本發(fā)明公開一種多異黃酮衍生物的組合物，同時還公開了該組合物的制備方法及其在治療糖尿病的醫(yī)用用途，屬于醫(yī)學制藥
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：鷹嘴豆為豆科植物鷹嘴豆CicerarietinumL.的干燥種子，鷹嘴豆長期以來就一直在作為維族民間藥和傳統(tǒng)中藥治療消渴病使用，特別是在2000年國家衛(wèi)生部《藥品標準》維吾爾藥分冊和《維吾爾藥志》中都明確記載了鷹嘴豆治療糖尿病的藥用功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆異黃酮部位具有一定的降血糖作用，染料木素、鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花素均屬于鷹嘴豆異黃酮部位中成分。目前，多數(shù)異黃酮衍生物都是單獨給藥，雖然取得了一定的效果，但降糖作用均不是很理想，目前下述異黃酮衍生物組合及降糖活性方面的研究經(jīng)檢索未見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種多異黃酮衍生物的組合物，具有明顯的降糖活性，用于治療糖尿病。本發(fā)明所述的一種多異黃酮衍生物的組合物，其特征在于是由以下原料摩爾比制成的：4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素：1、7-2-溴乙氧基染料木素：1、染料木素氧釩配合物：1。本發(fā)明所述的一種多異黃酮衍生物的組合物的制備方法，包括以下步驟：按比例稱取4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素、7-2-溴乙氧基染料木素、染料木素氧釩配合物，混合均勻即得。其結(jié)構(gòu)式如下：通過對4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素、鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花素進行結(jié)構(gòu)修飾，并進行組合給藥降糖活性篩選，獲得上述三個衍生物組合在一起具有更優(yōu)的降糖效果，其組合摩爾比例為1:1:1。本發(fā)明涉及到上述三個異黃酮衍生物的制備，以及該組合在細胞層面的降糖活性研究。本發(fā)明的積極效果在于：通過對4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素、7-2-溴乙氧基染料木素、染料木素氧釩配合物進行結(jié)構(gòu)修飾，制成異黃酮衍生物組合物，通過給藥降糖活性篩選，細胞活性實驗結(jié)果表明，該組合具有很好的降糖效果，優(yōu)于單獨化合物的降糖效果，可以用來制備治療Ⅱ型糖尿病的藥物。附圖說明圖1為實施例1中4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素的氫譜；圖2為實施例1中4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素的碳譜；圖3為實施例1中4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素的質(zhì)譜；圖4為實施例1中7-溴乙氧基染料木素的氫譜；圖5為實施例1中7-溴乙氧基染料木素的碳譜；圖6為實施例1中7-溴乙氧基染料木素的質(zhì)譜；圖7為實施例1中染料木素的紅外譜圖；圖8為實施例1中染料木素氧釩配合物的紅外譜圖；圖9為實施例1中染料木素的紫外譜圖；圖10為實施例1中染料木素氧釩配合物的紫外譜圖；圖11為實施例1中染料木素氧釩配合物的質(zhì)譜圖。具體實施方式：以下通過具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明，但這些實施例并不用于限制本發(fā)明的保護范圍。實施例14′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素的制備：a)乙酰異阿魏酸的制備：1.在100mL圓底燒瓶中加入1g異阿魏酸，20mL乙酰氯；2.置于冰浴中使體系溫度降于0℃，再滴加5滴無水吡啶；3.攪拌下升溫至110℃，回流反應3h；4.室溫冷卻，有大量固體出現(xiàn)，抽濾，濾渣依次用水，無水乙醇洗滌后，干燥，得到乙酰異阿魏酸粗品；5.粗品用300～400目硅膠洗脫，洗脫條件為石油醚:乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝300:100:50:10，得到乙酰異阿魏酸單體。b)4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素的制備：1.稱取染料木素0.3g，乙酰異阿魏酸0.1g，DCC0.4g；2.加入THF20mL，攪拌下加入1.5mL吡啶，80℃反應4h；3.反應完成之后，蒸出THF，加入乙酸乙酯40mL；4.配制1mol/LHCl溶液，洗滌除去吡啶，收集乙酸乙酯層，加無水硫酸鈉除水，得粗品；5.粗品用300～400目硅膠洗脫，洗脫條件為石油醚:乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝300:100:50:10，得到4’,7-二乙酰異阿魏酸染料木素；該實施例目標產(chǎn)物為白色固體粉末，產(chǎn)率為15.2％，熔點：243.2～243.9℃。1HNMR(DMSO-d6)δ(ppm):12.99(s,1H,5-OH),8.65(s,1H,H-2),7.84(d,2H,J＝15.64Hz,H-3″),7.71(s,2H,H-2″′),7.65(d,2H,J＝8.6Hz,H-2′,6′),7.49(d,2H,J＝8.5Hz,H-3′,5′),7.43(d,2H,J＝8.7Hz,H-6″′),7.28(d,2H,J＝8.4Hz,H-5″′),7.13(d,2H,J＝15.8Hz,H-2″),6.89(s,1H,H-6),6.75(s,1H,H-8),3.89(s,6H,-OCH3),2.38(s,6H,-CH3)；13C-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):180.79(C-4),167.12,166.41(C-1″),164.82,164.49(-COO-),157.12(C-5),155.79(C-4′),153.11(C-7),151.93(C-8a),151.29,150.22(C-3″′),149.30(C-2),145.60,145.10(C-3″),142.12,141.81(C-4″′),132.11,131.71(C-1″′),129.89(C-2′,6′),122.82(C-1′),121.61,121.21(C-5″′),120.51(C-3),120.21,119.32(C-6″′),116.72,116.09(C-2″),112.80(C-3′,5′),110.23,110.10(C-2″′),104.51(C-4a),100.53(C-6),95.80(C-8),55.31(two-OCH3),19.81(-CH3),19.09(-CH3).HRMS(ESI)m/z:707.17632[M+H]+,calcd.forC39H31O13707.17647(譜圖見附圖1～圖3)；7-2-溴乙氧基染料木素的制備：1.染料木素0.2g和1,2-二溴乙烷0.68mL加到10mL無水乙醇中；2.加入無水K2CO30.2g，攪拌回流20h；3.趁熱過濾除去不溶物，濾液減壓濃縮，得粗品；4.粗品用300～400目硅膠洗脫，洗脫條件為石油醚:乙酸乙酯＝6:1，得到7-溴乙氧基刺芒柄花素。該實施例目標產(chǎn)物為白色固體粉末，產(chǎn)率為25.9％，熔點：274.2～274.9℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):12.94(s,1H,5-OH),9.77(s,1H,4’-OH),8.41(s,1H,H-2),7.51(d,J＝8.4Hz,2H,H-2’,6’),6.95(d,J＝9.1Hz,2H,H-3’,5’),6.67(s,1H,H-8),6.48(s,1H,H-6),4.21(t,J＝6.3Hz,2H,-OCH2-),3.41(t,J＝7.2Hz,2H,BrCH2-).13C-NMR(DMSO-d6)δ(ppm):175.04(C-4),161.95(C-7),161.35(C-4’),159.38(C-5),158.05(C-8a),153.52(C-2),130.54(C-2’,6’),124.79(C-1’),123.54(C-3),114.05(C-3’,5’),105.55(C-4a),98.54(C-6),92.52(C-8),68.61(-OCH2-),34.89(BrCH2-).HRMS(ESI)m/z:374.97623[M-H]-,calcd.forC17H12BrO5374.98681(譜圖見附圖4～圖6)；染料木素氧釩配合物的制備：1.稱取染料木素0.54g，溶于20mL甲醇中；2.稱取乙酰丙酮氧釩0.27g，溶于20mL甲醇中；3.將上述兩種甲醇溶液混合，室溫攪拌反應30min，生成深棕色溶液；4.該深棕色溶液暴露在空氣中3天，直到3/4的溶劑自然揮發(fā)并形成結(jié)晶；通過過濾分得晶體，用冷甲醇洗滌三次，在空氣中干燥。a)目標化合物的理化性質(zhì)及元素分析染料木素釩配合物為棕色粉末，產(chǎn)率58.2％，溶于甲醇、丙酮、四氫呋喃。用VarioEL型元素分析儀對染料木素釩配合物中的C、H進行測定，釩元素的含量測定采用電感耦合等離子原子發(fā)射光譜儀(ICP)。分子量的測定采用ThermoLQTOrbitrapXLLC-MS。測定結(jié)果如表1所示。表1染料木素氧釩配合物的元素分析及分子量b)差熱與熱重分析在流動空氣下，升溫速度10℃/min，進行配合物的差熱與熱重分析。失重階段在330～410℃，失重率為88.91％，相當于失去兩個配體分子(理論失重率為88.94％)。c)紅外光譜分析在400-4000cm-1范圍內(nèi)，用Thermo-NicoletNexus型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)測定配體和配合物的紅外光譜圖。主要數(shù)據(jù)列于表2表2染料木素及氧釩配合物的主要紅外光譜數(shù)據(jù)及其歸屬(cm-1)化合物V(O-H)V(C＝O)V(C＝C)V(C-O-C)染料木素(L)3412165216161259VL23439162916111263由表2數(shù)據(jù)可知，染料木素的羰基伸縮振動頻率為1652cm-1，形成配合物后移至1629cm-1，向低波數(shù)方向位移了23cm-1，由此可見，配體的4位羰基參與了配位。5-OH所在苯環(huán)骨架的伸縮振動v(C＝C)在配合物中明顯減弱，波數(shù)也有減少；染料木素的3412cm-1左右羥基的伸縮振動頻率在形成配合物后波數(shù)增加了27cm-1，這都是5-OH參與配位造成的。配體中芳醚鍵的伸縮振動v(C-O-C)與形成配合物后位置變化不大，說明染料木素芳醚鍵上的氧并沒有參與配位(譜圖見附圖7～圖9)；d)紫外光譜分析在DMSO:CH3OH＝1:9溶劑中染料木素在260nm和332nm存在兩個特征紫外吸收峰。形成配合物后兩個峰帶均向長波方向移動，最大吸收波長分別為269nm和393nm(弱)。其中，強吸收帶Ⅱ由260nm紅移9nm后到269nm處，而弱吸收帶Ⅰ也有較大位移，其原因是在染料木素分子中B環(huán)不能與C環(huán)的不飽和羰基共軛，使其帶Ⅰ的吸收強度減弱，為一肩峰；而在配合物中由于2個染料木素分子通過4位羰基和5位羥基與釩配位，使整個分子的平面型增強，共軛體系增大，導致帶Ⅰ紅移，強度略增。紫外數(shù)據(jù)也證明了染料木素的4位羰基和5位羥基參與了配位。(譜圖見附圖)實施例24′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素的制備：a)乙酰異阿魏酸的制備：1.在100mL圓底燒瓶中加入1g異阿魏酸，20mL乙酰氯；2.置于冰浴中使體系溫度降于2.5℃，再滴加5滴無水吡啶；3.攪拌下升溫至115℃，回流反應3.5h；4.室溫冷卻，有大量固體出現(xiàn)，抽濾，濾渣依次用水，無水乙醇洗滌后，干燥，得到乙酰異阿魏酸粗品；5.粗品用300～400目硅膠洗脫，洗脫條件為石油醚:乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝300:100:50:10，得到乙酰異阿魏酸單體。b)4’,7-二乙酰異阿魏酸染料木素的制備：1.稱取染料木素0.3g，乙酰異阿魏酸0.1g，DCC0.4g；2.加入THF25mL，攪拌下加入2.0mL吡啶，80℃反應4h；3.反應完成之后，蒸出THF，加入乙酸乙酯45mL；4.配制1mol/LHCl溶液，洗滌除去吡啶，收集乙酸乙酯層，加無水硫酸鈉除水，得粗品；5.粗品用300～400目硅膠洗脫，洗脫條件為石油醚:乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝300:100:50:10，得到4’,7-二乙酰異阿魏酸染料木素。該實施例目標產(chǎn)物產(chǎn)率為35.0％，目標化合物的理化性質(zhì)、核磁數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)同實施例1.7-2-溴乙氧基染料木素的制備：1.染料木素0.2g和1,2-二溴乙烷0.68mL加到12.5mL無水乙醇中；2.加入無水K2CO30.25g，攪拌回流22h；3.趁熱過濾除去不溶物，濾液減壓濃縮，得粗品；4.粗品用300～400目硅膠洗脫，洗脫條件為石油醚:乙酸乙酯＝6:1，得到7-溴乙氧基刺芒柄花素。該實施例目標產(chǎn)物產(chǎn)率為41.0％，目標化合物的理化性質(zhì)、核磁數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)同實施例1。染料木素氧釩配合物的制備：1.稱取染料木素0.54g，溶于25mL甲醇中；2.稱取乙酰丙酮氧釩0.27g，溶于25mL甲醇中；3.將上述兩種甲醇溶液混合，室溫攪拌反應40min，生成深棕色溶液；4.該深棕色溶液暴露在空氣中4天，直到3/4的溶劑自然揮發(fā)并形成結(jié)晶；5.通過過濾分得晶體，用冷甲醇洗滌三次，在空氣中干燥。該實施例目標產(chǎn)物產(chǎn)率為58.5％，目標化合物的理化性質(zhì)、譜圖數(shù)據(jù)同實施例1。實施例34′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素的制備：a)乙酰異阿魏酸的制備：1.在100mL圓底燒瓶中加入1g異阿魏酸，20mL乙酰氯；2.置于冰浴中使體系溫度降于5℃，再滴加5滴無水吡啶；3.攪拌下升溫至120℃，回流反應4h；4.室溫冷卻，有大量固體出現(xiàn)，抽濾，濾渣依次用水，無水乙醇洗滌后，干燥，得到乙酰異阿魏酸粗品；5.粗品用300～400目硅膠洗脫，洗脫條件為石油醚:乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝300:100:50:10，得到乙酰異阿魏酸單體。b)4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素的制備：1.稱取染料木素0.3g，乙酰異阿魏酸0.1g，DCC0.4g；2.加入THF30mL，攪拌下加入2.5mL吡啶，80℃反應4h；3.反應完成之后，蒸出THF，加入乙酸乙酯50mL；4.配制1mol/LHCl溶液，洗滌除去吡啶，收集乙酸乙酯層，加無水硫酸鈉除水，得粗品；5.粗品用300～400目硅膠洗脫，洗脫條件為石油醚:乙酸乙酯:甲醇:乙酸＝300:100:50:10，得到4’,7-二乙酰異阿魏酸染料木素。該實施例目標產(chǎn)物產(chǎn)率為34.9％，目標化合物的理化性質(zhì)、核磁數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)同實施例1.7-2-溴乙氧基染料木素的制備：1.染料木素0.2g和1,2-二溴乙烷0.68mL加到15mL無水乙醇中；2.加入無水K2CO30.3g，攪拌回流24h；3.趁熱過濾除去不溶物，濾液減壓濃縮，得粗品；4.粗品用300～400目硅膠洗脫，洗脫條件為石油醚:乙酸乙酯＝6:1，得到7-溴乙氧基刺芒柄花素。該實施例目標產(chǎn)物產(chǎn)率為41.3％，目標化合物的理化性質(zhì)、核磁數(shù)據(jù)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)同實施例1.染料木素氧釩配合物的制備，1.稱取染料木素0.54g，溶于30mL甲醇中；2.稱取乙酰丙酮氧釩0.27g，溶于30mL甲醇中；3.將上述兩種甲醇溶液混合，室溫攪拌反應50min，生成深棕色溶液；4.該深棕色溶液暴露在空氣中5天，直到3/4的溶劑自然揮發(fā)并形成結(jié)晶；4.通過過濾分得晶體，用冷甲醇洗滌三次，在空氣中干燥。該實施例目標產(chǎn)物產(chǎn)率為58.9％，目標化合物的理化性質(zhì)、譜圖數(shù)據(jù)同實施例1。實施例4按等比例稱取4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素、7-2-溴乙氧基染料木素、染料木素氧釩配合物，混合均勻即得。實施例5按等比例稱取4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素、7-2-溴乙氧基染料木素、染料木素氧釩配合物，混合均勻即得。實施例6按等比例稱取4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素、7-2-溴乙氧基染料木素、染料木素氧釩配合物，混合均勻即得。通過以下試驗表明本發(fā)明異黃酮衍生物組合物降糖活性：1.儀器與材料染料木素、鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花素購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司(批號依次為20140901、20140905、20140909，純度≥98％)；人肝癌細胞株HepG2：為北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院保存細胞株。Dulbecco’sModifiedEagleMedium(DMEM)高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司，批號：05865)；CellCountingKit(CCK-8)(同仁化學，批號GW770)；磷酸鹽緩沖液(PhosphateBufferSaline，PBS)(美國biotopped公司，批號：150123)；胎牛血清(美國ORIGIN公司，批號：P130707ES)；胰島素(諾和靈R，批號：DVG1470)；青霉素-鏈霉素混合液(美國biotopped公司，批號：150401)；鹽酸二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號AAA2857)；細胞培養(yǎng)瓶(美國Fisherscientific公司，批號：7199245)；葡萄糖檢測試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號：20150101147)；0.25％胰蛋白酶(美國biotopped公司，批號：NWF0831)。Glomaxmulti酶標儀：美國promega公司；HERAcell150iCO2孵育箱：美國Thermoscientific公司；IX71倒置顯微鏡：日本Olympus公司；DF-101s集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Sigma臺式高速低溫冷凍離心機：Sigma-Aldrich公司；R200D型分析天平：德國賽多利斯集團；HDL型超凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。2.方法2.1細胞株的培養(yǎng)HepG2細胞經(jīng)37℃復蘇后，轉(zhuǎn)移至含10％滅活胎牛血清、1％青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)。每天觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞貼壁長滿后，棄去培養(yǎng)液，用PBS溶液輕輕洗滌2次，用0.25％胰蛋白酶消化，1000r/min，4℃，離心5min，制成細胞懸液，稀釋后轉(zhuǎn)移至新的細胞培養(yǎng)瓶。每3d按1:3比例傳代一次，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。將對數(shù)生長期的細胞用0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清、1％青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL細胞懸液，接種過程中不斷震搖，避免細胞沉降。待每孔細胞鋪滿80％后，每孔更換為新配制的胰島素濃度為5×10-7mol/L的DMEM高糖培養(yǎng)液200μL，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24h，以建立高胰島素抵抗細胞模型。2.2降糖活性研究實驗設空白對照組、鹽酸二甲雙胍組(終劑量為500μmol/L)、不同濃度給藥組(終劑量分別為1000、500、100、10、1μmol/L，三個化合物濃度比例為1:1:1)。吸棄培養(yǎng)液，給藥組加入不含血清且不同濃度的含藥培養(yǎng)基，對照組加入不含血清的培養(yǎng)基，鹽酸二甲雙胍組則加入不含血清的含500μmol/L的鹽酸二甲雙胍培養(yǎng)基。于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后，用葡萄糖臨床試劑盒檢測培養(yǎng)基上清液中的葡萄糖含量，計算各組細胞培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗量。計算公式如下：葡萄糖含量(mmol/L)＝(各組吸光度/校準液吸光度)×校準液濃度，葡萄糖消耗量(GC)＝未接種細胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量-各組細胞上清液中葡萄糖含量。2.3CCK8實驗葡萄糖消耗實驗結(jié)束后，每孔加入10μLCCK8，放入37℃恒溫箱中，反應1h后取出置于酶標儀中檢測，波長設定為450nm，測定吸光度值。2.4統(tǒng)計學分析結(jié)果均以表示，數(shù)據(jù)處理使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行T-Test組間分析，P<0.05認為有統(tǒng)計學差異，P<0.01認為有極顯著差異。3.結(jié)果各化合物及組合降糖活性測定如表3所示。表3各化合物及組合物對胰島素抵抗HepG2細胞糖消耗的影響注：△表示與鹽酸二甲雙胍相比，P<0.05，△△表示與鹽酸二甲雙胍相比，P<0.01。結(jié)論：通過上述活性數(shù)據(jù)表明，4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素、7-2-溴乙氧基染料木素、染料木素氧釩配合物單獨使用，活性濃度為1000μmol·L-1，三者的組合物的活性濃度是1μmol·L-1，兩者達到一樣的療效(P<0.05或P<0.01)，組合物用量減少了1000倍。達到一個效果，如果三個單獨使用用量為1000mg，使用組合物的用量是1mg,就達到了同樣治療效果。本發(fā)明的按等比例稱取4′,7-二乙酰異阿魏酸染料木素、7-2-溴乙氧基染料木素、染料木素氧釩配合物的組合物，與模型組對比具有顯著性差異，證明組合物具有明顯的降糖活性，組合物的活性優(yōu)于各單獨化合物，表現(xiàn)在組合物給藥濃度是各單獨化合物給藥濃度的千分之一時，活性作用與模型組比較具有相同的顯著性差異，優(yōu)于1000單位的單獨化合物。所以說組合物用量少作用強。當前第1頁1 2 3