本發(fā)明涉及一種從丹鳳牡丹籽殼中制備白藜蘆醇的方法，屬于天然產(chǎn)物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr.）屬于芍藥科（Paeoniaeeae）、芍藥屬（Paeonia）多年生木本植物。牡丹根皮具用很好藥用價值，在兩千年以前，就記載于《本草經(jīng)》。直到隋唐時期，牡丹則成為了名貴的觀賞植物。牡丹籽為牡丹花結(jié)的種子，色黑、皮硬、味苦，不規(guī)則圓型，比黃豆稍大。牡丹籽殼為牡丹籽外表的黑色堅硬的外殼。牡丹籽在民間可以治療腰腿疼痛，具有消炎、抗氧化的作用。經(jīng)中藥化學(xué)和藥理研究發(fā)現(xiàn)牡丹籽具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)靜、降血糖、抗過敏及免疫調(diào)節(jié)等作用。白藜蘆醇（C14H12O3）結(jié)構(gòu)為3ˊ,4,5ˊ-三羥基-1，2-二苯乙烯（3ˊ,4,5ˊ-tri-hydroxylstillbene），無色針狀晶體。白藜蘆醇有順式和反式兩種結(jié)構(gòu)，植物中主要以反式結(jié)構(gòu)存在。白藜蘆醇是一種天然的植物抗毒素，廣泛存在于紅葡萄皮、花生、桑葚以及其他一些藥用的植物中，其中在種皮中含量極高。紫斑牡丹的葉、側(cè)枝、莖以及根中均不含白藜蘆醇，其籽和果莢中含有白藜蘆醇，含量約為0.87%和0.26%。近年來，隨著牡丹籽油產(chǎn)業(yè)的興起，產(chǎn)生了大量的油牡丹籽殼。油牡丹籽殼部分用作肥料，但是更多的是被丟棄，利用率極低。目前，國內(nèi)外關(guān)于從油牡丹籽殼中提取高附加值白藜蘆醇的學(xué)術(shù)報道極少，僅僅研究了其中芍藥苷和丹皮酚檢測方法。深度開發(fā)豐富并且廉價的油牡丹籽殼資源，獲得高純度的具有生物活性的物質(zhì)——白藜蘆醇，不僅能夠變廢為寶，也具有很好的社會和經(jīng)濟(jì)效益。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明了一種從丹鳳牡丹籽殼中制備白藜蘆醇的方法，其特征在于由以下步驟組成：第一步原料預(yù)處理將丹鳳牡丹籽殼干燥至水份8%以內(nèi)粉碎，用10～60目的篩子進(jìn)行篩分，得到丹鳳牡丹籽殼細(xì)粉；第二步白藜蘆醇粗提物制備在牡丹籽殼細(xì)粉中加入體積分?jǐn)?shù)50%-95%的乙醇水溶液，兩者的質(zhì)量體積比為1:8～1:30(g:mL)，然后用超聲波或微波輔助提取60～120min，提取溫度40℃～90℃，提取1～3次，過濾，合并濾液，濾液于40～60℃下減壓蒸發(fā)，回收溶劑，濃縮物經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得到白藜蘆醇粗提物；第三步白藜蘆醇粗提物分級萃取將白藜蘆醇粗提物按質(zhì)量體積比1:5～1:10(g:mL)加入蒸餾水，60℃攪拌溶解，過濾，濾液加入體積比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下減壓濃縮得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯等體積萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物；第四步大孔脂脂選擇性吸附篩選從X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、XDA-4、H103、D101和S-8大孔吸附樹脂中篩選得到對白藜蘆醇多酚吸附選擇性好的X-5、AB-8和D101樹脂，其吸附量高于2.5mg/g，吸附率和解附率大于90%；第五步大孔樹脂吸附分離乙酸乙酯萃取物將乙酸乙酯萃取物用蒸餾水溶解，乙酸乙酯萃取物與水質(zhì)量體積比為0.8～3.0mg/mL，調(diào)節(jié)溶液pH為1.0～4.0，大孔樹脂與乙酸乙酯萃取物水溶液質(zhì)量體積比為1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度為1～6mL/min，樣品吸附結(jié)束后用50～90%乙醇洗脫大孔樹脂柱，洗脫劑流速1～3mL/min，洗脫劑用量為大孔樹脂體積1～4倍，收集白藜蘆醇多酚部位，經(jīng)HPLC分析，得到富含白藜蘆醇、肉桂酸類、兒茶素、丹皮酚、蘆丁和槲皮素類組成的白藜蘆醇多酚提取物；第六步白藜蘆醇分離采用硅膠柱層析分離白藜蘆醇，將白藜蘆醇多酚提取物溶于少量乙酸乙酯溶液中攪拌成均勻膏狀，干燥并用研缽研細(xì)為粉末，均勻加入硅膠層析柱中，以乙酸乙酯與石油醚體積比為5:100～40:100為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每個梯度洗脫1～3倍柱體積，收集乙酸乙酯與石油醚體積比=7:3的洗脫液，經(jīng)減壓濃縮后獲得95%以上白藜蘆醇白色粉末。本專利第五步中白藜蘆醇多酚HPLC分析：HPLC色譜柱為HypersilGOLDaQC18Φ250×4.6mm，5μm，流動相：甲醇與0.5%冰醋酸水溶液體積比為4:6；紫外波長306nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min。本專利第五步得到的白藜蘆醇多酚提取物在240℃以下具有良好的熱穩(wěn)定性，在240～378℃之間有10-20%的質(zhì)量損失，其分解速率為1.5～2.0%/min，在240～420℃下全程失重總計50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。本專利第五步得到的白藜蘆醇多酚提取物具有抗氧化抗菌生物活性，總抗氧化能力為1200mg/g（BHT為200mg/g）以上，半數(shù)抑制濃度為50μg/mL以下，對表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度為5.2mg/mL以下，對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為20.6mg/mL以下。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明所提供的一種從丹鳳牡丹籽殼中制備白藜蘆醇的方法，還具有以下特點(diǎn)：（1）本發(fā)明采用超聲輔助提取方法，可以有效地防止多酚提取物的分解，大大地提高提取得率；（2）本發(fā)明采用超聲波提取、分級萃取和大孔樹脂純化，可以有效地提高白藜蘆醇的含量與純度；（3）本發(fā)明工藝操作簡單，易實(shí)施，純度高。附圖說明圖1白藜蘆醇多酚提取物的HPLC圖；圖2丹鳳牡丹籽殼白藜蘆醇液相色譜圖；圖3丹鳳牡丹籽殼白藜蘆醇的紅外譜圖；圖4丹鳳牡丹籽殼白藜蘆醇的1HNMR圖；圖5丹鳳牡丹籽殼白藜蘆醇的13CNMR圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對本發(fā)明的限定。實(shí)施例1將丹鳳牡丹籽殼干燥至水份8%以內(nèi)粉碎，用10～60目的篩子進(jìn)行篩分，得到丹鳳牡丹籽殼細(xì)粉；在牡丹籽殼細(xì)粉中加入體積分?jǐn)?shù)50%-95%的乙醇水溶液，兩者的質(zhì)量體積比為1:8～1:30(g:mL)，然后用超聲波提取60～120min，提取溫度40℃～90℃，提取1～3次，過濾，合并濾液，濾液于40～60℃下減壓蒸發(fā)，回收溶劑，濃縮物經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得到白藜蘆醇粗提物；將白藜蘆醇粗提物按質(zhì)量體積比1:5～1:10(g:mL)加入蒸餾水，60℃攪拌溶解，過濾，濾液加入體積比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下減壓濃縮得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯等體積萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物；從X-5、AB-8、NKA-Ⅱ、NKA-9、XDA-4、H103、D101和S-8大孔吸附樹脂中篩選得到對白藜蘆醇多酚吸附和解吸附性較好的樹脂，結(jié)果見表1。表18種大孔樹脂對油牡丹籽殼多酚靜態(tài)吸附及解吸的結(jié)果8種大孔吸附樹脂對油牡丹籽殼多酚的吸附與解吸性能見表4-2。這幾種大孔樹脂對油牡丹籽殼多酚吸附性能差異不大，應(yīng)該是因?yàn)闃渲^量。但是，大孔吸附樹脂的解吸量和解吸率有較大差別。其中，X-5和AB-8的解吸性能最好，解析率分別達(dá)到94.51%和97.91%。8種樹脂中S-8對油牡丹籽殼多酚的解析率最低，可能是因?yàn)镾-8樹脂對油牡丹籽殼中的多酚類物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力，因而多酚類物質(zhì)很難被洗脫，所以S-8大孔吸附樹脂不被用來純化油牡丹籽殼多酚。實(shí)施例2將乙酸乙酯萃取物用蒸餾水溶解，乙酸乙酯萃取物與水質(zhì)量體積比為0.8～3.0mg/mL，調(diào)節(jié)溶液pH為1.0～4.0，大孔樹脂X-5與乙酸乙酯萃取物水溶液質(zhì)量體積比為1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度為1～6mL/min，樣品吸附結(jié)束后用50～90%乙醇洗脫大孔樹脂柱，洗脫劑流速1～3mL/min，洗脫劑用量為大孔樹脂體積1～4倍，收集白藜蘆醇多酚部位，經(jīng)HPLC分析，得到富含白藜蘆醇、肉桂酸類、兒茶素、丹皮酚、蘆丁和槲皮素類組成的白藜蘆醇多酚提取物。HPLC分析條件：HPLC色譜柱為HypersilGOLDaQC18Φ250×4.6mm，5μm，流動相：甲醇與0.5%冰醋酸水溶液體積比為4:6；紫外波長306nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min。白藜蘆醇、肉桂酸類、兒茶素、丹皮酚、蘆丁和槲皮素的混合物標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間見表2，白藜蘆醇多酚提取物的HPLC圖如附圖1所示。表2標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間表實(shí)施例3將丹鳳牡丹籽殼干燥至水份8%以內(nèi)粉碎，用10～60目的篩子進(jìn)行篩分，得到丹鳳牡丹籽殼細(xì)粉；在牡丹籽殼細(xì)粉中加入體積分?jǐn)?shù)50%-95%的乙醇水溶液，兩者的質(zhì)量體積比為1:8～1:30(g:mL)，然后用微波提取60～120min，提取溫度40℃～90℃，提取1～3次，過濾，合并濾液，濾液于40～60℃下減壓蒸發(fā)，回收溶劑，濃縮物經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得到白藜蘆醇粗提物；將白藜蘆醇粗提物按質(zhì)量體積比1:5～1:10(g:mL)加入蒸餾水，60℃攪拌溶解，過濾，濾液加入體積比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下減壓濃縮得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯等體積萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物；將乙酸乙酯萃取物用蒸餾水溶解，乙酸乙酯萃取物與水質(zhì)量體積比為0.8～3.0mg/mL，調(diào)節(jié)溶液pH為1.0～4.0，大孔樹脂AB-8與乙酸乙酯萃取物水溶液質(zhì)量體積比為1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度為1～6mL/min，樣品吸附結(jié)束后用50～90%乙醇洗脫大孔樹脂柱，洗脫劑流速1～3mL/min，洗脫劑用量為大孔樹脂體積1～4倍，收集白藜蘆醇多酚部位，經(jīng)HPLC分析，得到富含白藜蘆醇、肉桂酸類、兒茶素、丹皮酚、蘆丁和槲皮素類組成的白藜蘆醇多酚提取物。實(shí)施例4將丹鳳牡丹籽殼干燥至水份8%以內(nèi)粉碎，用10～60目的篩子進(jìn)行篩分，得到丹鳳牡丹籽殼細(xì)粉；在牡丹籽殼細(xì)粉中加入體積分?jǐn)?shù)50%-95%的乙醇水溶液，兩者的質(zhì)量體積比為1:8～1:30(g:mL)，然后用微波提取60～120min，提取溫度40℃～90℃，提取1～3次，過濾，合并濾液，濾液于40～60℃下減壓蒸發(fā)，回收溶劑，濃縮物經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，得到白藜蘆醇粗提物；將白藜蘆醇粗提物按質(zhì)量比1:5～1:10(g:mL)加入蒸餾水，60℃攪拌溶解，過濾，濾液加入體積比1:1的石油醚萃取3～5次，合并石油醚萃取相，在40～60℃下減壓濃縮得到石油醚萃取物；水層繼續(xù)用乙酸乙酯等體積萃取3～5次，合并乙酸乙酯萃取相，在40～60℃下減壓濃縮得到乙酸乙酯萃取物；將乙酸乙酯萃取物用蒸餾水溶解，乙酸乙酯萃取物與水質(zhì)量體積比為0.8～3.0mg/mL，調(diào)節(jié)溶液pH為1.0～4.0，大孔樹脂D101與乙酸乙酯萃取物水溶液質(zhì)量體積比為1:0.5～10（mg:mL），乙酸乙酯萃取物水溶液上柱吸附速度為1～6mL/min，樣品吸附結(jié)束后用50～90%乙醇洗脫大孔樹脂柱，洗脫劑流速1～3mL/min，洗脫劑用量為大孔樹脂體積1～4倍，收集白藜蘆醇多酚部位，經(jīng)HPLC分析，得到富含白藜蘆醇、肉桂酸類、兒茶素、丹皮酚、蘆丁和槲皮素類組成的白藜蘆醇多酚提取物。實(shí)施例5采用硅膠柱層析分離白藜蘆醇，將白藜蘆醇多酚提取物溶于少量乙酸乙酯溶液中攪拌成均勻膏狀，干燥并用研缽研細(xì)為粉末，均勻加入硅膠層析柱中，以乙酸乙酯與石油醚體積比為5:100～40:100為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，每個梯度洗脫1～3倍柱體積，收集乙酸乙酯與石油醚體積比=7:3的洗脫液，經(jīng)減壓濃縮后獲得95%以上白藜蘆醇白色粉末。白色粉末樣品的HPLC色譜圖中只有一個能識別的色譜峰，其保留時間為19.388min，見附圖2。在波長范圍200-800nm內(nèi)掃描，其中在最大吸收波長僅為219和304nm。經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定該化合物為白藜蘆醇。其波譜特征如下：紅外光譜：3300.00，1609.91和964.55cm-1均為白藜蘆醇化學(xué)結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，并且具有1441.84、1462.83、1511.84、1580cm-1等苯環(huán)的特征吸收峰。并與相關(guān)文獻(xiàn)對照，符合白藜蘆醇的紅外色譜圖。油牡丹籽殼白藜蘆醇樣品的紅外譜圖見附圖3。1HNMR（δ）：9.38（1H，s，OH-4′），9.18（2H，s，OH-3，5），7.35（2H，d，H-2′，6′），6.84（1H，d，J=16.3Hz，α-H），6.78（1H，d，J=16.3Hz，β-H），6.73（2H，d，H-3′，5′），6.34（2H，d，H-3′，5′），6.07（1H，t，H-4），見附圖4。以及在化學(xué)位移為6.84和6.78處的雙鍵偶合常數(shù)與報道文獻(xiàn)中數(shù)據(jù)一致。13CNMR（δ）：159.05（C-3，5)，157.78（C-4′），139.81（C-1′），128.58（C-1），128.46（C-α），128.40(C-2′，6′)，126.18（C-β），116.05(C-10，14)，104.82（C-2，6），102.28（C-4），見附圖5。綜合1HNMR和13CNMR與已報道文獻(xiàn)比較，鑒定為白藜蘆醇。實(shí)施例6對白藜蘆醇多酚提取物的熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明白藜蘆醇多酚提取物在240℃以下具有良好的熱穩(wěn)定性，在240～378℃之間有10-20%的質(zhì)量損失，其分解速率為1.5～2.0%/min，在240～420℃下全程失重總計50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。白藜蘆醇多酚提取物的微商熱重曲線，對應(yīng)熱解過程有四次較大的失重階段。第一階段在30℃至173℃溫度范圍內(nèi)熱解失外部水和物質(zhì)中的結(jié)合水，失重峰出現(xiàn)在130.8℃，失重為4.63%，這階段的失重及失重速率都較小。第二階段173-240℃，失重峰出現(xiàn)在219.0℃，此時的失重速率為0.98%/min，失重較輕微，損失率為5.86%。表明白藜蘆醇多酚提取物在240℃以下具有良好的熱穩(wěn)定性。第三階段溫度為240-378℃，失重峰出現(xiàn)在303.8℃，此時的失重速率為105-2.0%/min，分解速率達(dá)到最高，損失率約為10-20%。在240～420℃下全程失重總計50～60%，失重速率2.0～3.0%/min。實(shí)施例7以體外試驗(yàn)研究了白藜蘆醇多酚提取物的抗氧化活性和抑菌活性。采用總抗氧化能力評價白藜蘆醇多酚提取物的抗氧化活性。研究了白藜蘆醇多酚提取物抑制大腸桿菌CMCC44102（Escherichiacoli，E.coli）、金黃色葡萄球菌CMCC26003（Staphylococcusaureus，S.aureus）、產(chǎn)氣腸桿菌ATCC13048（Escherichiaaerogenes，E.aerogenes）、表皮葡萄球菌CMCC26069（Staphylococcusepidermidis，S.epidermidis）、肺炎克雷伯氏菌CMCC46117（Klebsiellapneumoniae，K.pneumoniae）的能力。VC與BHT的FRAP值分別為1814.88和226.00mmol/L，白藜蘆醇多酚提取物的FRAP值為1250.08mg/g，雖然低于VC的總抗氧化能力但遠(yuǎn)高于BHT。FRAP值越大，說明具有的還原能力越強(qiáng)，即總抗氧化能力越強(qiáng)?？寡趸芰υ礁邔PPH自由基的清除能力就越強(qiáng)，因而半數(shù)抑制濃度IC50值越小。白藜蘆醇多酚提取物對DPPH自由基均具有不同程度的清除能力。BHT的半數(shù)抑制濃度IC50值為34.30mg/L。白藜蘆醇多酚提取物的半數(shù)抑制濃度IC50為45μg/mL。白藜蘆醇多酚提取物對所測試菌種均有一定的抑制作用，具體結(jié)果見表3。白藜蘆醇多酚提取物對這5種菌，均有一定的抑制作用。白藜蘆醇多酚提取物對這5種菌均有抑制作用，對表皮葡萄球菌的抑制作用最好，最低抑菌濃度分別為5.2g/L。表3白藜蘆醇多酚提取物對菌種的抑制作用菌種抑菌圈值（mm）最低抑菌濃度（g/L）肺炎克雷伯氏球菌17.310.38產(chǎn)氣腸桿菌12.420.8表皮葡萄球菌36.75.15金黃色葡萄球菌11.619.8大腸桿菌12.120.8當(dāng)前第1頁1 2 3