本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種厭氧降解處理采油廢水的梭菌屬菌株YB-6的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

采油廢水主要是石油開采、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、脫水和再利用過程中產(chǎn)生廢水的混合物。采油廢水成分復(fù)雜，主要含有淤泥和泥沙等固體懸浮物、溶解的油質(zhì)、苯的有機(jī)物、硫化氫、銅和鎳等重金屬以及硫酸鹽等組分，同時(shí)其具有COD含量高、BOD含量低、毒性高和溶解性油難去除等特點(diǎn)，因此屬于難降解廢水。采油廢水的組分是持續(xù)變化的，這主要與所提煉油的性質(zhì)、階段和油水層的地質(zhì)特征有關(guān)，所以如何利用現(xiàn)有技術(shù)高效穩(wěn)定環(huán)保的處理采油廢水是企業(yè)所關(guān)注的焦點(diǎn)。如今，采油廢水的物化處理方法主要包括電化學(xué)法、吸附法、臭氧法、絮凝法和催化法，但是物化處理工藝存在高能耗、低產(chǎn)率和二次污染等問題，并不符合國家節(jié)能環(huán)保的要求。相比之下，生物法效率高投入低，處理效果穩(wěn)定。目前主要的生物處理法包括活性污泥法、生物膜法、厭氧-好氧法和自然人工濕地處理法，重視并應(yīng)用生化處理技術(shù)是國內(nèi)外采油廢水處理的趨勢。

生物處理工藝中厭氧法可以穩(wěn)定有機(jī)物密度和種類，有一定的抗沖擊負(fù)荷能力；好氧法則可以徹底的去除廢水中的有機(jī)物。雖然厭氧法或者好氧法均能處理廢水，但是單一的好氧或者厭氧工藝均存在一定的局限性。為了更好的處理廢水中的有機(jī)物，越來越多的研究者將兩個(gè)或兩個(gè)以上工藝組合起來，以提高廢水的處理效果。本研究中的采油廢水處理廠采用ABR-SBR聯(lián)用工藝，COD、石油類、SS、S^2-的去除率分別為83-94%，78-92%，99%和94%，出水達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB18918-2002）一級(jí)排放標(biāo)準(zhǔn)。因此，本申請從ABR活性污泥池內(nèi)篩選出高效石油降解厭氧菌株，為下一步構(gòu)建高效除油菌劑提高采油廢水的處理效果具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種厭氧降解處理采油廢水的梭菌屬菌株YB-6的培養(yǎng)方法。

具體步驟為：

(1)將活性污泥經(jīng)過梯度稀釋后選擇10^-6~10^-8濃度的菌液采用平板涂布法涂布于強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中，并將強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基置于厭氧培養(yǎng)箱中于37℃下分離培養(yǎng)7天，待選備用。

(2)從步驟(1)所得的待選備用的強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中挑選長勢好、形態(tài)各異的單菌落，分別采用劃線培養(yǎng)法接種于新的強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中，然后將強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基置于厭氧培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)7天，即篩選得到在強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中生長良好的梭菌屬菌株，其菌落白色，不規(guī)則形，表面光滑，不透明，邊緣不整齊，命名為YB-6，然后對(duì)YB-6分別進(jìn)行三次純化培養(yǎng)，得到無其他雜菌干擾的純的梭菌屬菌株YB-6。

所述活性污泥為采油終端處理廠的厭氧折流板反應(yīng)器中的污泥，即Anaerobic Bafflted Reactor中的污泥，簡稱ABR污泥。

所述強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基的組成如下：牛肉浸出粉9~11g/L，胨9~11g/L，酵母浸出粉2~4g/L，可溶淀粉0.5~1.5g/L，葡萄糖4~6g/L，鹽酸半胱氨酸0.5~1g/L，氯化鈉4~6g/L，醋酸鈉2~4g/L，瓊脂的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)含量為2%；該強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基的pH值6.8±0.2。

所述梭菌屬菌株YB-6現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期：2016年03月15日，保藏編號(hào)：CGMCC No.12214，分類命名：梭菌Clostridium sp.；其菌體形態(tài)和分子生物學(xué)特征：菌體桿狀，0.4~0.6μm×2.5~3.2μm，單個(gè)或成對(duì)排列，芽胞中生，柱狀，胞囊膨大，革蘭氏陽性。

本發(fā)明方法操作簡單，所培養(yǎng)的梭菌屬菌株YB-6對(duì)采油廢水的厭氧降解處理效果良好，對(duì)采油廢水中的TOC的降解率在30%以上，且成本低廉，便于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中得到的梭菌屬菌株YB-6的菌落形態(tài)示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中得到的梭菌屬菌株YB-6的顯微鏡菌體形態(tài)示意圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中得到的梭菌屬菌株YB-6的序列信息。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中得到的梭菌屬菌株YB-6與相關(guān)種的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例：

本實(shí)施例以廣西北海潿洲島中海油終端處理廠的ABR（Anaerobic Bafflted Reactor，厭氧折流板反應(yīng)器）中的活性污泥為樣品具體實(shí)施，完整展現(xiàn)梭菌屬菌株YB-6的篩選、鑒定及其厭氧降解處理采油廢水的應(yīng)用。

(1)將活性污泥經(jīng)過梯度稀釋后選擇10^-7濃度的菌液采用平板涂布法涂布于強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中，并將強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基置于厭氧培養(yǎng)箱中于37℃下分離培養(yǎng)7天，待選備用。

(2)從步驟(1)所得的待選備用的強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中挑選長勢好、形態(tài)各異的單菌落，分別采用劃線培養(yǎng)法接種于新的強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中，然后將強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基置于厭氧培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)7天，即篩選得到在強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中生長良好的梭菌屬菌株，其菌落白色，不規(guī)則形，表面光滑，不透明，邊緣不整齊，如圖1所示，命名為YB-6，然后對(duì)YB-6分別進(jìn)行三次純化培養(yǎng)，得到無其他雜菌干擾的純的梭菌屬菌株YB-6。

所述強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基的組成如下：牛肉浸出粉10g/L，胨10g/L，酵母浸出粉3g/L，可溶淀粉0.5g/L，葡萄糖5g/L，鹽酸半胱氨酸0.5g/L，氯化鈉5g/L，醋酸鈉3g/L，瓊脂的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)含量為2%；該強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基的pH值6.8。

通過顯微鏡觀察本實(shí)施例得到的梭菌屬菌株YB-6的菌體形態(tài)，如圖2所示，菌體桿狀，0.4~0.6μm×2.5~3.2μm，單個(gè)或成對(duì)排列，芽胞中生，柱狀，胞囊膨大；然后進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，經(jīng)過初染、媒染、脫色、復(fù)染后，將載玻片覆上蓋玻片，置于Classica E220LED雙目光學(xué)顯微鏡100×油鏡下觀察，鑒定其為革蘭氏陽性。

對(duì)本實(shí)施例得到的梭菌屬菌株YB-6采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行菌株基因組DNA的提取，操作步驟按說明書進(jìn)行。DNA樣品的濃度通過Quawell Q5000超微量紫外分光光度計(jì)檢測，同時(shí)用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并在Gel DocTM XR+成像儀上顯像。對(duì)梭菌屬菌株YB-6采用FMIC-QO01-002細(xì)菌16S rDNA檢測方法進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，得到的堿基序列在GeneBank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，用比對(duì)的結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，YB-6為梭菌屬（Clostridium sp.）的一個(gè)潛在新種，菌株的序列信息和16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹分別如圖3和圖4所示。將所得梭菌屬菌株YB-6送至中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，保藏日期：2016年03月15日，保藏編號(hào)：CGMCC No.12214，分類命名：梭菌Clostridium sp.。

將本實(shí)施例培養(yǎng)的梭菌屬菌株YB-6在新的強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基中富集，置于厭氧培養(yǎng)箱中于37℃下培養(yǎng)7天，制得富集菌液，將制得的富集菌液接種到采油廢水中，富集菌液和采油廢水的體積比為1:150，然后在37℃下恒溫厭氧培養(yǎng)96h，即完成對(duì)采油廢水的厭氧降解處理，結(jié)果如下：采油廢水TOC含量為112.30~147.10 mg/L，COD含量為451~496 mg/L，pH值在7.76~7.91之間，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)96h后取10ml作為檢測樣品，使用Multi N/C3100測定儀測定采油廢水中TOC含量在接種前后的變化情況，結(jié)果表明，梭菌屬菌株YB-6對(duì)于采油廢水的TOC降解率為33.3%。