本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是一種化合物及其用于治療糖尿病的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病是以持續(xù)高血糖為主要生化特征的綜合代謝性疾病，主要是由機體胰島素作用受損或是機體的胰島素分泌不足引起的^[1]。流行病學調(diào)查顯示，糖尿病的發(fā)展會危及人的心腦血管和腎臟，已經(jīng)成為世界上繼腫瘤、心腦血管病之后第三位嚴重威脅人健康的慢性病。

糖尿病主要表現(xiàn)為血液及尿液中葡萄糖濃度的升高異常，患者有明顯的多飲，多食，多尿，體重減輕的癥狀^[2]。血糖的高低，受胰島素的影響。胰島素是一種能促進全身組織攝取、利用葡萄糖的激素，它有降低血液中葡萄糖濃度的作用。當進食碳水化合物之后，血液中葡萄糖增多，便會刺激胰島素分泌。糖尿病作為一種慢性疾病，發(fā)病人數(shù)在快速上升，嚴重影響人們的正常生活。已被WHO列為慢性病防治的重點之一^[3]。

糖尿病主要分為兩種類型：

1型糖尿病，又稱為胰島素依賴型糖尿病(Insulin dependent diabetes mellitus，IDDM)，主要是由于胰島β細胞損害導致胰島素分泌水平低而引起的高血糖^[4]；

2型糖尿病，非胰島素依賴型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus，NIDDM)，是胰島素分泌不足，胰島素抵抗或由于其作用環(huán)節(jié)不健全而引起的高血糖，是最常見的一類糖尿病，在中國，占糖尿病患者總數(shù)的93.7％，且發(fā)病年齡日趨年輕化^[5_,^6]。

當前市場上用于預(yù)防治療糖尿病的藥物類型眾多，應(yīng)根據(jù)病人的實際癥狀來進行合理的選擇。對于1型糖尿病患者來說，需終身使用胰島素制劑或者代用品，維持血糖正常水平；而對于2型糖尿病患者需通過嚴格控制飲食，并輔佐以口服降糖藥使血糖處于正常水平。

口服降血糖藥依其作用機制可分為四類：

1.胰島素分泌促進劑，例如，磺酰脲類藥物通過與胰島β細胞膜上的特異性受體結(jié)合，以增加胰島素分泌^[7]；非擴酰尿類與磺酰脲類藥物結(jié)構(gòu)不同，但作用機制與購酰脲類藥物類似。主要區(qū)別是對β細胞的結(jié)合位點不同，來刺激胰島素的分泌^[8]。

2.雙胍類，胰島素增敏劑通過增強靶組織對胰島素敏感性而降低血糖，且不刺激胰島素分泌。主要有雙胍類，此類藥物可以通過抑制肝臟的糖異生途徑，改善外周的胰島素紀組織對葡萄糖的吸收和利用，進而來改善肌體對胰島素的敏感性。減少肝糖輸出及增加葡萄糖利用^[9]。

3.格列酮類,其作用機制為，活化過氧化物酶體增值劑激活受體(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPARγ)，增加胰島素的敏感度，降低空腹血糖及血液中胰島素的濃度。

4.α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-glucosidase inhibitor)，例如，阿卡波糖，伏格列波糖以及米格列醇是用于治療糖尿病的α-糖苷酶抑制劑類藥物，它們都能夠通過抑制體內(nèi)α-糖苷酶的活性，減少淀粉和寡糖的降解，減少葡萄糖的產(chǎn)生以及延緩葡萄糖的吸收入血來實現(xiàn)其降低高血糖的藥效活性。

α-葡萄糖苷酶的機制為：α-糖苷酶抑制劑結(jié)構(gòu)類似于單糖或者寡糖，而其結(jié)構(gòu)中一般含有氮、硫等雜原子，可與α-糖苷酶的活性空間緊密結(jié)合，且親和力比酶的正常底物大，因此，α-糖苷酶抑制劑和寡糖競爭結(jié)合位點，通過占據(jù)糖苷酶活性空腔，減少寡糖的消化吸收速率^[10]，從而使碳水化合物的消化過程延長^[11]，降低葡萄糖的吸收。

參考文獻：

[1]陳迎春，抗糖尿病藥物瑞格列奈中間體的合成研究[D].吉林大學2007.

[2]楊瀟，陳祥貴，代娟.基于細胞水平的2型糖尿病藥物篩選模型研究進展[J].中國藥房，2006，17(19).

[3]昌玉蘭.糖尿病藥物治療新進展[J].華中醫(yī)學雜志,2001,25(3):131-132.

[4]杜偉奇，施秀芳，邱明艷等.治療糖尿病藥物的研究進展[J].中國醫(yī)院藥學雜志，2005，25(1):67-69.

[5]陳景珠.內(nèi)科學第[J].北京：人民衛(wèi)生出版社,1996,997:275

[6]顏曉燕，盛艷梅，莫正紀.幾類新型糖尿病治療藥物近期研究進展[J].四川生理科學雜志，2006，28(2):74-76.

[7]趙賽，朱雄，王爾華.口服2型糖尿病藥物的研究進展[J].安徽醫(yī)藥，2006，10(3):161-163.

[8]沈澄.口服降糖藥及其合理選擇[J].Chinese General Practice,2002,5(0):2.

[9]C.J.Bailey,R.C.Turner.Metformin[J].The New England journal of medicine,1996,334(9):574.

[10]B.Junge,M.Matzke,J.Stoltefuss.Chemistry and structure-activity relationships of glucosidase inhibitors[J].Handbook of experimental pharmacology,1996，119:411-482.

[11]H.E.Lebovitz.Alpha-glucosidase inhibitors[J].Endocrinology and metabolism clinics of North America，1997，26(3):539-551.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一個新的化合物C-2，該化合物有極強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可用于制備治療糖尿病的藥物。

本發(fā)明的化合物結(jié)構(gòu)式為：

命名為4-乙酰氧基-4,5,6-三羥基-2-羥甲基-2-環(huán)己烯酮。

本發(fā)明的化合物C-2理化性質(zhì)為：

C₉H₁₂O₆，黃色固體。

[α]_D²¹＝+106.88(c 0.37，MeOH)；

UV(MeOH):λmax(logε)＝219(3.58)；

IR(KBr):ν_max＝3354,1731,1684,1241,1201,1139cm^-1；

ESI-MS(positive)m/z：271.217[M+Na+MeOH]⁺；

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD)δ：6.88(1H,d,J＝5.2Hz,H-3),5.68(1H,dd,J＝5.2,3.8Hz,H-4),4.34(1H,d,J＝9.8Hz,H-6),4,25(2H,s,H-7),3.99(1H,dd,J＝9.8,3.8Hz,H-5),2.10(3H,s,H-2’)；

¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD)δ：198.8(C-1)，172.1(C-1’)，142.2(C-2)，137.1(C-3)，75.4(C-6)，72.3(C-5)，69.7(C-4)，59.3(C-7)，20,7(C-2’)。

該化合物從拉丁學名為Streptomyces avidinii的親和素鏈霉菌的發(fā)酵液中提取得到，該菌株可在中國普通微生物菌種保藏管理中心獲得，編號為：CGMCC 4.6409。

該化合物的提取包括：

(1)親和素鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)：取活化好的親和素鏈霉菌菌餅接種于黃豆粉液體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)得到發(fā)酵液，培養(yǎng)溫度為28℃，培養(yǎng)時間為14天；

(2)化合物的提取分離：將(1)中得到的發(fā)酵液濃縮后經(jīng)乙酸乙酯萃取得到粗提物，粗提物用硅膠柱劃段后經(jīng)氯仿-甲醇梯度洗脫收集得到第三個餾分，第三個餾分通過RP-18色譜柱分離收集得到第七個餾分，第七個餾分依次通過凝膠柱LH-20、硅膠柱和半制備型HPLC純化即得所述化合物。

所述的化合物作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的應(yīng)用。所述的化合物用于制備治療糖尿病藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的化合物C-2作為α-葡萄糖苷酶抑制劑，可抑制碳水化合物的吸收并預(yù)防或治療2型糖尿病的降血糖及減肥藥，是具有潛力的。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的化合物C-2的質(zhì)譜圖；

圖2為本發(fā)明的化合物C-2的紅外譜圖；

圖3為本發(fā)明的化合物C-2的紫外譜圖；

圖4為本發(fā)明的化合物C-2的氫譜圖；

圖5為本發(fā)明的化合物C-2的碳譜圖；

以下結(jié)合說明書附圖和具體實施方式對本發(fā)明做具體說明。

具體實施方式

本發(fā)明的化合物是從一株鏈霉菌Streptomyces的發(fā)酵液中分離得到的，是一個新的化合物，該化合物命名為C-2。該鏈霉菌菌株為鏈霉菌屬Streptomyces avidinii no.8，可在中國普通微生物菌種保藏管理中心獲得，編號為：CGMCC 4.6409；中文菌名：親和素鏈霉菌；拉丁學名：Streptomyces avidinii。該鏈霉菌的培養(yǎng)條件為：保藏菌種采用PDA斜面培養(yǎng)基。將菌種接種于PDA平皿中，于28℃活化培養(yǎng)7天，至平皿上長滿菌絲體。PDA平板培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基含200g土豆，20g葡萄糖，16g瓊脂粉。

一、本發(fā)明的化合物的提取方法、鑒定及應(yīng)用檢驗：

1、實驗材料

培養(yǎng)基：

黃豆粉液體培養(yǎng)基：黃豆粉20g，淀粉10g，蔗糖3g，蛋白胨2g，酵母膏2g，K₂HPO₄ 1g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，CaCO₃ 2g，ZnSO₄ 0.01g，F(xiàn)eSO₄.7H₂O 0.01g，NaCl 2g，水1000ml，pH＝7.2；

試劑與儀器：

常用有機溶劑：三氯甲烷，甲醇，乙酸乙酯，石油醚、丙酮等均為工業(yè)試劑，重蒸后使用。有機溶劑：DMSO，色譜甲醇，色譜乙腈等視實際使用情況使用分析純或色譜純試劑。

常用儀器：旋光儀Rudolph AutopolⅢ型；高效液相色譜儀：Waters 1525；紫外光譜儀：Thermo Evolution-300型；紅外光譜儀：Bruker TENSOR 27型(溴化鉀壓片法)；核磁共振：Bruker AvanceⅢ500(TMS內(nèi)標)；低分辨質(zhì)譜儀：Thermo Fisher LTQ Fleet型；高分辨質(zhì)譜儀：Agilent 6520Accurate-Mass Q-TOF LC/MS型。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Büchi Rotavapor R-101、R-3HB型；低溫冷卻液循環(huán)泵：DLSB-10/20型(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；循環(huán)水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；超凈工作臺：SW-OJ-2F型(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；立式蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。柱層析硅膠(100-200目、200-300目及300-400目)及薄層層析硅膠(硅膠H)均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；液相色譜柱：Hypersil BDS 5μm C18(250×4.6and 250×10；Thermo)；羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-20和RP-C18反向硅膠均為Merk公司生產(chǎn)。

1.1鏈霉菌的發(fā)酵培養(yǎng)：

發(fā)酵培養(yǎng)條件包括：取活化好的菌餅(7mm²)接種于200mL黃豆粉液體培養(yǎng)基上，200mL黃豆粉液體培養(yǎng)基放置在500mL錐形瓶中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為28℃，120rpm條件下培養(yǎng)14天；發(fā)酵共得到80L發(fā)酵液。

1.2化合物提取分離：

將1.1中得到的80L發(fā)酵液濃縮至5L，等體積比加入乙酸乙酯萃取3次，得到粗提物20.0g用硅膠柱劃段，用氯仿-甲醇(100:1→1:1)梯度洗脫，獲得5個餾分A-E。餾分C通過RP-18色譜柱(甲醇-水，10-100％)分離，得到8個餾分(C1-C8)。餾分C7依次通過凝膠柱LH-20(溶劑為甲醇)、硅膠柱(溶劑為石油醚-乙酸乙酯，4:1)和半制備型HPLC(50％，甲醇-水，10ml/min)進一步純化，得到的化合物命名為C-2(t_R＝10min，16mg)。

1.3對得到的化合物C-2分別進行了質(zhì)譜、紅外、紫外、氫譜和碳譜的測定，測定結(jié)果見圖1-5：

化合物c-2的質(zhì)譜ESI-MS在m/z 271.217處顯示[M+Na+MeOH]⁺峰，結(jié)合該化合物的氫譜和碳譜，推斷分子式為C₉H₁₂O₆，不飽和度為4。從紅外譜中可以推出存在羥基3354cm^-1,和酯基或醛基1731,1684,cm^-1；從¹³C-NMR可以看出，該化合物有9個碳，其中1個甲基δ_C20,7(C-2’)，1個亞甲基δ_C59.3(C-7)，4個次甲基(有三個連氧的次甲基δ_C75.4(C-6)，72.3(C-5)，69.7(C-4)和一個sp²雜化的次甲基碳δ_C137.1(C-3))，3個季碳(δ_C198.8(C-1)，δ_C172.1(C-1’)，δ_C142.2(C-2))。

通過對所有譜圖數(shù)據(jù)綜合分析，得出化合物C-2的結(jié)構(gòu)式如下：

命名為4-乙酰氧基-4,5,6-三羥基-2-羥甲基-2-環(huán)己烯酮

(4-acetoxy-4,5,6-trihydroxy-2-hydroxymethyl-2-cyclohexenone)。

本發(fā)明的化合物C-2理化性質(zhì)為：

C₉H₁₂O₆，黃色固體。

[α]_D²¹＝+106.88(c 0.37，MeOH)；

UV(MeOH):λmax(logε)＝219(3.58)；

IR(KBr):ν_max＝3354,1731,1684,1241,1201,1139cm^-1；

ESI-MS(positive)m/z：271.217[M+Na+MeOH]⁺；

¹H-NMR(500MHz,CD₃OD)δ：6.88(1H,d,J＝5.2Hz,H-3),5.68(1H,dd,J＝5.2,3.8Hz,H-4),4.34(1H,d,J＝9.8Hz,H-6),4,25(2H,s,H-7),3.99(1H,dd,J＝9.8,3.8Hz,H-5),2.10(3H,s,H-2’)；

¹³C-NMR(125MHz,CD₃OD)δ：198.8(C-1)，172.1(C-1’)，142.2(C-2)，137.1(C-3)，75.4(C-6)，72.3(C-5)，69.7(C-4)，59.3(C-7)，20,7(C-2’)。

1.4化合物C-2作為α-葡萄糖苷酶抑制劑，治療糖尿病的應(yīng)用：

用以測定的藥品有：α-葡萄糖苷酶，阿卡波糖Acarbose皆購自Alladin LTD公司。

α-葡萄糖苷酶抑制活性測定方法：

將3.75μLα-葡萄糖苷酶溶液(10U/ml)加入到596.25μL pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液中，加入37.5μL不同濃度的樣品溶液，在37℃條件下孵育40min；然后加入112.5μL PNPG(對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷,p-Nitrophenylα-D-glucopyranoside)溶液，反應(yīng)半小時后，400nm下測反應(yīng)混合物的吸光度值。

阿卡波糖為陽性對照，含DMSO的緩沖液做空白對照。

每個實驗體系需平行三組實驗，最終取平均值。用SPSS軟件輸入5組數(shù)據(jù)，梯度濃度以及與之相對應(yīng)的抑制率，擬合出標準曲線，取抑制率為50％的點，即可得到半數(shù)抑制濃度。

化合物C-2的活性測定：

以化合物C-2作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性測定：

A樣品溶液：DMSO溶解的化合物C-2的溶液，濃度見表1；

A空白溶液：含DMSO的緩沖液(NaCl:8.006g,KCl:0.201g,Na₂HPO₄﹒12H₂O:2.901g,KH₂PO₄:0.259g,水：1000ML)，注：DMSO含量不超過1％(V/V)；

抑制率的計算：

抑制率％＝(A空白溶液的吸光度-A樣品溶液的吸光度)/A空白溶液的吸光度×100％。

表1

由表1中的數(shù)值以內(nèi)插法求得IC₅₀值：IC₅₀＝9.073μM。

阿卡波糖活性測定：

以阿卡波糖(Acarbose)作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性測定：

B樣品溶液：DMSO溶解的阿卡波糖溶液，濃度見表2；

A空白溶液：含DMSO的緩沖液，注：DMSO含量不超過1％(V/V)

抑制率的計算：抑制率％＝(A空白溶液的吸光度-B樣品溶液的吸光度)/A空白溶液的吸光度×100％，測定結(jié)果見表2。

表2

由上述之數(shù)值以內(nèi)插法求得IC₅₀值：IC₅₀＝663.281μM。

由以上結(jié)果分析比較可知，化合物C-2與阿卡波糖的IC₅₀值(其定義為：抑制α-葡糖糖苷酶活性為50％時該抑制劑的濃度)的實驗數(shù)據(jù)可知，阿卡波糖的抑制濃度為663.281μM，而化合物C-2的抑制濃度為9.073μM，說明本發(fā)明得到的化合物C-2能夠以更低的濃度達到抑制α-葡萄糖苷酶活性的效果，其抑制活性遠遠高于阿卡波糖。因此，以本發(fā)明的化合物C-2作為α-葡萄糖苷酶抑制劑，可抑制碳水化合物的吸收并預(yù)防或治療2型糖尿病的降血糖及減肥藥，是具有潛力的。