本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種蛭弧菌凍干制劑的制備方法。
背景技術(shù)：
：沒有水就沒有生命，就沒有人類，可是隨著社會人口的增多，生活需求量是越來越大，排放量也越來越大，因此人生活需要糧食，糧食生產(chǎn)需要農(nóng)藥化學(xué)肥料，農(nóng)民為了增產(chǎn)豐收大量超標(biāo)使用化肥農(nóng)藥，化肥農(nóng)藥超標(biāo)使用造成水源污染，農(nóng)藥中的砷、鎘、氰化物等有毒有害物，在下雨時混同水源反消的化學(xué)肥料一同流入溝塘河壩，進(jìn)入江河湖泊、污染水資源，使綠水變臭水，造成魚蝦不生，有害微生物漫延，產(chǎn)生病菌病毒，污染生態(tài)環(huán)境，給人的生活用水帶來安全隱患；人們需要生活用具，交通住宿等，需要開礦和工廠生產(chǎn)，工廠的生產(chǎn)，礦山的開采，大量的重金屬流入水體，污染了水資源；金屬礦石淬取的尾渣堆集儲存不當(dāng)，在下雨時尾渣中未被淬取的剩余重金屬也會隨雨水流入河流進(jìn)入湖泊，造成水體重金屬超標(biāo)形成污染。養(yǎng)殖水體是動物賴以生存的環(huán)境和直接接觸的媒介。水體質(zhì)量的高低決定著水產(chǎn)動物的生長發(fā)育狀況和養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。在水資源短缺、高密度養(yǎng)殖、殘餌污染的養(yǎng)殖條件下，水產(chǎn)動物的抗病力降低，易導(dǎo)致各種病原菌的侵襲，給養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來很大經(jīng)濟(jì)損失。這些水體內(nèi)養(yǎng)殖的水生動物，容易出現(xiàn)病害，因此必須進(jìn)行相應(yīng)的消毒殺菌處理，但是現(xiàn)階段，各種殺菌消毒的制劑本身具有一定污染，雖然實現(xiàn)了部分水體的消毒殺菌，但是本身產(chǎn)生的污染造成了水體的二次污染，使用效果并不好。CN101779628B中公開了一種沒食子酸水產(chǎn)消毒殺菌劑的制備方法及其產(chǎn)品，是將五倍子經(jīng)微波離心過濾，微濾，精濾，精濾液用5萬分子量聚砜膜超濾，超濾截留液回用提取，超濾透析液再納濾，納濾透析液回用提取所得，可制成水劑和粉劑。但是該菌劑殺菌效果并不是非常顯著，而且五倍子作為中藥，其來源也不固定，成本較高。CN101606534B中公開了一種含溴消毒殺菌劑，其中消毒殺菌劑組成及其重量配比為：固體溴或二溴二甲基海因10-50，無水硫酸鈉5-30，堿性劑10-20、十二烷基硫酸鈉2-8，氨類活性劑3-20，EDTA1-10。但是該殺菌劑，采用化學(xué)藥劑作為基礎(chǔ)藥物，在水體中會有較大的殘留性，會影響后續(xù)水體的養(yǎng)殖特性。因此，化學(xué)殺菌劑，雖然能夠有效殺滅水體中有害微生物，但是同樣會污染水體，使有害物質(zhì)在魚類體內(nèi)富集，造成藥物殘留。在食品安全日益重視的今天，這無疑會對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成不小的危害，影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。生物修復(fù)(Bioremediation)是指生物尤其是微生物催化降解環(huán)境污染物，減少或消除環(huán)境污染的受控或自發(fā)過程(MadsenEL.Metermininginsitubiodegradation:factsandchallenges[J].EvrionSciTechnol,1991,25(10):1663-1672)。利用微生物為主體的生物修復(fù)在治理海洋中有毒有害污染物的作用日顯重要，對養(yǎng)殖環(huán)境起到明顯改善效果。研究表明，光合細(xì)菌、諾卡氏菌、芽孢桿菌、硝化細(xì)菌、酵母、綠藻、席藻、螺旋藻、小球藻等微生物及復(fù)合微生物菌群均具有良好的凈化水質(zhì)的效果，可用于海水養(yǎng)殖生物修復(fù)過程(劉衛(wèi)東，蘇浩，鄧立康.微生物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].水產(chǎn)科學(xué)，2001，20(2):28-31；趙玉潔，謝風(fēng)行，周可.微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].可持續(xù)發(fā)展，2007，1:27-29)。中國專利ZL200810230123.9公開了利用海水養(yǎng)殖系統(tǒng)自產(chǎn)污泥對海水養(yǎng)殖廢水進(jìn)行反硝化凈化，廢水中NH/-N由0.80mg/L降至0.54mg/L,NOf-N由60.37mg/L降至41.lmg/L。但該方法主要去除水體中的硝酸鹽，對有機(jī)物，磷等污染物去除效果不明顯，處理菌種單一，不徹底。CN102381768B公開了一種利用復(fù)合微生物菌劑凈化海水養(yǎng)殖廢水的方法，包括如下步驟：1)篩選復(fù)合微生物菌劑：由光合細(xì)菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌、產(chǎn)朊假絲酵母、嗜酸乳酸菌以及芽孢桿菌組成復(fù)合微生物菌劑。但是該菌劑需要的微生物種類繁多，培養(yǎng)的條件也各不相同，制備及其復(fù)雜，在菌體中微生物殘留也不較多，對于后續(xù)的養(yǎng)殖也會產(chǎn)生較大的影響。蛭弧菌(Bdellovibrio)是由Stolp和Petzhold從菜豆葉燒病假單胞菌ATCCl1355中分離發(fā)現(xiàn)的一類以攻擊和裂解其它細(xì)菌來完成自身生長和繁殖的寄生菌。蛭弧菌具有類似噬菌體的功能，對能導(dǎo)致漁業(yè)養(yǎng)殖病害和人類食物中毒的致病菌具有良好的裂解清除效果，但對動植物無毒副作用。蛭弧菌作為一類具有裂解致病菌的特殊細(xì)菌，不僅可應(yīng)用到淡水產(chǎn)品生產(chǎn)的全過程，而且也不會導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)抗性，也無噬菌體宿主過于專一的缺點，因此蛭弧菌作為一類致病菌的生物消除劑具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢。如能在淡水產(chǎn)品在養(yǎng)殖期間、運輸過程或食用、加工前，先進(jìn)行致病菌的生物消除工作，則一方面可以減少或消除食物中毒的機(jī)率，減少或消除藥物殘留的可能，提高產(chǎn)品質(zhì)量安全系數(shù)，保護(hù)消費者的健康，另一方面也可為淡水產(chǎn)品的加工提供優(yōu)質(zhì)原材料和加工上的便利，為出口創(chuàng)匯提供強有力的保障。噬菌蛭弧菌制劑的制備方法在過去的報導(dǎo)中也有大量介紹，例如：中華流行病學(xué)雜志1989年第10卷特刊11號中刊登了題為“噬菌蛭弧菌在死的宿主菌中生長特性的研究”的文章，其中詳細(xì)介紹了噬菌蛭弧菌制劑的制備方法。但目前這類制劑通常都是液態(tài)的，由于在該類液態(tài)制劑中，隨著自身菌的不斷生長繁殖，會導(dǎo)致液態(tài)制劑中的新陳代謝產(chǎn)物不斷積累、pH值逐漸變化，而且制品中的雜菌也會日漸增殖，有毒有害因子越積越多，所以，必然致使該制品的有效成分不斷下降，而不安全因素日趨增多。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種蛭弧菌凍干制劑及其生產(chǎn)工藝，以克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的缺陷。本發(fā)明的任務(wù)是以下述方式完成的：一種噬菌蛭弧菌凍干制劑生產(chǎn)工藝，其關(guān)鍵是它依次包括以下工藝過程：a.按噬菌蛭弧菌的常規(guī)培養(yǎng)方法制成菌液，獲得噬菌蛭弧菌水劑，b.將由a工藝過程獲得的噬菌蛭弧菌水劑與冷凍劑混合，獲得待凍干混合液，c.將上述待凍干混合液置于冷凍干燥器中進(jìn)行冷凍干燥，獲得噬菌蛭弧菌凍干制劑，d.將上述噬菌蛭弧菌凍干制劑在真空條件下或者在填充惰性氣體(例如氮氣)的條件下進(jìn)行密封包裝，獲得噬菌蛭弧菌凍干制劑成品。上述b工藝過程中所提及的冷凍劑為：脫脂乳粉15％，甘油10％，蔗糖12％，海藻糖15％，谷氨酸鈉1％，半乳糖20％。上述b工藝過程中所提及的冷凍劑還可以為：脫脂乳粉11％，甘油15％，蔗糖10％，海藻糖17％，谷氨酸鈉2％，半乳糖25％。上述b工藝過程中所提及的冷凍劑還可以為：脫脂乳粉10％，甘油15％，蔗糖8％，海藻糖14％，谷氨酸鈉1.5％，半乳糖22％。上述穩(wěn)定劑均需經(jīng)高壓滅菌處理，無菌檢查合格后備用。上述b工藝過程中所提及的噬菌蛭弧菌水劑與冷凍劑的混合比例最好為1∶2-10。其中蛭弧菌水劑的菌濃最好為5*109個/mL以上。上述步驟c中，先在-80℃預(yù)凍2h之后，接著真空冷凍干燥，干燥分為二步，第一步抽真空至干燥室壓力50Pa，溫度逐漸升溫至-25℃，保持時間2h；第二步，快速升溫至4℃，抽真空至干燥室壓力10Pa，處理至干燥即可(含水率為0-1％)。由于在低溫真空條件下干燥，氧氣極少，微生物的生長和酶的作用幾乎無法進(jìn)行，易氧化物質(zhì)得到有效保護(hù)，因此能夠保持物質(zhì)的原來性狀，冷凍干燥能排除99％的水分，使干燥后的制品能長期保存而不致變質(zhì)。并且本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，優(yōu)化了噬菌蛭弧菌的凍干保護(hù)劑即冷凍劑以及相應(yīng)的冷凍條件，優(yōu)化得到了二者最優(yōu)的比例，使得凍干的時間以及凍干后菌劑的活性都得到了大大的提高。下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實施例1蛭弧菌菌液的制備所述的蛭弧菌舉例為蛭弧菌(Bdellovibriosp.)BDS02，保藏編號為CCTCCNO:M209170；所述的蛭弧菌微生物制劑通過以下步驟獲得:①宿主菌濃縮液的制備:挑取大腸桿菌單菌落，接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液，然后將培養(yǎng)液離心，棄上清，每100mL培養(yǎng)液收集的沉淀用3mLDNB液體培養(yǎng)基懸浮,得到宿主菌濃縮液,4℃保存?zhèn)溆?；②蛭弧菌微生物制劑的制?按照蛭弧菌:宿主濃縮液:DNB液體培養(yǎng)基的體積比1:1:50的比例進(jìn)行混合，恒溫培養(yǎng)，每24h添加一次宿主濃縮液，培養(yǎng)48h，得到培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液離心，取上清液，過濾，濾液使用質(zhì)量體積比(g/mL)1.5％鹽度的滅菌蒸餾水調(diào)整其濃度，最終蛭弧菌微生物制劑的終濃度為8.2*1010PFU/mL。其中步驟①中所述的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基為營養(yǎng)肉湯18g/L，pH7.2，121℃高壓滅菌15min后保存?zhèn)溆?；步驟①中所述的培養(yǎng)的條件為200rpm、28℃培養(yǎng)18h；步驟①中所述的離心的條件為4℃、5000rpm離心15min；步驟②中所述的恒溫培養(yǎng)的條件為230rpm、28℃培養(yǎng)；步驟②中所述的將培養(yǎng)液離心的條件為5000rpm、4℃離心15min；步驟②中所述的過濾為用0.45μm醋酸纖維素膜進(jìn)行過濾；步驟①和②中所述的DNB液體培養(yǎng)基，通過如下步驟制備:稱取0.8g/L的營養(yǎng)肉湯，0.5g/L的酪蛋白酸水解物和0.1g/L的酵母提取物，15g/L海水晶,用蒸餾水溶解混勻，調(diào)pH值至7.2～7.6，121℃0.1MPa條件下處理20min保存?zhèn)溆?；實施?凍干冷凍劑1的制備將奶粉加入適量水加熱溶化，再加入庶糖，海藻糖，谷氨酸鈉，使各組分的濃度分別為脫脂乳粉11％w/v，甘油15％v/v，蔗糖10％w/v，海藻糖17％w/v，谷氨酸鈉2％w/v，半乳糖5％w/v，混勻，調(diào)PH值8.0，滅菌，冷后備用。實施例3凍干冷凍劑2的制備將奶粉加入適量水加熱溶化，再加入庶糖，海藻糖，谷氨酸鈉，使各組分的濃度分別為脫脂乳粉10％w/v，甘油15％v/v，蔗糖8％w/v，海藻糖14％w/v，谷氨酸鈉1.5％w/v，半乳糖5％w/v，混勻，調(diào)PH值8.0，滅菌，冷后備用。實施例4凍干冷凍劑3的制備將奶粉加入適量水加熱溶化，再加入庶糖，海藻糖，谷氨酸鈉，使各組分的濃度分別為脫脂乳粉15％w/v，甘油10％v/v，蔗糖12％w/v，海藻糖15％w/v，谷氨酸鈉1％w/v，半乳糖20％w/v，混勻，調(diào)PH值8.0，滅菌，冷后備用。對照例分別選取5％蔗糖或15％甘油作為對照1和對照2。實施例5菌劑的凍干方法將由實施例1工藝過程獲得的噬菌蛭弧菌水劑與本發(fā)明的凍干保護(hù)劑按1∶5比例混合，獲得待凍干混合液；先在-80℃預(yù)凍2h之后，接著真空冷凍干燥，干燥分為二步，第一步抽真空至干燥室壓力50Pa，溫度逐漸升溫至-25℃，保持時間2h；第二步，快速升溫至4℃，抽真空至干燥室壓力10Pa，處理至干燥即可。將上述噬菌蛭孤菌凍干制劑在真空條件下密封包裝在各自的包裝容器內(nèi)，獲得噬菌蛭弧菌凍干制劑成品。實施例6凍干制劑保質(zhì)期的測定計算蛭弧菌凍干制劑的保質(zhì)期(單位，天/d):通過記錄的數(shù)據(jù)，運用阿倫尼烏斯方程計算蛭弧菌微生物制劑濃度降低為原始濃度1％的保質(zhì)期(見下表)。從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的冷凍劑采用特定的冷凍方法，制備得到的冷凍產(chǎn)品在保質(zhì)期上面具有較好的活性，比現(xiàn)有技術(shù)的冷凍保護(hù)劑有一個質(zhì)的飛躍。實施例7養(yǎng)殖水體殺菌實驗細(xì)菌數(shù)檢測1、菌落總數(shù)用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基檢測(GB4789.2-2010)2、弧菌總數(shù)用TCBS培養(yǎng)基檢測(SN/T0173-2010)取相同的養(yǎng)殖水體，分為6個獨立的實驗區(qū)域。其中，1號為不添加弧菌的對照，2-5號分別為添加了5％蔗糖、15％甘油、實施例2的冷凍劑、實施例3的冷凍劑、實施例4的冷凍劑制備得到的蛭弧菌菌劑。投放菌劑前后的結(jié)果如下：冷凍劑的類型初始水體中細(xì)菌濃度投放菌劑之后水體中細(xì)菌的濃度空白4.5X103cfu/mL8.5X103cfu/mL5％蔗糖4.5X103cfu/mL1.8X102cfu/mL15％甘油4.5X103cfu/mL1.9X102cfu/mL實施例2的冷凍劑4.5X103cfu/mL25cfu/mL實施例3的冷凍劑4.5X103cfu/mL33cfu/mL實施例4的冷凍劑4.5X103cfu/mL27cfu/mL從以上結(jié)果可以看出蛭弧菌凍干劑能有效控制水體的細(xì)菌數(shù)，改善水質(zhì)。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3