本發(fā)明涉及利用重組大腸桿菌合成2'-巖藻乳糖的方法，屬于代謝工程領(lǐng)域。更具體地說(shuō)是一種構(gòu)建重組大腸桿菌生物合成2'-巖藻乳糖的方法。

背景技術(shù)：

母乳中包含嬰兒生長(zhǎng)和發(fā)育所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但是它同時(shí)也含有傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中所沒(méi)有的物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)身體是有益的。其中一些物質(zhì)就是人乳寡糖（HMOs）。唾液乳糖是常見(jiàn)的人乳寡糖，具有抗黏附，維持腸道微生物組成及糖組修飾等功能, 在營(yíng)養(yǎng)和藥用方面，也是很有前途的寡糖。

巖藻寡糖，如2'-巖藻乳糖，乳酰-N-巖藻五糖和乳酰-N-巖藻六糖，都是常見(jiàn)的人乳寡糖。巖藻化寡糖作為選擇雙歧桿菌的生長(zhǎng)刺激因子和致病細(xì)菌的可溶性受體類似物，從而保護(hù)嬰兒免受腸道病原體和綁定的毒素的感染。據(jù)報(bào)道,尤其是α-1,2-鏈接的巖藻寡糖具有對(duì)空腸彎曲桿菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌，產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌，幽門(mén)螺旋桿菌和諾瓦克病毒^]等病原體的防護(hù)活性。在所有的這些人乳寡糖中，2'-巖藻乳糖是母乳中含量最豐富的，約占人乳寡糖的30%。如果一個(gè)母親在生氣的情況下對(duì)嬰兒進(jìn)行哺乳，那么奶中所含的較低的2'-FL可能會(huì)提供高嬰兒的腹瀉率。因此，在營(yíng)養(yǎng)和藥用方面，2'-FL是一種很有前途的寡糖。

目前，2'-巖藻乳糖的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)法，化學(xué)法生產(chǎn)存在諸多弊端，如合成步驟過(guò)多，生成的產(chǎn)物較多，副產(chǎn)物復(fù)雜，其反應(yīng)液對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染等，通過(guò)生物法來(lái)制備2'-巖藻乳糖越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。

本發(fā)明中構(gòu)建的重組工程菌實(shí)現(xiàn)了2'-巖藻乳糖的生物合成，為生物法探索生成目標(biāo)代謝產(chǎn)物提供了新思路。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建一株重組大腸桿菌，實(shí)現(xiàn)了從乳糖到2'-巖藻乳糖的生物合成。所采取的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供了一種利用乳糖合成2'-巖藻乳糖的重組大腸桿菌。其特征在于，具有2'-巖藻乳糖的合成途徑。名稱為E.coli-XYY-1。同時(shí)過(guò)表達(dá)磷酸甘露糖酶基因（manB），磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因（manC），GDP-甘露糖- 4,6-脫水酶基因（gmd），GDP-fucose合成酶基因（fcl），甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因（manA），GDP-fucose的合成的一個(gè)正向調(diào)控因子（rcsA），β-半乳糖苷透性酶基因（lacY），α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因 （futC）。

所述磷酸甘露糖酶基因manB，基因登錄號(hào)GI：946574; 磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因manC，基因登錄號(hào)GI：946580；GDP-甘露糖- 4,6-脫水酶基因gmd，基因登錄號(hào)GI：946562；GDP-fucose合成酶基因fcl,基因登錄號(hào)GI：946563；甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因manA,基因登錄號(hào)GI：944840；GDP-fucose的合成的一個(gè)正向調(diào)控因子rcsA,基因登錄號(hào)GI：946467；β-半乳糖苷透性酶基因lacY，基因登錄號(hào)GI：949083；來(lái)源于幽門(mén)螺旋桿菌的α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因 futC, 基因登錄號(hào)GI:CP010436; 所述具有2'-巖藻乳糖合成途徑，是指過(guò)表達(dá)磷酸甘露糖酶，磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶，GDP-甘露糖- 4,6-脫水酶，GDP-fucose合成酶,甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶,GDP-fucose合成的一個(gè)正向調(diào)控因子,β-半乳糖苷透性酶,α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶。

本發(fā)明第二個(gè)目的在于提供了大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于步驟如下：

1）分別制備含有磷酸甘露糖酶基因（manB），磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因（manC），GDP-甘露糖- 4,6-脫水酶基因（gmd），GDP-fucose合成酶基因（fcl），甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因（manA），GDP-fucose的合成的一個(gè)正向調(diào)控因子（rcsA），β-半乳糖苷透性酶基因（lacY），α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因 （futC）的重組質(zhì)粒，獲得構(gòu)建代謝途徑的質(zhì)粒；

2）將質(zhì)粒pSim導(dǎo)入轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coli BL21（DE3）中，獲得攜帶質(zhì)粒的宿主菌；

3）分別擴(kuò)增帶有β-半乳糖苷酶基因lacZ，UDP-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶基因wcaJ，ATP依賴的蛋白酶基因lon同源臂的抗性敲除片段；

4) 先向步驟2所得的攜帶質(zhì)粒pSim的宿主菌中轉(zhuǎn)化同一個(gè)基因的抗性敲除片段，獲得缺失一個(gè)基因的重組菌；

5) 將步驟4所得的重組菌進(jìn)行溶源化處理，利用pCP20質(zhì)粒進(jìn)行抗性消除；

6) 以步驟5所得的缺失一個(gè)基因的重組菌為宿主菌，重復(fù)步驟5）的操作，獲得缺失兩個(gè)基因的重組菌，再重復(fù)步驟5）的操作，每次操作均以上一次操作獲得的重組菌為宿主菌，直至將步驟3）所述的基因全部敲除，獲得缺失個(gè)基因的重組大腸桿菌；

7) 將步驟6）中基因敲除的大腸桿菌進(jìn)行溶源化處理，再將步驟1）所得的代謝途徑構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到溶源菌中，獲得能夠利用乳糖合成2'-巖藻乳糖的重組大腸桿菌；

其中所述構(gòu)建β-半乳糖苷酶基因lacZ的缺失引物和鑒定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.4 所示；構(gòu)建UDP-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶基因wcaJ的缺失引物和鑒定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示；構(gòu)建ATP依賴的蛋白酶基因lon的缺失引物和鑒定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12所示；

本發(fā)明第三個(gè)目的在于提供了采用所獲得的大腸桿菌基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵合成2'-巖藻乳糖，培養(yǎng)基和發(fā)酵方法如下：

LB培養(yǎng)基（1L）:Tryptone(胰蛋白胨)：10g，Yeast Extract（酵母提取物）：5g，NaCl（氯化鈉）：5g。若配置固體培養(yǎng)基，則再加入15g Agar（瓊脂）。

M9培養(yǎng)基（1L）：Na₂HPO₄·7H₂O（七水合磷酸氫二鈉）：12.8g，KH₂PO₄（磷酸二氫鉀）3g，NaCl（氯化鈉）：0.5g，NH₄Cl（氯化銨）2g，MgSO₄·7H₂O（七水合硫酸鎂）0.25g，Yeast Extract（酵母提取物）2g，Glycerol（甘油）：20g。

將所得基因工程菌在5mL含有卡那霉素50 μg/ml，氨芐青霉素100 μg/ml，鏈霉素50 μg/ml的LB培養(yǎng)基中37℃，220rpm/min培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)入M9培養(yǎng)基，M9培養(yǎng)基在使用前加入卡那霉素，氨芐青霉素，鏈霉素（卡那霉素50 μg/ml，氨芐青霉素100 μg/ml，鏈霉素50 μg/ml），37℃，培養(yǎng)月3h左右，加入IPTG（IPTG 0.2mM）,并轉(zhuǎn)入25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)約2h后，加入乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，取樣。該方法的具體步驟如下：

1）分別制備含有磷酸甘露糖酶基因（manB），磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因（manC），GDP-甘露糖- 4,6-脫水酶基因（gmd），GDP-fucose合成酶基因（fcl），甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因（manA），GDP-fucose的合成的一個(gè)正向調(diào)控因子（rcsA），β-半乳糖苷透性酶基因（lacY），α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因 （futC）的重組質(zhì)粒，獲得構(gòu)建代謝途徑的質(zhì)粒；

2）將質(zhì)粒pSim導(dǎo)入轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coli BL21（DE3）中，獲得攜帶質(zhì)粒的宿主菌；

3）分別擴(kuò)增帶有β-半乳糖苷酶基因lacZ，UDP-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶基因wcaJ，ATP依賴的蛋白酶基因lon同源臂的抗性敲除片段；

4）先向步驟2所得的攜帶質(zhì)粒pSim的宿主菌中轉(zhuǎn)化一個(gè)基因帶有同源臂的抗性消除片段，獲得缺失一個(gè)基因的重組菌；

5）將步驟4）所獲得的缺失一個(gè)基因的重組菌進(jìn)行溶源化處理，利用pCP20質(zhì)粒進(jìn)行抗性消除；

6）以步驟5）所得的缺失一個(gè)基因的重組菌為宿主菌，重復(fù)步驟4）和步驟5）的操作，獲得缺失兩個(gè)基因的重組菌，再重復(fù)步驟4）和步驟5）的操作，每次操作均以上一次操作獲得的重組菌為宿主菌，直至將步驟3）所述的基因全部敲除，獲得缺失3個(gè)基因的重組大腸桿菌；

7）將步驟6）中基因敲除的大腸桿菌進(jìn)行溶源化處理，再將步驟1）所得的代謝途徑構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到溶源菌中，獲得能夠利用乳糖合成2'-巖藻乳糖的重組大腸桿菌；

8）利用步驟7）所得的重組大腸桿菌合成2'-巖藻乳糖；

所述任一大腸桿菌工程菌在生產(chǎn)2'-巖藻乳糖中的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。所述應(yīng)用的步驟如下：

1） 活化大腸桿菌基因工程菌，獲得種子液；

2） 將步驟1）獲得的種子液與含有氯霉素、氨芐青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基，按照種子液:培養(yǎng)基=1:100的比例接種至新鮮的培養(yǎng)基，35~37℃，180rpm~220rpm/min,培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.6~0.8，并加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.2mM~0.3mM, 然后轉(zhuǎn)入20~25℃，180rpm~220rpm/min,補(bǔ)加乳糖繼續(xù)培養(yǎng)4~6h；發(fā)酵生產(chǎn)2'-巖藻乳糖過(guò)程中，大腸桿菌基因工程菌所用的培養(yǎng)基包括各種適于所選用的宿主細(xì)胞（大腸桿菌）生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，碳源優(yōu)選為低成本的葡萄糖。

本發(fā)明公開(kāi)的構(gòu)建重組大腸桿菌生物合成2'-巖藻乳糖的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于：

（1）本發(fā)明所構(gòu)建的大腸桿菌基因工程菌具有以葡萄糖為碳源發(fā)酵合成2'-巖藻乳糖的特點(diǎn)，發(fā)酵4h，可以得到5~8g/L的2'-巖藻乳糖。

（2）本發(fā)明建立了一條2'-巖藻乳糖的合成途徑，本發(fā)明同時(shí)克服了現(xiàn)有的技術(shù)難題，獲得了一個(gè)高效的基因敲除方案；原始菌株在通過(guò)基因工程改造以后，除了生產(chǎn)2'-巖藻乳糖外，沒(méi)有改變菌株的其它特性，不影響發(fā)酵生產(chǎn)；該菌株采用的質(zhì)粒為成熟的大腸桿菌質(zhì)粒，因此在代謝過(guò)程中不影響細(xì)菌生長(zhǎng)和正常代謝。

附圖說(shuō)明

圖1是質(zhì)粒pACYCDuet-1-rcsA-manA的圖譜，用來(lái)過(guò)表達(dá)2'-巖藻乳糖合成途徑中的rcsA、manA基因；

圖2是質(zhì)粒pET-Duet1-manB-manC-gmd-fcl的圖譜，用來(lái)過(guò)表達(dá)2'-巖藻乳糖合成途徑中的manB、manC、gmd、fcl基因；

圖3是質(zhì)粒pCDF-Duet-1-futC的圖譜，用來(lái)過(guò)表達(dá)2'-巖藻乳糖合成途徑中的futC基因；

圖4是敲除wcaj基因后的PCR驗(yàn)證產(chǎn)物的電泳圖；

（圖中，M:Marker；泳道1-2分別為：陰性對(duì)照,wcaj

圖5是敲除lon基因后的PCR驗(yàn)證產(chǎn)物的電泳圖；

（圖中，M:Marker；泳道1-2分別為：陰性對(duì)照l(shuí)on

圖6是敲除lacZ基因后的PCR驗(yàn)證產(chǎn)物的電泳圖；

（圖中，M:Marker；泳道1-2分別為：陰性對(duì)照 lacZ

圖7是本發(fā)明中構(gòu)建的合成2'-巖藻乳糖的代謝途徑；

圖8是ESI-MS檢測(cè)重組菌株發(fā)酵液，其中487.03為目的產(chǎn)物2'-巖藻乳糖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說(shuō)明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書(shū)所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用原料及試劑均有市售。以下實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器和方法未經(jīng)特殊說(shuō)明均為本領(lǐng)域中的常規(guī)材料、試劑、儀器和方法，均可通過(guò)商業(yè)渠道獲得；例如Tryptone(胰蛋白胨)，Yeast Extract（酵母提取物），Agar（瓊脂）；卡那霉素，氨芐青霉素，鏈霉素，E.coli DH5α等等。

本發(fā)明中質(zhì)粒提取采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（Catalog NO.：B518191），切膠回收是采用生工生物工程（上海）有限公司的SanPrep柱式膠回收試劑盒（Catalog NO.：B518131），DNA片段的連接是使用fermentas公司的T4 DNA Ligase（Catalog NO.：EL0014），DNA片段的擴(kuò)增使用fermentas公司的pfu DNA polymerase（Catalog NO.：EP0571）,PCR質(zhì)粒模板的消化使用fermentas公司的Falst Digelst KpnI（Catalog NO.：FD0524），BamHI（Catalog NO.：FD0054） NcoI（Catalog NO.：FD0574）BglII（Catalog NO.：FD0083）E.coli電擊轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)使用Bio-Rad的電轉(zhuǎn)儀（Catalog NO.：165-2100）。細(xì)菌基因組提取使用北京康為世紀(jì)生化科技有限公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒（Catalog NO.：CW0552S）。

實(shí)施例1

基因的獲?。?/p>

本實(shí)施例中，獲取來(lái)源于大腸桿菌MG1655的磷酸甘露糖酶基因manB（基因登錄號(hào) GI:946574），磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因manC（基因登錄號(hào) GI:946580），GDP-甘露糖- 4,6-脫水酶基因gmd（基因登錄號(hào) GI:946562），GDP-fucose合成酶基因fcl（基因登錄號(hào) GI:946563），甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因manA（基因登錄號(hào) GI:944840），GDP-fucose的合成的一個(gè)正向調(diào)控因子rcsA（基因登錄號(hào) GI:946467），獲取來(lái)源于大腸桿菌BL21的β-半乳糖苷透性酶基因lacY（基因登錄號(hào) GI:949083），獲取來(lái)源于幽門(mén)螺旋桿菌的α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因 futC（基因登錄號(hào) GI:CP010436）。

實(shí)施例2

重組質(zhì)粒的制備

使用設(shè)計(jì)的引物F₁，R₁對(duì)實(shí)施例1中獲得的來(lái)源于大腸桿菌MG1655的磷酸甘露糖酶基因manB，磷酸鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移酶基因manC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的片段進(jìn)行切膠純化，并用NcoI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切后的片段與同樣經(jīng)過(guò)NcoI和HindIII雙酶切的質(zhì)粒pETDuet-1質(zhì)粒進(jìn)行連接，將載體：目的片段按摩爾比為1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶連5h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，并在氨芐青霉素板上進(jìn)行篩選，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-1-manB-manC。

使用設(shè)計(jì)的引物F₂，R₂對(duì)實(shí)施例1中獲得的來(lái)源于大腸桿菌MG1655的GDP-甘露糖- 4,6-脫水酶基因gmd，GDP-fucose合成酶基因fcl進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的片段進(jìn)行切膠純化，并用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切后的片段與同樣經(jīng)過(guò)NdeI和XhoI雙酶切的質(zhì)粒pETDuet-1-manB-manC質(zhì)粒進(jìn)行連接，將載體：目的片段按摩爾比為1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶連5h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，并在鏈霉素板上進(jìn)行篩選，獲得重組質(zhì)粒pETDuet-1-manB-manC-gmd-fcl。

使用設(shè)計(jì)的引物F₃，R₃對(duì)實(shí)施例1中獲得的來(lái)源于大腸桿菌BL21的β-半乳糖苷透性酶基因（lacY）,來(lái)源于幽門(mén)螺旋桿菌的α-1，2-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶基因 futC進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的片段進(jìn)行切膠純化，并用NcoI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切后的片段與同樣經(jīng)過(guò)NcoI和HindIII雙酶切的質(zhì)粒pCDFDuet-1質(zhì)粒進(jìn)行連接，將載體：目的片段按摩爾比為1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶連5h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，并在鏈霉素板上進(jìn)行篩選，獲得重組質(zhì)粒pCDFDuet-1-lacY-futC。

使用設(shè)計(jì)的引物F₄，R₄對(duì)實(shí)施例1中獲得的來(lái)源于大腸桿菌MG1655的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因manA，GDP-fucose的合成的一個(gè)正向調(diào)控因子rcsA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的片段進(jìn)行切膠純化，并用NcoI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切后的片段與同樣經(jīng)過(guò)NcoI和HindIII雙酶切的質(zhì)粒pACYCDuet-1質(zhì)粒進(jìn)行連接，將載體：目的片段按摩爾比為1:3的比例混合，加入T4 DNA Ligase后在22℃下酶連5h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，并在鏈霉素板上進(jìn)行篩選，獲得重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-manA-rcsA。

實(shí)施例3

基因的敲除

本實(shí)施例使用λRed重組系統(tǒng)敲除E.coli BL21(DE3)的多個(gè)基因，該方法每敲除一個(gè)基因都進(jìn)行抗性的消除。下面以wcaj基因?yàn)槔?，詳?xì)闡述基因敲除的步驟，其余2個(gè)基因的敲除與此相同。

在NCBI中查找E.coli BL21(DE3) wcaj基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)wcaj基因的缺失引物和鑒定引物。wcaj基因的缺失引物和鑒定引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.8所示。

實(shí)施例4

缺失型E.coli BL21(DE3) ?3的構(gòu)建

4.1質(zhì)粒pSim的轉(zhuǎn)化

挑取-80℃凍存的野生型E.coli BL21(DE3)在無(wú)抗性的LB平板上劃線，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。第二天挑取單克隆，接種至5mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm/min，過(guò)夜培養(yǎng)。第二天按1%的接種量，轉(zhuǎn)接至200ml的LB培養(yǎng)基中。37℃，220rpm/min，培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.6~0.8，冰浴20min，5500rpm，5min，收集菌體于已滅菌的50ml離心管中，4℃，5500rpm，離心5min，棄上清，用50ml冰浴過(guò)的無(wú)菌的10%甘油重懸菌體，4℃，5500rpm，再離心5min，重復(fù)上述操作3次，最后一次，利用棄上清時(shí)的殘余液體重懸菌體，取80μL于至新的無(wú)菌EP管中。-80℃凍存。

將-80℃凍存的感受態(tài)細(xì)胞置于冰中融化10min，加入1μL的pSim質(zhì)粒，混勻后加入電擊杯中，冰浴2min，1.8KV電擊轉(zhuǎn)化，電擊后立即加入1ml的LB培養(yǎng)基，30℃，220rpm/min復(fù)蘇20min，取適量菌液涂布于滅瘟素平板上（滅瘟素濃度200μg/ml），30℃倒置過(guò)夜培養(yǎng)，第二天長(zhǎng)出的單克隆即是攜帶pSim質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)。

4.2 目的基因的敲除

4.2.1同源重組片段的制備

以pKD3質(zhì)粒為模板，使用引物SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠純化回收，獲得兩端含有wcaj同源臂的敲除片段wcaj-Fragment I。

4.2.2 第一步同源重組（wcaj-Fragment I的轉(zhuǎn)化）

挑取攜帶pSim質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)單克隆接種至5ml LB培養(yǎng)基中，37℃，220rpm/min，過(guò)夜培養(yǎng)。第二天按1%的接種量，轉(zhuǎn)接至200ml的LB培養(yǎng)基中。37℃，220rpm/min，培養(yǎng)至OD₆₀₀約為0.6~0.8，將菌液轉(zhuǎn)至42℃水浴搖床中，150rpm/min，20min，然后冰浴20min，4℃，5500rpm/min，離心5min，收集菌體于已滅菌的50ml離心管中，4℃，5500rpm，離心5min，棄上清，用50ml冰浴過(guò)的無(wú)菌的10%甘油重懸菌體，4℃，5500rpm，再離心5min，重復(fù)上述操作3次，最后一次，利用棄上清時(shí)的殘余液體重懸菌體，取80μL于至新的無(wú)菌EP管中，加入4μLlacZ-Fragment I片段，混勻后加入電擊杯中，冰浴2min，1.8KV電擊轉(zhuǎn)化，電擊后立即加入1ml的LB培養(yǎng)基，37℃，180rpm/min，培養(yǎng)2h，取適量菌液涂布于抗性平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。第二天挑取單克隆，PCR鑒定出wcaj基因被wcaj-Fragment I替換的正確克隆，即E.coli BL21（DE3） 。

基因缺失后抗性的消除

4.3.1E.coli BL21 (DE3) ?wcaj菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備

挑取E.coli BL21 (DE3) ?wcaj單克隆接種至5ml的LB培養(yǎng)基中，按照上面步驟制備感受態(tài)，電轉(zhuǎn)pCP20質(zhì)粒，電擊后立即加入1ml的LB培養(yǎng)基，30℃，180rpm/min，培養(yǎng)20min，取適量菌液涂布于氨芐青霉素平板上（氨芐青霉素濃度100 μg/ml），30℃過(guò)夜培養(yǎng)。第二天挑取單克隆至5ml的LB培養(yǎng)基中（氯霉素濃度25μg/ml），30℃，180rpm/min, 培養(yǎng)10h，轉(zhuǎn)移至新的液體培養(yǎng)基，不加抗生素，42℃，培養(yǎng)6h后，稀釋涂板，37℃，倒置過(guò)夜培養(yǎng)，第二天挑單克隆，分別在無(wú)抗板和氯霉素板上進(jìn)行影印。氯霉素板上未長(zhǎng)，但是無(wú)抗板對(duì)應(yīng)位置上長(zhǎng)出的單克隆，即為抗性消除成功的陽(yáng)性克隆，進(jìn)一步通過(guò)PCR驗(yàn)證。

4.4 剩余2個(gè)基因的敲除

剩余2個(gè)基因的敲除原理和步驟與wcaj相同，以敲除了wcaj基因的菌株為基礎(chǔ)，通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟中的4.2和4.3，可依次將全部3個(gè)基因敲除，最終構(gòu)建出缺失的E.coli BL21 (DE3) ?3。

圖4為野生型E.coli BL21(DE3)和E.coli BL21 (DE3) ?3的PCR驗(yàn)證結(jié)果，兩組結(jié)果使用相同的鑒定引物，圖4中泳道2的條帶泳道1的條帶相比，出現(xiàn)了顯著的減小，表明相應(yīng)目的基因已經(jīng)被成功敲除。pSim質(zhì)粒為溫度敏感型質(zhì)粒，培養(yǎng)溫度高于30℃的條件下，質(zhì)粒將會(huì)丟失，因此，在將pSim質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)后，菌株將一直在30℃條件下培養(yǎng)，以防止pSim質(zhì)粒的丟失。

實(shí)施例5

產(chǎn)2'-巖藻乳糖E.coli BL21 (DE3) ?3菌株的構(gòu)建

以敲除3個(gè)基因的E.coli BL21 (DE3)?3菌株為基礎(chǔ)，制備感受態(tài)細(xì)胞（方法參照實(shí)驗(yàn)步驟4.1），將pCDFDuet-1-lacY，pETDuet-1-manB-manC-gmd-fcl，pACYCDuet-1-rcsA-manA轉(zhuǎn)入，在LB平板（氯霉素50 μg/ml，氨芐青霉素100 μg/ml，鏈霉素50 μg/ml）上篩選正確的克隆。經(jīng)雙酶切驗(yàn)證得到攜帶整個(gè)2'-巖藻乳糖合成途徑的菌株E.coli BL21(DE3) ?3/2'-FL。得到5~8g/L的2'-巖藻乳糖，圖7為本發(fā)明中合成2'-巖藻乳糖的代謝途徑。

實(shí)施例6

E.coli BL21 ?3/2'-FL菌株2'-FL合成的驗(yàn)證

將菌株接種至5mL的LB培養(yǎng)基中（氯霉素50 μg/ml，氨芐青霉素100μg/ml，鏈霉素50μg/ml），37℃，220rpm/min，過(guò)夜培養(yǎng)。第二天按1%的接種量轉(zhuǎn)接至優(yōu)化的M9培養(yǎng)基中，OD₆₀₀約為0.6時(shí)誘導(dǎo)（IPTG濃度0.2mM），轉(zhuǎn)至25℃，誘導(dǎo)2h后，加入2mL乳糖，約4h后取樣，4℃，7000rpm/min，離心10min，將上清與沉淀分開(kāi)。上清過(guò)0.22μm濾膜。通過(guò)ESI-MS和高效液相色譜檢測(cè)。

沉淀首先用滅菌水懸浮，4℃，7000rpm/min，離心10min，重復(fù)一次，然后采取反復(fù)凍融來(lái)破碎細(xì)胞，破碎后，4℃，5100rpm/min，離心25min，

離心，將上清轉(zhuǎn)移至10mL的離心管中，過(guò)0.22μm濾膜，通過(guò)ESI-MS檢測(cè)。

2'-巖藻乳糖的檢測(cè)：，

儀器：Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer (Thermo Electron,CA)

離子化模式：電噴霧負(fù)離子模式;

電噴霧范圍：400-700m/z;

干燥器溫度：220℃；

噴霧壓力：45psi；

毛細(xì)管電壓：4500V;

進(jìn)樣量：0.2mL/min;

碰撞氣體為氮?dú)猓o助氣體為氦氣；

高效液相檢測(cè)

色譜柱：Venusil C18柱（5μm particle size，4.6 by 250mm）；

流動(dòng)相：10% 乙腈， 90% 三乙胺冰醋酸（pH 6.0）；

流速：0.6mL/min;

進(jìn)樣量5μL。

以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制，盡管參照上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的范圍和精神。

SEQUENCE LISTING

<110> 南開(kāi)大學(xué)

<120> 一種構(gòu)建重組大腸桿菌生物合成2'-巖藻乳糖的方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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