本發(fā)明涉及一種雜合抗菌肽突變體cam-w融合基因及其重組表達(dá)方法，具體涉及一種天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w融合基因及其重組表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antimicrobialpeptides)是一類具有抗菌活性多肽的總稱。1981年瑞典科學(xué)家boman等從惜古比天蠶(hyatophoracecropia)蛹中誘導(dǎo)分離得到一種抗菌肽，并將其命名為cecropin，中文名為天蠶素。天蠶素對(duì)革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽性菌具有很強(qiáng)的殺傷作用，而對(duì)真核細(xì)胞沒有毒性。天蠶素抗菌肽一般含有37～39個(gè)氨基酸殘基，半胱氨酸含量低，其n端區(qū)域具有強(qiáng)堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結(jié)構(gòu)，而在c端區(qū)域可形成疏水螺旋，且兩者之間由甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，多數(shù)多肽的c端被酰胺化，而酰胺化對(duì)其抗菌活性具有重要作用。
蜂毒素(melittin)是蜜蜂工蜂毒腺和副腺分泌出的具有芳香氣味的透明毒液(蜂毒)的重要組成部分，占蜂毒干重的50％以上，由26個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量2984，不含二硫鍵，是蜂毒中的主要活性物質(zhì)，具有抗菌、抗輻射和非常顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用。蜂毒素能夠抑制20～30種革蘭氏陰性及革蘭氏陽性病原微生物的發(fā)育，并能對(duì)抗對(duì)青霉素有耐藥性的金黃色葡萄球菌。蜂毒素是迄今為止人類所知的抗炎活性最強(qiáng)的物質(zhì)之一，其抗炎活性是氫化可的松的100倍。由于許多疼痛是炎癥導(dǎo)致的，因此蜂毒素在治療關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等炎性疼痛方面，具有顯著的成效。近年來的研究表明，蜂毒素還具有抑制腫瘤生長的作用，從而進(jìn)一步拓寬了蜂毒素的應(yīng)用范圍。
目前，由于抗菌肽的組成特點(diǎn)是由氨基酸組成，基本不含外源成分及化學(xué)修飾，不需要翻譯后加工修飾。因此，抗菌肽可以采取原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，但由于抗菌肽本身對(duì)宿主細(xì)胞也有一定的傷害作用，同時(shí)分子量較小的小肽也不能直接進(jìn)行表達(dá)，需要借助融合蛋白來適時(shí)封閉抗菌肽的毒性。而融合蛋白的合成，迄今為止，主要使用大腸桿菌和酵母菌作為重組技術(shù)工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的宿主菌細(xì)胞，由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)所表達(dá)的目的蛋白一般存在于細(xì)胞內(nèi)并且容易形成包涵體，這就導(dǎo)致獲得目的蛋白的后處理工藝比較復(fù)雜、成本也會(huì)比較高。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)生物合成外源蛋白周期較長，導(dǎo)致其生產(chǎn)外源蛋白的成本也較高。但是，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)合成目的蛋白的周期短、可以把目的蛋白分泌到細(xì)胞外并且不易生成包涵體，是一個(gè)比較理想的表達(dá)系統(tǒng)；而且枯草芽孢桿菌wb700為7種蛋白酶缺陷型菌株，可以在很大程度上降低分泌到細(xì)胞外的目的蛋白降解，提高目的蛋白的產(chǎn)率。利用定點(diǎn)突變技術(shù)突變特殊位點(diǎn)氨基酸產(chǎn)生的突變體eddie，能避免體內(nèi)剪切，在體外能夠增加蛋白質(zhì)的溶解性，并能夠準(zhǔn)確剪切和快速折疊，這個(gè)突變蛋白被命名為eddie。eddie蛋白來源于npro蛋白，npro蛋白是豬瘟病毒外殼蛋白的一部分，由168個(gè)氨基酸組成，它能將聯(lián)在其c端的蛋白質(zhì)準(zhǔn)確地剪切下來，而形成具有原始n端的蛋白質(zhì)；它還能在原核細(xì)菌中高效表達(dá)，其由高度疏水氨基酸組成，易形成包涵體；同時(shí)原始自我剪切蛋白npro在細(xì)胞內(nèi)也有部分自我剪切的功能，用它表達(dá)抗菌肽時(shí)會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w是近年來在天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽cam的基礎(chǔ)上經(jīng)定點(diǎn)突變而來，具有高效殺菌活性和低細(xì)胞毒性，同時(shí)具有很好的生物學(xué)穩(wěn)定性。耐高溫、耐酶解、酸堿耐受范圍也較廣，是一種綜合表現(xiàn)比較優(yōu)良的、在生物醫(yī)藥、食品防腐、畜牧業(yè)安全生產(chǎn)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用前景的抗菌肽。因此，如若能以枯草芽孢桿菌wb700為宿主，以天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w的基因與突變體eddie的基因融合，合成新的融合蛋白來封閉抗菌肽的毒性，必將產(chǎn)生良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種雜合抗菌肽突變體cam-w融合基因及其重組表達(dá)方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種雜合抗菌肽突變體cam-w融合基因，以pgj222為表達(dá)載體，以枯草芽孢桿菌wb700為宿主，以天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w的基因與豬瘟病毒外殼蛋白突變體eddie的基因融合，合成編碼edd用-cam-w融合基因的重組表達(dá)，所述eddie-cam-w融合基因的核苷酸序列如seqidno：1所示。
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進(jìn)一步，所述編碼eddie-cam-w融合基因的融合蛋白的氨基酸序列如seqidno：2所示。
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本發(fā)明進(jìn)一步解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，一種雜合抗菌肽突變體cam-w融合基因的重組表達(dá)方法，是以pgj222為表達(dá)載體，以枯草芽孢桿菌wb700為宿主，以天蠶素一蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w的基因與豬瘟病毒外殼蛋白突變體eddie的基因融合，合成編碼eddie-cam-w融合基因的重組表達(dá)。
進(jìn)一步，所述雜合抗菌肽突變體cam-w融合基因的重組表達(dá)方法，包括以下步驟：
(1)將天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w的基因與豬瘟病毒定點(diǎn)突變外殼蛋白eddie和果聚糖蔗糖酶信號(hào)肽sacb基因融合，合成編碼sacb-eddie-cam-w融合蛋白的融合基因；
(2)用限制性內(nèi)切酶ecori和saci對(duì)sacb-eddie-cam-w融合蛋白的基因進(jìn)行雙酶切，并與用同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的表達(dá)載體pgj222質(zhì)粒連接，構(gòu)建一種可以自我裂解釋放出有生物學(xué)活性抗菌肽蛋白的表達(dá)載體pdm031；
(3)將大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pdm031轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α菌株，獲得重組大腸桿菌ewd31菌株，并擴(kuò)增質(zhì)粒pdm031；
(4)將在大腸桿菌dh5α菌株中擴(kuò)增后的pdm031轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌wb700菌株，獲得可以向胞外表達(dá)eddie-cam-w融合蛋白的重組枯草芽孢桿菌bwd31菌株；
(5)通過在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組bwd31菌株并使用5％麥芽糖誘導(dǎo)，獲得分泌到細(xì)胞外的eddie-cam-w融合蛋白。
進(jìn)一步，步驟(1)中，在eddie的dna序列n-末端連上親和層析純化的sacb的dna序列，在其c-末端連上cam-w的dna序列，并在整個(gè)融合dna序列的5’端和3’端分別加上ecori和saci酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)堿基。
進(jìn)一步，步驟(5)中，將重組枯草芽孢桿菌bwd31菌株在固體培養(yǎng)基上的單克隆子，接種到含有5μg/ml氯霉素50μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃、225rpm/min條件下培養(yǎng)10～12h；然后以5％的比例轉(zhuǎn)接到上述含雙抗培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm/min條件下培養(yǎng)至菌液od值到1.5～2.0之間，5％麥芽糖誘導(dǎo)12～24h；收集、離心并過濾菌液；通過eddie蛋白的自切割功能，即可獲得天蠶素一蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w的粗蛋白液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下預(yù)想不到的技術(shù)效果：
(1)本發(fā)明通過豬瘟病毒定點(diǎn)突變外殼蛋白eddie與抗菌肽cam-w基因融合，以借助eddie蛋白封閉抗菌肽cam-w的毒性，使融合蛋白的毒性減弱，蛋白表達(dá)量明顯提高；同時(shí)可在細(xì)胞外通過eddie自切割功能的釋放出有生物學(xué)活性的cam-w。
(2)本發(fā)明的抗菌肽cam-w的重組融合表達(dá)可促使重組蛋白胞內(nèi)區(qū)域化，降低對(duì)酶解的敏感性。
(3)本發(fā)明重組表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建簡(jiǎn)單方便，成本低，可為在醫(yī)藥、獸藥、水產(chǎn)、飼料添加劑等產(chǎn)業(yè)取代抗生素奠定了基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明制備的天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w蛋白純度可達(dá)到80％以上。
附圖說明
圖1為抗菌肽cam-w表達(dá)工藝相關(guān)節(jié)點(diǎn)的tricine-sds-page分析及westernblot驗(yàn)證圖。其中，(a)胞外總蛋白tricine-sds-page分析圖，泳道1為蛋白marker，泳道2為重組枯草芽孢桿菌bwd31未經(jīng)5％麥芽糖誘導(dǎo)的發(fā)酵液上清里的總蛋白，泳道3為重組枯草芽孢桿菌bwd31經(jīng)5％麥芽糖誘導(dǎo)后發(fā)酵液上清里的總蛋白；(b)eddie的westernblot檢測(cè)圖，泳道1為為重組枯草芽孢桿菌bwd31未經(jīng)5％麥芽糖誘導(dǎo)的發(fā)酵液上清總蛋白的eddie抗體檢測(cè)情況，泳道2為重組枯草芽孢桿菌bwd31經(jīng)5％麥芽糖誘導(dǎo)后發(fā)酵液上清總蛋白eddie抗體檢測(cè)情況；(c)cam-w的westernblot檢測(cè)圖，泳道1為為重組枯草芽孢桿菌bwd31未經(jīng)5％麥芽糖誘導(dǎo)的發(fā)酵液上清總蛋白cam-w抗體檢測(cè)情況，泳道2為重組枯草芽孢桿菌bwd31經(jīng)5％麥芽糖誘導(dǎo)后發(fā)酵液上清總蛋白的cam-w抗體檢測(cè)情況。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步加以說明。
cam-w的基因，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭表達(dá)載體pgj222，購自金艮生物科技(北京)有限公司；宿主細(xì)胞枯草芽孢桿菌wb700菌株，購自金艮生物科技(北京)有限公司。
實(shí)施例1：天蠶素一蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w蛋白的制備
1、融合蛋白sacb-eddie-cam-w基因的人工合成
根據(jù)枯草芽孢桿菌的偏愛密碼子優(yōu)化豬瘟病毒定點(diǎn)突變外殼蛋白(eddie)、天蠶素一蜂毒素雜合抗菌肽突變體(cam-w)和果聚糖蔗糖酶信號(hào)肽(sacb)的基因序列，采用固相亞磷酰胺三脂法合成如下片段：在eddie的dna序列n-末端連上親和層析純化的sacb的dna序列；在其c-末端連上cam-w的dna序列；并在整個(gè)融合dna序列的5’端和3’端分別加上ecori和saci酶切位點(diǎn)及相應(yīng)保護(hù)堿基。合成的eddie-cam-w融合基因的核苷酸序列為：
atgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggca；
編碼eddie-cam-w融合基因的融合蛋白的氨基酸序列為：
mnikkfakqatvltfttallaggatqafahhhhhhmelnhfellyktnkqkpvgveepvydttg。
2、pgj222-sacb-eddie-cam-w(pdm031)表達(dá)載體的構(gòu)建
用限制性內(nèi)切酶ecori和saci對(duì)人工合成的sacb-eddie-cam-w融合蛋白的基因進(jìn)行雙酶切，并與用同樣限制性內(nèi)切酶雙酶切的表達(dá)載體pgj222質(zhì)粒連接，構(gòu)建一種可以自我裂解釋放出有生物學(xué)活性抗菌肽蛋白的表達(dá)載體pgj222-sacb-eddie-cam-w(pdm031)。
3、表達(dá)cam-w的重組枯草芽孢桿菌bwd31的獲取
將大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pdm031轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5d菌株，獲得重組大腸桿菌ewd31菌株，并擴(kuò)增質(zhì)粒pdm031；將在大腸桿菌dh5α菌株中擴(kuò)增后的pdm031轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌wb700菌株，獲得可以向胞外表達(dá)eddie-cam-w融合蛋白的重組枯草芽孢桿菌bwd31菌株。
4、雜合抗菌肽cam-w的獲得
(1)發(fā)酵種子液制備：將重組枯草芽孢桿菌bwd31菌株在固體培養(yǎng)基上的單克隆子，接種到含有5μg/ml氯霉素50μg/ml壯觀霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃、225rpm/min條件下培養(yǎng)12h；
(2)發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)：以5％的比例轉(zhuǎn)接到上述含雙抗培養(yǎng)基中，在30℃、200rpm/min條件下培養(yǎng)至菌液od值到1.5～2.0之間，5％麥芽糖誘導(dǎo)12～24h；收集、離心并過濾菌液；
(3)獲得抗菌肽cam-w：通過eddie蛋白的自切割功能，即可獲得天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w的粗蛋白液。
5、發(fā)酵液中cam-w含量分析
將cam-w粗蛋白液進(jìn)行tricine-sds-page分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和bandscan軟件分析，見圖1。由此證實(shí)實(shí)施例1制備的天蠶素-蜂毒素雜合抗菌肽突變體cam-w蛋白含量可達(dá)到80％以上。