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纖維素可及度測量的融合蛋白及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號:12242763閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.用于測量纖維素對纖維素酶可及度的融合蛋白,其包含纖維素識別多肽、連接肽和熒光蛋白,或者由纖維素識別多肽、連接肽和熒光蛋白組成,其中所述連接肽位于纖維素識別多肽和熒光蛋白之間,并且所述融合蛋白的分子量為30-80 kD。

2.如權(quán)利要求1所述的融合蛋白,其中所述纖維素識別多肽為選自曲霉屬、木霉屬和青霉屬中任一種真菌的纖維素酶的纖維素結(jié)合元件(CBM),優(yōu)選為外切葡聚糖酶的纖維素結(jié)合元件;優(yōu)選地,其中所述纖維素識別多肽包含SEQ ID No:1所示的氨基酸序列,或由SEQ ID No:1所示的氨基酸序列組成。

3.如權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的融合蛋白,其中所述連接肽為選自曲霉屬、木霉屬和青霉屬中任一種真菌的外切葡聚糖酶的連接肽,優(yōu)選為外切葡聚糖酶中的CBM與催化域之間的連接肽;優(yōu)選地,其中所述連接肽包含如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列,或者由SEQ ID No:2所示的氨基酸序列組成。

4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的融合蛋白,其中所述熒光蛋白選自綠色熒光蛋白或其變體,包括藍(lán)色熒光蛋白、藍(lán)綠色熒光蛋白、原綠色熒光蛋白、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白、光活性綠色熒光蛋白等;優(yōu)選地,其中所述熒光蛋白為分子量為20-60kD的綠色熒光蛋白;優(yōu)選地,所述融合蛋白中包含1- 3個(gè)綠色熒光蛋白;更優(yōu)選地,其中所述熒光蛋白包含SEQ ID No:3 所示的氨基酸序列,或者由SEQ ID No:3 所示的氨基酸序列組成。

5.核酸分子,其編碼權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白。

6.重組質(zhì)粒,其包含權(quán)利要求5所述的核酸分子;優(yōu)選地,所述重組質(zhì)粒表達(dá)載體選自大腸桿菌pET28a載體。

7.構(gòu)建權(quán)利要求6所述的重組質(zhì)粒的方法,其包括以下步驟:

(1)設(shè)計(jì)并合成權(quán)利要求5所述的核酸分子序列,使得其所表達(dá)的融合蛋白的分子量為 30-80kD;

(2)PCR擴(kuò)增步驟(1)中所合成的核酸分子序列;優(yōu)選地,所使用的擴(kuò)增引物如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示;以及

(3)將步驟(2)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物回收并連接到大腸桿菌表達(dá)載體上,挑選出陽性克隆。

8.表達(dá)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的方法,其包括以下步驟:

(1)如權(quán)利要求7所述構(gòu)建重組質(zhì)粒;以及

(2)將步驟(1)中所構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株中,挑選出陽性克隆,并且誘導(dǎo)培養(yǎng)所述的陽性克隆表達(dá)融合蛋白;優(yōu)選地,所述誘導(dǎo)培養(yǎng)條件如下:誘導(dǎo)劑,終濃度為1 mM IPTG;誘導(dǎo)溫度,30℃;誘導(dǎo)時(shí)間,6 h。

9. 纖維素可及度的測定方法,其包括利用權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白來測定纖維素的可及度;優(yōu)選地,所述方法包括以下步驟:將1-100 mg/ml 的底物懸浮在pH4至9的緩沖溶液中,加入1至20μg/ml如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白,于10至40℃下反應(yīng)10至180分鐘,測定吸附前后液相熒光強(qiáng)度變化,由此計(jì)算出底物的纖維素可及度。

10.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的融合蛋白在測定纖維素可及度中的應(yīng)用;優(yōu)選地,所述纖維素為純的纖維素或者經(jīng)預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素中纖維素。

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