本發(fā)明涉及生物過程控制和優(yōu)化工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種基于在線監(jiān)控pH變化率的乳酸菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

目前，乳酸菌及其發(fā)酵已經(jīng)成為發(fā)酵乳制品以及其他發(fā)酵食品的核心。同時，乳酸菌中的某些菌株因其對健康有益而被冠稱為“益生菌”，在普通食品和保健食品中的應(yīng)用具有廣闊前景。近年來，我國乳酸菌市場正逐漸突破以乳酸菌/益生菌飲料為主要載體的產(chǎn)品格局，嬰幼兒奶粉、泡菜、糖果、干酪、益生菌制劑等多元化的產(chǎn)品將開拓新的市場空間。我國乳酸菌/益生菌產(chǎn)業(yè)連續(xù)3年增長率在25%以上，是快速成長的產(chǎn)業(yè)。目前全球乳酸菌/益生菌產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值為300億美元。因此，乳酸菌粉作為高附加值的生物產(chǎn)品，具有非?？捎^的社會經(jīng)濟(jì)效益和良好的生態(tài)效益。

無論是作為直投式發(fā)酵劑（direct vat set, DVS）還是作為生產(chǎn)原料的乳酸菌粉，其生產(chǎn)的最終目標(biāo)是獲得高活性的乳酸菌濃縮物。而在乳酸菌增殖培養(yǎng)過程中達(dá)到高細(xì)胞密度培養(yǎng)（high cell density cultivation, HCDC），則是制備高活性乳酸菌濃縮物的首要條件和重中之重。

高細(xì)胞密度培養(yǎng)的生產(chǎn)模式有分批、補(bǔ)料和連續(xù)發(fā)三種。目前乳酸菌的工業(yè)生產(chǎn)上，主要采用補(bǔ)料—分批培養(yǎng)技術(shù)，其核心是營養(yǎng)物質(zhì)的供給方式和最佳發(fā)酵狀態(tài)的維持，可通過控制補(bǔ)料速率使抑制產(chǎn)物濃度得到控制，從而提高細(xì)胞濃度。同時，該方法簡單、生產(chǎn)潛力高。因此，對于補(bǔ)料—分批培養(yǎng)技術(shù)，其關(guān)鍵的控制點(diǎn)在于確定補(bǔ)料時間、最高細(xì)胞密度時刻、發(fā)酵終點(diǎn)。由于培養(yǎng)液中的細(xì)胞密度達(dá)到最高值時也意味著需要對菌體進(jìn)行放罐和收集，所以最高細(xì)胞密度時刻可以認(rèn)為等同于發(fā)酵終點(diǎn)。另外，若涉及工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)酵規(guī)模逐級放大，還需要確定移種時間。近年來，補(bǔ)料—分批培養(yǎng)控制類型主要包括預(yù)設(shè)參數(shù)的非反饋控制補(bǔ)料和反饋控制補(bǔ)料。前者包括間歇補(bǔ)料、恒速補(bǔ)料、變速補(bǔ)料和指數(shù)補(bǔ)料等補(bǔ)料速率控制方法；后者為更先進(jìn)的具反饋控制系統(tǒng)的補(bǔ)料方法，可進(jìn)一步細(xì)分為間接反饋控制，包括基于溶解氧恒定、pH恒定、CO₂釋放速率和細(xì)胞濃度的間接反饋控制和基于底物濃度的直接反饋控制。

實(shí)現(xiàn)乳酸菌培養(yǎng)過程的優(yōu)化控制，充分發(fā)揮菌種的潛力，是高密度培養(yǎng)技術(shù)的最高境界。但是培養(yǎng)過程中菌株增殖的生物過程往往要涉及到成百上千個物理過程和化學(xué)反應(yīng)，菌細(xì)胞生化變量檢測的復(fù)雜性，使培養(yǎng)過程中某些重要參數(shù)遠(yuǎn)不能滿足發(fā)酵自動控制的要求。因此，乳酸菌高密度培養(yǎng)過程存在以下特征以及問題：

（1）動力學(xué)模型呈高度的非線性，一般普通菌株增殖都要經(jīng)過調(diào)整期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期（如圖1所示）。

該曲線在培養(yǎng)過程中還要受到培養(yǎng)工藝的影響，如保持pH恒定對菌株不同時期的影響不同；如補(bǔ)料造成二次對數(shù)或多次對數(shù)期，又如菌株活化接種后菌株增殖可能會躍遷過調(diào)整期直接進(jìn)入對數(shù)期等；

（2）隨著菌株或培養(yǎng)條件或發(fā)酵批次的不同，過程的動力學(xué)模型參數(shù)常常變化不定，呈現(xiàn)強(qiáng)烈的時變性特征，對于某些生物過程甚至無法用數(shù)學(xué)模型來對動力學(xué)特征進(jìn)行定量的描述；

（3）除了某些簡單的物理和化學(xué)狀態(tài)變量，如溫度、pH、壓力、氣體分壓、溶氧濃度外，絕大多數(shù)生物狀態(tài)變量（如生物量、營養(yǎng)物質(zhì)濃度、代謝產(chǎn)物濃度、生物活性等），是很難在線測量的。盡管近些年來生物電極和傳感器技術(shù)的飛速發(fā)展使得某些生物狀態(tài)的在線測量成為可能，但測量噪聲、穩(wěn)定性、苛刻的操作維護(hù)條件、價(jià)格等因素依然制約著它們在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用；

（4）最后，生物過程由于涉及到許多物理過程和化學(xué)反應(yīng)，其相互之間的作用和影響必然造就了生物過程的響應(yīng)速率慢、在線測量帶有大幅時間滯后的特征。

菌株增殖的生物過程的上述特性，使得基于線性動力學(xué)模型的傳統(tǒng)控制與優(yōu)化理論難以適應(yīng)和滿足生物過程控制與優(yōu)化的要求。

以菌株增殖為目的的高密度培養(yǎng)，生物量（biomass）是最重要也是最直接的結(jié)果指標(biāo)。目前這個指標(biāo)主要是離線檢測，最普通的離線檢測方法是細(xì)胞干重法、顯微鏡計(jì)數(shù)法、光密度法（OD）和活菌計(jì)數(shù)法。這些方法中，細(xì)胞干重法、顯微鏡計(jì)數(shù)法和光密度法都無法對菌株全細(xì)胞和菌株活細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分，所得生物量并非為有效生物量；細(xì)胞干重法和光密度法受培養(yǎng)基成分影響顯著，可靠性不穩(wěn)定。活菌計(jì)數(shù)法，即為平板計(jì)數(shù)法，雖然準(zhǔn)確性高，耗時太長，需要48-72h才能獲得計(jì)數(shù)結(jié)果。光密度法有時也可實(shí)現(xiàn)生物量的在線監(jiān)測，但是受到培養(yǎng)基濁度、熒光性、粘度、阻抗、溫度等影響和限制。例如在線激光濁度計(jì)容易受到發(fā)酵液中的氣泡對測量信號擾動，從而影響測量的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，生物量的直接在線檢測，目前尚難以在所有重要的工業(yè)化發(fā)酵過程中應(yīng)用。

同時，在實(shí)際生產(chǎn)中，離線檢測需要在線取樣。由于發(fā)酵罐在培養(yǎng)過程中處于閉封狀態(tài)，如果不斷通過取樣口取樣測定，不僅操作復(fù)雜，而且由于罐內(nèi)氣壓平衡才能出料，就必需向罐中通入空氣，這容易導(dǎo)致雜菌隨之侵入造成污染，而污染在微生物培養(yǎng)工業(yè)造成的損失和危害最為巨大。同時，對工人要求高，需要熟練地進(jìn)行繁瑣的滅菌—取樣—滅菌操作，稍有不慎就有染菌和罐內(nèi)壓力突變的風(fēng)險(xiǎn)，這些風(fēng)險(xiǎn)隨著取樣頻次的增加而增加。因此需要尋找一種新的、安全有效的參數(shù)來衡量發(fā)酵罐中菌株的增殖情況。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于在線監(jiān)控pH變化率的乳酸菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。

一種基于在線監(jiān)控pH變化率的乳酸菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)方法，具體包括如下步驟：

S1.采用裝有pH傳感器和堿液流加系統(tǒng)的發(fā)酵罐進(jìn)行乳酸菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)；

S2.培養(yǎng)過程中通過pH傳感器和堿液流加系統(tǒng)保持發(fā)酵罐中乳酸菌培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定；

S3.在步驟S2的培養(yǎng)過程中，每隔0.5h～1.0h關(guān)閉堿液流加系統(tǒng)，停止堿液流加，從而測定pH下降率，測定結(jié)束后再啟動堿液流加系統(tǒng)；

S4.根據(jù)S3所得的pH下降率的變化趨勢來判斷乳酸菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)過程中乳酸菌增殖情況，進(jìn)而判斷分批補(bǔ)料時間、過種時間和放罐時間。

優(yōu)選地，所述堿液流加系統(tǒng)為與pH設(shè)定值相關(guān)聯(lián)的自動流加堿液pH控制系統(tǒng)。

優(yōu)選地，所述堿液為25%(w/w) 氨水溶液、20～25%(w/w) NaOH溶液、20～25%(w/w) Na₂CO₃溶液或20～25%(w/w) (NH₄)₂CO₃溶液。

優(yōu)選地，所述步驟S2中的pH穩(wěn)定范圍是5.7～6.0。

優(yōu)選地，所述的乳酸菌菌株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）或動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）。

優(yōu)選地，步驟S3中pH下降率的計(jì)算公式為：

；

pH1：計(jì)時起始時培養(yǎng)液的pH；

pH2：計(jì)時結(jié)束時培養(yǎng)液的pH；

t：計(jì)時時長/min；

pH下降率：pH/min。

優(yōu)選地，步驟S4所述根據(jù)pH下降率的變化趨勢來判斷乳酸菌增殖情況是指：當(dāng)菌株增殖處于遲滯期時，菌株的pH下降率數(shù)值很低且增長緩慢；當(dāng)菌株培養(yǎng)處于對數(shù)期時，菌株的pH變化率數(shù)值較高且增長迅速。

優(yōu)選地，步驟S4所述根據(jù)所述pH下降率來判斷分批補(bǔ)料時間、過種時間和放罐時間是指：菌株在調(diào)整期時，菌株增殖緩慢，代謝速率低，利用培養(yǎng)基中的碳源少，乳酸分泌少，培養(yǎng)基中pH下降速率和幅度少，堿液補(bǔ)充量少；

本發(fā)明提供的一種基于在線監(jiān)控pH變化率的乳酸菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)方法，是基于這樣的構(gòu)思：菌株在對數(shù)期時，菌株迅速增長，代謝旺盛，迅速地利用培養(yǎng)基中的碳源和氮源進(jìn)行分裂增殖，乳酸分泌量多，培養(yǎng)基中pH下降速率和幅度均不斷增大，堿液補(bǔ)充量也隨之增快增多；在穩(wěn)定期，菌株分裂增殖數(shù)量等于衰退死亡數(shù)量，因此活細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定，總體的代謝速率以及pH下降速率穩(wěn)定；在衰亡期，活菌數(shù)量急劇下降，菌株代謝能力減弱，產(chǎn)酸能力下降，pH下降速率和幅度變小，堿液補(bǔ)充量也變少。

因此，將pH與時間參數(shù)相結(jié)合，利用最簡單的開關(guān)（on-off）控制的手段來控制，可以計(jì)算出某個時間點(diǎn)培養(yǎng)液中的乳酸菌的產(chǎn)酸情況從而反映出菌株的增殖情況和代謝活力，即pH下降速率。

更進(jìn)一步，將pH下降速率作為一種間接反饋可以用于補(bǔ)料—分批培養(yǎng)控制，通過pH下降率來判斷菌株增殖對數(shù)期和穩(wěn)定期的拐點(diǎn)來設(shè)定補(bǔ)料時間和放罐時間。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：

（1）直觀實(shí)時：①相比于活菌計(jì)數(shù)法需要48-72h，采用pH下降率的計(jì)算和監(jiān)控，可以在線實(shí)時地反映乳酸菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)過程中乳酸菌菌株的增殖情況；可以準(zhǔn)確、即時判斷補(bǔ)料時間、過種時間和放罐時間等主要工藝參數(shù)，避免因碳源不足引起菌株發(fā)生衰退，菌株活力和活菌量下降；③有效縮短培養(yǎng)時間，避免造成操作滯后帶來時耗和能耗，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。

（2）穩(wěn)定可靠：①pH傳感器已經(jīng)發(fā)展成熟，測定值不受培養(yǎng)基溫度、濁度、粘度等指標(biāo)影響，適用范圍廣；②pH和時間的測定設(shè)備和人為誤差均較小，測定值準(zhǔn)確性和可靠性均較高；③該方法反映的是活菌的代謝情況，不受已衰亡菌細(xì)胞的影響。

（3）便捷安全：①采用pH下降率的計(jì)算和監(jiān)控，跳過了以往監(jiān)控的取樣環(huán)節(jié)，可以大大降低發(fā)酵過程中取樣造成污染的風(fēng)險(xiǎn)；②同時也減少人工繁瑣的操作，更為方便。

附圖說明

圖1 菌株增殖曲線圖。

圖2 培養(yǎng)過程中活菌數(shù)及pH下降率變化曲線圖。

圖3 20L種子罐培養(yǎng)階段pH變化率。

圖4 200L發(fā)酵罐培養(yǎng)階段pH變化率。

圖5 500L種子罐培養(yǎng)階段pH變化率。

圖6 1500L發(fā)酵罐培養(yǎng)階段pH變化率。

圖7 10L厭氧發(fā)酵罐培養(yǎng)階段pH變化率。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實(shí)施例1 pH下降率與活菌數(shù)模型驗(yàn)證

以鼠李糖乳桿菌為驗(yàn)證菌株，進(jìn)行20L發(fā)酵罐的高細(xì)胞密度培養(yǎng)，保持溫度和pH恒定，在培養(yǎng)過程中測定pH下降率和活菌數(shù)，進(jìn)行對照，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，菌株增殖過程中，pH下降率與活菌數(shù)的增殖曲線在遲滯期和對數(shù)期完全吻合，符合模型設(shè)計(jì)的預(yù)期。同時，可以看到當(dāng)活菌數(shù)增殖到對數(shù)期末期時，pH下降率突降至接近于零，這是由于菌體的大量增殖，培養(yǎng)基中的碳源消耗殆盡，菌株無法產(chǎn)酸導(dǎo)致，繼續(xù)培養(yǎng)可以發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中活菌數(shù)由于營養(yǎng)匱乏而下降，因此可以由此拐點(diǎn)判斷補(bǔ)料時間或者放罐時間，達(dá)到對乳酸菌補(bǔ)料—分批高細(xì)胞密度培養(yǎng)的在線監(jiān)控。

實(shí)施例2

第一步 采用裝有pH傳感器和25%氨水自動流加系統(tǒng)的20L種子罐和200L放大發(fā)酵罐進(jìn)行植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）高細(xì)胞密度培養(yǎng)；

第二步 培養(yǎng)過程中通過pH傳感器和氨水自動流加系統(tǒng)保持發(fā)酵罐中植物乳桿菌培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定在5.7；

第三步 在第二步的培養(yǎng)過程中，每隔0.5h關(guān)閉氨水自動流加系統(tǒng)，停止氨水流加，從而測定pH下降率，測定結(jié)束后方可再次啟動堿液流加系統(tǒng)。

pH下降率的計(jì)算公式為：

；

pH1：計(jì)時起始時培養(yǎng)液的pH；

pH2：計(jì)時結(jié)束時培養(yǎng)液的pH；

t：計(jì)時時長/min；

pH下降率：pH/min；

第四步 根據(jù)第三步所得的pH下降率的變化趨勢來判斷植物乳桿菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)過程中乳酸菌增殖情況，進(jìn)而判斷分批補(bǔ)料時間、過種時間和放罐時間。最終所得的pH下降率的變化趨勢如圖3和圖4所示。

本次培養(yǎng)，共耗時12.5小時，最終活菌數(shù)1.1×10¹⁰cfu/mL，達(dá)到了高密度培養(yǎng)的要求。

實(shí)施例3

第一步 采用裝有pH傳感器和20%NaOH自動流加系統(tǒng)的500L種子罐和1500L放大發(fā)酵罐進(jìn)行鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）高細(xì)胞密度培養(yǎng)；

第二步 培養(yǎng)過程中通過pH傳感器和20%NaOH自動流加系統(tǒng)保持發(fā)酵罐中植物乳桿菌培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定在5.8；

第三步 在第二步的培養(yǎng)過程中，每隔0.5h關(guān)閉NaOH溶液自動流加系統(tǒng)，從而測定pH下降率，測定結(jié)束后方可再次啟動堿液流加系統(tǒng)。

pH下降率的計(jì)算公式為：

；

pH1：計(jì)時起始時培養(yǎng)液的pH；

pH2：計(jì)時結(jié)束時培養(yǎng)液的pH；

t：計(jì)時時長/min；

pH下降率：pH/min；

第四步 根據(jù)第三步所得的pH下降率的變化趨勢來判斷鼠李糖乳桿菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)過程中乳酸菌增殖情況，進(jìn)而判斷分批補(bǔ)料時間、過種時間和放罐時間。最終所得的pH下降率的變化趨勢如圖5和圖6所示。

本次培養(yǎng)，共耗時14小時，最終活菌數(shù)2.1×10¹⁰cfu/mL，達(dá)到了高密度培養(yǎng)的要求。

實(shí)施例4

第一步 采用裝有pH傳感器和25%NaOH自動流加系統(tǒng)的10L厭氧發(fā)酵罐進(jìn)行動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）高細(xì)胞密度培養(yǎng)；

第二步 培養(yǎng)過程中通過pH傳感器和25%NaOH自動流加系統(tǒng)保持發(fā)酵罐中動物雙歧桿菌培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定在6.0；

第三步 在第二步的培養(yǎng)過程中，每隔0.5h關(guān)閉NaOH溶液自動流加系統(tǒng)，從而測定pH下降率，測定結(jié)束后方可再次啟動堿液流加系統(tǒng)。

pH下降率的計(jì)算公式為：

；

pH1：計(jì)時起始時培養(yǎng)液的pH；

pH2：計(jì)時結(jié)束時培養(yǎng)液的pH；

t：計(jì)時時長/min；

pH下降率：pH/min；

第四步 根據(jù)第三步所得的pH下降率的變化趨勢來判斷動物雙歧桿菌高細(xì)胞密度培養(yǎng)過程中乳酸菌增殖情況，進(jìn)而判斷分批補(bǔ)料時間和放罐時間。最終所得的pH下降率的變化趨勢如圖7所示。

本次培養(yǎng)，共耗時10小時，最終活菌數(shù)5.8×10¹⁰cfu/mL，達(dá)到了高密度培養(yǎng)的要求。