本發(fā)明屬于細(xì)胞免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高增值、高細(xì)胞毒性的人GD-CIK細(xì)胞的專用試劑盒。

背景技術(shù)：

由于腫瘤的危害性，對(duì)抗腫瘤的研究已經(jīng)擴(kuò)展到將腫瘤細(xì)胞作為特定靶點(diǎn)的針對(duì)性治療，在腫瘤免疫治療中，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer cells,CIK)回輸治療也就成為一種有效的細(xì)胞免疫治療的手段。

CIK細(xì)胞是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，其能夠分泌較多的Th1類細(xì)胞因子，如IL-12、IFN-γ等，以調(diào)節(jié)體內(nèi)其他細(xì)胞因子的分泌以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)CIK殺傷作用的敏感性，起到抑制腫瘤和殺傷腫瘤的作用。CIK細(xì)胞可以在體外用人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過抗CD3單抗、多種細(xì)胞因子共孵育后培養(yǎng)獲得，主要表達(dá)CD3⁺CD56⁺T細(xì)胞抗原，具有非主要組織相容性復(fù)合體(MHC)限制性的特點(diǎn)，且增殖力強(qiáng)、殺瘤活性高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能夠培養(yǎng)出以CD3⁺CD56⁺T淋巴細(xì)胞為主效應(yīng)細(xì)胞的人GD-CIK細(xì)胞制備的專用試劑盒。

該試劑盒由淋巴細(xì)胞分離液、免疫細(xì)胞無動(dòng)物源培養(yǎng)基、重組人IFN-γ、重組人IL-2、重組人IL-1α、抗CD3單抗、抗CD28單抗、慶大霉素硫酸鹽注射液、GD因子組成。

作為優(yōu)選，所述淋巴細(xì)胞分離液為Ficoll淋巴細(xì)胞分離液，規(guī)格為500ml。

作為優(yōu)選，所述免疫細(xì)胞無動(dòng)物源培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，規(guī)格為2L×2。

作為優(yōu)選，所述重組人IFN-γ的規(guī)格為100μg×2，使用中溶劑為RPMI-1640 培養(yǎng)基，使用終濃度為50ng/ml。

作為優(yōu)選，所述重組人IL-2的規(guī)格為100μg×2，使用中溶劑為RPMI-1640培養(yǎng)基，使用終濃度為100ng/ml。

作為優(yōu)選，，所述重組人IL-1α的規(guī)格為100g×2，使用中溶劑為RPMI-1640培養(yǎng)基，使用終濃度為10ng/ml。

作為優(yōu)選，所述抗CD3單抗的規(guī)格為100μg×2，使用中溶劑為RPMI-1640培養(yǎng)基，使用終濃度為10ng/ml。

作為優(yōu)選，所述抗CD3單抗的規(guī)格為100μg×2，使用中溶劑為RPMI-1640培養(yǎng)基，使用終濃度為10ng/ml。

作為優(yōu)選，所述慶大霉素硫酸鹽注射液的規(guī)格為1ml×2，使用中溶劑為RPMI-1640培養(yǎng)基，使用終濃度為1ml/L。

作為優(yōu)選，所述GD因子的規(guī)格為2mg，使用中溶劑為PAA^TM培養(yǎng)基、GT-T551^TM培養(yǎng)基、Opti-MEM^TM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基中的任意一種，使用終濃度為1μg/ml。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種高增值、高細(xì)胞毒性的人GD-CIK細(xì)胞的制備方法。該方法為按照專屬試劑盒的操作說明書要求并補(bǔ)加5％-10％自體血漿的條件下，以CD3⁺CD56⁺T淋巴細(xì)胞為主效應(yīng)細(xì)胞，達(dá)到50％以上。與K562細(xì)胞共培養(yǎng)18小時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷活性可達(dá)90％以上。

本發(fā)明的高增值、高細(xì)胞毒性的人GD-CIK細(xì)胞制備的專用試劑盒選擇性強(qiáng)，可以從人PBMCs中誘導(dǎo)處以CD56T細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞群體。用該高增值、高細(xì)胞毒性的人GD-CIK細(xì)胞制備的專用試劑盒獲得的人GD-CIK細(xì)胞能夠直接配合傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療等治療方式進(jìn)行體內(nèi)回輸，直接用于癌癥病人的治療，可達(dá)到常規(guī)療法清除大量腫瘤細(xì)胞后，進(jìn)行清除少量殘留或擴(kuò)散的腫瘤細(xì)胞，以提高、鞏固腫瘤治療效果，減少復(fù)發(fā)，改善患者生活質(zhì)量。

本發(fā)明中的GD因子是一種Toll樣受體7的配體，而Toll樣受體(TLRs)是存在于不同類型細(xì)胞上的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)， PAMPs是病原體保守結(jié)構(gòu)分子，和宿主的其他分子模式有很大區(qū)別，當(dāng)病原體侵襲宿主時(shí)，機(jī)體啟動(dòng)針對(duì)病原體相應(yīng)免疫程序，從而抵抗外來病原體侵襲而不影響宿主。這種模式識(shí)別機(jī)制是機(jī)體抵抗病原菌的第一道“特異性”屏障，而Toll樣受體7在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用。

本發(fā)明所用的合成小分子Toll樣受體7的配體GD具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、低毒性以及低成本等優(yōu)點(diǎn)，將自主研發(fā)的GD因子(分子式如下所示)在CIK培養(yǎng)中使用，從而制備出更有效的CIK細(xì)胞，稱之為GD-CIK細(xì)胞。經(jīng)過本試劑盒誘導(dǎo)刺激CIK細(xì)胞擴(kuò)增和活化，具有更好的細(xì)胞毒活性。因此，GD-CIK細(xì)胞可應(yīng)用于惡性腫瘤患者的治療，有助于解除腫瘤患者體內(nèi)T細(xì)胞的免疫無能，提高抗腫瘤活性，從而提高治療效果，改善患者生活質(zhì)量。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.084(brs,1H),9.954(s,1H),6.486(s,2H),4.249(t,J＝3.60Hz,2H),3.693(t,J＝5.20Hz,2H),3.584(t,J＝3.60Hz,2H),3.266(s,3H),2.205(t,J＝6.00Hz,2H),1.844(t,J＝5.60Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ174.15,160.09,152.67,149.75,147.88,98.61,70.62,65.65,58.45,38.86,31.14,23.80.MS(ESI)calculated for C₁₂H₁₇N₅O₅,m/z[M+1]312.1230；found 334.1120(M+Na)⁺.

治療腫瘤中通常會(huì)應(yīng)用到聯(lián)合治療，如化療聯(lián)合生物治療等，從CIK細(xì)胞的基礎(chǔ)研究到臨床試驗(yàn)都已經(jīng)驗(yàn)證了其安全性和可行性，有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明旨在克服當(dāng)前細(xì)胞培養(yǎng)中CIK含量不足，細(xì)胞活性低等不足，通過自主研發(fā)和優(yōu)化的人GD-CIK細(xì)胞的專用試劑盒誘導(dǎo)刺激高含量、高細(xì)胞毒活性的CIK細(xì)胞，增強(qiáng)天然免疫反應(yīng)和腫瘤殺傷作用，共同發(fā)揮抗腫瘤作用。

附圖說明

圖1：成熟CIK細(xì)胞團(tuán)形態(tài)。培養(yǎng)第15天，成熟CIK在倒置顯微鏡下的 形態(tài)，放大倍率為40×。

圖2：連續(xù)培養(yǎng)15天細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，圖為細(xì)胞擴(kuò)增倍增曲線圖。

圖3：培養(yǎng)第15天流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行GD-CIK成熟度檢測(cè)。

圖4：采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行免疫表型檢測(cè)(n＝3)。外周血來源的PBMCs，通過不同方式培養(yǎng)，在第15天取細(xì)胞進(jìn)行流式熒光抗體：抗CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PECY5、CD56-APC進(jìn)行表面染色并檢測(cè)。CIK組：指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞；GD-CIK組：指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。

圖5：采用CCK-8試劑盒檢測(cè)對(duì)不同的培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs的細(xì)胞毒性(n＝3)。通過不同方式培養(yǎng)，在第15天取細(xì)胞通過CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測(cè)。CIK組：指采用斯坦福大學(xué)應(yīng)用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細(xì)胞；GD-CIK組：指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。橫坐標(biāo)：表示效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞比值，E∶T＝20∶1表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為20∶1，E∶T＝10∶1表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為10∶1，E∶T＝5∶1表示效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比值為5∶1。

具體實(shí)施方式

下面用實(shí)例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實(shí)例中凡未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。

實(shí)施例1

本實(shí)施例1是分離獲得的PBMCs并進(jìn)行GD-CIK細(xì)胞的培養(yǎng)。包括以下步驟：

1.采集患者外周靜脈血25ml，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞。具體步驟為：1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56℃滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水1:1稀釋沉淀的血細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按1∶2的比例加入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)速分別為1600轉(zhuǎn)/分，1300轉(zhuǎn)/分，均離心7分鐘，即得到PBMCs。

2.GD-CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)。具體步驟為：將實(shí)施例1步驟1中收集的懸浮細(xì)胞重懸于含10％自體滅活血漿的GT-T551^TM等商品化無血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度2×10⁶/ml左右，并加入重組人IFN-γ至終濃度50ng/ml，最后轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后加入抗CD3單抗、抗CD28單抗、重組人IL-1α、重組人IL-2、GD因子，連續(xù)培養(yǎng)15天，其中每2天補(bǔ)加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補(bǔ)加培養(yǎng)基后的細(xì)胞密度控制在1×10⁶/ml。其中，抗CD3單抗?jié)舛葹?0ng/ml，抗CD28單抗的濃度為10ng/ml，IL-1α的濃度為10ng/ml，IL-2的濃度為100ng/ml；加入GD的濃度為1μg/ml。

在第0、3、5、7、9、11、13、15天分別進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和檢測(cè)活率，以及在15天檢測(cè)細(xì)胞生長狀態(tài)(結(jié)果見圖1)，將當(dāng)前細(xì)胞總數(shù)除以開始培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞總數(shù)，所得數(shù)值為細(xì)胞增殖倍數(shù)，結(jié)果見圖2和表1。

表1：不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs擴(kuò)增倍數(shù)(n＝3)

結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，兩組細(xì)胞均有增長，但從第9天后，GD-CIK組擴(kuò)增速度明顯加快，特別是在13天和15天，擴(kuò)增倍數(shù)顯著高于CIK組(P＜0.05)

取第15天的細(xì)胞，PBS洗滌，重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/ml，每個(gè)檢測(cè)管內(nèi)加入50μl細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記抗體(抗CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PECY5.5、CD56-AP3)染色，避光孵育30分鐘，用上述PBS洗滌，重懸，稀釋至100ul，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)文件采用FlowJo軟件分析，結(jié)果見圖3、圖4、表2。

表2：不同培養(yǎng)方式對(duì)外周血來源PBMCs表型影響(n＝3)

結(jié)果顯示，培養(yǎng)第15天，三組細(xì)胞中CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺和CD3^-CD56⁺細(xì)胞之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD3⁺CD56⁺細(xì)胞中，GD-CIK組顯著高于CIK組(P<0.05)。

對(duì)GD-CIK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒活性檢測(cè)。包括以下步驟：

1.取培養(yǎng)第15天的GD-CIK細(xì)胞，檢測(cè)對(duì)K562腫瘤細(xì)胞株的殺傷活性。

2.調(diào)整K562的細(xì)胞密度為4×10⁴/孔，96孔板，每孔100μl，按1∶5、1∶10、 1∶20的比例與GD-CIK細(xì)胞混合，各濃度均設(shè)置3復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置單獨(dú)靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)對(duì)照、單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞(GD-CIK細(xì)胞和CIK細(xì)胞)對(duì)照和單獨(dú)培養(yǎng)基空白對(duì)照。

3.置于37℃、5％CO₂和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4小時(shí)后，每孔加入10μl的CCK-8溶液，再培養(yǎng)4h，然后用酶標(biāo)儀于450nm波長處測(cè)定吸光度(OD)值。

4.根據(jù)公式：殺瘤率(％)＝[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞組OD值)]/(靶細(xì)胞組OD值)×100％，計(jì)算殺瘤效率。其中，公式中各OD值均為減去空白對(duì)照組OD值后的值。結(jié)果見圖4、表2。

表2：不同培養(yǎng)方式對(duì)外周血來源PBMCs細(xì)胞毒活性影響(n＝3)

結(jié)果顯示，在不同比例下，GD-CIK組的殺傷活性均顯著高于CIK組(P<0.05)。說明CIK細(xì)胞經(jīng)過改進(jìn)的方案誘導(dǎo)后，占絕大部分比例的殺傷性細(xì)胞的細(xì)胞毒活性明顯提高，說明本發(fā)明的培養(yǎng)方法制備的GD-CIK細(xì)胞有更好的治療優(yōu)勢(shì)。