本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種齊口裂腹魚HSP60基因的cDNA全長(zhǎng)序列及其用途。
背景技術(shù)：
：齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)俗稱雅魚，是雅安三絕之一，屬于鯉形目、鯉科、裂腹魚亞科、裂腹魚屬魚類，分布于長(zhǎng)江上游、大渡河、岷江、青衣江、金沙江及烏江下游等水域。齊口裂腹魚具有肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的特點(diǎn)，是我國(guó)名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，備受消費(fèi)者青睞。近10多年來(lái)，該魚作為一種新興的水產(chǎn)養(yǎng)殖種類，在四川、貴州和重慶等快速發(fā)展,并逐漸形成具有地方優(yōu)勢(shì)特色的產(chǎn)業(yè)。但隨著齊口裂腹魚養(yǎng)殖規(guī)模與養(yǎng)殖密度的不斷提高，細(xì)菌性疾病的發(fā)生日益嚴(yán)重，給齊口裂腹魚養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尤其是近年來(lái)在主要養(yǎng)殖區(qū)流行的由無(wú)乳鏈球菌感染引起的齊口裂腹魚爆發(fā)性傳染病，以突眼、體表出血和神經(jīng)癥狀為臨床特征，具有發(fā)病率和死亡率高的特點(diǎn)。2013年8月，四川雅安養(yǎng)殖場(chǎng)爆發(fā)了無(wú)乳鏈球菌病，發(fā)病率高達(dá)50％，病死率達(dá)100％，給養(yǎng)殖戶造成極為嚴(yán)重的損害。目前，臨床上檢測(cè)齊口裂腹魚感染無(wú)乳鏈球菌的方法，主要依靠對(duì)患病樣品中病原微生物學(xué)分離、培養(yǎng)和生化試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定，但這種方法是在已明確發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚細(xì)菌感染時(shí)進(jìn)行，不利于病情控制。控制齊口裂腹魚感染無(wú)乳鏈球菌最好的辦法是預(yù)防和早期診斷，做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療，防止無(wú)乳鏈球菌病蔓延，保證齊口裂腹魚健康養(yǎng)殖。熱休克蛋白(HeatShockProtein，HSP)又名熱應(yīng)激蛋白，是機(jī)體在應(yīng)激情況下細(xì)胞內(nèi)迅速合成的一組蛋白質(zhì)，在機(jī)體遭受熱應(yīng)激、低氧脅迫、重金屬和微生物感染等脅迫中能快速作出響應(yīng)，普遍存在于整個(gè)生物界。Hsp60是已知HSP家族中的一員，可以作為分子伴侶，參與新生肽鏈的折疊、寡聚蛋白質(zhì)的組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)。在魚類中Hsp60的研究起步較晚，目前的研究主要集中在溫度和物理化學(xué)因素對(duì)Hsp60的應(yīng)激方面。目前未見齊口裂腹魚HSP60基因的報(bào)道，更未見齊口裂腹魚HSP60與病原體感染相關(guān)的報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種齊口裂腹魚HSP60基因的cDNA全長(zhǎng)序列及其用途。本發(fā)明提供了一種如SEQIDNO：1所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種如SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種齊口裂腹魚HSP60蛋白，其特征在于，它是由SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的核苷酸序列編碼。進(jìn)一步地，它的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。本發(fā)明還提供了上述核苷酸序列、上述蛋白在制備檢測(cè)齊口裂腹魚細(xì)菌感染的試劑中的用途。其中，所述試劑為檢測(cè)齊口裂腹魚血液、肝胰臟、中腎和/或脾臟的Hsp60核苷酸表達(dá)水平的試劑。其中，所述細(xì)菌感染為無(wú)乳鏈球菌感染。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)齊口裂腹魚細(xì)菌感染的試劑盒，其特征在于，它包含用來(lái)擴(kuò)增SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示核苷酸序列的試劑。其中，所述試劑包含序列如SEQIDNO：4-5所示的引物對(duì)。其中，所述試劑為檢測(cè)齊口裂腹魚血液、肝胰臟、中腎和/或脾臟的Hsp60核苷酸表達(dá)水平的試劑；其中，所述細(xì)菌感染為無(wú)乳鏈球菌感染。本發(fā)明人克隆得到了齊口裂腹魚Hsp60的cDNA全序列，并且發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚Hsp60的表達(dá)水平與齊口裂腹魚是否受細(xì)菌感染相關(guān)：例如齊口裂腹魚在受細(xì)菌感染的急性期、早期和中期，肝胰臟的Hsp60表達(dá)量均顯著提高，隨后表達(dá)量顯著降低；而脾臟中的Hsp60表達(dá)量與肝胰臟中趨勢(shì)完全相反。綜上，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)Hsp60可作為診斷細(xì)菌感染的靶標(biāo)，用于制備細(xì)菌感染的檢測(cè)試劑，尤其是無(wú)乳鏈球菌感染。本發(fā)明包含檢測(cè)齊口裂腹魚Hsp60的表達(dá)水平的試劑盒，可用于早期監(jiān)控和檢測(cè)齊口裂腹魚細(xì)菌感染，實(shí)施早期預(yù)防和診斷，減少對(duì)齊口裂腹魚造成的損害，臨床應(yīng)用前景良好。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。附圖說(shuō)明圖1為總RNA凝膠電泳圖，其中，1、2泳道為鰓，3泳道為脾臟，4、5泳道為中腎。圖2為SpHsp60基因擴(kuò)增圖，其中，圖2a為保守區(qū)域擴(kuò)增圖，圖2b為5’端擴(kuò)增圖，圖2c為3’端擴(kuò)增圖；泳道M:2000DNAMarker,泳道1:擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3為SpHsp60全長(zhǎng)cDNA序列及預(yù)測(cè)氨基酸序列圖，其中，單橫線表示ATP/ADP綁定位點(diǎn)，雙橫線表示Mg2+連接位點(diǎn)，虛線表示底物結(jié)合位點(diǎn)，黑色方框表示GGM重復(fù)模序，星號(hào)(*)表示終止密碼子。圖4為SpHsp60的組織分布圖，其中，Sk：皮膚，Mu：肌肉，In：腸，Tk：中腎，Sp：脾臟，Br：腦，He：心臟，Gi：鰓，Bl：血液，Hep：肝胰臟。a-f表示表達(dá)量顯著性變化(*P<0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是通過(guò)β-actin和18SrRNA作為內(nèi)參進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)最大值歸一處理，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(n＝5尾/組)。圖5為SpHsp60mRNA在齊口裂腹魚組織中的表達(dá)量變化圖，其中，○表示感染組，■表示對(duì)照組，*表示在同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05)。β-actin和18SrRNA作為內(nèi)參進(jìn)行校準(zhǔn)，每個(gè)組織的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)單獨(dú)進(jìn)行最大值歸一處理，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤(n＝8尾/組)。具體實(shí)施方式下面以實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1齊口裂腹魚Hsp60基因的cDNA克隆一、試驗(yàn)材料1、菌體/載體大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購(gòu)自于天根生化科技有限公司，北京，中國(guó))；pMD19-T(購(gòu)于寶生物工程公司，大連，中國(guó))。2、試驗(yàn)動(dòng)物健康齊口裂腹魚購(gòu)于四川潤(rùn)兆漁業(yè)有限公司。3、主要試劑(1)Sanprep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒、樣品RNA/DNA保護(hù)劑、RNAisoPlus裂解液、PrimeScriptTMReagentKit(PerfectRealTime)cat#RR037A(購(gòu)于寶生物工程公司，大連，中國(guó))。(2)2×TaqMasterMix、Goldview、瓊脂糖、DNAMarker(DL2000、DL1000DNAMarker)(購(gòu)自于天根生化科技有限公司，北京，中國(guó))。(3)SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit(購(gòu)于BDBiosciencesClontech,PaloAlto,CA,USA)4、主要儀器WaterProPlus超純水儀(LABCONCO公司)；Mis-3780型全自動(dòng)高壓滅菌鍋(Sanyo公司)；Allegra21R型高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司)；C1000ThermalCyclerPCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad公司)；GelDoc2000凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；核酸檢測(cè)儀(Bio-Rad公司)；Mini-SUB凝膠電泳裝置(Bio-Rad公司)；725型超低溫冰箱(Thermo公司)。5、主要試劑配置(1)培養(yǎng)基配置普通液體培養(yǎng)基(LB)見大連寶生物產(chǎn)品說(shuō)明書附錄，121℃滅菌30min；氨芐青霉素(Ampicillon,Amp)(100mg/mL)儲(chǔ)備液見大連寶生物產(chǎn)品目錄；Amp-LB瓊脂培養(yǎng)基配置：在LB液體培養(yǎng)基中添加2.5％～3.0％的瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2，121℃滅菌30min。待冷卻至50℃～60℃后添加Amp(100mg/mL)儲(chǔ)備液使其終濃度達(dá)到100μg/mL。(2)其他試劑配置5×TBE電泳緩沖液(儲(chǔ)備液)、1×TBE電泳緩沖液(工作液)見大連寶生物產(chǎn)品目錄；1％瓊脂糖凝膠：450mL雙蒸水中加入50mL5×TBE電泳緩沖液，配置成1×TBE電泳緩沖液，取100mL緩沖液加入1.0g瓊脂糖融化。磷酸緩沖液(PhosphateBufferSaline,PBS)：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO42.9g，KCl0.2g，雙蒸水1000mL，調(diào)pH至7.4。二、試驗(yàn)方法1、樣品采集將健康齊口裂腹魚用(45±3g)MS-222(0.1g/L)麻醉后，快速解剖取出鰓、脾臟、中腎，混合放入裝有1mL樣品RNA/DNA保護(hù)劑的1.5mL無(wú)菌EP管，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?、組織總RNA的提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄將凍存的齊口裂腹魚組織在4℃融化后，用無(wú)菌雙蒸水快速清洗數(shù)遍，然后在液氮中將組織磨成細(xì)粉，取50～100mg加入裝有1mLRNAisoPlus裂解液的1.5mL的無(wú)菌EP管中，提取總RNA，用1％的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，用核酸檢測(cè)儀測(cè)定總RNA濃度，保存于-80℃?zhèn)溆?。提取組織RNA的具體操作如下：(1)將加入組織的裂解液用渦旋儀進(jìn)行混勻處理。(2)混勻后，將EP管置于冰上靜置5-10min，然后4℃10000×r/min離心10min，取上清。(3)每1ml裂解液加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15sec，室溫放置5min，4℃10000×r/min離心15min。(4)取上清移入新的EP管中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min，4℃10000×r/min離心10min。(5)棄上清，加入1mL預(yù)冷的75％乙醇洗滌RNA沉淀。4℃不超過(guò)10000×r/min離心5min，棄上清。(6)超凈臺(tái)中風(fēng)干大約2-5min。加入20～50μL無(wú)RNase的水使RNA溶解。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMReagentKit(PerfectRealTime)cat#RR037A說(shuō)明書進(jìn)行。cDNA在-20℃保存?zhèn)溆谩?、5’或3’RACE準(zhǔn)備cDNA的合成按照SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit說(shuō)明書進(jìn)行擴(kuò)增cDNA，cDNA稀釋200倍后分裝，-20℃保存?zhèn)溆?，操作步驟如下：(1)按照表1進(jìn)行配置BufferMix。表1BufferMix配置好后，然后室溫放置。(2)按照表2、3進(jìn)行配置5’端和3’端擴(kuò)增體系。表25’端擴(kuò)增體系表33’端擴(kuò)增體系按照表2、3配置好后，瞬時(shí)離心混勻，然后在PCR儀中進(jìn)行程序：72℃3min，42℃2min，然后取出14000×r/min離心30sec。(3)向5’端擴(kuò)增反應(yīng)管中加入1μLSMARTERLLAolligo，混勻后瞬時(shí)離心3000×r/min3sec。(4)在(1)中BufferMix中依次加入0.25μLRNaseinhibitor(40U/μL)和1μLSMATERScribeTMReverseTranscriptase(100U)。(5)在5’端擴(kuò)增反應(yīng)管和3’端擴(kuò)增反應(yīng)管中加入(4)中的混合物，用移液槍輕柔的混勻試劑，瞬時(shí)離心。(6)在PCR儀中進(jìn)行42℃90min，70℃10min反應(yīng)。(7)反應(yīng)完成后，加入TE緩沖液200倍稀釋。稀釋后產(chǎn)物在-20℃可保存3個(gè)月。4、Hsp60cDNA克隆(1)Hsp60保守區(qū)的擴(kuò)增及克隆A.Hsp60保守區(qū)引物設(shè)計(jì)齊口裂腹魚的Hsp60的擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)見表4，由上海生工合成。表4Hsp60保守區(qū)域引物B.Hsp60保守區(qū)擴(kuò)增齊口裂腹魚Hsp60保守區(qū)域擴(kuò)增引物如(表4)，擴(kuò)增Hsp60保守區(qū)域PCR體系按照表5進(jìn)行，擴(kuò)增體系為25.0μL。表5PCR體系齊口裂腹魚Hsp60保守區(qū)域的PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃4min，變性94℃30sec，退火溫度57℃30sec，延伸72℃45sec，35個(gè)循環(huán)，延伸72℃8min，4℃保存。取5μl反應(yīng)產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。C.Hsp60保守區(qū)域的T載體克隆與鑒定a.用1％瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用Sanprep柱式DNA膠回收試劑盒回收目的基因片段。b.目的DNA與T-載體的連接按照表6中的體系進(jìn)行，16℃連接過(guò)夜。表6pMD19-T載體連接體系c.將10μL的反應(yīng)產(chǎn)物加入含有50μLDH5αE.coil的EP管中，冰浴30min，再42℃熱激90sec，再冰浴5min。d.加入940μL的LB肉湯于EP管中，37℃震蕩培養(yǎng)2h。e.取50μL菌液，鋪于Amp-LB平板上。37℃過(guò)夜培養(yǎng)。f.挑取單個(gè)菌落進(jìn)行菌落PCR，取陽(yáng)性菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并送到上海生工測(cè)序。(2)Hsp605’端和3’端RACE擴(kuò)增A.Hsp605’端和3’端RACE擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)根據(jù)Hsp60保守區(qū)域測(cè)序結(jié)果進(jìn)行設(shè)計(jì)Hsp605’端和3’端RACE引物。引物序列如表7。表7Hsp60RACE擴(kuò)增引物B.Hsp60基因的5’端RACE擴(kuò)增將5’端RACEcDNA稀釋200倍用作模板進(jìn)行Hsp605’端的擴(kuò)增，以UPM(UPM-Short:UPM-Long＝5:1)作為上游引物，Hsp60-5’R1和Hsp60-5’R2分別作為第一次和第二次擴(kuò)增的下游引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增。第一次PCR為降落PCR，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃4min；變性94℃30sec，退火溫度70℃30sec，延伸72℃1min，5個(gè)循環(huán)；變性94℃30sec，退火溫度68℃30sec，延伸72℃1min，5個(gè)循環(huán)；變性94℃30sec，退火溫度66℃30sec，延伸72℃1min、16個(gè)循環(huán)延伸；72℃8min，4℃保存。經(jīng)第一次擴(kuò)增后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行30倍、40倍、50倍稀釋后作為第二次擴(kuò)增的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃4min；變性94℃30sec，退火溫度64℃30sec，延伸72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃8min，4℃保存。PCR產(chǎn)物取5μL反應(yīng)產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。C.Hsp60的3’端RACE擴(kuò)增將3’端RACEcDNA用作模板進(jìn)行Hsp603’端的擴(kuò)增，以UPM作為下游引物，Hsp60-3’F1和Hsp60-3’F2分別作為第一次和第二次擴(kuò)增的上游引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增。擴(kuò)增方法與Hsp605’端擴(kuò)增相同，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃4min；變性94℃30sec，退火溫度70℃30sec，延伸72℃2min，5個(gè)循環(huán)；變性94℃30sec，退火溫度68℃30sec，延伸72℃2min，5個(gè)循環(huán)；變性94℃30sec，退火溫度66℃30sec，延伸72℃2min、16個(gè)循環(huán)延伸；72℃8min，4℃保存。經(jīng)第一次擴(kuò)增后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行30倍、40倍、50倍稀釋后作為第二次擴(kuò)增的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性94℃4min；變性94℃30sec，退火溫度64℃30sec，延伸72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃8min，4℃保存。PCR產(chǎn)物取5μL反應(yīng)產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。D.Hsp605’端和3’端擴(kuò)增產(chǎn)物的T載體克隆與鑒定5’端和3’端擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體，將鑒定的陽(yáng)性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后，送到上海生工測(cè)序。5、cDNA序列的分析3’端擴(kuò)增序列、5’端擴(kuò)增序列和基因的保守區(qū)域序列采用SeqMan拼接，將所得的完整基因cDNA序列輸入NCBI進(jìn)行核苷酸Blast比對(duì)(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，基因cDNA序列的開放閱讀框在開放閱讀框查詢器中進(jìn)行查找(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)核酸序列的開放閱讀框和氨基酸序列預(yù)測(cè)。并通過(guò)NCBI的BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行核酸和蛋白的一致分析。通過(guò)Motifscan(http://myhits.isb.sib.ch/cigbin/motif_scan)進(jìn)行特征性模序查找和結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。三、試驗(yàn)結(jié)果1、總RNA純度和濃度檢測(cè)通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的組織總RNA進(jìn)行完整性檢測(cè)，見圖1。結(jié)果顯示，提取的總RNA較為完整。通過(guò)核酸蛋白儀對(duì)總RNA進(jìn)行純度和濃度的檢測(cè)，結(jié)果顯示OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，總RNA的濃度在469-1035μg/mL之間。結(jié)果表明提取的組織總RNA質(zhì)量良好，符合進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的要求。以4號(hào)泳道中腎組織提取的RNA來(lái)進(jìn)行RACE逆轉(zhuǎn)錄。2、Hsp60cDNA克隆及序列分析(1)Hsp60克隆通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)Hsp60的保守序列進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增到預(yù)期大小的目的條帶(593bp)(見圖2a)。將目的條帶連接到T載體上，并送到生工測(cè)序。用測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)RACE引物。以RACE試劑盒反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增Hsp60的5’端和3’端，凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖2b，圖2c)。將目的產(chǎn)物連接到T載體上，并送到生工測(cè)序。(2)Hsp60cDNA序列和預(yù)測(cè)氨基酸序列分析通過(guò)Hsp60的保守區(qū)域PCR擴(kuò)增和利用RACE技術(shù)對(duì)其5’端和3’端擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆，并送到生工測(cè)序。測(cè)序所得到的序列通過(guò)SeqMan軟件進(jìn)行拼接得到齊口裂腹魚的Hsp60全長(zhǎng)的cDNA序列。齊口裂腹魚的該基因cDNA的全長(zhǎng)為2277bp，其中包括1728bp的開放閱讀框、61bp的5’-UTR和488bp的3’-UTR其中包括PloyA結(jié)構(gòu)(見圖3)。預(yù)測(cè)編碼575個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為61.22kDa，理論等電點(diǎn)為5.48。。通過(guò)氨基酸序列結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示該氨基酸序列含有保守的ATP/ADP綁定位點(diǎn)和Mg2+綁定位點(diǎn)(ATP結(jié)合位點(diǎn)1：DGVTVAK，ATP結(jié)合位點(diǎn)2：ATRAAVEEGIVLGGG)，底物結(jié)合位點(diǎn)(EGMKFDRGYISPY)和3’端典型的GGM重復(fù)模序(見圖3)。cDNA序列和預(yù)測(cè)氨基酸序列分析表明該基因是齊口裂腹魚的Hsp60的基因(SpHsp60)。SEQIDNO：1HSP60cDNA全長(zhǎng)序列TCAGTCTGCTGTACTGACGGATACGTGCATCCCTTCATTCACCTCCAGATCACTCTGCAAAATGCTGCGTTTACCCAGTGTAATGAAAAAGATGAGGCCAGTGTGCAGGGCGCTGGCCCCACACCTGACCCGTGCATATGCCAAGGAGGTCAAGTTTGGAGCAGATGCCCGTGCCCTCATGCTCCAGGGTGTTGACCTGCTGGCTGATACTGTGGCCGTCACCATGGGACCAAAGGGTCGCACCGTTATCATTGAGCAGAGCTGGGGAAGCCCTAAAGTCACCAAAGATGGTGTCACAGCTGCCAAAAGTATCGACTTGAAGGATAAGTATAAGAACATCGGGGCCAGGCTGGTACAGGACGTGGCCAACAACACAAATGAGGAGGCTGGAGATGGCACCACAACCGCCACAGTTTTGGCCCGTGCTATTGCCAAGGAGGGATTTGACACCATCAGCAAAGGCGCCAACCCTGTGGAGATCCGTAGAGGAGTCATGTTGGCGGTGGAGGAAGTCATCAATGAACTCAAGAAACTCTCCAAGCCGGTCACAACACCAGAGGAAATTGCCCAGGTGGCCACTATTTCTGCCAATGGAGACACTGAAGTTGGTAACATCATCTCCAATGCTATGAAGAAAGTGGGCCGCAAGGGTGTTATTACAGTGAAGGATGGTAAAACCCTACATGATGAGCTTGAGATCATTGAGGGCATGAGGTTCGACCGTGGCTACATTTCTCCTTACTTCATCAACTCAGCTAAAGGCCAGAAGTGTGAGTTCCAGGATGCTTACCTACTTCTGAGTGAGAAGAAGATCTCCAGCGTACAGAGCATCGTGCCAGCACTGGAAATTGCCAACCAGCATCGCAAACCTCTGGTGATCATCGCTGAAGATGTGGACGGAGAAGCACTCAGCACTATGGTCCTCAACAGGTTGAAGGTTGGACTTCAGGTCGTTGCAGTCAAGGCTCCAGGATTCGGGGACAACAGGAAAAGCCAGCTGCAGGATTTGGCAATTTCCACTGGAGGCACGGTGTTTGGTGATGATGCTGTGGGTTTGGCCATTGAGGATATCCAGGCACATGACTTTGCCAGAGTCGGCGAGGTCATTGTGACAAAGGATGACACTATGCTCCTCAAAGGCCGTGGTGATCCAGCAACCATTGAGAAGCGTGTGAATGAGATCGCTGAACAGCTGGAGAGCACAAACAGTGACTACGAGAAGGAGAAACTCAACGAGCGTCTGGCCAAGCTCTCTGATGGAGTGGCTGTGATTACGGTTGGAGGAACAAGTGACGTTGAAGTGAATGAGAAGAAGGACCGTGTCACTGATGCGCTGAATGCCACTCGAGCTGCTGTGGAGGAGGGAATCGTTCTTGGAGGAGGATGTGCCCTGCTGCGCTGCATCCCAGCCCTGGACAACATCAAGCCAGCCAATGATGATCAGAAGATTGGTATCGACATTATTCGCAGAGCGCTTCGTATTCCAGCAATGACTATTGCCAAGAATGCAGGAGTTGAGGGCTCTCTGGTGGTGGAGAAGATCTTGCAGAGCGCTCCAGAGATTGGATACGATGCCATGAATGGAGAATATGTCAACATGGTCGAAAGAGGCATTATTGACCCCACAAAGGTTGTGAGGACTGCACCGCTAGATGCTGCAGGTGTTGCATCTCTGCTGTCTACTGCTGAAGCCGTTGTCACCGAGATACCAAAGGAGGAGAAGGACATGCCGGCTGGARGAATGGGTGGAATGGGAGGCATGGGTGGCATGGGAGGCATGGGATTTTAAACCGATCTGCACTGACTTTAGTGAAAGGGTTGTGGGCAGGGGACATGATTTGCCCCTCCCTTTCGACTTGAAAAAACCTGCCGAAATTGAGTGCTGGTGGTCTGATCATGGAGCAAAAGAAATGGACCTTACAGCCTCCCATCCTTCCACCGCTATGTTCAATCTTATCTCTCTACTCATGGCTGAAGATGTCACCCTACCGCTTTTAAGACAGGTTCTTGATAATGTGACCAGGGGGAGTCTGTCTGCCTTTGTTCTATAACATTGTGCTCACCAATGTTTAATGGGGAAGTGCATTTAACATATTGCATACTGTCATGCTGTTGTGTTGTACGAATGTCATTGTGCGTATAGCTGGTTTTGAATCAGACCATCTGTAGGGGCTTTAAAAGCCAGATGTTCAGGTTAAAGTTTGTCTTCATGAGCAAGAGAGTAGTAGGAACTTTGACCAGTTGTATCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQIDNO：2HSP60開放閱讀框：ATGCTGCGTTTACCCAGTGTAATGAAAAAGATGAGGCCAGTGTGCAGGGCGCTGGCCCCACACCTGACCCGTGCATATGCCAAGGAGGTCAAGTTTGGAGCAGATGCCCGTGCCCTCATGCTCCAGGGTGTTGACCTGCTGGCTGATACTGTGGCCGTCACCATGGGACCAAAGGGTCGCACCGTTATCATTGAGCAGAGCTGGGGAAGCCCTAAAGTCACCAAAGATGGTGTCACAGCTGCCAAAAGTATCGACTTGAAGGATAAGTATAAGAACATCGGGGCCAGGCTGGTACAGGACGTGGCCAACAACACAAATGAGGAGGCTGGAGATGGCACCACAACCGCCACAGTTTTGGCCCGTGCTATTGCCAAGGAGGGATTTGACACCATCAGCAAAGGCGCCAACCCTGTGGAGATCCGTAGAGGAGTCATGTTGGCGGTGGAGGAAGTCATCAATGAACTCAAGAAACTCTCCAAGCCGGTCACAACACCAGAGGAAATTGCCCAGGTGGCCACTATTTCTGCCAATGGAGACACTGAAGTTGGTAACATCATCTCCAATGCTATGAAGAAAGTGGGCCGCAAGGGTGTTATTACAGTGAAGGATGGTAAAACCCTACATGATGAGCTTGAGATCATTGAGGGCATGAGGTTCGACCGTGGCTACATTTCTCCTTACTTCATCAACTCAGCTAAAGGCCAGAAGTGTGAGTTCCAGGATGCTTACCTACTTCTGAGTGAGAAGAAGATCTCCAGCGTACAGAGCATCGTGCCAGCACTGGAAATTGCCAACCAGCATCGCAAACCTCTGGTGATCATCGCTGAAGATGTGGACGGAGAAGCACTCAGCACTATGGTCCTCAACAGGTTGAAGGTTGGACTTCAGGTCGTTGCAGTCAAGGCTCCAGGATTCGGGGACAACAGGAAAAGCCAGCTGCAGGATTTGGCAATTTCCACTGGAGGCACGGTGTTTGGTGATGATGCTGTGGGTTTGGCCATTGAGGATATCCAGGCACATGACTTTGCCAGAGTCGGCGAGGTCATTGTGACAAAGGATGACACTATGCTCCTCAAAGGCCGTGGTGATCCAGCAACCATTGAGAAGCGTGTGAATGAGATCGCTGAACAGCTGGAGAGCACAAACAGTGACTACGAGAAGGAGAAACTCAACGAGCGTCTGGCCAAGCTCTCTGATGGAGTGGCTGTGATTACGGTTGGAGGAACAAGTGACGTTGAAGTGAATGAGAAGAAGGACCGTGTCACTGATGCGCTGAATGCCACTCGAGCTGCTGTGGAGGAGGGAATCGTTCTTGGAGGAGGATGTGCCCTGCTGCGCTGCATCCCAGCCCTGGACAACATCAAGCCAGCCAATGATGATCAGAAGATTGGTATCGACATTATTCGCAGAGCGCTTCGTATTCCAGCAATGACTATTGCCAAGAATGCAGGAGTTGAGGGCTCTCTGGTGGTGGAGAAGATCTTGCAGAGCGCTCCAGAGATTGGATACGATGCCATGAATGGAGAATATGTCAACATGGTCGAAAGAGGCATTATTGACCCCACAAAGGTTGTGAGGACTGCACCGCTAGATGCTGCAGGTGTTGCATCTCTGCTGTCTACTGCTGAAGCCGTTGTCACCGAGATACCAAAGGAGGAGAAGGACATGCCGGCTGGARGAATGGGTGGAATGGGAGGCATGGGTGGCATGGGAGGCATGGGATTTTAASEQIDNO：3HSP60氨基酸序列：MLRLPSVMKKMRPVCRALAPHLTRAYAKEVKFGADARALMLQGVDLLADTVAVTMGPKGRTVIIEQSWGSPKVTKDGVTAAKSIDLKDKYKNIGARLVQDVANNTNEEAGDGTTTATVLARAIAKEGFDTISKGANPVEIRRGVMLAVEEVINELKKLSKPVTTPEEIAQVATISANGDTEVGNIISNAMKKVGRKGVITVKDGKTLHDELEIIEGMRFDRGYISPYFINSAKGQKCEFQDAYLLLSEKKISSVQSIVPALEIANQHRKPLVIIAEDVDGEALSTMVLNRLKVGLQVVAVKAPGFGDNRKSQLQDLAISTGGTVFGDDAVGLAIEDIQAHDFARVGEVIVTKDDTMLLKGRGDPATIEKRVNEIAEQLESTNSDYEKEKLNERLAKLSDGVAVITVGGTSDVEVNEKKDRVTDALNATRAAVEEGIVLGGGCALLRCIPALDNIKPANDDQKIGIDIIRRALRIPAMTIAKNAGVEGSLVVEKILQSAPEIGYDAMNGEYVNMVERGIIDPTKVVRTAPLDAAGVASLLSTAEAVVTEIPKEEKDMPAGXMGGMGGMGGMGGMGF.本實(shí)驗(yàn)證明得到了齊口裂腹魚的Hsp60基因和蛋白質(zhì)。以下用實(shí)驗(yàn)例的方式說(shuō)明本發(fā)明的有益效果：實(shí)驗(yàn)例1Hsp60基因在無(wú)乳鏈球菌感染后的表達(dá)量變化一、試驗(yàn)材料1、菌體無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae,S.agalactiae)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心提供。2、主要試劑PrimeScriptTMReagentKitWithgDNAEraser(PerfectRealTime)cat#RR047A、PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)(購(gòu)于寶生物工程公司，大連，中國(guó))；Bloodtotalprotein,totalRNA,DNAandmicroRNA-kit(購(gòu)于北京博凌科為生物科技有限公司。3、主要儀器StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)-LifeTech(appliedbiosystems)(life-technologies公司)。其他儀器實(shí)施例1的儀器。4、試驗(yàn)動(dòng)物健康齊口裂腹魚購(gòu)于四川潤(rùn)兆漁業(yè)有限公司。5、主要試劑配置(1)培養(yǎng)基配置腦心浸出液肉湯(BrainHeartInfusionBroth,BHI)：稱取BHI37g，加蒸餾水至1000mL，每支試管10mL的量分裝，115℃滅菌15min，冷卻至室溫保存?zhèn)溆谩ＤX心浸出液瓊脂平板(BrainHeartInfusionAgar,BHIA)：在腦心浸出液液體培養(yǎng)基中添加2.0％～3.0％的瓊脂粉，115℃滅菌15min，待冷卻至50℃～60℃時(shí)倒入平板，每個(gè)平板約15mL～20mL。冷卻凝固，4℃保存?zhèn)溆谩?2)其他試劑配置同實(shí)施例1的試劑配置。二、Hsp60基因的組織表達(dá)譜分析1、方法如下：(1)樣品采集取健康的齊口裂腹魚(45±3g)5尾用MS-222(0.1g/L)麻醉后，先用0.1mL一次性注射器從魚的尾柄靜脈中抽取0.1mL的全血，將血液放入裝有900μL的血細(xì)胞裂解液的1.5mL無(wú)菌離心管中，充分混勻后，保存在-80℃?zhèn)溆?；分別取其鰓、腦、心臟、肝胰臟、脾臟、中腎、皮膚、肌肉、腸道共9個(gè)組織，將組織放入裝有1mL樣品RNA/DNA保護(hù)劑的1.5mL的無(wú)菌離心管中，保存在-80℃?zhèn)溆谩?2)組織總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄方法同實(shí)施例1的二(2)。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMReagentKit(PerfectRealTime)cat#RR047A說(shuō)明書進(jìn)行。第一步除去基因組DNA，第二步將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA在-20℃保存?zhèn)溆谩?3)齊口裂腹魚Hsp60的組織表達(dá)譜分析A.qRT-PCR引物設(shè)計(jì)及制作標(biāo)準(zhǔn)曲線采用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)用于qPCR的引物(見表8)，引物由上海生工合成。引物合成后，進(jìn)行PCR檢測(cè)引物的特異性。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠檢測(cè)目的條帶大小。若獲得的目的片段與預(yù)期目的條帶的大小一致，然后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與原始序列比對(duì)，正確才進(jìn)行下一步試驗(yàn)。將cDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5倍，以稀釋的cDNA作為模板和雙蒸水進(jìn)行qPCR反應(yīng)，然后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定模板cDNA稀釋倍數(shù)。表8熒光定量PCR引物B.quantityReal-timePCR采用StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，先按照表9在1.5mL的EP管中配制預(yù)混液，移取9μL的預(yù)混液到96孔板中，再加入1μL輕輕混勻的cDNA模板，每個(gè)樣品進(jìn)行三個(gè)技術(shù)平行。表9熒光定量反應(yīng)體系qRT-PCR程序：95℃預(yù)變性2min；95℃變性5sec，退火延伸30sec，讀板，40個(gè)循環(huán)；最后經(jīng)60℃升溫到95℃，每升高0.5℃讀板一次，進(jìn)行融解曲線分析，檢測(cè)產(chǎn)物是否單一，引物是否具有特異性。導(dǎo)出的熒光定量結(jié)果采用2-△△CT法分析基因組織分布。(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS19.0(SPSSInc,Chicago,IL,USA)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)用單因素方差分析，P<0.05即達(dá)到顯著水平。在本實(shí)驗(yàn)中，組織分布表達(dá)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，無(wú)乳鏈球菌感染后組織表達(dá)量的分析是同一組織在相同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組進(jìn)行顯著性分析。2、表達(dá)譜分析結(jié)果(1)熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作Hsp60、β-actin和18SrRNA內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系，10倍梯度稀釋Ct值的點(diǎn)在同一直線上，引物的相關(guān)系數(shù)分別為0.996、0.997、0.998，擴(kuò)增效率分別為102.589％、100.500％、97.728％，斜率分別為-3.261、-3.31、-3.378。標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果表明qRT-PCR引物有良好的線性關(guān)系，適用于表達(dá)量的檢測(cè)。(2)Hsp60的表達(dá)譜通過(guò)qRT-PCR對(duì)Hsp60在齊口裂腹魚的各個(gè)組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示Hsp60mRNA普遍存在于檢測(cè)的11個(gè)組織。將所有組織中Hsp60mRNA表達(dá)量進(jìn)行顯著性分析后，顯示在肝胰臟中的表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織(P<0.05)，其次為血液和鰓，血液中Hsp60mRNA的表達(dá)量為肝胰臟的0.875倍，而鰓中的表達(dá)量為肝胰臟的0.590倍；而在皮膚中的表達(dá)量最低，除了肌肉中Hsp60mRNA的表達(dá)量與之無(wú)顯著性外，其余的組織中的Hsp60mRNA表達(dá)量顯著高于皮膚中的表達(dá)量(見圖4)，其表達(dá)量?jī)H為肝胰臟的0.117倍。肌肉、腸道、中腎、脾臟、腦、心臟中的表達(dá)量分別是肝胰臟的0.186倍、0.219倍、0.236倍、0.282倍、0.343倍、0.390倍。三、Hsp60基因在無(wú)乳鏈球菌感染后的表達(dá)量變化1、方法如下：(1)細(xì)菌的活化將分離菌株GY101劃線接種BHI平板，28℃孵育24h–48h。挑取單個(gè)菌落接種于BHI肉湯，28℃低速振蕩，活化過(guò)夜培養(yǎng)；將活化后的菌液按10％接種于新鮮BHI肉湯，28℃過(guò)夜孵育后(OD600值在0.6-0.8之間)，將培養(yǎng)的菌液8000×r/min離心15min，棄上清，然后用PBS緩沖液重懸，重復(fù)操作二次；用麥?zhǔn)媳葷岱?，調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度，將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)至1.5×107CFU。(2)動(dòng)物飼養(yǎng)健康齊口裂腹魚(45±3g)85尾，飼養(yǎng)于裝有160L水的40cm×60cm×100cm魚缸，水源為經(jīng)曝氣處理后的自來(lái)水，水質(zhì)標(biāo)志均符合漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB11607-89)。魚在飼養(yǎng)期間水溫保持在23±1℃左右，每天換掉總體積1/2的水，且定期清潔魚缸。試驗(yàn)前健康齊口裂腹魚在魚缸中暫養(yǎng)一周，暫養(yǎng)期間每天按體重2％投喂商業(yè)餌料，每天喂食2次，上午9:00和晚上5:00分別喂食。(3)動(dòng)物分組及處理將暫養(yǎng)一周后的齊口裂腹魚隨機(jī)分成2個(gè)組，分別為實(shí)驗(yàn)組(即感染組)和對(duì)照組(40尾/組)，每組魚分為2個(gè)平行水缸，20尾/缸。感染組通過(guò)人工注射無(wú)乳鏈球菌感染，具體操作為將魚先用MS-222(0.1g/L)麻醉后，腹鰭基部腹腔注射0.1mL的濃度為1.5×107CFU的無(wú)乳鏈球菌；對(duì)照組進(jìn)行模擬注射，在腹鰭基部腹腔注射等量的PBS緩沖液。注射后的魚放回原來(lái)的水缸中。(4)樣品采集在攻毒前及攻毒后的6h、24h、72h、120h采取組織樣品；每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取8尾魚，在每個(gè)平行水缸中隨機(jī)取4尾。用MS-222(0.1g/L)麻醉后，用1mL注射器尾靜脈采血，取0.1mL血液放入裝有1mL血細(xì)胞裂解液的EP管中，并快速混勻。取肝胰臟、脾臟、中腎快速放入裝有0.8mL樣品保護(hù)劑的EP管中，然后將EP管放入-80℃超低溫冰箱中保存，直至使用。(5)組織總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄方法同實(shí)施例1的二(2)。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMReagentKit(PerfectRealTime)cat#RR047A說(shuō)明書進(jìn)行。第一步除去基因組DNA，第二步將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA在-20℃保存?zhèn)溆谩?、無(wú)乳鏈球菌感染后Hsp60的表達(dá)變化分析結(jié)果在齊口裂腹魚感染無(wú)乳鏈球菌后，將同一組織中的Hsp60mRNA表達(dá)量在感染后的相同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組齊口裂腹魚的血液、肝胰臟、脾臟和中腎中SpHsp60mRNA的表達(dá)量均發(fā)生了顯著變化(P<0.05)，具體數(shù)值如下：血液中Hsp60mRNA表達(dá)量，在感染后上升并在6h達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量下降，且在72h和120h顯著下降；肝胰臟中Hsp60mRNA在感染后6h-72h均顯著升高，且在24h達(dá)到峰值，隨后表達(dá)量下降；脾臟中其表達(dá)量在感染后6-72h與對(duì)照組比較均顯著降低，在120h時(shí)表達(dá)量上升且較對(duì)照組顯著上升；在中腎中其表達(dá)量升高，且在6h達(dá)到峰值，隨后下降并在120h降至與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。見圖5、表10。表10實(shí)驗(yàn)組的Hsp60mRNA表達(dá)量變化不同組織感染后6h24h72h120h血液2.67倍*1.142倍*0.575倍*0.336倍*肝胰臟1.85倍*2.336倍*2.110倍*0.731倍*中腎4.42倍*1.84倍*2.43倍*0.865倍脾臟0.640倍*0.851倍*0.611倍*1.120倍*注：表中“倍”指實(shí)驗(yàn)組的Hsp60mRNA表達(dá)量與相同時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組相比。*表示與對(duì)照組的表達(dá)量相同有顯著差異(P<0.05)。腹腔內(nèi)注射細(xì)菌感染魚被分為急性期(6h)，早期(24h)，中期(72h)和晚期(120h)。其中，急性期和早期，從外觀上看不到魚體變化；中期開始，偶見有魚表現(xiàn)出離群、體表發(fā)黑、反應(yīng)遲鈍等癥狀；感染晚期，才能明顯體現(xiàn)出整個(gè)魚群的發(fā)病癥狀，并出現(xiàn)魚死亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，齊口裂腹魚在感染無(wú)乳鏈球菌后，SpHsp60mRNA的表達(dá)量變化在血液、肝胰臟、中腎和脾臟中都顯示出了時(shí)間變化。例如，齊口裂腹魚在受細(xì)菌感染的急性期、早期和中期，肝胰臟的Hsp60表達(dá)量均顯著提高，隨后表達(dá)量顯著降低；而脾臟中的Hsp60表達(dá)量與肝胰臟中趨勢(shì)完全相反。因此，Hsp60mRNA可作為齊口裂腹魚細(xì)菌感染的輔助生物標(biāo)記物。通過(guò)檢測(cè)齊口裂腹魚群血液、肝胰臟、中腎和/或脾臟組織的Hsp60mRNA表達(dá)水平，可以篩查齊口裂腹魚是否被細(xì)菌感染，用來(lái)監(jiān)測(cè)齊口裂腹魚健康狀態(tài)。綜上，本發(fā)明克隆得到了齊口裂腹魚Hsp60的cDNA全序列，并且發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚Hsp60的表達(dá)水平與齊口裂腹魚是否受細(xì)菌感染相關(guān)。結(jié)果表明本發(fā)明的Hsp60可作為診斷齊口裂腹魚無(wú)乳鏈球菌感染的靶標(biāo)，用于制備細(xì)菌感染的檢測(cè)試劑，臨床應(yīng)用前景良好。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3