本發(fā)明涉及中藥提取物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種黨參中抗衰老成分的提取方法，還涉及提取到的黨參中抗衰老成分的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中藥品種繁多，且大多數(shù)中藥中含有多糖類成分，因此，如何充分利用好這一寶貴的自然資源是目前亟待解決的課題。目前對(duì)中藥中多糖類成分的研究還存在以下主要問題：(1)分離純化工藝較繁瑣，成本較高，不利于工業(yè)化；(2)結(jié)構(gòu)研究還較膚淺，大多僅確定了部分一級(jí)結(jié)構(gòu)，而對(duì)其高級(jí)結(jié)構(gòu)未見報(bào)道；(3)活性研究一般用的都是粗多糖，缺乏多糖結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究。因此，實(shí)用、高效的分離純化技術(shù)研究和深入、系統(tǒng)的構(gòu)-效關(guān)系研究應(yīng)是今后中藥中多糖類成分研究的主要方向。

黨參為桔?？浦参稂h參Cdoonopisispilosula(Farneh.)Nan-nf,素花黨參CodonoPsispilouslaNannfvar.modesatN(annf)L.T.shen或川黨參Codonopisisatngshenoliv.的干燥根，是我國(guó)常用的補(bǔ)益中藥。本品性甘、味平，主治脾肺虛弱，氣短心悸，內(nèi)熱消渴等癥，臨床上廣泛用于降血脂、降血糖、抗衰老等癥。

黨參化學(xué)成分的研究主要集中在香豆素、黃酮等小分子化合物，而對(duì)其中多糖類成分尚停留在粗多糖的含量測(cè)定及提取工藝優(yōu)化的層面，缺乏進(jìn)一步的分離精制過程研究；另外，對(duì)黨參藥理活性的研究大多僅針對(duì)粗提物，不利于明確藥理活性物質(zhì)基礎(chǔ)，更阻礙了深入探討黨參化學(xué)成分與藥理活性之間關(guān)系的作用機(jī)制研究。因此，進(jìn)行黨參多糖的分離純化、進(jìn)一步尋找藥材黨參的活性成分并闡述相應(yīng)的構(gòu)-效關(guān)系，是目前亟待解決的問題。只有不斷地、更加深入地解決這些問題才能使黨參這一傳統(tǒng)中藥更好的服務(wù)于人類的健康事業(yè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前對(duì)黨參多糖的研究多集中在粗多糖的藥理活性研究上，對(duì)其進(jìn)一步的分離純化還需要更深入的研究，本發(fā)明旨在建立黨參粗多糖的提取和分離方法，獲得黨參多糖分級(jí)組分，并進(jìn)一步尋找、追蹤黨參多糖的抗衰老活性部位，為探索黨參參多糖的構(gòu)-效關(guān)系、完善藥材黨參的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系乃至新藥資源開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，提供了一種黨參中抗衰老成分的提取方法。

本發(fā)明還提供了提取到的黨參中抗衰老成分的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

一種黨參中抗衰老成分的提取方法，包括以下步驟：

(1)黨參粉碎后脫脂，用乙醇回流去除小分子化合物，得藥渣，晾干；

(2)藥渣用水加熱回流提取若干次，提取液合并后減壓濃縮，離心取上清液，采用80％乙醇醇沉得醇沉多糖，醇沉多糖經(jīng)過洗滌、溶劑揮干后得到黨參粗多糖；

(3)黨參粗多糖制成溶液，用0.45μm的濾膜抽濾，選擇300KD的超濾膜進(jìn)行超濾，然后依次用30KD和5KD的超濾膜分別對(duì)黨參粗多糖進(jìn)行超濾，分別得到黨參多糖組分Co1、Co2、Co3。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(3)中超濾壓力為0.21MPa，溫度為25℃。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(1)中脫脂用的萃取液為石油醚，用量為黨參體積的3倍，冷凝水回流脫脂5-6h，棄去萃取液，重復(fù)操作3次。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(1)中去除小分子化合物使用95％的乙醇溶液，體積為黨參粉末體積的3倍，回流提取，棄去提取液，循環(huán)重復(fù)3次，回流時(shí)間分別為2.0、1.5、1.0h。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(2)中水的加入量為黨參質(zhì)量的10-12倍，85℃加熱回流提取2次，回流時(shí)間分別均為1.0h。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(2)中2次水提取液合并后減壓濃縮至十到十六分之一體積，離心取上清液，采用80％乙醇醇沉。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(2)中醇沉多糖依次以無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌。

所述的提取方法，優(yōu)選步驟(2)中離心轉(zhuǎn)速4000r/min，時(shí)間15min。

提取方法提取得到的參多糖組分Co3在制備抗衰老藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明選用超濾分級(jí)多糖技術(shù)，耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)之前的準(zhǔn)備工作即為超濾杯的清洗和超濾膜的預(yù)處理，且超濾膜的清潔也十分簡(jiǎn)便，只需2～4天即可完成分級(jí)，而用常規(guī)的離子柱層析分級(jí)則需要約10天，不但耗時(shí)長(zhǎng)且耗費(fèi)大量的試劑和人工，同時(shí)給環(huán)境帶來污染。同常規(guī)的分離方法相比，超濾膜分級(jí)具有分離效率高、能耗低、設(shè)備簡(jiǎn)單、無污染等優(yōu)點(diǎn)，是行之有效的、具有廣闊發(fā)展前景的分離方法。

2.本發(fā)明將得到的三個(gè)黨參多糖組分分別進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，通過還原能力、DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力四個(gè)指標(biāo)綜合、全面地分析了黨參各組分的抗氧化能力。為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)的抗氧化實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

3.本發(fā)明最終將體外抗氧化活性最高的組分進(jìn)行了體內(nèi)的抗氧化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過黨參多糖對(duì)D-半乳糖所致的衰老作用，得出黨參多糖具有顯著的抗衰老活性，為開發(fā)有效的抗衰老藥物提供依據(jù)。

附圖說明

圖1為Co1組分紫外光譜掃描圖，

圖2為Co2組分紫外光譜掃描圖，

圖3為Co3組分紫外光譜掃描圖，

圖4為Co1組分紅外光譜，

圖5為Co2組分紅外光譜圖，

圖6為Co3組分紅外光譜圖，

圖7為黨參多糖三組分還原能力比較，濃度單位為mg/mL，

圖8為黨參多糖組分Co1、Co2、Co3清除率比較，

圖9為黨參多糖組分Co1、Co2、Co3清除率比較，

圖10為黨參多糖組分Co1、Co2、Co3超氧陰離子清除能力比較。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明：

實(shí)施例1

1.儀器與試藥

1.1儀器

TU-1901紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；中空纖維超濾試驗(yàn)裝置(北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司)；中空纖維超濾組件截留分子量分別為300KD、150KD、30KD、10KD、5KD、3KD(內(nèi)壓式超濾膜有效膜面積為0.3m²，外壓式超濾膜有效膜面積為0.9m²)(北京旭邦膜設(shè)備有限責(zé)任公司)；漩渦震蕩器(北京華爾博科技有限責(zé)任公司)；LGJ-10冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)科學(xué)儀器四廠)；高速冷凍離心機(jī)(Hettich有限責(zé)任公司)；ML503電子天平(Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)。

1.2試藥

考馬斯亮藍(lán)G-250(上海邁坤化工有限公司)；牛血清白蛋白(北京恒業(yè)中遠(yuǎn)化工有限公司)；安捷倫1260(Agilent 1260Infinity)系統(tǒng)色譜柱型號(hào)：安捷倫(Agilent Zorbox SB-C18,4.6×150mm,5m)。

2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1分析方法

2.1.1紫外光譜掃描

將黨參多糖樣品配成0.1mg/ml的溶液，用紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)190～900nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。

2.1.2黨參粗多糖含量測(cè)定

總糖含量的測(cè)定采用硫酸-苯酚比色法(同“方法2.2”)。

2.1.蛋白含量的測(cè)定

多糖樣品的蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法(同“方法2.3”)。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1黨參多糖粗提液的制備

(1)取黨參藥材100.0g，置1000mL圓底燒瓶中，加入3倍體積的石油醚回流脫脂3次，每次6h，將脫脂后的藥材揮干溶劑，再用95％乙醇回流3次，每次乙醇加入量均為600mL，回流時(shí)間分別為2.0、1.5、1.0h，以去除單糖等小分子化合物，過濾，藥渣晾干；

(2)藥渣用水加熱回流提取2次，每次蒸餾水加入量均為1200mL，回流時(shí)間分別均為1.0h，2次提取液合并后減壓濃縮至150mL，離心(4000r/min，15min)取上清液，采用80％乙醇醇沉，醇沉多糖依次以無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，溶劑揮干后得到黨參粗多糖樣品。稱重并計(jì)算醇沉多糖的提取率。

2.2.2超濾法分級(jí)黨參多糖的研究

將制備好的黨參多糖溶解得到的溶液初步的采用0.45μm的濾膜抽濾，以除去溶液中的固形物，降低對(duì)超濾膜的污染。選用合適的超濾膜，在適當(dāng)?shù)膲毫湍ね康那闆r下，以一定的流速進(jìn)行超濾，當(dāng)壓力變大時(shí)，可以加入適量的去離子水以降低提取液的濃度，反復(fù)的超濾，得到少量的濃縮液和大量的濾過液。整個(gè)超濾系統(tǒng)由蠕動(dòng)泵、超濾裝置、壓力表、調(diào)壓閥及相應(yīng)的管路組成。

2.2.2.1超濾膜的選擇

控制超濾壓力為0.21MPa，溫度為25℃，待條件穩(wěn)定后，取上述制備好的提取液500ml，濃縮至100ml。選擇截留分子量分別為300KD、150KD、30KD、10KD、5KD、3KD的超濾膜，分別計(jì)算其截留率R和膜通量J。選擇合適的超濾膜。不同規(guī)格的超濾膜對(duì)截留率和膜通量的影響，如下表1所示：

表1 不同規(guī)格的超濾膜對(duì)截留率和膜通量的影響

由表1可知：截留分子量越大，截留率越低，膜通量越大，30KD和10KD相比截留率相差不明顯，而膜通量顯著增加；5KD和3KD相比截留率液相差不明顯，而5KD的膜通量顯著增加，因此，選擇300KD的超濾膜進(jìn)行初濾，30KD和5KD分別對(duì)多糖進(jìn)行截留。

2.2.2.2超濾壓力的選擇

選擇截留分子量為10KD的超濾膜，實(shí)驗(yàn)溫度為25℃，取上述制備好的提取液500ml，濃縮至100ml。分別在0.1MPa、0.15MPa、0.2MPa、0.25MPa、0.3MPa壓力下，考察黨參多糖提取液的膜通量，選擇合適的操作壓力，進(jìn)行溶液的分級(jí)。在一定的條件下，不同的壓力對(duì)截留率和膜通量的影響如下表2：

表2 超濾壓力對(duì)截留率和膜通量的影響

由表2可知，適當(dāng)?shù)脑黾映瑸V壓力，膜通量在一定范圍內(nèi)可以提高，但隨著超濾壓力的增大，膜表面的濃度也會(huì)增加，因此導(dǎo)致截留率會(huì)相應(yīng)的降低，由上表可以看出，當(dāng)超濾壓力為0.2MPa時(shí)，膜通量相對(duì)較大，而截留率也不至于太低，因此選擇超濾壓力為02MPa較合適。

2.2.2.3超濾溫度的選擇

控制超濾壓力為0.21MPa，截留分子量為10KD的超濾膜，取上述制備好的提取液500ml，濃縮至100ml。采用恒溫水浴鍋控制溫度，分別選定實(shí)驗(yàn)溫度為25℃、35℃、45℃，考察黨參多糖提取液的膜通量和截留率的變化，最終選擇合適的溫度。

多糖的生物活性會(huì)隨著溫度的升高而改變，因此一般情況下超濾的溫度不宜超過50℃。因此，本試驗(yàn)控制在45℃以下，以下表3是超濾溫度分別為25℃、35℃、45℃時(shí)，對(duì)截留率和膜通量的影響：

表3 超濾溫度對(duì)截留率和膜通量的影響

一般情況，膜通量會(huì)隨著溫度的升高而增加，但是隨著溫度的升高，溶液的黏度也會(huì)增加，相應(yīng)的膜的截留率也會(huì)下降，因此在保證有一定的膜通量的情況下，選擇25℃作為超濾溫度，更加好操作。

2.2.2.4超濾法分離黨參多糖的流程

將預(yù)處理的黨參多糖粗提液采用中空纖維超濾實(shí)驗(yàn)裝置，設(shè)定超濾壓力為0.20MPa，超濾溫度為25℃，超濾膜選用CLN-300KD、CLN-30KD、CLN-5KD三種濾膜，其中CLN-300KD的超濾膜起初濾的作用，CLN-30KD和CLN-5KD分別可截留3萬以上，3萬～5000,和5000以下分子質(zhì)量的多糖共三個(gè)組分，分別記為Co1、Co2、Co3。

2.2.3黨參多糖組分的含量測(cè)定和結(jié)構(gòu)分析

2.2.3.1黨參多糖含量的測(cè)定

將得到的黨參多糖分級(jí)組分，采用硫酸-苯酚法測(cè)定含量，并計(jì)算多糖的純度：

黨參多糖含量＝(A/0.6085)×100％

黨參多糖的純度＝(截留液體積×截留液濃度)/多糖干制品的質(zhì)量％

黨參多糖組分Co1、Co2、Co3的糖含量如下：

表4 黨參多糖各組分的多糖得率

由表4可知，黨參多糖分級(jí)組分Co3多糖含量和得率均較高，表明，黨參多糖中低分子量的多糖含量較高。

2.2.3.2黨參多糖紫外光譜掃描

將得到的黨參多糖組分配置成濃度為0.5mg/ml的溶液，采用紫外分光光度計(jì)，對(duì)190-900nm分別進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，記錄掃描圖譜。圖1、2、3分別為黨參多糖組分Co1、Co2、Co3的紫外光譜，光譜顯示在200nm波長(zhǎng)處均有多糖的吸收峰，表明三種組分均含有多糖成分；在280nm波長(zhǎng)處有吸收峰，證明三種組分含有少量的蛋白質(zhì)。

2.2.3.3黨參多糖紅外光譜掃描

將多糖樣品干燥至恒重，分別取3.0mg與KBr混合研磨均勻后壓片，使用紅外光譜掃描儀在4000-400cm^-1內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄掃描圖譜。由圖4、5、6可知黨參多糖組分Co1和Co2差別不大，886cm^-1處有明顯的β-D葡萄糖的吸收峰；圖4和圖5均顯示在3418cm^-1處，圖6顯示在3408cm^-1處有吸收強(qiáng)度一大的寬峰，這是糖分子內(nèi)或分子間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)引起的吸收，也包括-NH₂中-N-H的伸縮振動(dòng)；三個(gè)組分均提示在2930cm^-1處有次甲基(-CH₂)中-C-H的伸縮振動(dòng)的吸收峰；Co1、Co2均在1455-1261cm^-1處，Co3在1417-1101cm^-1處顯示有-C-H的變角振動(dòng)；三圖中均顯示有1633cm^-1的吸收峰，此吸收峰為-C＝O的伸縮振動(dòng)；三圖中均顯示有1056cm^-1的吸收峰，此為醇羥基的變角振動(dòng)；圖4、5顯示有923cm^-1的吸收，此吸收為吡喃糖環(huán)醚鍵(-C-O-C-)的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)；923cm^-1、866cm^-1的吸收為α-D葡萄糖的特征吸收。

實(shí)施例2體外抗氧化化研究

1.儀器與試藥

1.1儀器

TU-1901紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；德國(guó)Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(艾拓思實(shí)驗(yàn)設(shè)備(上海)有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ML503電子天平(Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)；Milli QA純水處理器(Millipore公司)。

1.2試藥

實(shí)施例1得到的黨參多糖Co1、黨參多糖Co2、黨參多糖Co3，磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸TCA、三氯化鐵、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、硫酸亞鐵、水楊酸、抗壞血酸Vc、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)均為分析純。

2.方法與結(jié)果

2.1黨參多糖的抗氧化活性檢測(cè)方法

2.1.1黨參多糖不同組分還原能力的測(cè)定

采用鐵離子還原能力測(cè)定法。由于樣品的還原能力與其抗氧化性成正相關(guān)性，因此樣品反應(yīng)后的生成物在700nm處的吸光度值的大小反映了其還原能力的大小。具體方法如下：

吸取1.0ml 1.0mg/ml的多糖待測(cè)液至試管中，加入3.0ml磷酸鹽緩沖液(0.2M，PH6.6)以及2.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0％的鐵氰化鉀溶液(K₃[Fe(CN)₆)，混合均勻后將該體系置于50℃恒溫20min,然后加入2.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的三氯乙酸(TCA)溶液，混合均勻，3000r離心10min。移取2.5ml上清液與另一試管中，加入2.5ml蒸餾水及0.5ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的三氯化鐵(FeCl₃)溶液，混合均勻，靜置10min后，在700nm處測(cè)定體系的吸光度。以蒸餾水作為陰性對(duì)照，以同濃度維生素C溶液為陽性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，見表5。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，見圖7。

表5 黨參多糖組分Co1、Co2、Co3抗氧化能力測(cè)定表

2.1.2黨參多糖DPPH自由基清除能力的測(cè)定

采用DPPH氧化法測(cè)定。DPPH·自由基，由于苯環(huán)的共軛和位阻及硝基的吸電子作用,屬于比較穩(wěn)定的有機(jī)自由基，具有單電子而使其在517nm處有一強(qiáng)吸收(呈深紫色)。當(dāng)存在自由基清除劑時(shí)，由于其單電子配對(duì)而使其吸收消失，吸光度變小，紫色變淺，其退色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。并且隨著抗氧化劑濃度的增加，DPPH·溶液顏色逐漸越淡,說明對(duì)DPPH·自由基的清除率逐漸增加。具體方法如下：

取1.0mg/ml的多糖溶液2.0ml，加入2.0ml現(xiàn)配的0.2mmol/LDPPH-乙醇溶液，混勻后靜置30min，以50％的乙醇作參比，在517nm測(cè)定樣品的吸光度A。同時(shí)測(cè)定2ml蒸餾水+2mlDPPH-乙醇溶液的吸光度A_DPPH。樣品對(duì)DPPH的清除率為：

自由基清除率(％)＝(A_DPPH-A_樣品)/A_DPPH×100％

分別取樣品Co1、Co2、Co3，分別配置濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0mg/ml的供試品溶液，測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，并計(jì)算DPPH清除率如下表6：

表6 黨參多糖Co1、Co2、Co3DPPH自由基清除率測(cè)定表

以DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)，見圖8。

2.1.3黨參多糖羥自由基清除能力測(cè)定

采用水楊酸法，通過反應(yīng)H₂O₂+Fe→·OH+OH-+Fe³⁺，產(chǎn)生羥自由基(·OH)；·OH氧化水楊酸產(chǎn)生有色物質(zhì)，該產(chǎn)物在510nm處有強(qiáng)吸收；若體系中加入清除·OH的物質(zhì)，則會(huì)減少有色物質(zhì)生成，吸光度降低；吸光度越低，清除·OH效果越好。具體方法如下：

取10ml的試管，每支加入2ml的FeSO₄溶液(6mmol/L)以及2ml不同濃度的多糖溶液，然后加入2ml的H₂O₂(6mmol/L)溶液，搖勻后靜置10min，再加入2ml的水楊酸(6mmol/L)溶液，搖勻后靜置30min，測(cè)定其在510nm處吸光度值A(chǔ)510，以蒸餾水按同樣方法做空白，以Vc作陽性對(duì)照。每個(gè)樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值。羥自由基的清除率(％)計(jì)算公式如下：

清除率(％)＝A₀-(A_i-A_j)/A₀×100％

A₀—不加樣品溶液的吸光度值；

A_i—加入樣品溶液反應(yīng)后的吸光度值；

A_j—不加水楊酸時(shí)溶液的吸光度值。

分別取樣品Co1、Co2、Co3，分別配置濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0mg/ml的供試品溶液，測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，并計(jì)算羥自由基清除率如下表7：

表7 黨參多糖組分Co1、Co2、Co3羥自由基清除率測(cè)定表

以濃度為橫坐標(biāo)，以羥自由基清除率為縱坐標(biāo)見圖9。

在一定的范圍內(nèi)多糖清除羥自由基的能力隨著濃度的增大而增強(qiáng),相同濃度下，多糖對(duì)羥自由基清除能力為Co3>Co2>Co1。

2.1.4黨參多糖超氧陰離子自由基清除能力測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法。鄰苯三酚在堿性條件下能發(fā)生自氧化，生成有色中間物(在365nm處有最大吸收峰)和O^2-﹒，而O^2-﹒對(duì)自氧化又起催化作用，依據(jù)有色中間物生成量的多少，可判斷O^2-﹒生成量的多少。

取6mlTris-HCl(50mmol/L，PH＝8.12)緩沖液置于各試管中，分別加入不同濃度多糖溶液0.5ml，混勻后水浴(37℃)10min，然后加入1ml經(jīng)37℃預(yù)熱過的鄰苯三酚鹽酸溶液(7mmol/L，PR)，搖勻。精確反應(yīng)4min后用0.5ml濃鹽酸終止反應(yīng)，測(cè)定其在325nm處的吸光度值A(chǔ)，即加入多糖溶液后，鄰苯三酚的自氧化速率。依照以上方法，用蒸餾水，代替樣品，所測(cè)值A(chǔ)₀為鄰苯三酚的自氧化速率，以VC作為陽性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，取其平均值。清除率(％)計(jì)算公式如下：

清除率(％)＝(A₀-A)/A₀×100％

式中：A₀——空白鄰苯三酚的自氧化速率；

A——加入樣品溶液后鄰苯三酚的自氧化速率。

取樣品Co1、Co2、Co3，分別配置濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0mg/ml的供試品溶液，測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，并計(jì)算超氧陰離子自由基清除率，如下表8。

表8 黨參多糖Co1、Co2、Co3超氧陰離子自由基清除率測(cè)定表

以多糖濃度為橫坐標(biāo)，以超氧陰離子自由基清除率為縱坐標(biāo)，見圖10。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)黨參多糖不同分子量組分Co1、Co2、Co3抗氧化能力比較如表9。

表9 黨參多糖Co1、Co2、Co3抗氧化能力比較

結(jié)論：分子量越小，抗氧化能力越強(qiáng)，黨參多糖三組分在一定的范圍內(nèi)抗氧化能力均隨著多糖濃度的增大而增強(qiáng)，以Vc作陽性對(duì)照，表明黨參多糖組分Co3具有較強(qiáng)的抗氧化能力。為下一步進(jìn)行體內(nèi)藥理活性研究奠定基礎(chǔ)。

實(shí)施例3對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的保護(hù)作用

衰老小鼠模型的建立有多種，主要分為自然衰老和人為干預(yù)衰老，由于自然衰老模型的建立周期比較長(zhǎng)，所以一般選擇人為干預(yù)建立衰老模型，研究表明D-半乳糖致衰老模型，容易建立，且小鼠的身體機(jī)能表現(xiàn)明顯，所以本試驗(yàn)選擇D-gal致衰老模型小鼠，由于本試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒r(shí)需要頸背部皮下注射，為避免同一籠的小鼠相互撕咬或抓撓，選擇相對(duì)溫順的雌性小鼠。經(jīng)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明采用超濾法分離得到的黨參多糖三組分中Co3的抗氧化能力較強(qiáng)，即清除體內(nèi)自由基的能力較強(qiáng)，因此本試驗(yàn)設(shè)定，黨參多糖Co3高、中、低三個(gè)劑量組為實(shí)驗(yàn)組，以維生素E為陽性對(duì)照組，并同時(shí)設(shè)定，模型對(duì)照組和空白對(duì)照組，共分為六組，通過測(cè)定小鼠血清和肝臟中SOD、GSH-Px和GSH酶的活性以及MDA含量驗(yàn)證黨參多糖Co3對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠的保護(hù)作用，追蹤黨參多糖的抗衰老活性部位。

1.實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

一月齡清潔型雌性ICR Mice 60只，體重20±2g,購(gòu)于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(魯)20140007。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，室溫25℃，各組小鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.2藥品與試劑

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

TU-1901紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；

高速冷凍離心機(jī)(Hettich有限責(zé)任公司)；

ML503電子天平(Mettler Toledo儀器(上海)有限公司)；

MagNALyser全自動(dòng)組織勻漿儀(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司)；

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；

SpectraMax 190微孔板檢測(cè)系統(tǒng)(酶標(biāo)儀)(美谷分子儀器(上海)有限公司)；

數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療器械有限公司)；

漩渦震蕩器(北京華爾博科技有限責(zé)任公司)；

微量移液器(sigma公司)；

96孔培養(yǎng)板(Costar，美國(guó))。

2.方法與結(jié)果

2.1藥物的配置

(1)D-半乳糖的配置：取一定量的D-半乳糖溶于生理鹽水配置成80mg/kg，即4mg/ml體積濃度的D-gal溶液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。

(2)黨參多糖溶液的配置：稱取一定量的黨參粗多Co3,溶于生理鹽水中配置成400mg/kg,即20mg/ml體積濃度的多糖溶液，儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。

2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

2.2.1動(dòng)物分組

將購(gòu)進(jìn)的健康育齡清潔級(jí)ICR純系雌性小鼠，經(jīng)一周環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)，隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、VE陽性對(duì)照組、黨參多糖Co3低劑量組、黨參多糖Co3中劑量組、黨參多糖Co3高劑量組。每組10只，分籠飼養(yǎng)。

2.2.2給藥

除正常對(duì)照組每天頸背部皮下注射生理鹽水，其他5組均按80mg/kg/d的劑量頸背部皮下注射D-gal。與此同時(shí)，黨參多糖Co3低、中、高劑量組分別以100mg/kg/d、200mg/kg/d、400mg/kg/d灌胃，VE陽性對(duì)照組以25mg/kg/d灌胃，正常對(duì)照組和衰老模型組小鼠則以相應(yīng)體積的生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)周期為48天。

2.2.3組織樣品的處理及制備

每周對(duì)小鼠的體重測(cè)量?jī)纱危凑障鄳?yīng)體重確定給藥量，實(shí)驗(yàn)第48天，停止藥物干預(yù)，小鼠禁食12小時(shí)，以眼眶后靜脈叢法取血，取血后頸椎脫臼法處死小鼠，取出肝臟用0.9％預(yù)冷的生理鹽水制備10％的組織勻漿備用。分別測(cè)定SOD、GSH-PX、T-AOC的酶活性，及MDA的含量。

(1)血清的制備：ICR小鼠靜脈叢取血后，將血液移入2ml離心管中，靜置2h，再將離心管放入冷凍離心機(jī)3500rpm/min離心15min，取上清，并將上清置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存。

(2)肝組織：將小鼠頸部脫臼處死后，以手術(shù)剪及鑷子迅速解剖，取出肝臟組織，并用預(yù)冷的生理鹽水將血液及殘留脂肪組織清洗干凈，再用定性濾紙將小鼠肝臟組織表面的水分吸干，使用電子天平準(zhǔn)確稱取小鼠肝臟1g，加入預(yù)冷的生理鹽水，并用組織勻漿儀對(duì)肝臟組織進(jìn)行研磨，制備成10％的肝臟組織勻漿備用。

2.3實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定

2.3.1組織樣品蛋白含量測(cè)定

小鼠血清、肝臟組織勻漿的蛋白含量測(cè)定采用碧云天生物有限公司的Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)載體為96孔酶標(biāo)板。

(1)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取一96孔板，按表10所述分別加入相應(yīng)的試劑：

表10 蛋白含量測(cè)定參考表

(2)各孔加入200μlG250染色液，室溫放置3～5min。

(3)用酶標(biāo)儀測(cè)定A595，或560～610nm之間的其他波長(zhǎng)的吸光度。

(4)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和使用的樣品體積計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

2.3.2MDA含量測(cè)定

MDA含量測(cè)定的意義及原理：丙二醛(MDA)可以形成脂質(zhì)過氧化物，通過測(cè)定MDA的量來反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。本試劑盒在較高的溫度及酸性環(huán)境中與TBA發(fā)生反應(yīng)，生成紅色的MDA-TBA加合物，此加合物在535nm處有最大吸收，據(jù)次可以采用比色法測(cè)定MDA的含量。

小鼠血清、肝臟組織勻漿的丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用碧云天生物有限公司的脂質(zhì)氧化(MDA)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)載體為96孔板。樣品測(cè)定步驟如下：

(1)取適量標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水稀釋至1、2、5、10、20、50μM。在離心管內(nèi)加入0.1ml生理鹽水作為空白對(duì)照，加入0.1ml上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，加入0.1ml樣品用于測(cè)定；隨后加入0.2mlMDA檢測(cè)工作液，參考表11：

表11 MDA含量測(cè)定參考表

混勻后，沸水浴加熱15min。加熱時(shí)務(wù)必注意避免液體瀑沸濺出。

(3)水浴冷卻至室溫，1000g離心10min。取200μl上清加入到96孔板中，用酶標(biāo)儀測(cè)定532nm處的波長(zhǎng)。

(4)MDA含量的計(jì)算：血清樣品可以直接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算獲得MDA的摩爾濃度，肝臟組織勻漿，計(jì)算出樣品溶液中的MDA含量后，通過單位重量的蛋白含量來計(jì)算樣品中MDA的含量。

2.3.3GSH-Px活力的測(cè)定

GSH-Px測(cè)定的意義及原理：谷胱甘肽過氧化物酶可以清除活細(xì)胞內(nèi)的過氧化物，在保護(hù)細(xì)胞免受自由基損傷過程中起到了關(guān)鍵的作用。細(xì)胞內(nèi)的脂類容易和自由基發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生脂類過氧化物。谷胱甘肽過氧化物酶可以利用還原型谷胱甘肽(GSH)還原脂類過氧化物，從而消除自由基的毒害作用。谷胱甘肽過氧化物酶還可以利用GSH催化過氧化氫以及許多有機(jī)過氧化物，產(chǎn)生水或有機(jī)醇。如果以過氧化氫為底物進(jìn)行檢測(cè)，則同樣可以分解過氧化氫的過氧化氫酶的酶活性會(huì)干擾谷胱甘肽過氧化物酶的測(cè)定。本試劑盒利用了一種間接測(cè)定的方法，GSH-Px可以催化GSH產(chǎn)生GSSG，而GSH可以利用NADPH催化GSSG產(chǎn)生GSH，通過檢測(cè)NADPH的減少量就可以計(jì)算出GSH-Px的活力水平。

小鼠血清、肝臟組織勻漿的GSH-Px活力測(cè)定采用碧云天生物有限公司的谷胱甘肽過氧化物酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)載體為96孔板。樣品測(cè)定步驟參考表12：

表12 GSH-Px活力測(cè)定參考表

(1)參考上表，依次加入檢測(cè)緩沖液、待測(cè)樣品和GPx檢測(cè)工作液，混勻。加入4μl15mM過氧化物試劑溶液后，開始反應(yīng)，需要混勻。

(2)采用酶標(biāo)儀測(cè)定A₃₄₀。每隔30s測(cè)定一次A₃₄₀,，連續(xù)記錄3min，獲得6個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)，取中間三個(gè)數(shù)據(jù)的平均值作為最終數(shù)據(jù)。

(3)樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活力的測(cè)定：

a[樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活力]＝[檢測(cè)體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力]×[稀釋倍數(shù)]/[樣品中的蛋白濃度]

注：[樣品中谷胱甘肽過氧化物酶活力]的單位為：U/mg蛋白或mU/mg蛋白；

[樣品中的蛋白濃度]的單位為：mg/ml。

B[檢測(cè)體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力]＝[A₃₄₀/min(sample)-A₃₄₀/min(blank)]/0.00622

注：[檢測(cè)體系中谷胱甘肽過氧化物酶活力]的單位為mU/ml。

2.3.4SOD活力的測(cè)定

SOD活力的測(cè)定的意義及原理：超氧化物歧化酶(SOD)是一種具有特殊生物催化功能的蛋白質(zhì)，它能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成過氧化氫(H₂O₂)和氧氣(O₂)，維持機(jī)體中自由基產(chǎn)生和清除的動(dòng)態(tài)平衡，可以保護(hù)生物體，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶。因此，通過測(cè)定SOD的含量，就可以間接的反應(yīng)體內(nèi)自由基的活性。目前測(cè)定SOD比較先進(jìn)的方法包括WST-1法和WST-8法，其中WST-8法更加穩(wěn)定、靈敏，本試劑盒采用WST-8法，原理為WST-8可以和超氧化物陰離子(此為黃嘌呤氧化酶催化產(chǎn)物)反應(yīng)產(chǎn)生甲臜染料，該反應(yīng)可以被SOD所抑制。因此可以通過此方法測(cè)定出SOD的酶活力。

小鼠血清、肝臟組織勻漿的SOD活力測(cè)定采用碧云天生物有限公司的CuZn/Mn-SOD活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)載體為96孔板。樣品測(cè)定步驟參考表13：

表13 SOD活力測(cè)定參考表

注：如果樣品有顏色或含有抗氧化物質(zhì)，需要設(shè)置空白對(duì)照3，如果樣品沒有顏色且不含有抗氧化物質(zhì)則不必設(shè)置空白對(duì)照3。

(1)按上表加入反應(yīng)試劑37℃孵育30min。

(2)采用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的波長(zhǎng)。

(3)樣品中總SOD活力的計(jì)算：

a.SOD酶活力單位的意義：在上述黃嘌呤氧化酶偶聯(lián)反應(yīng)體系中抑制百分率為50％時(shí)，反應(yīng)體系中的SOD酶活力定義為一個(gè)酶活力單位(unit)。

b.SOD酶活力的計(jì)算公式：[待測(cè)樣品中SOD酶活力單位]＝[檢測(cè)體系中的酶活力單位]＝[抑制百分率]/(1-[抑制百分率])units

[抑制百分率]＝[(A_{空白對(duì)照1}-A_{空白對(duì)照2})-(A_樣品-A_{空白對(duì)照3})]/(A_{空白對(duì)照1}-A_{空白對(duì)照2})×100％

2.3.5GSH含量的測(cè)定

GSH含量測(cè)定的意義及原理：還原型谷胱甘肽(GSH)作為關(guān)鍵的抗氧化劑，對(duì)于維護(hù)蛋白巰基的氧化還原狀態(tài)有著重要作用。因此，通過測(cè)定GSH的含量，就可以間接的反應(yīng)自由基的活性。本試劑盒通過谷胱甘肽還原酶把氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成GSH，而GSH可以和生色底物DNTB反應(yīng)產(chǎn)生黃色的TNB和GSSG。適當(dāng)配置反應(yīng)體系，前后兩個(gè)反應(yīng)合并起來后，總谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相當(dāng)于一個(gè)顏色產(chǎn)生的限速因素，總谷胱甘肽的量就決定了黃色的TNB的形成量。

小鼠血清、肝臟組織勻漿的GSH含量測(cè)定采用碧云天生物有限公司的GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)載體為96孔板。樣品的測(cè)定步驟參考如下：

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：把10mM GSSG儲(chǔ)備液用蛋白取出試劑M溶液稀釋成15μM GSSG溶液，然后依次稀釋成10、5、2、1、0.5μM GSSG溶液，取15、10、5、2、1、0.5μM GSSG溶液六個(gè)點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)使用96孔酶標(biāo)板，參考下表，依次加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩，混勻。加入150μl總谷胱甘肽檢測(cè)工作液后，混勻。25min孵育5min。立即用酶標(biāo)儀測(cè)定412nm處的波長(zhǎng)，每5min測(cè)定一次，共采5個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)，取第5個(gè)點(diǎn)作為最終結(jié)果。

表14 GSH含量測(cè)定參考表

(3)樣品中總谷胱甘肽含量的計(jì)算:采用單點(diǎn)測(cè)定法，根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出總谷胱甘肽的含量。

2.4試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1小鼠血清抗氧化能力的變化

表15 黨參多糖Co3對(duì)小鼠血清SOD、GSH-Px、GSH及MDA的影響

注：與空白對(duì)照組比較：^aP<0.05；與模型對(duì)照組比較：^bP<0.05；與VE對(duì)照組比較：^cP<0.05；

由表15可得知：與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px和GSH的活性均明顯降低(P<0.05)，而MDA的含量顯著增加(P<0.05)，證明D-半乳糖致正常小鼠衰老模型造模成功。黨參多糖Co3高劑量組，均能顯著升高SOD、GSH-Px和GSH的活性(P<0.05)，且顯著降低MDA的含量(P<0.05)，與VE陽性對(duì)照組無顯著性區(qū)別(P>0.05)，證明黨參多糖組分Co3高劑量組對(duì)小鼠的抗氧化作用顯著；而黨參多糖Co3中劑量組和黨參多糖Co3低劑量組對(duì)小鼠的抗氧化作用不明顯。

2.4.2小鼠肝臟抗氧化能力的變化

表16 黨參多糖Co3對(duì)小鼠肝臟組織勻漿SOD、GSH-Px、GSH及MDA的影響

注：與空白對(duì)照組比較：^aP<0.05；與模型對(duì)照組比較：^bP<0.05；與VE對(duì)照組比較：^cP<0.05；

由表16可知：與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟組織勻漿中SOD、GSH-Px和GSH的活性均明顯降低(P<0.05)，而MDA的含量顯著增加(P<0.05)，證明D-半乳糖致正常小鼠衰老模型造模成功。黨參多糖高劑量組Co3能顯著提高小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px和GSH酶的活性(P<0.05)，并能顯著降低MDA的含量(P<0.05)，與VE陽性對(duì)照組相比，無顯著性變化(P>0.05)；而黨參多糖Co3中劑量組和低劑量組對(duì)小鼠肝臟中SOD、GSH-Px和GSH的活性及MDA的含量的影響較小(P>0.05)。

目前，小鼠的抗衰老實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ陀凶匀凰ダ系膶?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、膽堿能神經(jīng)損傷的衰老模型、轉(zhuǎn)基因衰老動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、代謝紊亂誘發(fā)的衰老實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、?shí)驗(yàn)性自身免疫性衰老模型等。本試驗(yàn)采用D-半乳糖頸背部皮下注射誘導(dǎo)模型。研究表明，D-半乳糖致衰老模型，與人類自然衰老有相似的細(xì)胞退行性變化和生化變化，其優(yōu)點(diǎn)是可行性強(qiáng)、易于控制，能夠較好的模擬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的衰老行為、氧化應(yīng)激等方面，常被用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)、抗免疫及抗氧化等的影響研究。D-半乳糖衰老模型的評(píng)估指標(biāo)主要有外觀特征觀察、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清、肝臟組織中SOD、GSH-Px和GSH酶的活性以及MDA含量的變化。

SOD能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用，生成過氧化氫和氧氣，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶；GSH-Px可以通過清除活細(xì)胞內(nèi)的過氧化物以及利用還原型谷胱甘肽還原脂類過氧化物，來保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損傷及毒害；GSH作為關(guān)鍵的抗氧化劑，對(duì)于維護(hù)蛋白巰基的氧化還原狀態(tài)具有重要的作用；MDA作為脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物，通過對(duì)其水平的檢測(cè)，來用作評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)。因此本試驗(yàn)選定SOD、GSH-Px和GSH酶的活性以及MDA含量作為小鼠抗衰老實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，黨參多糖組分Co3對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老模型有顯著的抗衰老作用。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受實(shí)施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡(jiǎn)化均應(yīng)為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。