本發(fā)明涉及一種熒光標(biāo)記的全氟烷基酸探針及其應(yīng)用，屬于生物分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

全氟烷基酸(Perfluoroalkyl acids,PFAAs)是一類(lèi)由完全氟化的烷基鏈和末端的極性酸性官能團(tuán)組成的化合物。由于PFAAs的C-F共價(jià)鍵具有極高化學(xué)鍵能，因此這類(lèi)化合物普遍具有非常高的穩(wěn)定性，能夠經(jīng)受強(qiáng)的熱處理、光照、化學(xué)處理、生物代謝作用而不降解。PFAAs特別的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其具有非常特殊的化學(xué)性質(zhì)：既具有疏水性也具有疏油性。因此，PFAAs被廣泛的應(yīng)用在多個(gè)工業(yè)和消費(fèi)產(chǎn)品領(lǐng)域：如紡織、造紙、不粘涂料和滅火泡沫等。目前PFAAs包含約20種化合物，具有不同碳鏈長(zhǎng)度(長(zhǎng)度為4碳至18碳)和不同極性官能團(tuán)(如磺酸鹽、羧酸鹽等)。由于PFAAs化合物的大量使用，以及其高穩(wěn)定性和易于在環(huán)境中、生物體內(nèi)富集的特點(diǎn)，PFAAs已經(jīng)成為一種全球性的新型持久性有機(jī)污染物。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明PFAAs具有多種毒性作用，包括肝毒性、內(nèi)分泌干擾作用、胚胎毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性和潛在的致癌性等。但是其毒理機(jī)制目前還不清楚，原因之一是PFAAs在生物體內(nèi)作用的靶蛋白還不明確。篩選PFAAs潛在的生物靶蛋白對(duì)于深入研究其毒理機(jī)制具有重要意義。在前期，已經(jīng)有研究人員建立了一些用于探索PFAAs在生物體內(nèi)可能的靶蛋白的方法。Wolf等(Wolf et al.,Toxicological Sciences,2008,1:162-171)通過(guò)熒光素酶表達(dá)體系證明PFAAs能夠與過(guò)氧化物酶體增殖受體(PPARs)作用。Kjeldsen等(Kjeldsen et al.,Environ Sci Pollut Res.,2013,20:8031-8044)也通過(guò)熒光素酶表達(dá)體系證明PFAAs能夠作用于雌激素受體(ER)。以上熒光素酶表達(dá)體系的方法需要在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染相應(yīng)的核受體調(diào)控的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，操作復(fù)雜，對(duì)操作人員技術(shù)要求高。而且該方法僅限于研究PFAAs與核受體類(lèi)蛋白的相互作用，不能用于研究酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等其他類(lèi)型的蛋白。Chen等(Chen et al.,Arch Toxicol.,2009,83:255-261)通過(guò)測(cè)定人血清白蛋白(HSA)內(nèi)源性熒光信號(hào)的變化，證實(shí)PFAAs能夠與HSA結(jié)合。該方法操作簡(jiǎn)便，但是只能局限于研究具有內(nèi)源性熒光信號(hào)的蛋白。而且對(duì)于一些蛋白，PFAAs與其結(jié)合并不會(huì)導(dǎo)致其內(nèi)源熒光信號(hào)變化，容易造成假陰性結(jié)果。Benninghoff等(Benninghoff et al.,Toxicological Sciences,2011,1:42-58)通過(guò)放射性標(biāo)記的雌激素探針競(jìng)爭(zhēng)法，研究PFAAs與ER的相互作用。Ren等(Ren et al.,Arch Toxicol.,2015,89:233-242)通過(guò)熒光素標(biāo)記的甲狀腺激素探針競(jìng)爭(zhēng)法，研究PFAAs與甲狀腺激素受體(TR)的結(jié)合作用。以上放射性探針和熒光探針的方法需要針對(duì)目標(biāo)蛋白設(shè)計(jì)合成特異性的探針，方法具有很大的局限性。對(duì)于一些不能得到特異性探針的蛋白，就無(wú)法采用探針競(jìng)爭(zhēng)法研究PFAAs與其相互作用。除此之外，上述各種實(shí)驗(yàn)方法只能針對(duì)性的研究PFAAs與某一種蛋白的相互作用，缺乏系統(tǒng)性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種熒光標(biāo)記的全氟烷基酸探針及其應(yīng)用，本發(fā)明熒光標(biāo)記的全氟烷基酸探針與檢測(cè)待測(cè)樣品的結(jié)合檢測(cè)方法簡(jiǎn)單有效，能建立定性定量的研究蛋白與探針結(jié)合能力的方法，本發(fā)明熒光標(biāo)記的全氟烷基酸探針能有效的用于篩選PFAAs潛在的生物靶蛋白。

本發(fā)明提供的全氟烷基酸探針為式Ⅰ所示的化合物：

R₁-L-(CF₂)_n-R₂

式Ⅰ

式Ⅰ中，R₁為產(chǎn)生熒光檢測(cè)信號(hào)的無(wú)機(jī)基團(tuán)或有機(jī)基團(tuán)；n為4～20之間的整數(shù)；L為連接R₁和(CF₂)_n的化學(xué)結(jié)構(gòu)；R₂為羧基或磺酸基。

上述的全氟烷基酸探針中，R₁可為5(6)-羧基熒光素基團(tuán)、CY3基團(tuán)或CY5基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)式分別如下式Ⅲ、式Ⅳ和式Ⅴ所示；

L為-NH-(CH₂)_m-NH-，其中m為4～6之間的整數(shù)。

上述的全氟烷基酸探針中，當(dāng)式Ⅰ所示的化合物中，R₁為5(6)-羧基熒光素基團(tuán)，n為8，m為4，R₂為羧酸基；所述全氟烷基酸探針為式Ⅱ所示的化合物：

本發(fā)明所述全氟烷基酸探針，一部分化學(xué)結(jié)構(gòu)為全氟烷基酸基團(tuán)，該部分用于結(jié)合潛在的生物靶蛋白；另一部分化學(xué)結(jié)構(gòu)為熒光信號(hào)分子，當(dāng)所述全氟烷基酸探針與靶蛋白結(jié)合后，其熒光信號(hào)分子的信號(hào)會(huì)發(fā)生改變，由此可判斷探針與蛋白的結(jié)合。

本發(fā)明所述全氟烷基酸探針的制備方法包括如下步驟：全氟二酸的一端酸性基團(tuán)進(jìn)行氨基衍生化，之后對(duì)衍生的氨基進(jìn)行熒光基團(tuán)衍生化，即得到所述全氟烷基酸探針。

本發(fā)明所述全氟烷基酸探針為式Ⅱ所示的化合物時(shí)，其制備方法包括如下步驟：

1、化合物1的制備

(1)在氬氣保護(hù)的條件下制備反應(yīng)體系1，由10g十六氟癸二酸和50mL二氯亞砜組成；

(2)在氬氣保護(hù)的條件下，向反應(yīng)體系1滴加1mL二甲基甲酰胺，得到反應(yīng)體系2；

(3)將反應(yīng)體系2在室溫條件下回流4小時(shí)；

(4)完成步驟(3)后，將過(guò)量的有機(jī)溶劑旋干，得到化合物1的粗產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(2)所示)，可直接投到下一步反應(yīng)；

2、化合物2的制備

(1)制備反應(yīng)體系3，由30mL無(wú)水二氧六環(huán)和11g化合物1粗產(chǎn)物組成；

(2)在氬氣保護(hù)的條件下，將反應(yīng)體系3用油浴加熱到50℃，攪拌條件下將芐醇的二氧六環(huán)溶液(1.5g芐醇溶解于15mL二氧六環(huán))在一小時(shí)內(nèi)緩慢滴加進(jìn)去，制備反應(yīng)體系4；

(3)完成步驟(2)后，將反應(yīng)體系4的反應(yīng)溫度升到100℃，氬氣保護(hù)下反應(yīng)20小時(shí)；

(4)反應(yīng)結(jié)束后，將體系降到室溫，減壓蒸餾去除溶劑，得到化合物2的粗產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)如圖1中的(4)所示)，可直接投到下一步反應(yīng)；

3、化合物3的制備

(1)取一個(gè)250mL的三口圓底燒瓶，制備反應(yīng)體系5，由150mL無(wú)水四氫呋喃和12g化合物2粗產(chǎn)物組成。

(2)在氬氣保護(hù)的條件下，將反應(yīng)體系5采用冰浴降溫至0℃，攪拌條件下依次將N-叔丁氧羰基-丁二胺的四氫呋喃溶液(2.5gN-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺溶解于30mL四氫呋喃)和三乙胺的四氫呋喃溶液(3.8g三乙胺溶解于30mL四氫呋喃)在半小時(shí)內(nèi)緩慢滴加進(jìn)去，制備反應(yīng)體系6，攪拌反應(yīng)2小時(shí)，在操作過(guò)程中保證體系溫度不超過(guò)5℃；

(3)將反應(yīng)體系6升溫至室溫后繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)；

(4)完成步驟(3)后，首先通過(guò)減壓蒸餾除去溶劑，然后將殘留物上樣至硅膠層析柱，再用5個(gè)柱體積的洗脫液1沖洗所述硅膠層析柱并收集柱層析后溶液，柱層析后溶液經(jīng)濃縮、干燥即為化合物3(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(6)所示)；

洗脫液1：由石油醚和乙酸乙酯按照5:1的體積比混合得到；

4、化合物4的制備

(1)制備反應(yīng)體系7，由2mL三氟乙酸、0.45g化合物3和10mL二氯甲烷組成；

(2)將反應(yīng)體系7在室溫條件下攪拌3小時(shí)；

(3)完成步驟(2)后，減壓蒸餾去除溶劑，得到化合物4(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(7)所示)，可直接投到下一步反應(yīng)；

5、化合物5的制備

(1)制備反應(yīng)體系8，由10mL二甲基亞酰胺、5mL N，N-二甲基甲酰胺、0.3g化合物4和0.1g 5(6)-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(8)所示)和46mgN，N-二異丙基乙胺組成；

(2)將反應(yīng)體系8在50℃條件下攪拌3小時(shí)，然后加入10mL蒸餾水，得到反應(yīng)體系9；

(3)向反應(yīng)體系9中加入20mL乙酸乙酯，渦旋1min，然后8000g離心10min，靜置分層，分別收集上層有機(jī)相和下層液相；

(4)向步驟(3)收集的下層液相中加入20mL乙酸乙酯，渦旋1min，然后8000g離心10min，靜置分層，分別收集上層有機(jī)相和下層液相；

(5)向步驟(4)收集的下層液相中加入20mL乙酸乙酯，渦旋1min，然后8000g離心10min，靜置分層，分別收集上層有機(jī)相；

(6)將步驟(3)收集的上層有機(jī)相、步驟(4)收集的上層有機(jī)相和步驟(5)收集的上層有機(jī)相合并濃縮干燥，即為化合物5(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(9)所示)；

6、化合物6的制備

(1)制備反應(yīng)體系10，由1mL氫氧化鋰水溶液(濃度為0.36mmol/L)、5mL甲醇、5mL四氫呋喃和0.2g化合物5組成；

(2)將反應(yīng)體系10在室溫(25℃)條件下攪拌5小時(shí)后進(jìn)行濃縮干燥，然后加入10mL蒸餾水，采用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，即為粗樣品；

(7)取粗樣品，進(jìn)行制備液相進(jìn)行分離純化，即得到所述全氟烷基酸探針為式Ⅱ所示的化合物，又稱化合物6(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(10)所示)。

本發(fā)明還提供了所述全氟烷基酸探針與待測(cè)樣品結(jié)合的檢測(cè)方法，包括如下步驟：將所述全氟烷基酸探針的溶液與待測(cè)樣品的溶液混合孵育，然后檢測(cè)經(jīng)所述孵育后上述體系的熒光偏振信號(hào)；通過(guò)所述體系的熒光偏振信號(hào)較所述全氟烷基酸探針的溶液的熒光偏振信號(hào)提高，即可得到所述全氟烷基酸探針與所述待測(cè)樣品結(jié)合。

上述的檢測(cè)方法中，所述方法中還包括將所述待測(cè)樣品的溶液濃度為橫坐標(biāo)，所述體系的熒光偏振信號(hào)為縱坐標(biāo)作圖，得到所述全氟烷基酸探針與所述待測(cè)樣品的結(jié)合曲線，計(jì)算得到所述全氟烷基酸探針與所述待測(cè)樣品的結(jié)合常數(shù)的步驟。

本發(fā)明中，具體采用Graphpad Prism軟件對(duì)所述結(jié)合曲線進(jìn)行非線性擬合。

上述的檢測(cè)方法中，所述待測(cè)樣品為蛋白質(zhì)。

上述的檢測(cè)方法中，所述蛋白質(zhì)具體可為T(mén)R、ER、PPARs和HAS中的至少一種。

本發(fā)明所述全氟烷基酸探針以游離狀態(tài)存在時(shí)，其熒光偏振信號(hào)較低，當(dāng)所述全氟烷基酸探針與蛋白結(jié)合后，其熒光偏振信號(hào)會(huì)顯著提高；通過(guò)熒光偏振信號(hào)的提高即可判斷蛋白是否與所述全氟烷基酸探針結(jié)合。

上述的檢測(cè)方法中，在混合后的溶液中，所述全氟烷基酸探針的溶液濃度可為20～150nmol/L；具體可為50nmol/L、30～100nmol/L或30～120nmol/L；

所述待測(cè)樣品的溶液的濃度可為0～20000nmol/L；具體可為0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L、2000nmol/L、5000nmol/L、10000nmol/L或20000nmol/L。

上述的檢測(cè)方法中，所述孵育的溫度為室溫；

所述孵育的時(shí)間可為3～30min，具體可為5min、3～5min、5～30min或3～20min。

本發(fā)明中，所述室溫指的是本領(lǐng)域人員公知的10～30℃。

上述的檢測(cè)方法中，采用熒光光譜儀檢測(cè)所述熒光偏振信號(hào)；

所述熒光光譜儀的檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)可為400～700nm，具體可為485nm，檢測(cè)波長(zhǎng)為420～770nm，具體可為520nm。

本發(fā)明所述全氟烷基酸探針應(yīng)用于篩選全氟烷基酸的生物靶蛋白中；所述生物靶蛋白具體可為T(mén)R、ER、PPARs和HAS中的至少一種。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供的全氟烷基酸探針通過(guò)與待測(cè)樣品結(jié)合能力檢測(cè)，能有效的用于篩選PFAAs潛在的生物靶蛋白；全氟烷基酸探針能夠模擬PFAAs與蛋白的作用模式；全氟烷基酸探針能系統(tǒng)有效的篩選多種待測(cè)樣品，無(wú)需針對(duì)某一樣品專(zhuān)門(mén)建立方法；全氟烷基酸探針的檢測(cè)為熒光檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單，且穩(wěn)定性好、無(wú)危害性；采用熒光光譜儀檢測(cè)特異熒光探針與待測(cè)樣品的結(jié)合，操作簡(jiǎn)單?？梢?jiàn)，本發(fā)明提供的方法在篩選PFAAs潛在的靶蛋白方面重要應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為制備熒光探針FITC-PFNA的化學(xué)反應(yīng)流程圖。

圖2為HPLC的檢測(cè)結(jié)果。

圖3為MS的檢測(cè)結(jié)果。

圖4為氫核磁的檢測(cè)結(jié)果。

圖5為氟核磁的檢測(cè)結(jié)果。

圖6為檢測(cè)熒光探針FITC-PFNA與人血清白蛋白HSA的結(jié)合常數(shù)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中硅膠層析柱為Merck公司產(chǎn)品，230～400目，產(chǎn)品型號(hào)為Merck Kieselgel 60；人血清白蛋白(HSA)為Sigma公司產(chǎn)品；熒光光譜儀為美國(guó)Horiba公司產(chǎn)品。

實(shí)施例1、熒光標(biāo)記的全氟烷基酸探針的制備

制備探針熒光標(biāo)記的全氟烷基酸探針(式Ⅱ所示化合物)的化學(xué)反應(yīng)流程如圖1所示。按照如下步驟制備熒光標(biāo)記的全氟烷基酸探針：

1、化合物1的制備

(1)取一個(gè)100mL的三口圓底燒瓶，在氬氣保護(hù)的條件下制備反應(yīng)體系1，由10g十六氟癸二酸和50mL二氯亞砜組成。

(2)在氬氣保護(hù)的條件下，向反應(yīng)體系1滴加1mL二甲基甲酰胺，得到反應(yīng)體系2。

(3)將反應(yīng)體系2在室溫25℃條件下回流4小時(shí)。

(4)完成步驟(3)后，將過(guò)量的有機(jī)溶劑旋干，得到化合物1的粗產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(2)所示)，可直接投到下一步反應(yīng)。

2、化合物2的制備

(1)取一個(gè)100mL的三口圓底燒瓶，制備反應(yīng)體系3，由30mL無(wú)水二氧六環(huán)和11g化合物1粗產(chǎn)物組成。

(2)在氬氣保護(hù)的條件下，將反應(yīng)體系3用油浴加熱到50℃，攪拌條件下將芐醇的二氧六環(huán)溶液(1.5g芐醇溶解于15mL二氧六環(huán))在一小時(shí)內(nèi)緩慢滴加進(jìn)去，制備反應(yīng)體系4。

(3)完成步驟(2)后，將反應(yīng)體系4的反應(yīng)溫度升到100℃，氬氣保護(hù)下反應(yīng)20小時(shí)。

(4)反應(yīng)結(jié)束后，將體系降到室溫，減壓蒸餾去除溶劑，得到化合物2的粗產(chǎn)物(結(jié)構(gòu)如圖1中的(4)所示)，可直接投到下一步反應(yīng)。

3、化合物3的制備

(1)取一個(gè)250mL的三口圓底燒瓶，制備反應(yīng)體系5，由150mL無(wú)水四氫呋喃和12克化合物2粗產(chǎn)物組成。

(2)在氬氣保護(hù)的條件下，將反應(yīng)體系5采用冰浴降溫至0℃，攪拌條件下依次將N-叔丁氧羰基-丁二胺的四氫呋喃溶液(2.5gN-叔丁氧羰基-1,4-丁二胺溶解于30mL四氫呋喃)和三乙胺的四氫呋喃溶液(3.8g三乙胺溶解于30mL四氫呋喃)在半小時(shí)內(nèi)緩慢滴加進(jìn)去，制備反應(yīng)體系6，攪拌反應(yīng)2小時(shí)。在操作過(guò)程中保證體系溫度不超過(guò)5℃。

(3)將反應(yīng)體系6升溫至室溫后繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。

(4)完成步驟(3)后，首先通過(guò)減壓蒸餾除去溶劑，然后將殘留物上樣至硅膠層析柱，再用5個(gè)柱體積的洗脫液1沖洗所述硅膠層析柱并收集柱層析后溶液，柱層析后溶液經(jīng)濃縮、干燥即為化合物3(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(6)所示)。

洗脫液1：由石油醚和乙酸乙酯按照5:1的體積比混合得到。

4、化合物4的制備

(1)制備反應(yīng)體系7，由2mL三氟乙酸、0.45g化合物3和10mL二氯甲烷組成。

(2)將反應(yīng)體系7在室溫條件下攪拌3小時(shí)。

(3)完成步驟(2)后，減壓蒸餾去除溶劑，得到化合物4(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(7)所示)，可直接投到下一步反應(yīng)。

5、化合物5的制備

(1)制備反應(yīng)體系8，由10mL二甲基亞酰胺、5mL N，N-二甲基甲酰胺、0.3g化合物4和0.1g 5(6)-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(8)所示)和46mgN，N-二異丙基乙胺組成。

(2)將反應(yīng)體系8在50℃條件下攪拌3小時(shí)，然后加入10mL蒸餾水，得到反應(yīng)體系9。

(3)向反應(yīng)體系9中加入20mL乙酸乙酯，渦旋1min，然后8000g離心10min，靜置分層，分別收集上層有機(jī)相和下層液相。

(4)向步驟(3)收集的下層液相中加入20mL乙酸乙酯，渦旋1min，然后8000g離心10min，靜置分層，分別收集上層有機(jī)相和下層液相。

(5)向步驟(4)收集的下層液相中加入20mL乙酸乙酯，渦旋1min，然后8000g離心10min，靜置分層，分別收集上層有機(jī)相。

(6)將步驟(3)收集的上層有機(jī)相、步驟(4)收集的上層有機(jī)相和步驟(5)收集的上層有機(jī)相合并濃縮干燥，即為化合物5(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(9)所示)。

6、化合物6的制備

(1)制備反應(yīng)體系10，由1mL氫氧化鋰水溶液(濃度為0.36mmol/L)、5mL甲醇、5mL四氫呋喃和0.2g化合物5組成。

(2)將反應(yīng)體系10在室溫(25℃)條件下攪拌5小時(shí)后進(jìn)行濃縮干燥，然后加入10mL蒸餾水，采用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，即為粗樣品。

(7)取粗樣品，進(jìn)行制備液相進(jìn)行分離純化，得到化合物6(結(jié)構(gòu)式如圖1中的(10)所示)，并對(duì)所得產(chǎn)物分別進(jìn)行HPLC檢測(cè)，MS檢測(cè)，氫核磁檢測(cè)和氟核磁檢測(cè)。

結(jié)構(gòu)確證如下：使用配有Waters XBridge^TMC18反相柱(2.1mm×50mm，Waters公司產(chǎn)品)的高效液相色譜儀(Agilent Technologies產(chǎn)品，型號(hào)為HP-1100)進(jìn)行檢測(cè)。流動(dòng)相由甲醇(A)和水(B)組成，流速為0.8mL/min，使用以下洗脫條件：在0～7min內(nèi)，流動(dòng)相中甲醇的體積百分含量由10％勻速增至100％，水的體積百分含量由90％勻速降至0％，進(jìn)行線性梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。HPLC的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。對(duì)采用低分辨液相-質(zhì)譜(Agilent Technologies)進(jìn)行分析。采用正電荷模式電噴射離子化對(duì)樣品進(jìn)行分析。MS的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。氫核磁的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。氟核磁的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示。

上述結(jié)果表明，從粗樣品中純化得到化合物6(圖1中的(10))，其結(jié)構(gòu)式如式Ⅱ所示，

化合物6即為本發(fā)明制備的熒光標(biāo)記的全氟烷基酸探針(又稱熒光探針FITC-PFNA)。

實(shí)施例2、熒光光譜儀檢測(cè)熒光探針FITC-PFNA與HSA的結(jié)合常數(shù)

取EP管，每管加入100μL pH7.4、50mmol/L的PBS緩沖液，本發(fā)明實(shí)施例1制備的熒光探針FITC-PFNA，和不同濃度的HSA蛋白得到檢測(cè)體系。檢測(cè)體系中，熒光探針FITC-PFNA的濃度為50nmol/L，HSA的濃度為0nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L、1000nmol/L、2000nmol/L、5000nmol/L、10000nmol/L或20000nmol/L(每個(gè)檢測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔)。檢測(cè)體系室溫孵育5min后采用熒光光譜儀對(duì)溶液的熒光偏振信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。熒光光譜儀的檢測(cè)參數(shù)條件為，485nm激發(fā)波長(zhǎng)，520nm檢測(cè)波長(zhǎng)，采用熒光偏振的檢測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)。熒光偏振檢測(cè)熒光當(dāng)熒光探針以游離狀態(tài)存在時(shí)，其熒光偏振信號(hào)較低，當(dāng)探針與蛋白結(jié)合后，其熒光偏振信號(hào)會(huì)顯著提高。通過(guò)熒光偏振信號(hào)的提高即可判斷蛋白是否與熒光探針結(jié)合。

結(jié)果如圖6所示，由圖6可知，當(dāng)檢測(cè)體系中只有熒光探針FITC-PFNA時(shí)，其熒光偏振信號(hào)約為30mP。隨著檢測(cè)體系中HSA蛋白濃度的提高，其熒光偏振信號(hào)逐漸上升，在5000nmol/L時(shí)達(dá)到360mP。將熒光偏振信號(hào)值對(duì)HSA蛋白濃度作圖，得到結(jié)合曲線。

圖6中采用GraphPad軟件對(duì)結(jié)合曲線進(jìn)行非線性結(jié)合曲線擬合，即得到熒光探針FITC-PFNA與HSA的結(jié)合常數(shù)為800nmol/L。