻(xiàn)或文件在不限于此的情況下通過引用以其全文結(jié)合在此。而且，在此所用的任何節(jié)標(biāo)題僅僅是出于組織目的并且不得解釋為限制所述的主題。

實(shí)例

通過參考以下實(shí)例，將更容易地理解如此總體描述的本發(fā)明，所述實(shí)例以說明的方式提供并且不旨在限制本發(fā)明。這些實(shí)例并不旨在表明以下實(shí)驗(yàn)是所進(jìn)行的所有的或僅有的實(shí)驗(yàn)。除非另外指明，份數(shù)是以重量計(jì)的份數(shù)，分子量是重均分子量，溫度是攝氏度，并且壓力是在大氣壓或接近大氣壓。

實(shí)例1

腫瘤起始細(xì)胞群的表征

為了在實(shí)體瘤在癌癥患者中存在時表征它們的細(xì)胞異質(zhì)性、使用特定表型標(biāo)記闡明腫瘤永存細(xì)胞(TPC；即癌干細(xì)胞：CSC)的身份并且鑒定臨床有關(guān)的診斷性生物標(biāo)記和治療靶標(biāo)，使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)開發(fā)并維護(hù)大型的非傳統(tǒng)異種移植物(NTX^TM)腫瘤庫。包含大量離散的原發(fā)性腫瘤的NTX腫瘤庫在免疫低下小鼠中通過異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的多次傳代而增殖，其中所述異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞最初從患有多種實(shí)體瘤惡性腫瘤的癌癥患者獲得。具有良好定義的譜系的大量離散早期傳代NTX腫瘤細(xì)胞系的可獲得性大大促進(jìn)了將TPC鑒定和分離為NTX腫瘤系，該系的細(xì)胞密切反映直接取自患者的腫瘤的生物學(xué)，允許可重復(fù)及反復(fù)地在體內(nèi)表征腫瘤細(xì)胞亞群。更具體地說，將分離或純化的TPC根據(jù)它們在小鼠中產(chǎn)生表型上和形態(tài)上異質(zhì)的腫瘤的能力以回顧的方式最精確地定義，這些腫瘤重演了這些細(xì)胞從其中起源的患者腫瘤樣品，同時保留它們在低細(xì)胞數(shù)(即<200個細(xì)胞)連續(xù)移植時促進(jìn)腫瘤生長的能力。因此，使用小群分離的細(xì)胞通過至少兩次連續(xù)移植在小鼠中產(chǎn)生完全異質(zhì)性腫瘤的能力強(qiáng)烈地指示了分離的細(xì)胞包含TPC的事實(shí)。在這樣的工作中，使用傳代最少的在體外從未擴(kuò)增(例如為了增加細(xì)胞數(shù)目的目的)的NTX細(xì)胞系大大簡化了體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并且在生理有關(guān)環(huán)境中提供了可證實(shí)的結(jié)果。而且，早期傳代NTX腫瘤也對治療劑如依立替康(即)有反應(yīng)，這為驅(qū)動腫瘤生長、對現(xiàn)有療法的抵抗性和腫瘤復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)機(jī)制提供了臨床有關(guān)的了解。

隨著NTX腫瘤系建立，使用流式細(xì)胞術(shù)分析組成腫瘤細(xì)胞表型來鑒定離散的標(biāo)記，所述標(biāo)記可能用來鑒定、表征、分離、純化或富集腫瘤起始細(xì)胞(TIC)和分開或分析這樣的群體內(nèi)的TPC和腫瘤祖細(xì)胞。在這方面，發(fā)明人采用了專有的基于蛋白質(zhì)組的平臺(即PhenoPrint^TM陣列)，所述平臺提供了細(xì)胞蛋白表達(dá)的快速表征和潛在有用的標(biāo)記的同時鑒定。

PhenoPrint陣列是專有的蛋白質(zhì)組平臺，其包含在96孔平板中排列的數(shù)百個離散的結(jié)合分子，許多從商業(yè)來源獲得，其中每個孔含有在藻紅蛋白(PE)熒光通道中的不同結(jié)合分子。出于鑒定腫瘤細(xì)胞樣品內(nèi)的亞群目的，在所有細(xì)胞分布至PhenoPrint陣列的孔中之前，向它們均勻地施加非PE熒光通道中的其他結(jié)合分子。PhenoPrint陣列的使用允許快速鑒定蛋白質(zhì)或標(biāo)記，所述蛋白質(zhì)或標(biāo)記有希望地區(qū)分TIC與非致瘤性(NTG)本體腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)(例如，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)。更具體地說，在所有腫瘤細(xì)胞樣品范圍內(nèi)顯示異質(zhì)性細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白質(zhì)允許基于差異性蛋白質(zhì)表達(dá)鑒定、分離和移植不同的和高度純化的TIC亞群。應(yīng)當(dāng)理解的是，基于本申請的標(biāo)記表型表征和富集或分離細(xì)胞亞群(例如，通過流式細(xì)胞術(shù)或熒光激活細(xì)胞分選：FACS)允許將它們移植至免疫低下小鼠中，從而促進(jìn)通過功能性測試TIC的體內(nèi)致瘤能力而評定它們在一個腫瘤細(xì)胞亞群中相對于另一個亞群是否被富集。當(dāng)PhenoPrint陣列與本領(lǐng)域熟知的組織解離、移植和干細(xì)胞技術(shù)組合使用時(Al-Hajj等人，2004，Dalerba等人，2007和Dylla等人，2008，均見上文，所述文獻(xiàn)各自通過引用以其全文結(jié)合在此)，有可能有效地鑒定根據(jù)本發(fā)明的有關(guān)標(biāo)記并且隨后以高效率分離和移植特定人腫瘤細(xì)胞亞群。

在這種情況下，使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，在嚴(yán)重免疫低下小鼠中建立包含人腫瘤的各種NTX腫瘤系。當(dāng)達(dá)到800-2,000mm³時，將腫瘤從小鼠切除并且使用本領(lǐng)域公認(rèn)的機(jī)械解離技術(shù)和涉及使用膠原酶、透明質(zhì)酸酶和DNA酶I的酶促解離技術(shù)將其解離成單細(xì)胞懸液(參見，例如美國專利號2007/0292414，所述專利結(jié)合在此)。使用標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞技術(shù)，在BD FACSCanto^TMII流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)上表征單獨(dú)的腫瘤細(xì)胞的數(shù)百種細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)。與均勻表達(dá)(或不存在)的大多數(shù)細(xì)胞表面蛋白相反，選擇的蛋白質(zhì)(包括CD46、CD324和在圖9-12中所述的那些)或大或小程度地在眾多原發(fā)性人結(jié)直腸(“CR”)腫瘤細(xì)胞、胰腺(“PA”)腫瘤細(xì)胞、三陰性乳腺(“BR”)腫瘤細(xì)胞、以及非小細(xì)胞肺癌(“LU”)腫瘤細(xì)胞的表面上陽性地和/或異質(zhì)性地表達(dá)。在圖1和圖2中針對幾種不同的腫瘤類型展示了這些標(biāo)記的兩種(CD46和CD324)的異質(zhì)性表達(dá)。更具體地說，圖1和圖2描述了單獨(dú)的腫瘤細(xì)胞的基于流式細(xì)胞術(shù)的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)，其顯示為柱狀圖，其中使用同種型對照抗體的熒光減一(FMO)染色以灰色填充的柱狀圖顯示，并且使用粗黑線顯示如使用可商業(yè)獲得的抗原特異性、結(jié)合PE的抗體所測定的靶抗原表達(dá)(即，CD46和CD324)。

如可以在圖1A中并且根據(jù)本發(fā)明所見，通常在存在各種類型的實(shí)體瘤的受試者中觀察到CD46表達(dá)。而且，雖然表達(dá)水平變化，但是它通常高于背景染色。對使用來自新鮮分離的腫瘤的腫瘤細(xì)胞的柱狀圖的觀察揭示CD46表達(dá)尤其在源自結(jié)直腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌和三陰性乳腺癌患者的腫瘤中是異質(zhì)的(圖1B)，其中亞群通常展示陰性/lo或陽性表達(dá)。具體而言，陽性表達(dá)CD46的那些細(xì)胞經(jīng)常具有范圍從低水平至高水平的染色，如使用同種型對照/FMO染色和標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞方法定量的。用CD324產(chǎn)生相似的觀察結(jié)果，如在圖2中所見，其中經(jīng)常觀察到表達(dá)CD324的腫瘤細(xì)胞亞群包含少數(shù)群體。出人意料地并且與本領(lǐng)域中的解釋相反，當(dāng)在相似的實(shí)體瘤類型中使用相同的技術(shù)測量時，通常被認(rèn)為僅僅與致瘤細(xì)胞的亞群相關(guān)的蛋白質(zhì)(例如CD24和CD34)通常顯示均勻表達(dá)，如在圖3A(CD24)和圖3B(CD34)中所例舉的。就這一點(diǎn)而論，這些現(xiàn)有技術(shù)標(biāo)記可以與在此的教導(dǎo)內(nèi)容不相符。

在任何情況下，精確重演腫瘤生理學(xué)的NTX腫瘤模型與如上所述的PhenoPrint陣列分析腫瘤細(xì)胞的聯(lián)合使用，證明在表征許多的數(shù)百種腫瘤抗原(包括CD46和CD324)的細(xì)胞表面表達(dá)水平方面的可能性和用途。不同于顯示同質(zhì)表達(dá)的標(biāo)記，本發(fā)明的標(biāo)記在來自眾多腫瘤類型的腫瘤細(xì)胞亞群之間通常是異質(zhì)的，并且因此在鑒定、表征和/或分離或富集TIC或其組分時提供了顯著優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)例2

通過FACS和移植富集腫瘤起始細(xì)胞群

在顯示特定蛋白質(zhì)或感興趣的蛋白質(zhì)(例如，CD46和/或CD324)的異質(zhì)表達(dá)的腫瘤中，基于這樣的標(biāo)記富集或分離細(xì)胞并且然后將它們移植至免疫低下小鼠中。更具體地說，為了確定高水平或低水平的表面CD46和/或CD324是否可能與增強(qiáng)的致瘤性相關(guān)，使用如上文所述的現(xiàn)有技術(shù)將NTX腫瘤樣品解離并且使用FACSAria流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)分離以提供不同標(biāo)記富集的亞群，所述群體然后移植至免疫低下小鼠中。在這個方面，將細(xì)胞以典型地范圍在每只小鼠1,000個至50個細(xì)胞之間的劑量皮下注射至免疫受損的雌性受體NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪墊中。當(dāng)產(chǎn)生自這些移植物的腫瘤達(dá)到800-2,000mm³時，使小鼠安樂死并且將腫瘤移出并通過酶消化解離成單細(xì)胞懸液，目的在于表征表型，以便評定細(xì)胞的構(gòu)造是否代表從中最初分離移植細(xì)胞的親本腫瘤。

圖4-8展示了使用源自結(jié)直腸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌和三陰性乳腺癌患者的NTX腫瘤的代表性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖8中的空白空間表示未測試所指示的實(shí)驗(yàn)條件。顯著地，致瘤性一致性地與表達(dá)CD46和CD324的細(xì)胞亞群相關(guān)，并且由具有CD46^hiCD324⁺表型的細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤在組成方面與它們的親本腫瘤相似。而且，因?yàn)檫@些實(shí)體瘤內(nèi)的所有人類細(xì)胞為上皮特異性抗原(ESA；EpCAM)陽性，并且所有或至少絕大多數(shù)為CD24⁺和CD34^-(圖3)，可以使用表型譜ESA⁺CD46^hi CD324⁺CD24⁺CD34^-，鑒定來自這些腫瘤的腫瘤起始細(xì)胞(TIC)亞群和絕大多數(shù)分析的那些腫瘤。然而，因?yàn)镋SA、CD24和CD34在它們的表面表達(dá)方面變化很少并且在定義腫瘤細(xì)胞亞群方面用途有限，在此披露的TIC亞群可以被鑒定為CD324⁺和任選地鑒定為CD46^hi。如上文所述并且使用源自許多位結(jié)直腸癌、胰腺癌、三陰性乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌患者的NTX系進(jìn)行重復(fù)，當(dāng)移植入小鼠時，CD46^hi細(xì)胞一致地產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤，從而表明這種分離的細(xì)胞亞群針對TIC而被顯著富集。根據(jù)在此的教導(dǎo)內(nèi)容，雖然可以各自單獨(dú)地使用CD46和CD324來富集和表征TIC亞群，但是本發(fā)明的各個方面將組合地使用這些標(biāo)記，并且在替代性實(shí)施例中，用另外的標(biāo)記來促進(jìn)更精確的腫瘤細(xì)胞亞群的分層和分離(圖8)。相反，不表達(dá)或表達(dá)低水平CD46或CD324的腫瘤細(xì)胞分別比它們的高表達(dá)或陽性表達(dá)對應(yīng)物具有低得多的致瘤性(圖4-8)?；诋a(chǎn)生的數(shù)據(jù)，出人意料地發(fā)現(xiàn)，表達(dá)CD46^hi CD324⁺表型的腫瘤細(xì)胞亞群通常含有絕大部分的致瘤能力。

實(shí)例3

腫瘤起始細(xì)胞上表達(dá)的代表性細(xì)胞表面標(biāo)記

腫瘤起始細(xì)胞，如同所有的細(xì)胞，可以表達(dá)若非數(shù)百種則數(shù)千種的標(biāo)記或抗原，優(yōu)選地表達(dá)在它們的細(xì)胞表面上。就這一點(diǎn)而論，雖然CD46和CD324針對是TIC的優(yōu)選標(biāo)記，可以使用其他伴隨的標(biāo)記來鑒定和/或分離相同的腫瘤細(xì)胞亞群，這獨(dú)立于使用能夠檢測CD46和/或CD324的分子。在使用上述細(xì)胞表面標(biāo)記譜證實(shí)TIC群后，使用試劑重復(fù)PhenoPrint陣列，以便鑒定顯示與CD46和/或CD324可比較的表達(dá)譜的蛋白質(zhì)，這表明就本發(fā)明而言，可以使用這些蛋白質(zhì)作為CD46和/或CD324的替代物。

為了鑒定與TIC細(xì)胞群相關(guān)或與CD46和/或CD324大量地共表達(dá)的蛋白質(zhì)，使在PhenoPrint陣列的所有孔中包含針對這些抗原的非PE結(jié)合的抗體，并且將識別各種不同的感興趣的蛋白的獨(dú)特抗體排列并且使用熒光分子PE評定它們。在圖9A和圖9B中列出了例如與CCD46^-/lo(NTG)和/或CD324^-亞組分相比，在異種移植的結(jié)直腸癌、胰腺癌、或非小細(xì)胞肺癌的人CD46^hi CD324⁺(TIC)亞組分內(nèi)表達(dá)更高的蛋白質(zhì)。圖10中包括了顯示在結(jié)直腸癌中每種標(biāo)記與CD46和CD324共表達(dá)的代表性FACS圖。圖11中包括了顯示在胰腺癌中每種標(biāo)記與CD46和CD324共表達(dá)的代表性FACS圖。圖12中包括了顯示在非小細(xì)胞肺癌中每種標(biāo)記與CD46和CD324共表達(dá)的代表性FACS圖。大量表達(dá)每種列出的標(biāo)記的細(xì)胞的表征或富集或分離也指示CD46^hi CD324⁺細(xì)胞(即，TIC)的表征或富集或分離。在這方面，圖9-12的標(biāo)記和與CD46或CD324表達(dá)相關(guān)的其他標(biāo)記可以作為替代物使用并且有效地用來鑒定如在此陳述的TIC。因而，在圖9-12中陳述的標(biāo)記可以用于分離TIC亞群并且擁有作為診斷標(biāo)記和治療靶標(biāo)的實(shí)質(zhì)效用。

實(shí)例4

CD66c可以在結(jié)直腸CD46^hi CD324⁺亞群之間區(qū)分

雖然大多數(shù)腫瘤細(xì)胞缺乏腫瘤形成能力并且可以因此表征為NTG，但是在正常細(xì)胞發(fā)育和造血系統(tǒng)腫瘤中存在能夠在移植后重建組織和/或腫瘤而不具有自我更新能力(即有限壽命)并且因此最終衰竭的高度增殖性細(xì)胞(即短期重建性細(xì)胞、過渡放大細(xì)胞或祖細(xì)胞)的先例。在癌癥的背景下，具有祖細(xì)胞表型的細(xì)胞可能再獲得通常限于干細(xì)胞群的自我更新特性并且此后滿足TPC或CSC的定義(Jamieson等人，《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》(N Engl J Med)；351,2004，所述文獻(xiàn)通過引用以其全文結(jié)合在此)，因?yàn)檫@些細(xì)胞和它們的子代將是長壽命的；然而，賦予祖細(xì)胞自我更新特性的這些誘變事件是罕見的。然而，由于：a)祖細(xì)胞的增殖能力可以是顯著的；b)一旦腫瘤達(dá)到大約1,500-2,000mm³，必須使免疫低下小鼠必安樂死；和c)免疫低下小鼠的壽命相對于人壽命是短的(對于NOD/SCID小鼠，大約9-12個月)，TIC在小鼠中產(chǎn)生腫瘤的能力不是顯示TIC為TPC的足夠穩(wěn)健的讀出。如在本領(lǐng)域討論的，只要可能，通過干細(xì)胞的自我更新能力的展示必須顯示在連續(xù)移植物中。

為了確定CD46^hi CD324⁺細(xì)胞亞群是否或多或少具有致瘤性和/或具有改變的潛能，對具有這種表型的細(xì)胞系統(tǒng)地篩選異質(zhì)性，以便鑒定使得能夠細(xì)胞分離和移植實(shí)驗(yàn)的另外的標(biāo)記。具體而言，使用如上文討論的如前面實(shí)例中陳述的PhenoPrint陣列，鑒定感興趣的細(xì)胞表面標(biāo)記和潛在效用。在這些實(shí)驗(yàn)過程期間，將CD66c鑒定為這樣的細(xì)胞表面標(biāo)記，所述細(xì)胞表面標(biāo)記通常顯示在CD46^hi CD324⁺細(xì)胞群之間的異質(zhì)性(圖13A)并且使得能夠分離擁有不同功能性重建能力的兩個不同的CD46^hi CD324⁺細(xì)胞亞群。在圖13A中表示了以每只小鼠200個細(xì)胞移植的對應(yīng)群體。產(chǎn)生自移植CD46^hi CD324⁺細(xì)胞的CD66c^-細(xì)胞子集的結(jié)直腸腫瘤是完全異質(zhì)的并且反映從中衍生它們的親本腫瘤(圖13B和13C[白色欄相對于黑色欄]和圖14A)。出人意料地并且與源自CD46^hi CD324⁺細(xì)胞的CD66c^-子集的腫瘤相反，用小數(shù)目CD66c⁺子集的移植物沒有產(chǎn)生完全異質(zhì)的腫瘤，因?yàn)榇嬖谟趶腃D46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞所產(chǎn)生的腫瘤中的CD66c^-細(xì)胞顯著較少(圖13C[灰色欄相對于黑色欄]和圖14A)，表明這些細(xì)胞是具有與正常祖細(xì)胞類似的特性的腫瘤祖細(xì)胞(TProg)，所述特性即顯著的增殖能力、但缺乏自我更新能力并且不能去分化成CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞。

以小細(xì)胞數(shù)連續(xù)移植有希望的TPC(CD46^hi CD324⁺CD66c^-)和TProg(CD46^hi CD324⁺CD66c⁺)細(xì)胞證實(shí)：所提出的這些腫瘤細(xì)胞亞群的身份為產(chǎn)生自下述腫瘤的CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞，其中所述腫瘤由連續(xù)移植僅50個細(xì)胞(p2相對于p1腫瘤)后高效產(chǎn)生腫瘤的CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞產(chǎn)生，而在連續(xù)移植后，來自CD46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤中的CD66c^-和CD66c⁺細(xì)胞亞群兩者都不能高效地再引發(fā)腫瘤(圖14B)。為清晰起見，從200個CD46^hiCD324⁺CD66c⁺細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤中所分離的50個CD46^hiCD324⁺CD66c⁺或50個CD46^hiCD324⁺CD66c^-細(xì)胞是很少致瘤的。出人意料地，這些數(shù)據(jù)指示以下事實(shí)，在來自一些結(jié)直腸癌患者的實(shí)體瘤中，CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞是TPC細(xì)胞并且CD46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞是TProg細(xì)胞。

為了確定結(jié)直腸癌中上述TPC表型的準(zhǔn)確度，通過FACS分離CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞(FACS前與FACS后；分別是圖15A與圖15B)并且將它們分別以每只小鼠1,000、200、50、20、8和3個細(xì)胞的稀釋度移植。使用基于陽性事件的泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)導(dǎo)致以下計(jì)算結(jié)果：CD46^hi CD324⁺CD66c^-TPC中的真實(shí)TIC頻率大致是5.4±2.5個細(xì)胞中有1個細(xì)胞(圖15C)，其中所述陽性事件定義為獨(dú)立于速率的成功腫瘤形成。我們已經(jīng)出乎意料地在代表性結(jié)直腸NTX腫瘤中證明，使用新穎的CD46^hi CD324⁺CD66c^-標(biāo)記組合促進(jìn)了可度量的TIC頻率的富集，并且CD66c的使用進(jìn)一步促進(jìn)了一些患者中的TIC亞群解析成TPC與TProg。這項(xiàng)進(jìn)展具有顯著意義，因?yàn)椴皇撬械腡IC是相同的并且僅僅TPC亞群在任何給定的患者中是真正推動疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)的長壽命癌干細(xì)胞。

先前未曾知道用來富集結(jié)直腸腫瘤中的上文定義的TPC和TProg細(xì)胞群的細(xì)胞表面蛋白的組合與任何組織或腫瘤中含有這種活性的細(xì)胞相關(guān)。這項(xiàng)工作代表在分離TIC及其亞群的方法的分辨率方面的重大改進(jìn)，并且進(jìn)一步改進(jìn)了技術(shù)，以便鑒定、分離和表征不同的、高度富集的在移植后專有地含有腫瘤產(chǎn)生能力的實(shí)體瘤細(xì)胞亞群，從而區(qū)分具有或沒有自我更新能力的致瘤細(xì)胞亞群，即分別為TProg和TPC。我們進(jìn)一步在此描述了一種通過以下方式計(jì)數(shù)TIC的方法：將人腫瘤細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)逐步降低的稀釋物移植并且評定獨(dú)立于速率的后續(xù)頻率，其中這些細(xì)胞稀釋物能夠以所述頻率在免疫低下小鼠中引發(fā)腫瘤形成。因此，雖然使用專有的PhenoPrint陣列鑒定的大多數(shù)細(xì)胞表面標(biāo)記未顯示出使用標(biāo)準(zhǔn)FACS操作方案從腫瘤富集TIC群的能力，不同的標(biāo)記及其組合可能用來鑒定至少兩個TIC亞群，包括TPC和TProg，其中所述亞群被功能性證明為分別滿足本領(lǐng)域中干細(xì)胞和祖細(xì)胞的定義標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)例5

TPC和TProg細(xì)胞群具有不同的潛能

已經(jīng)證明體外集落形成細(xì)胞(CFC)測定在協(xié)助剖析造血細(xì)胞層次中不同細(xì)胞群的分化潛能方面具有巨大效用；然而這些測定法對于上皮組織或?qū)嶓w瘤細(xì)胞是不適合的，因?yàn)闇y定條件并不有利于細(xì)胞生長和/或分化。使用其中許多表型上不同的腫瘤細(xì)胞亞群如它們在患者腫瘤中那樣存在的NTX腫瘤模型，支持TIC自我更新或分化的FACS和體外分析條件有助于確定所定義的腫瘤細(xì)胞亞群的潛能。這些體外CFC測定起碼在搜索新標(biāo)記和搜索抗癌劑的篩選方面提供有效的優(yōu)勢，所述新標(biāo)記定義了腫瘤細(xì)胞亞群，從而確定這些對應(yīng)的細(xì)胞群的分化潛能。

為了展示本發(fā)明的這樣的方面，使用FACSAria流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)，將具有定義的細(xì)胞表面表型CD46^hi CD324⁺(TIC)或CD46^-/lo CD324^-(NTG)的單個細(xì)胞從NTX CR腫瘤分離并且以稀釋度468、162、54、18、6或2個細(xì)胞/孔直接置入96孔板中。如作為本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)，然后將細(xì)胞在定義的無血清條件下在37℃/5％CO₂/5％O₂培養(yǎng)15天，并且如此評分集落形成陽性的孔(圖16A)。利用L-Calc^TM軟件(Stemcell Technologies)，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)置信息最終確定每個群體的集落形成單位的頻率，所述實(shí)驗(yàn)設(shè)置信息包括：a)被引發(fā)的單獨(dú)的孔的數(shù)目；b)用來引發(fā)每個孔的細(xì)胞數(shù)；和c)獨(dú)立于速率的、來自每個稀釋度的經(jīng)評分為陽性的孔數(shù)目。

在用少至18個分選的CD46^hi CD324⁺細(xì)胞接種的孔中觀察到集落，同時162個細(xì)胞是為觀察到來自分選的CD46^-/lo CD324^-細(xì)胞中的集落所需要的最小細(xì)胞數(shù)。因此集落形成細(xì)胞被證明對于TIC和NTG細(xì)胞群分別以每1,000個細(xì)胞7.3和1.1個細(xì)胞的頻率存在(圖16A)。為了清楚起見，在137個CD46^hi CD324⁺(TIC)細(xì)胞中有1個細(xì)胞在體外形成集落，而在918個CD46^-/lo CD324^-(NTG)細(xì)胞中僅1個細(xì)胞具有這種能力。這些結(jié)果有力地表明，集落形成細(xì)胞在結(jié)直腸癌細(xì)胞的CD46^hi CD324⁺部分中顯著地被富集并且這種活性與致瘤能力相關(guān)，如還通過體內(nèi)移植所展示的。

為了進(jìn)一步評定在結(jié)直腸腫瘤內(nèi)的更多不同的腫瘤細(xì)胞亞群的增殖和分化潛能，將表達(dá)CD46、CD324和CD66c的各種組合的細(xì)胞分選至含有支持干細(xì)胞自我更新的標(biāo)準(zhǔn)無血清培養(yǎng)基條件的平板中(Dylla等人，2008，上文)。以下細(xì)胞群從單個的、活的人ESA⁺細(xì)胞中分選：CD46^-/lo(NTG細(xì)胞；也主要是CD324^-)、CD46^hi CD324^-、CD46^hi CD324⁺CD66c⁺和CD46^hiCD324⁺CD66c^-。然后在鋪板之后21天評定這些對應(yīng)腫瘤細(xì)胞亞群引發(fā)集落的能力，作為是這些對應(yīng)的腫瘤細(xì)胞亞群產(chǎn)生可溶性CD66c(即，CEACAM6)蛋白的潛能。CD66c常規(guī)地從細(xì)胞表面脫落，在上述體外培養(yǎng)物的上清液中是容易地可測量的，并且被用作分化的替代標(biāo)記。

具體而言，例如，將來自NTX腫瘤CR33的2,000個細(xì)胞分選至無血清培養(yǎng)基條件下的平底96孔Primaria平板(BD Biosciences)中并且在上文所述的環(huán)境條件中孵育。在21天之后，排列密集的貼壁細(xì)胞集落(定義為每個集落>50個細(xì)胞)已經(jīng)在孔中形成和擴(kuò)增。手工計(jì)數(shù)每個孔中的集落數(shù)(白色欄)并且通過ELISA測量上清液中的CD66c蛋白的濃度(黑色欄)(圖16B)。集落形成的頻率很好地相應(yīng)于體內(nèi)觀察到的致瘤細(xì)胞的頻率。也就是說，CD46^-/lo細(xì)胞(即NTG細(xì)胞)僅產(chǎn)生單個集落(1/2,000個細(xì)胞頻率)并且盡管培養(yǎng)了21天，但在培養(yǎng)基中未檢測到可溶性CD66c蛋白(圖16B)。正如CD46^hi CD324^-細(xì)胞很少展示體內(nèi)腫瘤引發(fā)潛能，我們觀察到小數(shù)目的體外集落并且在培養(yǎng)基中檢測到相對低水平的CD66c。鑒于在許多NTX腫瘤中的CD46^hi CD324^-細(xì)胞亞群表達(dá)CD66c并且這些細(xì)胞通常顯得是短壽命的，這不令人驚訝。此外，CD46^hi CD324⁺細(xì)胞，無論是否表達(dá)CD66c，能夠比CD46^-/lo或CD46^hiCD324^-腫瘤細(xì)胞亞群更好地形成體外集落并且產(chǎn)生顯著更可溶的CD66c(圖16B)。另外，在上清液中產(chǎn)生的CD66c的量顯得與集落數(shù)相關(guān)，表明最初接種至孔內(nèi)的CD66⁺和CD66^-細(xì)胞群兩者都能夠產(chǎn)生CD66c。這與CD66c^-細(xì)胞能夠生CD66c⁺細(xì)胞的觀察結(jié)果一致，如上文在體內(nèi)證明的。

集落形成可以用作體內(nèi)移植的替代物和確定TIC是否相對于另一個腫瘤細(xì)胞亞群而存在于一個腫瘤細(xì)胞亞群中，并且通常能夠評定候選干細(xì)胞群和祖細(xì)胞群的潛能。然而，即使最好的體外細(xì)胞培養(yǎng)條件也不能模擬體內(nèi)遇到的生理環(huán)境。此外，這些無血清培養(yǎng)條件通常支持自我更新并阻止分化，但是并不積極地促進(jìn)分化。

為了更好地評定具有上述定義的細(xì)胞表面表型的單個細(xì)胞的分化潛能，調(diào)整培養(yǎng)基條件以便含有10％胎牛血清(FCS)，從而積極促進(jìn)分化，如本領(lǐng)域中常見的。在14天后，移除培養(yǎng)基并且通過ELISA評定上清液中的CD66c的量。雖然在來自CD46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞的培養(yǎng)基中預(yù)期了升高水平的CD66c，但是CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞能夠體外產(chǎn)生相似水平CD66c的事實(shí)與CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞可以分化成CD46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞的觀念是一致的(圖16C)。在如上文所述的支持自我更新的培養(yǎng)基條件下(即在定義的、無血清的培養(yǎng)基中)的擴(kuò)增顯得不支持穩(wěn)健的CD66c產(chǎn)生；然而，添加FCS至這種培養(yǎng)基促進(jìn)了分化并大大輔助了細(xì)胞產(chǎn)生CD66c的能力。鑒于上文證明CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞經(jīng)常是具有自我更新能力的唯一腫瘤細(xì)胞亞群(通過連續(xù)移植證明的)，這或許并不令人驚訝，具有體外最大CD66c產(chǎn)生潛能的腫瘤細(xì)胞亞群也是CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞。雖然鑒于接種至孔中的細(xì)胞呈CD66c蛋白表達(dá)陰性，并且這個細(xì)胞群的Taqman qRT PCR分析顯示很少存在甚至不存在CD66c轉(zhuǎn)錄物(數(shù)據(jù)未顯示)，這個結(jié)果出乎意料，這些結(jié)果證實(shí)了體內(nèi)觀察結(jié)果，其證明CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞最具增殖和分化潛能。這還暗示了體外鋪板CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞產(chǎn)生了表達(dá)CD66c的子代，并且通過促進(jìn)分化的細(xì)胞生長條件增強(qiáng)了這個過程。

如上文所述，不僅用NTX結(jié)直腸癌細(xì)胞而且用胰腺癌TIC觀察到通過添加FCS誘導(dǎo)了體外TIC分化。在具有或沒有血清情況下培養(yǎng)胰腺異種移植腫瘤細(xì)胞十四天之后，在其中存在FCS的條件下，相對于NTX PA14和PA20腫瘤細(xì)胞兩者，CD46^hi細(xì)胞(也主要是CD324⁺)的百分比下降了(圖16D)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持使用CD46和CD324作為體外區(qū)分較少分化和較多分化的NTX衍生的胰腺癌細(xì)胞之間的標(biāo)記，并且支持以下主張：這些標(biāo)記可能起到在幾種上皮腫瘤類型中的TIC與NTG細(xì)胞之間進(jìn)行區(qū)分的作用。

這個實(shí)例顯示，將TIC亞群(例如，TPC和TProg)可以基于它們引發(fā)集落、分化和產(chǎn)生通常與分化細(xì)胞相關(guān)的蛋白質(zhì)的能力而進(jìn)行體外區(qū)分。而且，也可以開發(fā)沒有或具有FCS的促進(jìn)分化的培養(yǎng)條件。

實(shí)例6

結(jié)直腸和胰腺腫瘤起始細(xì)胞相對抵抗標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理化學(xué)治療劑

癌干細(xì)胞范例的中心原則是CSC通常抵抗標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理治療方案，如化學(xué)療法和放射。為了評定哪種結(jié)直腸和胰腺腫瘤細(xì)胞亞群分別最抵抗標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理方案如依立替康或吉西他濱，將小鼠用結(jié)直腸腫瘤或胰腺NTX腫瘤再引發(fā)，并且一旦腫瘤達(dá)到大約180-350mm³就進(jìn)行隨機(jī)化。然后小鼠分別接受每周兩次腹膜內(nèi)給予15mg/kg依立替康或25mg/kg吉西他濱持續(xù)大約20天的時間，此后，使它們安樂死以便切除腫瘤和細(xì)胞分析。

為了評定腫瘤細(xì)胞亞群的化學(xué)抗性，將荷NTX結(jié)直腸腫瘤的小鼠的體內(nèi)同期組群隨機(jī)分成兩個組，使得每個組的平均腫瘤體積是大致相等的。然后這些組用15mg/kg依立替康或等體積載體緩沖液治療，每周兩次。每次注射之前一天，監(jiān)測腫瘤體積和動物健康并且記錄，每周兩次。在結(jié)直腸腫瘤的情況下，載體治療的腫瘤繼續(xù)生長，而依立替康治療的腫瘤顯示生長阻滯或體積減小(圖17A)。當(dāng)依立替康治療的小鼠中腫瘤開始減小體積時，使這個實(shí)驗(yàn)中的所有小鼠安樂死并且將腫瘤收獲、解離成單細(xì)胞懸液，并且使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)通過流式細(xì)胞術(shù)分析它們單獨(dú)的細(xì)胞表型。與鹽水治療的對應(yīng)物相比，確定在活的人細(xì)胞中具有TPC表型(CD46^hi CD324⁺CD66c^-)的細(xì)胞的頻率比來自依立替康治療小鼠的腫瘤中高2.5倍以上(圖17B和17C)。這表明，具有TPC表型(CD46^hi CD324⁺CD66c^-)的細(xì)胞抵抗依立替康誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，而其他腫瘤細(xì)胞亞群死于依立替康。另外，在載體治療的腫瘤的CD46^hi CD324⁺群體中，大多數(shù)殘余細(xì)胞為CD66c⁺；然而，在依立替康治療的小鼠的CD46^hiCD324⁺群體中，大多數(shù)殘余細(xì)胞為CD66c^-(即，TPC或CSC)(圖17D)。這些數(shù)據(jù)表明，具有TPC表型(即CD46^hi CD324⁺CD66c^-)的細(xì)胞比其他腫瘤細(xì)胞亞群更抵抗依立替康誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，其中所述其他腫瘤細(xì)胞亞群包括TIC(即CD46^hi CD324⁺CD66c⁺)的TProg子集和NTG細(xì)胞兩者。

在代表性胰腺NTX腫瘤中觀察到類似結(jié)果，其中在吉西他濱治療過程期間摘除殘余的胰腺NTX腫瘤并且將殘余的腫瘤細(xì)胞亞群基于們的標(biāo)記表型進(jìn)行分析。正如預(yù)期的，來自載體治療小鼠的胰腺腫瘤繼續(xù)生長而不減弱，而來自用吉西他濱治療的小鼠的腫瘤響應(yīng)于這種化學(xué)治療劑而體積減小(圖18A)。然后解離收獲的腫瘤并且通過流式細(xì)胞術(shù)分析組成性單個細(xì)胞。如用依立替康治療的結(jié)直腸癌NTX腫瘤中所觀察的，吉西他濱治療導(dǎo)致表達(dá)指示TIC的標(biāo)記(例如CD46)的腫瘤細(xì)胞的富集。載體相對于吉西他濱治療的腫瘤中的CD46表達(dá)的代表性實(shí)例顯示于圖18B中。與結(jié)直腸癌一樣，胰腺TIC顯得相對抵抗標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理化學(xué)治療劑吉西他濱。

在此我們證明，并非所有腫瘤細(xì)胞亞群都同樣地對護(hù)理化學(xué)治療劑如依立替康或吉西他濱敏感或抵抗。而且，在結(jié)直腸癌中，我們證明雖然TPC和TProg均是致瘤的，TPC(即CSC)對化學(xué)療法是更抵抗的。我們的精確鑒定最致瘤的化學(xué)抗性腫瘤亞群的能力促進(jìn)了與致瘤性和化學(xué)抗性相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的鑒定，并且因此將使得能夠鑒定具有重大診斷和/或治療效用的基因/蛋白質(zhì)。

實(shí)例7

提出的在結(jié)直腸腫瘤內(nèi)的細(xì)胞層次

如上文討論的，將TProg歸類為TIC亞群，這部分地歸因于它們在小鼠中產(chǎn)生腫瘤的有限能力。TProg是TPC的子代并且典型地能夠進(jìn)行有限數(shù)目的非自我更新性細(xì)胞分裂。而且，在造血細(xì)胞層次中存在例如幾種不同祖細(xì)胞群的先例，所述祖細(xì)胞群維持多譜系分化潛能，但是在面臨決定細(xì)胞命運(yùn)之前具有不同的增殖能力。造血系統(tǒng)中的祖細(xì)胞的代表性實(shí)例是短期重建性造血干細(xì)胞(ST-HSC)和多能祖細(xì)胞(MPP)。雖然這兩種細(xì)胞群都可以完全重建造血系統(tǒng)，但是二者都不能無限地重建(即，它們?nèi)狈φ鎸?shí)干細(xì)胞固有的自我更新能力)并且相比于MPP(是ST-HSC的子代)，ST-HSC可以這樣做較長的時間。雖然在實(shí)體組織和起源于這些組織的腫瘤兩者中的細(xì)胞的層次定義不清楚，但是細(xì)胞層次可能存在于許多器官和腫瘤內(nèi)，其中不同的細(xì)胞亞群擁有不同的增殖和分化潛能。我們在此首次證明，TProg不僅可以在結(jié)直腸癌內(nèi)作為TIC子集存在，TProg細(xì)胞還可以是進(jìn)一步細(xì)分成早期腫瘤祖細(xì)胞(ETP)和晚期腫瘤祖細(xì)胞(LTP)。這些對應(yīng)的TProg細(xì)胞群的每一個可以通過表型(例如，細(xì)胞表面標(biāo)記)和它們逐漸更小的增殖能力和分化潛能來區(qū)分，并且因此它們的重演某種腫瘤結(jié)構(gòu)的總能力的不同的。

如在圖19A和圖19B中所示，上述體內(nèi)和體外數(shù)據(jù)，連同腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，支持以下假設(shè)：在存在顯著分化能力和制定這些分化程序的能力的腫瘤中，TPC可以反映例如正常結(jié)腸干細(xì)胞的身份，其中我們在此提出所述正常結(jié)腸干細(xì)胞具有身份ESA⁺CD46^hiCD324⁺CD66c^-CD24⁺CD34^-。在此我們已經(jīng)證明，幾乎所有的結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞為ESA⁺CD24⁺CD34^-，并且因此這些標(biāo)記在鑒定腫瘤細(xì)胞亞群中發(fā)揮很小的效用。我們進(jìn)一步證明，CD46^hiCD324⁺CD66c^-細(xì)胞能夠產(chǎn)生部分地由CD46^hi CD324⁺CD66c^-和CD66c⁺細(xì)胞組成的完全異質(zhì)性腫瘤，因而雖然CD46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞是致瘤性的，它們不具有產(chǎn)生CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞的能力并且不能通過連續(xù)移植高效地促進(jìn)腫瘤生長。這些數(shù)據(jù)，連同以下觀察結(jié)果：具有a)連續(xù)移植后一致地產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤的能力；b)大部分集落形成細(xì)胞潛能；和c)體外產(chǎn)生CD66c細(xì)胞和蛋白質(zhì)的潛能的細(xì)胞是CD46^hi CD324⁺CD66c^-，支持以下假設(shè)：CD46^hi CD324⁺CD66c⁺細(xì)胞是具有受限增殖能力和潛能的CD46^hi CD324⁺CD66c^-細(xì)胞的子代。體內(nèi)致瘤性、體外集落形成潛能的進(jìn)一步降低以及當(dāng)細(xì)胞喪失CD324表達(dá)時產(chǎn)生CD66c的能力的降低，支持以下假設(shè)：CD46^hi CD324^-CD66⁺細(xì)胞代表具有某種殘余增殖能力(如有時已經(jīng)證明的那樣)但是通常沒有自我更新能力的晚期腫瘤祖細(xì)胞群(LTP)。最后，支持在圖19A中展示的細(xì)胞層次，CD46^-細(xì)胞也是CD324^-的并且通常也是CD66c^-的。這些NTG細(xì)胞可能代表終末分化的子代，所述子代在結(jié)腸中包括分泌譜系的杯狀細(xì)胞(G)和腸內(nèi)分泌(eE)細(xì)胞或者吸收譜系的腸細(xì)胞(E)。分離的細(xì)胞亞群的基因表達(dá)支持這種假設(shè)，因?yàn)镃D46^-細(xì)胞表達(dá)許多基因，這些基因歸屬于終末分化的分泌性和/或吸收性細(xì)胞類型(例如MUC2和MUC20；圖20A)。

以上實(shí)例出人意料地記錄了多種腫瘤起始細(xì)胞群的存在，所述腫瘤起始細(xì)胞群以當(dāng)它們植入小鼠中時產(chǎn)生腫瘤的不同能力為特征并且與獨(dú)特標(biāo)記表型相關(guān)。而且，離散的TIC亞群在它們自我更新和完全重建腫瘤的能力方面不同。腫瘤永存細(xì)胞(TPC)，如它們在此被定義的，在它們展示的自我更新能力方面滿足癌干細(xì)胞(CSC)的主流定義，如通過用小數(shù)目良好定義的細(xì)胞的連續(xù)移植和產(chǎn)生的腫瘤異質(zhì)性的分析所檢驗(yàn)的。相反，雖然在原發(fā)性移植物中致瘤，腫瘤祖細(xì)胞(TProg)與真實(shí)的TPC或CSC不同，因?yàn)樗鼈冿@得缺乏自我更新能力并且它們的分化潛能有時可能受到限制。以上實(shí)例也證明，存在著具有逐漸降低的增殖和分化潛能的離散TProg細(xì)胞群：ETP和LTP。在癌癥情況下的這些細(xì)胞的身份的知識、以及可能正常的組織生物學(xué)，促進(jìn)它們用于鑒定具有診斷和治療效用的蛋白質(zhì)和分子。如在圖19A和圖19B中圖解和在本披露中記錄的，包含致瘤性細(xì)胞群和NTG細(xì)胞群的異質(zhì)性腫瘤提供了TPC，其子代從CD46^hi CD324⁺CD66c^-表型演進(jìn)以獲得CD66c(取得ETP身份)的表達(dá)并且最終喪失CD324的表達(dá)(LTP表型)。最后，末端分化明顯地伴隨CD66c和CD46的同時喪失。

實(shí)例8

從富集的腫瘤起始細(xì)胞群鑒定有希望的診斷靶標(biāo)和治療靶標(biāo)

例如，建立的結(jié)直腸NTX腫瘤系SCRx-CR4如在實(shí)例1中所述被傳代并且用來在免疫低下小鼠中引發(fā)腫瘤。一旦平均腫瘤負(fù)荷達(dá)到約300mm³，將小鼠隨機(jī)化并且用15mg/kg依立替康或載體對照(PBS)治療，每周兩次，持續(xù)至少二十天時間，之后將它們處死。然后移出腫瘤，并且通常使用在實(shí)例2中展示的技術(shù)分別分離TPC、TProg和NTG細(xì)胞。更具體地說，通過FACS分離細(xì)胞群并且立即使其沉淀，然后在Qiagen RLTplus RNA裂解緩沖液(Qiagen公司)中裂解。然后將裂解物貯存在-80℃直至使用。在融化后，使用Qiagen RNeasy分離試劑盒(Qiagen公司)遵循供應(yīng)商的說明書提取總RNA，并且在Nanodrop(Thermo Scientific)和生物分析儀2100(安捷倫公司(Agilent))上再次使用供應(yīng)商的操作方案和推薦的儀器設(shè)置進(jìn)行定量。所得到的總RNA制劑適合于基因測序和分析。

從載體或依立替康治療的小鼠制備如從上文所述分離的對應(yīng)細(xì)胞群獲得的總RNA樣品，用于使用Applied Biosystems SOLiD 3.0(通過寡核苷酸連接/檢測測序)下一代測序平臺(Life Technologies)，以每份樣品≥5ng總RNA開始，進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序。由SOLiD平臺產(chǎn)生的從人基因組中映射至34,609個基因的數(shù)據(jù)能夠檢測感興趣的轉(zhuǎn)錄物，連同可驗(yàn)證的在所有樣品中的轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平的測量值。

通常，SOLiD3下一代測序平臺能夠平行地對與磁珠連接的克隆擴(kuò)增的RNA/DNA片段進(jìn)行測序。通過用染料標(biāo)記的寡核苷酸連接的測序然后將被用來產(chǎn)生每個片段的50個堿基讀碼，所述片段存在于樣品中，其中每份樣品總計(jì)多于5千萬個讀碼，產(chǎn)生基因組中蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄物表達(dá)水平的精確得多的表示。僅僅基于讀碼覆蓋率(唯一映射至基因組位置的讀數(shù))，SOLiD3平臺不僅能夠捕獲表達(dá)，而且還有SNP、已知的和未知的可變剪接事件、以及潛在新的外顯子發(fā)現(xiàn)。因此，這種下一代平臺的使用允許確定轉(zhuǎn)錄物水平表達(dá)的差異以及表達(dá)的那些mRNA轉(zhuǎn)錄物的特定剪接變體的差異或優(yōu)先性。而且，以使用來自Applied Biosystems的改良的全轉(zhuǎn)錄組操作方案的SOLiD3平臺進(jìn)行分析僅僅需要大約5ng的預(yù)擴(kuò)增原料。這對于從分選的細(xì)胞群提取總RNA是有意義的，其中TPC細(xì)胞子集例如在數(shù)目上大大小于NTG或本體腫瘤并且因此產(chǎn)生很少量的可用原料。

來自SOLiD3平臺的一式二份運(yùn)行測序數(shù)據(jù)被標(biāo)準(zhǔn)化并且轉(zhuǎn)換，然后計(jì)算疊合率(fold ratio)，正如標(biāo)準(zhǔn)工業(yè)實(shí)踐一樣。以這種方式，測量了在分離自SCRx-CR4腫瘤的NTG細(xì)胞(白色)、TProg(灰色)和TPC(黑色欄)中的轉(zhuǎn)錄物基因表達(dá)水平(表示為每百萬個映射至外顯子的讀碼；RPM_Exon)。以這種方式分析完整轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定到幾種蛋白質(zhì)和潛在的目的治療靶，包括APCDD1、Notum、REG1A和CD46剪接變體。數(shù)據(jù)分析顯示，相比于在載體和依立替康治療的小鼠中的NTG細(xì)胞中的表達(dá)，這些感興趣的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄物水平上被上調(diào)大于至少2倍(圖20A-20C)。以這種方式鑒定的有希望的診斷靶標(biāo)和治療靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的代表性實(shí)例包括NOTUM(圖20A)、APCDD1(圖20B)、示例性胰腺蛋白(圖20C)和MUC20。這些轉(zhuǎn)錄物在TPC中的表達(dá)提示，這些蛋白質(zhì)也優(yōu)選地由TPC細(xì)胞在蛋白質(zhì)水平表達(dá)(即，APCDD1)或分泌(即，示例胰腺蛋白和NOTUM)并且這些蛋白質(zhì)對于TPC維持和/或自我更新是關(guān)鍵的。同時可能鑒定由NTG細(xì)胞群(例如MUC20；圖20D)優(yōu)選表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物，所述轉(zhuǎn)錄物可以用作鑒定終末分化細(xì)胞的標(biāo)記，并且當(dāng)這樣做時促進(jìn)了陰性選擇，其中腫瘤被耗盡它們的本體腫瘤細(xì)胞群，使得可以更容易地鑒定和/或用治療方案靶向更多致瘤組分。此外，因?yàn)镹TG細(xì)胞通常比它們的TProg和TPC對應(yīng)物更多，由這些細(xì)胞群表達(dá)的蛋白質(zhì)將更容易檢測，因此用作疾病負(fù)荷和/或狀態(tài)的生物標(biāo)記。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員將進(jìn)一步理解的是，本發(fā)明可以具體化為其他特定的形式，而不脫離其精神或核心屬性。由于本發(fā)明的前述說明僅僅披露了其示例性實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)理解的是，其他變化被也被考慮為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因而，本發(fā)明不限于已經(jīng)在在此詳述的具體實(shí)施例。相反，應(yīng)當(dāng)參考所附的如指示本發(fā)明的范圍和內(nèi)容的權(quán)利要求書。