本發(fā)明屬于食品和化學領域，具體涉及一種從南極磷蝦中純化制備2,6-二叔丁基對甲酚的方法。

背景技術：

南極磷蝦(Euphausia superba)是生活于南極生態(tài)系統(tǒng)中的一種重要的生物資源，屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、磷蝦目，磷蝦的壽命一般為5-7年，2齡以后即成熟，體長最大可達到60mm以上。南極磷蝦具有結群的習性，經(jīng)常生活在200m以內的淺水層形成密集的群體，是鳥類和魚類等南極生物主要的食物來源。南極磷蝦是地球上數(shù)量最大繁衍最成功的單種生物資源之一，其生物蘊藏量約為6.5×10⁸～10×10⁸噸，最新估算量為3.79×10⁸噸。南極磷蝦含有豐富的油脂，油脂中的抗氧化物質如蝦青素、蝦青素酯、不飽和脂肪酸、2，6-二叔丁基對甲酚等。

2，6-二叔丁基對甲酚(縮寫為BHT)是國內外廣泛使用的油溶性抗氧化劑，抗氧化能力較強，耐熱及穩(wěn)定性好。主要可以用于油脂等食品添加中，防止其酸敗，維持食品的顏色和氣味等，還廣泛用于高分子材料、石油制品、和食品加工工業(yè)中。

目前2，6-二叔丁基對甲酚較常見的制備方法為化學合成方法，并未見在南極磷蝦中的提取純化的研究報道。因此，研究一種從南極磷蝦中提取純化的2，6-二叔丁基對甲酚的方法，這對南極磷蝦資源的開發(fā)利用以及2，6-二叔丁基對甲酚的制備具有十分重要的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種操作簡單、準確、可靠的南極磷蝦2，6-二叔丁基對甲酚的純化制備方法。

本發(fā)明采用下述技術方案：

一種從南極磷蝦中純化制備2,6-二叔丁基對甲酚的方法，包括以下工序：

制備粗提物的工序：南極磷蝦用甲醇進行提取，得到2,6-二叔丁基對甲酚粗提物；

第一次純化工序：該工序采用薄層層析刮板法對2,6-二叔丁基對甲酚粗提物進行純化，得到2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品；所述薄層層析中以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1為展開劑；

定性工序：該工序采用分析型高效液相色譜法對2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品進行定性分析，根據(jù)保留時間確定所述第一次純化工序的粗樣品中含有2,6-二叔丁基對甲酚；

第二次純化工序：該工序采用制備型高效液相色譜法對2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品進行分離純化，在目標保留時間內將含有2,6-二叔丁基對甲酚的洗脫液接出，蒸發(fā)除去溶劑得到純化后的2,6-二叔丁基對甲酚樣品。

本發(fā)明的制備粗提物的工序中，所述提取方法采用超聲波提取，超聲波提取條件為：室溫、300-400W、20或40kHz，提取時間為10-20分鐘；優(yōu)選的，所述超聲波提取條件為：室溫、350W、40kHz、提取時間為15分鐘。

制備2,6-二叔丁基對甲酚粗體物的具體操作方法為：將南極磷蝦與甲醇進行超聲波提取，過濾提取液，得到濾液，將所述濾液蒸干，然后用甲醇溶解，即得到2,6-二叔丁基對甲酚粗提物。

其中，所述南極磷蝦選用新鮮南極磷蝦，從提高2,6-二叔丁基對甲酚的觀點出發(fā)，所述南極磷蝦與甲醇的添加量比例為1g：(3～6)mL，采用此比例的南極磷蝦和甲醇提取為后續(xù)純化提供了良好的基礎。

本發(fā)明的第一次純化工序中：所述薄層層析刮板法的基本操作為本領域技術人員所公知的技術手段，基本操作步驟為：點樣、展開、顯色、刮板、洗脫。

對于薄層層析方法的分離純化的效果十分重要的因素是展開劑，在展開劑的選取過程中，嘗試了多種組合：氯仿：甲醇：乙酸、氯仿：乙酸乙酯、氯仿：乙酸乙酯：乙酸、乙酸乙酯：丙酮：石油醚等，但是2,6-二叔丁基對甲酚的Rf值偏高，且拖尾嚴重。因此選取極性較低的展開劑組合，通過嘗試各溶劑間組合和體積的配比，最終確定了石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1(V/V/V)為最適展開劑，此時南極磷蝦中的2,6-二叔丁基對甲酚得到了很好的分離純化，且Rf值合適。

本發(fā)明中的薄層層析刮板法，本發(fā)明選取高效薄層硅膠板H板(10×20cm)，展距為8～10cm(優(yōu)選9cm)；染色采用氯化鐵水溶液進行染色，100～110℃烘烤5-10分鐘，根據(jù)顯色結果，確定2,6-二叔丁基對甲酚的Rf＝0.79，其中，所述氯化鐵水溶液的質量分數(shù)為4～6％；洗脫時采用甲醇進行溶解；采用甲醇溶解后，進行超聲波提取，超聲波條件為：超聲時間為5～8min，功率為300～400W。

優(yōu)選的，制備2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品的具體操作方法為：

取2,6-二叔丁基對甲酚粗提物和標準液點于高效薄層硅膠板H板上，以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-5:1-2:0.5-1為展開劑，展距9.0cm，展完后晾干展板；在距離高效薄層硅膠板H板設定處用玻璃鋼刀沿豎直方向割下小部分薄層板，將割下的薄層硅膠板H板用氯化鐵水溶液進行染色，然后進行烘烤，根據(jù)顯色結果，確定割下的薄層硅膠板H板中2,6-二叔丁基對甲酚的位置(Rf＝0.79)處，對照薄層硅膠板H板上未被染色部分，將處于同一Rf值處的色譜帶刮下，將硅膠粉末放入離心管中，用色譜級甲醇溶解、震蕩。將離心管進行超聲提取5-8min，功率設置為300～400W。超聲完成后，將離心管放入離心機中進行離心，收集上清液，重復進行刮板-超聲-離心-收集上清液過程若干次(優(yōu)選10次)，將收集到的上清液蒸發(fā)除去甲醇，得到2,6-二叔丁基對甲酚色譜帶的濃縮液，即為2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品。其中，所述標準液的制備方法如下：稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液。

分析型高效液相色譜法能夠全面反映樣品組成信息，并對各組分進行定量和定性，采用分析型高效液相色譜儀完成；而制備型液相色譜方法主要是對產(chǎn)品的單體進行提取純化和鑒別。本發(fā)明中的定性工序和第二次純化工序中，高效液相色譜法參數(shù)均如下：色譜柱為C18柱，流動相為甲醇：水＝8～10:1(v/v)；洗脫模式為等度洗脫，流速為0.8～1.2mL/min，進樣量為8～12μL。優(yōu)選的參數(shù)如下，流動相為甲醇：水＝9:1；流速為1mL/min；洗脫時間為16-18min；進樣量為10μL；檢測器為紫外/可見光檢測器，檢測波長為210nm。

本發(fā)明的定性工序中，所述分析型高效液相色譜法的條件為：色譜柱為C18柱，優(yōu)選的型號是YMC-Pack ODS-A，內徑和長度250×4.6mm，粒徑：5μm，孔徑：12nm。

定性工序的具體操作方法為：按照設定好的參數(shù)和條件，稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液，經(jīng)微孔濾膜(優(yōu)選孔徑為0.45μm)過濾后進樣。取2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，用色譜級的甲醇進行溶解，用微孔濾膜(優(yōu)選孔徑為0.45μm)過濾后進樣，用色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm，5μm，12nm)進行檢測，對檢測結果中的峰進行分析，比較標準品與樣品中峰的保留時間，通過保留時間對2,6-二叔丁基對甲酚的存在進行定性；對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積占樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度。

本發(fā)明的第二次純化工序中，所述制備型高效液相色譜法的條件為：色譜柱為C18柱，優(yōu)選的型號是YMC-Pack ODS-A，內徑和長度：250×10mm，填料粒徑：5μm，孔徑：12nm。

第二次純化工序的具體操作方法為：

將2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，結合對粗樣品的純度分析，按照設定好的參數(shù)和條件，利用制備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×10mm，5μm，12nm)將粗樣品進行進一步純化與制備。在目標保留時間內，將含有樣品的洗脫液接出，重復操作，收集合并洗脫液后進行蒸發(fā)，得到純化后的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物。

采用以上方法制備得到的含有2,6-二叔丁基對甲酚的南極磷蝦樣品，該樣品中2,6-二叔丁基對甲酚的含量較高，可達96％以上。

上述技術方案中的一個技術方案具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了南極磷蝦中存在天然抗氧化劑2,6-二叔丁基對甲酚，打破了2,6-二叔丁基對甲酚只能人工合成的傳統(tǒng)觀點，為2,6-二叔丁基對甲酚的制備提供一種新的思路和途徑，對南極磷蝦資源的開發(fā)和利用也具有十分重要的意義。

(2)針對南極磷蝦這一特定的海洋動物，本發(fā)明提供了純化制備南極磷蝦2,6-二叔丁基對甲酚的良好方法，該方法簡單、準確、可靠、穩(wěn)定，得到的樣品中2,6-二叔丁基對甲酚的純度可達96％以上。

(3)本發(fā)明針對南極磷蝦中的2,6-二叔丁基對甲酚，首先采用甲醇預處理南極磷蝦得到含有2,6-二叔丁基對甲酚的粗提物，然后選取薄層層析刮板法制備含有2,6-二叔丁基對甲酚的粗樣品，再通過分析型高效液相色譜法進行成分分析，根據(jù)保留時間確定粗樣品中含有2,6-二叔丁基對甲酚，但同時還發(fā)現(xiàn)部分雜質，最后采用制備型高效液相色譜法分離得到高純度的2,6-二叔丁基對甲酚。本發(fā)明在制備南極磷蝦中的2,6-二叔丁基對甲酚選用了合適的提取、分離和純化的方法，使得本發(fā)明能夠順利高效從南極磷蝦中制備得到高純度的2,6-二叔丁基對甲酚。

附圖說明

圖1是2,6-二叔丁基對甲酚標準品的高效液相色譜圖。

圖2是2,6-二叔丁基對甲酚標準品的高效液相色譜峰面積積分圖。

圖3是實施例1中的BHT粗樣品的高效液相色譜圖。

圖4是實施例1中的純化后樣品的高效液相色譜圖。

圖5是實施例1中的純化后樣品的高效液相色譜峰面積積分圖。

圖6是實施例1中的純化后的高效薄層硅膠板，其中，A、2,6二叔丁基對甲酚樣品，B、2,6-二叔丁基對甲酚標準品。

圖7是實施例2中的純化后的高效薄層硅膠板，其中，A、2,6二叔丁基對甲酚樣品，B、2,6-二叔丁基對甲酚標準品。

圖8是實施例3中的純化后的高效薄層硅膠板，其中，A、2,6二叔丁基對甲酚樣品，B、2,6-二叔丁基對甲酚標準品。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1

取新鮮的南極磷蝦10g(w)和甲醇(v)以1:3的比例在室溫、350w、40kHz的條件下超聲提取15分鐘，過濾提取液。將上述濾液置于旋蒸儀中蒸干，用甲醇溶解，得到2，6-二叔丁基對甲酚的粗提物。精密稱取1mg 2，6-二叔丁基對甲酚標準品溶于1.0mL甲醇，得濃度為1mg/ml的標準液。取待檢測的粗提物和標準液點于高效薄層硅膠板H板(10×20cm)上，以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4:1:0.5為展開劑，展距9.0cm，展完后晾干展板；在距離薄層板1cm處用玻璃鋼刀沿豎直方向割下小部分薄層板，將割下的薄層板用5％氯化鐵水溶液進行染色，105℃烘烤5分鐘，根據(jù)顯色結果，確定割下的薄層板中2,6-二叔丁基對甲酚的位置(Rf＝0.79)處，如圖6，對照薄層板上未被染色部分，將處于同一Rf值處的色譜帶刮下，一般為每塊板5-6mg，將硅膠粉末放入4mL離心管中，用2mL色譜級甲醇溶解、震蕩。將離心管進行超聲提取5min，功率設置為350W。超聲完成后，將離心管放入離心機中，調控轉速為8000rpm，離心5min，收集上清液，重復進行刮板-超聲-離心-收集上清液過程10次，將收集到的上清液利用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去甲醇，得到2,6-二叔丁基對甲酚色譜帶的濃縮液，作為初步制備得到的粗樣品。

高效液相色譜法分離參數(shù)如下：流動相為甲醇：水＝9:1；洗脫模式為等度洗脫；流速為1mL/min；洗脫時間為16min；進樣量為10μL；檢測器為紫外/可見光檢測器，檢測波長為210nm。按照設定好的參數(shù)和條件，稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進樣。取經(jīng)刮板得到的粗樣品，用色譜級的甲醇進行溶解，用0.45μm的微孔濾膜過濾后進樣，用色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm，5μm，12nm)進行檢測，檢測結果如圖1、圖2和圖3，對檢測結果中的峰進行分析，比較標準品與樣品中峰的保留時間，通過保留時間對2,6-二叔丁基對甲酚的存在進行定性；對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積占樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度。以刮板法制得的2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，結合對粗樣品的純度分析，利用制備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A250×10mm，5μm，12nm)將粗樣品進行進一步純化與制備。在目標保留時間內，將含有樣品的洗脫液接出，重復操作，收集合并洗脫液后用旋轉蒸發(fā)儀進行旋轉蒸發(fā)，得到純化后的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物。取純化后的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物用色譜級甲醇溶解，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進樣檢測，檢測結果如圖4和圖5，對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積占樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度為96.05％。

實施例2

取新鮮的南極磷蝦10g(w)和甲醇(v)以1:5的比例在室溫、300w、20kHz的條件下超聲提取10分鐘，過濾提取液。將上述濾液置于旋蒸儀中蒸干，用甲醇溶解，得到2，6-二叔丁基對甲酚的粗提物。精密稱取1mg 2，6-二叔丁基對甲酚標準品溶于1.0mL甲醇，得濃度為1mg/ml的標準液。取待檢測的粗提物和標準液點于高效薄層硅膠板H板(10×20cm)上，以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝4-2:1為展開劑，展距9.0cm，展完后晾干展板；在距離薄層板1cm處用玻璃鋼刀沿豎直方向割下小部分薄層板，將割下的薄層板用5％氯化鐵水溶液進行染色，105℃烘烤8分鐘，根據(jù)顯色結果，確定割下的薄層板中2,6-二叔丁基對甲酚的位置(Rf＝0.79)處，如圖7，對照薄層板上未被染色部分，將處于同一Rf值處的色譜帶刮下，一般為每塊板5-6mg，將硅膠粉末放入4mL離心管中，用2mL色譜級甲醇溶解、震蕩。將離心管進行超聲提取6min，功率設置為350W。超聲完成后，將離心管放入離心機中，調控轉速為8000rpm，離心6min，收集上清液，重復進行刮板-超聲-離心-收集上清液過程10次，將收集到的上清液利用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去甲醇，得到2,6-二叔丁基對甲酚色譜帶的濃縮液，作為初步制備得到的粗樣品。

高效液相色譜法分離參數(shù)如下：流動相為甲醇：水＝9:1；洗脫模式為等度洗脫；流速為1mL/min；洗脫時間為16-18min；進樣量為10μL；檢測器為紫外/可見光檢測器，檢測波長為210nm。按照設定好的參數(shù)和條件，稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進樣。取經(jīng)刮板得到的粗樣品，用色譜級的甲醇進行溶解，用0.45μm的微孔濾膜過濾后進樣，用色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm，5μm，12nm)進行檢測，對檢測結果中的峰進行分析，比較標準品與樣品中峰的保留時間，通過保留時間對2,6-二叔丁基對甲酚的存在進行定性；對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積占樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度。以刮板法制得的2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，結合對粗樣品的純度分析，利用制備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×10mm，5μm，12nm)將粗樣品進行進一步純化與制備。在目標保留時間內，將含有樣品的洗脫液接出，重復操作，收集合并洗脫液后用旋轉蒸發(fā)儀進行旋轉蒸發(fā)，得到純化后的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物。取純化后的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物用色譜級甲醇溶解，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進樣檢測，對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積占樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度為96.05％

實施例3

取新鮮的南極磷蝦10g(w)和甲醇(v)以1:6的比例在室溫、400w、40kHz的條件下超聲提取20分鐘，過濾提取液。將上述濾液置于旋蒸儀中蒸干，用甲醇溶解，得到2，6-二叔丁基對甲酚的粗提物。精密稱取1mg 2，6-二叔丁基對甲酚標準品溶于1.0mL甲醇，得濃度為1mg/ml的標準液。取待檢測的粗提物和標準液點于高效薄層硅膠板H板

(10×20cm)上，以體積比石油醚：乙酸乙酯：正己烷＝5:1:1為展開劑，展距9.0cm，展完后晾干展板；在距離薄層板1cm處用玻璃鋼刀沿豎直方向割下小部分薄層板，將割下的薄層板用5％氯化鐵水溶液進行染色，105℃烘烤5-10分鐘，根據(jù)顯色結果，確定割下的薄層板中2,6-二叔丁基對甲酚的位置(Rf＝0.79)處，如圖8，對照薄層板上未被染色部分，將處于同一Rf值處的色譜帶刮下，一般為每塊板5-6mg，將硅膠粉末放入4mL離心管中，用2mL色譜級甲醇溶解、震蕩。將離心管進行超聲提取8min，功率設置為350W。超聲完成后，將離心管放入離心機中，調控轉速為8000rpm，離心8min，收集上清液，重復進行刮板-超聲-離心-收集上清液過程10次，將收集到的上清液利用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)除去甲醇，得到2,6-二叔丁基對甲酚色譜帶的濃縮液，作為初步制備得到的粗樣品。

高效液相色譜法分離參數(shù)如下：流動相為甲醇：水＝9:1；洗脫模式為等度洗脫；流速為1mL/min；洗脫時間為16-18min；進樣量為10μL；檢測器為紫外/可見光檢測器，檢測波長為210nm。按照設定好的參數(shù)和條件，稱取2,6-二叔丁基對甲酚標準品1mg，加色譜級甲醇定容至1mL，得到濃度為1mg/mL的標準液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進樣。取經(jīng)刮板得到的粗樣品，用色譜級的甲醇進行溶解，用0.45μm的微孔濾膜過濾后進樣，用色譜柱(YMC-Pack ODS-A250×4.6mm，5μm，12nm)進行檢測，對檢測結果中的峰進行分析，比較標準品與樣品中峰的保留時間，通過保留時間對2,6-二叔丁基對甲酚的存在進行定性；對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積占樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度。以刮板法制得的2,6-二叔丁基對甲酚粗樣品，結合對粗樣品的純度分析，利用制備型色譜柱(YMC-Pack ODS-A 250×10mm，5μm，12nm)將粗樣品進行進一步純化與制備。在目標保留時間內，將含有樣品的洗脫液接出，重復操作，收集合并洗脫液后用旋轉蒸發(fā)儀進行旋轉蒸發(fā)，得到純化后的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物。取純化后的2,6-二叔丁基對甲酚濃縮物用色譜級甲醇溶解，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后進樣檢測，對色譜峰手動積分，顯示樣品中目標物的峰面積占樣品總面積的百分比，與標準品積分結果進行對比，確定樣品的純度為96.05％。