本發(fā)明屬于生物技術、生物工程領域，涉及轉基因家蠶的制備方法，尤其涉及一種阻斷轉基因家蠶卵滯育的方法。

背景技術：

隨著piggyBac轉座子在家蠶轉基因中運用的不斷完善，轉基因技術在家蠶基因功能研究、遺傳素材創(chuàng)新和生物反應器開發(fā)等領域發(fā)揮了重要作用，取得了豐碩的成果。

由于轉基因家蠶產生需要經過注射、篩選、驗證、雜交等多個步驟，還需要經過多代飼養(yǎng)獲得純品系。因此，目前家蠶轉基因研究首選的受體材料主要為多化性家蠶品種的卵，但就其實用性而言具有很大的局限性：1、經濟性狀差；2、必須進行連續(xù)飼養(yǎng)，由于其不具有滯育期，利用其制作的轉基因蠶必須依靠連續(xù)的飼養(yǎng)繁殖方能維持和繼代，從而增加了生產成本和轉基因系統(tǒng)丟失的風險。

相對多化性品種而言，二化性家蠶品種經濟性狀優(yōu)異，不存在保種困難的問題，且已經大量用于蠶業(yè)生產，易于人們接受，使用二化性品種作為家蠶轉基因的受體材料，在轉基因蠶的推廣上極具優(yōu)勢。但是，二化性家蠶品種用于轉基因研究和應用，首先要解決的問題是阻斷滯育。目前阻斷滯育的方法主要有兩種：低溫催青法和早浸酸法。但是，兩種方法均有其弊端，其中，低溫催青法耗時長，需要近1個月的時間，且還需要反季節(jié)飼養(yǎng)，這些無疑都增加了制備轉基因家蠶的難度；而早浸酸法由于浸酸時間過早、脫酸不凈等原因影響轉基因注射后蠶卵的轉青率、孵化率，達不到實際科研生產需要，而不被采用。

因此，建立實用家蠶品種轉基因技術，首要技術環(huán)節(jié)是建立高效的適合于顯微注射的蠶卵滯育解除的方法。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種阻斷轉基因家蠶卵滯育的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

一種阻斷轉基因家蠶卵滯育的方法，包括如下步驟：

(1)以家蠶實用滯育品種作為原始材料，通過轉基因處理然后獲取轉基因滯育蠶卵；

(2)將步驟(1)獲得的轉基因滯育蠶卵置于密閉環(huán)境中進行充氧處理，即得轉基因阻斷滯育蠶卵。

進一步，步驟(1)中，所述家蠶實用滯育品種為二化性家蠶品種或一化性家蠶品種中的一種。

進一步，步驟(1)中，所述轉基因滯育蠶卵由以下方法制備：

1)將家蠶實用滯育品種在25～26.5℃下催青后進行飼養(yǎng)，獲得蠶蛾；

2)將步驟1)中的蠶蛾交配拆對后投放于上漿的蠶粘紙，在黑暗或者弱光的環(huán)境中產卵，每間隔1h收集一次蠶卵，獲得G₀代蠶卵，并將其置于24℃的環(huán)境中保護備用；

3)將步驟2)中的G₀代蠶卵用鑷子轉移至用體積分數(shù)為75％的酒精消毒的載玻片上并排列整齊，以收集的時間開始計時，于收集后0～5h用顯微注射儀將1～15nl、總濃度400ng/μl的轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔，得到轉基因滯育蠶卵。

進一步，步驟(2)中，所述轉基因滯育蠶卵為產后4～32h的蠶卵。

進一步，所述轉基因滯育蠶卵為產后4～20h的蠶卵。

進一步，步驟(2)中，充氧處理前還包括將轉基因滯育蠶卵經35％的甲醛蒸汽消毒5min。

進一步，步驟(2)中，所述充氧處理在氧氣濃度為30％～85％、相對濕度為75％～90％、溫度為25℃條件下充氧時間為10～50h。

進一步，所述氧氣濃度為60％～80％，所述充氧時間為30～50h。

進一步，所述氧氣濃度為70％。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種高效簡便的方法用于阻斷轉基因家蠶卵滯育。首先，本發(fā)明直接采用生產中普遍使用的家蠶實用滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過程，直接利用轉基因技術創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊的家蠶品種，解決了多化性品種作為轉基因素材難以勝任等問題，大大的縮短了育種的周期，節(jié)約了大量的人力和物力；其次，該方法克服了家蠶實用滯育品種低溫催青法時間過長、早浸酸法孵化率低且不易掌握等缺陷，使用氧氣替代鹽酸和甲醛，不僅使得阻斷家蠶卵滯育技術更安全、便捷、綠色、環(huán)保，還有效的簡化操作程序，縮短培育時間。經本發(fā)明方法處理后，轉基因家蠶卵注射條件下的孵化率可高達76.29％，轉青率可達94.35％。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：

圖1為蠶卵經低溫催青與經常溫催青所用的時長對比圖；

圖2為經轉基因顯微注射處理后的滯育蠶卵，在產后不同時間點進行不同氧氣濃度充氧處理40h，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，蠶卵的良卵轉青率情況。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。

實施例1

(1)以家蠶實用滯育品種作為原始材料，獲取轉基因滯育蠶卵；

1)將家蠶實用滯育品種在25℃條件下催青后進行飼養(yǎng)，獲得蠶蛾；

2)獲取滯育蠶卵：將步驟1)得到的蠶蛾交配拆對后投放于上漿的蠶粘紙，在黑暗或者弱光的環(huán)境中產卵，每間隔1h收集一次蠶卵，獲得G₀代蠶卵并將其置于24℃的環(huán)境中保護備用；

3)獲取轉基因滯育蠶卵：將步驟2)中的蠶卵用鑷子轉移至用75％的酒精消毒的載玻片上并排列整齊，取剛搜集的蠶卵用顯微注射儀將1～15nl、總濃度400ng/μl的piggyBac空載：pBac[3xp3EGFP]轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔，得到轉基因滯育蠶卵。

(2)獲取轉基因阻斷滯育蠶卵：將步驟(1)中的為產后4h的蠶卵經35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三氣培養(yǎng)箱，25℃下，濕度為75％，充入濃度為30％的氧氣，并保持充氧時間為50小時密閉環(huán)境中進行充氧處理，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，統(tǒng)計轉基因滯育蠶卵經充氧處理后的轉青及孵化情況。

實施例2

(1)以家蠶實用滯育品種作為原始材料，獲取轉基因滯育蠶卵；

1)將家蠶實用滯育品種在26.5℃條件下催青后進行飼養(yǎng)，獲得蠶蛾；

2)獲取滯育蠶卵：將步驟1)得到的蠶蛾交配拆對后投放于上漿的蠶粘紙，在黑暗或者弱光的環(huán)境中產卵，每間隔1h收集一次蠶卵，獲得G₀代蠶卵并將其置于24℃的環(huán)境中保護備用；

3)獲取轉基因滯育蠶卵：將步驟2)中的蠶卵用鑷子轉移至用75％的酒精消毒的載玻片上并排列整齊，以收集的時間開始計時，于收集后1h用顯微注射儀將1～15nl、總濃度400ng/μl的piggyBac空載：pBac[3xp3EGFP]轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔，得到轉基因滯育蠶卵；

(2)獲取轉基因阻斷滯育蠶卵：將步驟(1)中的為產后11h的蠶卵經35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三氣培養(yǎng)箱，25℃下，濕度為80％，充入濃度為40％的氧氣，并保持充氧時間為40小時密閉環(huán)境中進行充氧處理，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，統(tǒng)計轉基因滯育蠶卵經充氧處理后的轉青及孵化情況。

實施例3

步驟1)、2)如實施例1；

3)獲取轉基因滯育蠶卵：將步驟2)中的蠶卵用鑷子轉移至用75％的酒精消毒的載玻片上并排列整齊，以收集的時間開始計時，于收集后2h用顯微注射儀將1～15nl、總濃度400ng/μl的piggyBac空載：pBac[3xp3EGFP]轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔，得到轉基因滯育蠶卵；

(2)獲取轉基因阻斷滯育蠶卵：將步驟(1)中的為產后18h的蠶卵經35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三氣培養(yǎng)箱，25℃下，濕度為85％，充入濃度為50％的氧氣，并保持充氧時間為30小時密閉環(huán)境中進行充氧處理，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，統(tǒng)計轉基因滯育蠶卵經充氧處理后的轉青及孵化情況。

實施例4

步驟1)、2)如實施例1；

3)獲取轉基因滯育蠶卵：將步驟2)中的蠶卵用鑷子轉移至用75％的酒精消毒的載玻片上并排列整齊，以收集的時間開始計時，于收集后3h用顯微注射儀將1～15nl、總濃度400ng/μl的piggyBac空載：pBac[3xp3EGFP]轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔，得到轉基因滯育蠶卵；

(2)獲取轉基因阻斷滯育蠶卵：將步驟(1)中的為產后25h的蠶卵經35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三氣培養(yǎng)箱，25℃下，濕度為85％，充入濃度為60％的氧氣，并保持充氧時間為20小時密閉環(huán)境中進行充氧處理，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，統(tǒng)計轉基因滯育蠶卵經充氧處理后的轉青及孵化情況。

實施例5

步驟1)、2)如實施例1；

3)獲取轉基因滯育蠶卵：將步驟2)中的蠶卵用鑷子轉移至用75％的酒精消毒的載玻片上并排列整齊，以收集的時間開始計時，于收集后4h用顯微注射儀將1～15nl、總濃度400ng/μl的piggyBac空載：pBac[3xp3EGFP]轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔，得到轉基因滯育蠶卵；

(2)獲取轉基因阻斷滯育蠶卵：將步驟(1)中的為產后32h的蠶卵經35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三氣培養(yǎng)箱，25℃下，濕度為90％，充入濃度為70％的氧氣，并保持充氧時間為10小時密閉環(huán)境中進行充氧處理，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，統(tǒng)計轉基因滯育蠶卵經充氧處理后的轉青及孵化情況。

實施例6

步驟1)、2)如實施例1；

3)獲取轉基因滯育蠶卵：將步驟2)中的蠶卵用鑷子轉移至用75％的酒精消毒的載玻片上并排列整齊，以收集的時間開始計時，于收集后5h用顯微注射儀將1～15nl、總濃度400ng/μl的piggyBac空載：pBac[3xp3EGFP]轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入，并用無毒的膠水封閉卵殼注射留下的小孔，得到轉基因滯育蠶卵；

(2)獲取轉基因阻斷滯育蠶卵：將步驟(1)中的為產后32h的蠶卵經35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三氣培養(yǎng)箱，25℃下，濕度為90％，充入濃度為80％的氧氣，并保持充氧時間為10小時密閉環(huán)境中進行充氧處理，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，統(tǒng)計轉基因滯育蠶卵經充氧處理后的轉青及孵化情況。

實施例7

步驟1)、2)、3)如實施例5；

(2)獲取轉基因阻斷滯育蠶卵：將步驟(3)中的為產后18h的蠶卵經35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三氣培養(yǎng)箱，25℃下，濕度為85％，充入濃度為85％的氧氣，并保持充氧時間為30小時密閉環(huán)境中進行充氧處理，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，統(tǒng)計轉基因滯育蠶卵經充氧處理后的轉青及孵化情況。

按照實施例1～7的方法，經轉基因顯微注射處理后，以產后20h的滯育蠶卵為實驗對象，在氧氣濃度為70％的條件下充氧處理40h，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，統(tǒng)計孵化卵、轉青死卵、滯育卵、死卵(不含轉青死卵)，計算轉青率和孵化率，結果見表1。

表1

由表1可知，通過充氧處理后，絕大多數(shù)轉基因滯育蠶卵轉變成了轉基因阻斷滯育蠶卵，并且其良卵孵化率平均可高達76.29％，良卵轉青率平均可高達94.35％。

圖2為經轉基因顯微注射處理后的滯育蠶卵在產后時間4h、9h、20h，氧氣濃度為30％～85％條件下充氧處理40h，處理后的蠶卵常規(guī)催青約在10天后開始孵化，孵化時間為5天，蠶卵的良卵轉青率情況。由圖可知，三個產后時間的轉基因滯育蠶卵經充氧處理后的良卵轉青率隨著氧氣濃度的增加，先增大后變小，均在氧氣濃度為70％時達到最大。

對比實施例1

(1)將家蠶滯育蠶卵置于生化培養(yǎng)箱(SPX-250)在15℃的低溫、濕度為75％、黑暗條件下催青，至轉青后第3天(即孵化前1d)轉移到25～26℃保護，催青時間32d。收蟻后常規(guī)飼養(yǎng)，得到蠶蛾。將蠶蛾交配拆對后投放于上漿的蠶粘紙獲得G₀代蠶卵；

步驟(2)如實施例1中3)，獲得轉基因蠶卵。

將步驟(2)中的轉基因蠶卵孵化后，統(tǒng)計孵化卵、轉青死卵、滯育卵、死卵(不含轉青死卵)，計算轉青率和孵化率，其中良卵孵化率為56.01％，良卵轉青率為99.29％。雖然通過低溫催青處理后，蠶卵的良卵孵化率和良卵轉青率都取得了好的結果，但是，由圖1可知，圖中1軸展示蠶卵經低溫催青處理到孵化的時長，需耗時32天；2軸展示蠶卵在25℃條件下催青處理到孵化的時長，僅耗時9天，而充氧處理的對象為25℃條件下催青處理后獲得的蠶蛾產下的G₀代蠶卵，所以與低溫催青相比，大大縮短了獲得G₀代蠶卵的時間。另外，經低溫催青處理后的蠶卵需要反季節(jié)飼養(yǎng)，而25℃處理的蠶卵無需反季節(jié)飼養(yǎng)，即不需要單獨的房間設備來控制飼養(yǎng)條件，減少了飼養(yǎng)成本。

對比實施例2

步驟(1)如實施例1中1)、2)；

(2)收集產下后2h的蠶卵，用15～16％HCI于46℃水浴處理2.5min，然后用自來水沖洗蠶卵約15min；

步驟(3)如實施例1中3)，獲得轉基因蠶卵。

將步驟(3)中的轉基因蠶卵孵化后，統(tǒng)計孵化卵、轉青死卵、滯育卵、死卵(不含轉青死卵)，計算轉青率和孵化率，結果見表2。

表2

由表2可知，對轉基因滯育蠶卵進行早浸酸法處理，其良卵孵化率極低，良卵轉青率平均為58.64％，由于其孵化率極低，所以早浸酸的方法不能用于轉基因注射后蠶卵滯育的阻斷。

上述實施例中，家蠶實用滯育品種除了使用二化性家蠶品種，還可以使用一化性家蠶品種，可以達到阻斷轉基因家蠶卵滯育的效果。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。