本申請根據(jù)35U.S.C.§119(e)要求2011年5月17日提交的美國臨時(shí)申請No.61/486,960的優(yōu)先權(quán)。該臨時(shí)申請的公開內(nèi)容以其整體并入本文。聯(lián)邦基金資助研究的聲明導(dǎo)致本發(fā)明的研究部分地受到美國國立衛(wèi)生研究院基金No.P01AI08677-01的支持。因此，美國政府對本發(fā)明有一定的權(quán)利。序列表本申請含有以ASCII格式電子提交的序列表，其全文通過引用并入本文。所述制作于2016年1月21日的ASCII拷貝命名為1603418US01-序列表.txt，大小為935961字節(jié)。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對人免疫缺陷病毒(“HIV”)的表位的抗體。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防和治療HIV感染的針對HIV的gp120包膜蛋白的廣譜中和抗體的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：HIV導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(“AIDS”)。長期非進(jìn)展者中對HIV感染的免疫反應(yīng)表明，特異性病毒免疫可限制疾病的感染和癥狀。一些HIV感染個(gè)體在其血清中顯示有廣譜中和IgG抗體；雖然它們對于設(shè)計(jì)有效的疫苗有潛在的重要性，但對于這些抗體的特異性和活性知之甚少，并且還沒有單個(gè)的特征與保護(hù)性免疫相對應(yīng)。在動(dòng)物模型中，中和抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移可以有助于防止病毒攻擊。中和抗體反應(yīng)也可以在HIV感染的個(gè)體中發(fā)展，但血清反應(yīng)的詳細(xì)組成仍未完全揭示。已經(jīng)揭示了AIDS的許多免疫異常。這些包括但不限于，B細(xì)胞功能異常、異?？贵w反應(yīng)、單核細(xì)胞功能缺陷、細(xì)胞因子生產(chǎn)受損、自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒細(xì)胞功能抑制、淋巴細(xì)胞對可溶抗原的識別和反應(yīng)能力缺陷，以及T4輔助/誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞群的耗竭。來自大量HIV病毒株的編碼HIVenv的氨基酸和RNA序列是已知的(Modrow,S.等人.,J.Virology61(2):570(1987))。HIV病毒體覆蓋著源自宿主細(xì)胞外膜的膜或包被。該膜包含在其羧基末端區(qū)域錨定于膜雙層的一群包膜糖蛋白(gp160)。每個(gè)糖蛋白包含兩個(gè)片段：N-末端片段和C-末端片段。N-末端片段，由于其相對分子量為約120kD，而稱為gp120，突出到包圍病毒體的水環(huán)境中。C-末端片段，命名為gp41，橫跨膜。N-末端gp120和C-末端gp41通過對溶蛋白性裂解特別敏感的肽鍵共價(jià)連接。參見McCune等人的歐洲專利申請公開號No.0335635以及其所引用的參考文獻(xiàn)，每一個(gè)以全文引用的方式并入本文。已經(jīng)提出幾種構(gòu)建AIDS疫苗的方法，包括但不限于，滅活和減毒病毒疫苗、來自病毒感染細(xì)胞的亞單位疫苗、重組生產(chǎn)的病毒抗原、基于合成肽的疫苗、抗獨(dú)特型疫苗和基于病毒載體的疫苗。另外一種用于HIV治療性和預(yù)防性治療的方法包括制造強(qiáng)效的廣譜中和單克隆抗體。多個(gè)研究已經(jīng)報(bào)道了通過各種技術(shù)來克隆和制造靶向CD4結(jié)合位點(diǎn)和病毒體刺突的其他部分并中和HIV的單克隆抗體。一般來說，這些技術(shù)包括自我融合或噬菌體展示技術(shù)。通常，在使用噬菌體展示技術(shù)制備HIV中和抗體時(shí)，重鏈和輕鏈的隨機(jī)組合被組合且選擇隨機(jī)的一對。研究已經(jīng)報(bào)道了有限數(shù)目的單克隆抗體，例如，噬菌體展示抗體b12，其是廣譜強(qiáng)效的，并廣譜中和(即抗體可以中和血清中的多種HIV)HIV。單克隆抗體b12是已報(bào)道的預(yù)防獼猴中HIV感染的廣譜中和抗體。另一個(gè)廣譜中和抗體包括2G12，其非典型地具有在其它任何具有三個(gè)組合位點(diǎn)的抗體中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)。VRC01是最近發(fā)現(xiàn)的靶向HIV刺突上的CD4結(jié)合位點(diǎn)(CD4bs)的廣譜中和抗體。通過純化結(jié)合可溶的、生物素標(biāo)記的、穩(wěn)定化的以及重現(xiàn)表面化的(re-surfaced)的HIVgp120的核心片段的單個(gè)B細(xì)胞而分離出VRC01(X.Wu等人.,Science329,856(Aug13,2010))。雖然是成功的，但分離效率低，從一個(gè)個(gè)體的2500萬個(gè)外周血單核細(xì)胞僅產(chǎn)生3個(gè)密切相關(guān)的結(jié)合HIV的抗體。和其它通過單個(gè)細(xì)胞抗原捕獲方法所獲得的抗-HIV抗體一樣，VRC01-3顯示了非常高水平的體細(xì)胞突變，其對于效力和廣度是基本的。這種高頻率突變對于抗體克隆是潛在的障礙，因?yàn)橥蛔冃蛄锌赡懿辉倥c用于克隆的引物互補(bǔ)。一些研究報(bào)道，某些患者產(chǎn)生廣譜中和的HIV抗體。研究報(bào)道了，在非人靈長類的被動(dòng)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)中，抗體可以防御初始的HIV感染，并且可以在感染過程中調(diào)節(jié)病毒裝載。參見，例如，Mascola,2000；Shibata,1999；Veazey,2003；Parren,2001；Mascola,1999；Trkola,2005；Wei,2003；Frost,2005；Burton,2004；Mascola,2007；KarlssonHedestam,2008；McMichael,2006；Zolla-Pazner,2004。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方式中提供了HIV廣譜中和抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含重鏈，該重鏈包含共有的氨基酸序列：QXXLXQSGGXVKKPGXSVXVSCXASGYXXFXXYXIHWXRQAPGXGXXWVGXIXPRXGXXXXAXXFQGRLSLTRDXXXXXXTXXXFMDLXGLRXDDTAVYFCARXXXXXXXXXXXXXXXXXXDX(SEQIDNO:1)，其中X表示任意氨基酸或無氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含輕鏈，該輕鏈包含共有的氨基酸序列：EIXLTQSPXSLSXSXGEXXTISCXXXQXXXXXXXLXWYQQRXGXAPRLLIXXXSXXXXGVPXRFSGXXXGXXYXLXISXLXXDDXAXYFCXXYEXXXXXXX(SEQIDNO:2)，其中X表示任意氨基酸或無氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包括高度保守的共有序列，輕鏈包括高度保守的共有序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供了生產(chǎn)分離的HIV抗體的方法，該抗體包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含高度保守的共有序列，輕鏈包含高度保守的共有序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含SEQIDNO：1的重鏈共有序列以及SEQIDNO：2的輕鏈序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含SEQIDNO：1的重鏈共有序列以及SEQIDNO：2的輕鏈序列的一種或兩種，或與其具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的序列，且所述抗體不具有VRC01的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含SEQIDNO：1的重鏈共有序列以及SEQIDNO：2的輕鏈共有序列的一種或兩種，并且其中所述抗體在小于1.0μg/ml的IC50濃度時(shí)中和HIV病毒ZM53M.PB12，或在小于1.0μg/ml的IC50濃度時(shí)中和HIV病毒R1166.c1，或在小于30μg/ml的IC50濃度時(shí)中和DU172.17。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含SEQIDNO：1的重鏈共有序列以及SEQIDNO：2的輕鏈共有序列的一種或兩種，其中所述抗體在小于30μg/ml的IC50濃度時(shí)中和VRC01抗性的HIV病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其選自3BNC117、3BNC60、12A12、12A21、NIH45-46、8ANC131、8ANC134、IB2530、INC9和8ANC196。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)域，這些區(qū)域包括HIV抗體相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列，所述HIV抗體選自3BNC117、3BNC60、12A12、12A21、NIH45-46、bANC131、8ANC134、IB2530、INC9和8ANC196。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含選自SEQIDNO：5-438的氨基酸序列的重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含選自SEQIDNO：439-583的氨基酸序列的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含重鏈和輕鏈，所述重鏈和輕鏈包括表A或表B中所列的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包括含有氨基酸序列：ASWDFDF(SEQIDNO：3)的插入序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包括含有氨基酸序列：TARDY(SEQIDNO：4)的插入序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含插入序列SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用以提高分離的HIV抗體的HIV中和效力和廣度的方法，所述方法包括插入至少一個(gè)插入序列SEQIDNO：3和SEQIDNO：4。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的分離的HIV抗體的組合物。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的抗體以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的分離的HIV抗體的核酸分子。根據(jù)其他的實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明的分離的HIV抗體的核酸分子的載體，以及包含所述載體的細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療HIV感染或HIV相關(guān)疾病的方法，其包括步驟：鑒定需要這種預(yù)防或治療的哺乳動(dòng)物受試者，以及施與所述受試者至少一種治療有效量的本發(fā)明的HIV抗體。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，方法進(jìn)一步包括施用第二治療劑。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，第二治療劑是抗病毒劑。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式提供了減少病毒復(fù)制或感染傳播到其他宿主細(xì)胞或組織中的方法，其包括用至少一種本發(fā)明的抗體接觸哺乳動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療感染了HIV的哺乳動(dòng)物受試者的方法，該方法包括施與所述受試者包含至少一種本發(fā)明的抗體的藥物組合物。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供用于制備和施用HIV抗體制劑的方法，其中HIV抗體制劑適合以一定量或根據(jù)足以誘導(dǎo)對HIV的保護(hù)性免疫反應(yīng)或降低哺乳動(dòng)物受試者中HIV病毒的計(jì)劃表施用于患有HIV感染或具有感染HIV風(fēng)險(xiǎn)的哺乳動(dòng)物受試者。在另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了用于檢測生物樣品中包含含有高度保守共有序列的重鏈和含有高度保守共有序列的輕鏈的HIV抗體的方法，。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的分離的抗體，其用于治療HIV。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包含本發(fā)明的藥學(xué)有效量的分離的HIV抗體的藥學(xué)上可接受的劑量單位，以及藥學(xué)有效量的HIV試劑的藥學(xué)上可接受的劑量單位，所述HIV試劑選自非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、進(jìn)入或融合抑制劑以及整合酶抑制劑，其中這兩種藥學(xué)上可接受的劑量單位都可以任選地采取單個(gè)藥學(xué)上可接受的劑量單位的形式。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于診斷、預(yù)后或監(jiān)測受試者的HIV治療的試劑盒，其包括一種或多種檢測試劑，該檢測試劑特異性結(jié)合來源于受試者的生物樣品中的抗-HIV中和抗體。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，所述試劑盒還提供了用于進(jìn)行PCR或質(zhì)譜的試劑。附圖說明圖1A-D顯示了HIV抗體中和活性IC50。(A)限制面板。最上面一行表示供體數(shù)，然后是克隆或抗體(表4)；病毒顯示在左側(cè)。顏色表示IC50濃度：紅色≤0.1μg/ml；橙色0.1-1μg/ml；黃色1-10μg/ml；綠色≥10μg/ml；白色表示在測試的任何濃度下未被中和。(B)擴(kuò)展面板。(C)比較VRC01、NIH45-46、3BNC117的中和總結(jié)圖。線段長度和圓的尺寸與IC50成反比。顏色表示病毒進(jìn)化枝：紅色A、藍(lán)色B、綠色C、紫紅色D、黑色AE、金色AG。(D)3BNC60(SEQIDNO：893)、1B2530和8ANC134重鏈的序列，淺灰覆蓋的為在質(zhì)譜圖中發(fā)現(xiàn)的肽。紅點(diǎn)表示了各種種系序列之間的差異。圖2A-C顯示HIV抗體的結(jié)合性質(zhì)。(A)12A12、12A21和12A-種系(GL)還原(reverted)的抗體結(jié)合到Y(jié)U2-gp140和2CC-核心的代表性SPR傳感圖。(B)圖顯示了代表性抗體的KA。(C)圖顯示了與所示抗體孵育后，結(jié)合到表達(dá)Bal.26的293T細(xì)胞的抗-CD4i抗體的平均熒光強(qiáng)度。表顯示了抗體是否誘導(dǎo)了CD4i位點(diǎn)可達(dá)性。圖3A和B顯示了HIV抗體的共有序列，以及HIV抗體的氨基酸序列。(A)種系基因、10個(gè)選擇的抗體和8ANC195(分別為SEQIDNO：1和890-902，按出現(xiàn)順序編號)關(guān)于框架區(qū)(FR)和CDR區(qū)的氨基酸一致性的比對。殘基根據(jù)3BNC60的結(jié)構(gòu)來編號。(B)同A類似，顯示了輕鏈(分別為SEQIDNO：2和903-916，按出現(xiàn)順序編號)的比對。(C、D和E)3BNC60Fab的晶體結(jié)構(gòu)。圖4A和B顯示了將高度突變的免疫球蛋白重鏈用特異引物恢復(fù)。(A)新舊引物組的并列比較。紅色框表示IgVH基因的成功擴(kuò)增。圖4A分別公開了SEQIDNO：917-979，按出現(xiàn)順序編號)(B)結(jié)合來源于Pt8的2CC-核心的HIV抗體?？寺〖易灞硎緸椴煌瑪U(kuò)展的片形。二個(gè)不能用舊引物組擴(kuò)增的高突變克隆顯示為條紋扇形。圖5顯示了新的VRC01克隆成員的IgV重鏈(A)(分別為SEQIDNO：980-984，按出現(xiàn)順序編號)和輕鏈(B)(分別為SEQIDNO：985-989，按出現(xiàn)順序編號)的序列。圖6顯示了患者血清中和活性。(A)表總結(jié)了在Tzm-bl檢測中抗一組Tier2病毒的純化的血清IgG的中和活性。暗紅色框表示IC50值低于10μg/ml，橙色表示為IC50值在10-100μg/ml之間且黃色表示為IC50值高于100μg/ml。(B)點(diǎn)圖總結(jié)了4個(gè)更廣泛測試的患者的A中所示的IC50值。圖7證明了通過質(zhì)譜對抗體的檢測。碰撞活化的解離(collisionactivateddissociation)MS/MS譜記錄了帶兩個(gè)電荷的來自3BNC153HC的肽HSDYCDFDVWGSGSQVIVSSASTK(SEQIDNO：888)(A)和來自8ANC134HC的DGLGEVAPAYLYGIDAWGQGTTVIVTSASTK(SEQIDNO：889)。(B.將觀察到的b型片段離子(含N-末端)和y-型片段離子(含C-末端)標(biāo)記于譜中。來自片段離子的水的損失表示為*。對應(yīng)于來自母離子的水的損失的離子標(biāo)記于譜中。觀察到的骨架裂解在序列中用表示b型離子并且用表示y型離子。圖8A和B證實(shí)了HIV抗體的親和力。(A)通過表面等離子體共振(SPR)測定的結(jié)合于gp140和2CC-核的抗體。所選的3BNC-抗體克隆的抗體結(jié)合的SPR傳感圖隨時(shí)間顯示。(B)柱狀圖顯示了A中所示的所選IgG抗體與gp140和2CC-核心抗原的結(jié)合親和力(KA)。RU，反應(yīng)單位。圖9A-C顯示了所選HIV抗體對于(A)免疫球蛋白重鏈基因、(B)輕鏈κ和(C)輕鏈λ基因序列的體細(xì)胞超突變分析。用其各自的種系核苷酸序列進(jìn)行序列比對。體細(xì)胞突變顯示為紅色的字母，另外灰色框是指替代突變。具有指示共有殘基的*的種系氨基酸序列顯示于核苷酸比對之上。圖9A公開了SEQIDNO：991、990和992-997；圖9A續(xù)公開了SEQIDNO：999、998和1000-1003；圖9B公開了SEQIDNO：1005、1004和1006-1009；圖9B續(xù)公開了SEQIDNO：1011、1010和1012-1015；且圖9C公開了SEQIDNO：1017、1016和1018-1019，全部都是分別以出現(xiàn)順序編號的。圖10A-C顯示了來自每個(gè)(A)病人(Pt)1、(B)Pt3和(C)Pt8的一個(gè)擴(kuò)展的中和克隆的抗體序列。通過質(zhì)譜鑒定的肽以顏色表示。通過一個(gè)或多個(gè)質(zhì)譜所觀察到的肽(由淺灰色表示)唯一地定義標(biāo)有星號的變體。其余的質(zhì)譜所觀察到肽不唯一地對應(yīng)多個(gè)變體，表示為深灰色。帶有下劃線的氨基酸表示顯示的變體中的非胰蛋白酶裂解位點(diǎn)。推測裂解通過胰凝乳蛋白酶裂解或其他突變(在克隆的變體中未觀察到)產(chǎn)生，所述突變在這些位點(diǎn)加入了賴氨酸或精氨酸殘基。圖10A公開了SEQIDNO：1020-1061；圖10B公開了SEQIDNO：1062-1113；且圖10C公開了SEQIDNO：1114-1138，全部都是分別以出現(xiàn)順序編號。具體實(shí)施方式發(fā)明的詳細(xì)說明I.HIV中和抗體本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中提供了抗HIV廣譜中和抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含含有共有氨基酸序列：QXXLXQSGGXVKKPGXSVXVSCXASGYXXFXXYXIHWXRQAPGXGXXWVGXIXPRXGXXXXAXXFQGRLSLTRDXXXXXXTXXXFMDLXGLRXDDTAVYFCARXXXXXXXXXXXXXXXXXXDX(SEQIDNO：1)的重鏈，其中X表示任意氨基酸或無氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含含有共有氨基酸序列：EIXLTQSPXSLSXSXGEXXTISCXXXQXXXXXXXLXWYQQRXGXAPRLLIXXXSXXXXGVPXRFSGXXXGXXYXLXISXLXXDDXAXYFCXXYEXXXXXXX(SEQIDNO：2)的輕鏈，其中X表示任意氨基酸或無氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含SEQIDNO：1的重鏈序列和SEQIDNO：2的輕鏈序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含SEQIDNO：1的重鏈序列和SEQIDNO：2的輕鏈序列的一種或兩種，或與其具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的序列，且抗體不具有VRC01的氨基酸序列。同一性百分比如下文所公開的進(jìn)行測定。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分離的HIV抗體，其包含含有高度保守的重鏈氨基酸序列的重鏈和含有高度保守的輕鏈氨基酸序列的輕鏈。高度保守的重鏈氨基酸序列在本文中定義為與SEQIDNO:1的序列具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。高度保守的輕鏈氨基酸序列在本文中定義為與SEQIDNO:2的序列具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。同一性百分比如下文所公開的進(jìn)行測定。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含含有高度保守的重鏈氨基酸序列的重鏈和含有高度保守的輕鏈氨基酸序列的輕鏈，且抗體不具有VRC01的序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含SEQIDNO:1的重鏈序列和SEQIDNO：2的輕鏈序列的一個(gè)或兩個(gè)，并且其中抗體在小于1.0μg/ml的IC50濃度下中和HIV病毒ZM53M.PB12，或在小于1.0μg/ml的IC50濃度下中和HIV病毒R1166.c1，或在小于30μg/ml的IC50濃度下中和DU172.17。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含SEQIDNO:1的重鏈序列和SEQIDNO:2的輕鏈序列的一個(gè)或兩個(gè)，其中抗體在小于30μg/ml的IC50濃度下中和抗VRC01的HIV病毒。抗VRC01的HIV病毒在本文中定義為在50μg/ml的IC50值時(shí)能耐受VRC01的中和的HIV病毒?？筕RC01的HIV病毒包括，例如，HO86.8、DU172.17、250-4、278-50以及620345.c1。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其選自3BNC117、3BNC60、12A12、12A21、NIH45-46、bANC131、8ANC134、IB2530、INC9和8ANC196。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含重鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)和輕鏈CDR1、CDR2和CDR3區(qū)，這些區(qū)域包括選自3BNC117、3BNC60、12A12、12A21、NIH45-46、bANC131、8ANC134、IB2530、INC9和8ANC196的HIV抗體的相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含含有選自SEQIDNO：5-438的氨基酸序列的重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含含有選自SEQIDNO：439-583的氨基酸序列的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含含有列于表A或表B中的氨基酸序列的重鏈和輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含含有氨基酸序列：ASWDFDF(SEQIDNO：3)的插入序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其中插入序列SEQIDNO：3對應(yīng)于起始于如圖5A所示的3BNC117和3BNC60的氨基酸74的重鏈的FR3區(qū)域，如通過序列比對所確定的，插入序列SEQIDNO：3替換了本發(fā)明的HIV抗體的相應(yīng)區(qū)域。例如，SEQIDNO：3可以插入在重鏈FR3的第七個(gè)氨基酸之后。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其包含含有氨基酸序列：TARDY(SEQIDNO：4)的插入序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其中插入序列SEQIDNo：4對應(yīng)于起始于如圖5A所示的NIH45-46的氨基酸103的重鏈的CDR3區(qū)域，如通過序列比對所確定的，插入序列SEQIDNO：4替換了本發(fā)明的HIV抗體的相應(yīng)區(qū)域。例如，SEQIDNO：4可以插入在重鏈CDR3的第四個(gè)氨基酸之后。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了分離的HIV抗體，其中插入序列SEQIDNo：3對應(yīng)于起始于如圖5A所示的3BNC117和3BNC60的氨基酸74的重鏈的FR3區(qū)域，如通過序列比對所確定的，插入序列SEQIDNO：3替換了本發(fā)明的HIV抗體的相應(yīng)區(qū)域，并且插入序列SEQIDNo：4對應(yīng)于起始于如圖5A所示的NIH45-46的氨基酸103的重鏈的CDR3區(qū)域，如通過序列比對所確定的，插入序列SEQIDNO：4替換了本發(fā)明的HIV抗體的相應(yīng)區(qū)域。例如，SEQIDNO：3可以插入在重鏈的FR3的第七個(gè)氨基酸之后并且SEQIDNO：4可以插入在重鏈的CDR3的第四個(gè)氨基酸之后。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于提高分離的HIV抗體的HIV中和效力和廣度的方法，其包含制備分離的HIV抗體，其中插入序列SEQIDNo：3對應(yīng)于起始于如圖5A所示的3BNC117和3BNC60的氨基酸74的重鏈的FR3區(qū)域，如通過序列比對所確定的，插入序列SEQIDNO：3替換了本發(fā)明的HIV抗體的相應(yīng)區(qū)域，和/或插入序列SEQIDNo：4對應(yīng)于起始于如圖5A所示的NIH45-46的氨基酸103的重鏈的CDR3區(qū)域，如通過序列比對所確定的，插入序列SEQIDNO：4替換了本發(fā)明的HIV抗體的相應(yīng)區(qū)域。例如，SEQIDNO：3可以插入在重鏈的FR3的第七個(gè)氨基酸之后和/或SEQIDNO：4可以插入在重鏈的CDR3的第四個(gè)氨基酸之后。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用用于多肽或抗體生產(chǎn)的重組方法和/或合成化學(xué)技術(shù)修飾抗體的氨基酸序列。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過使用如下所述的HIV中和分析鑒定具有更強(qiáng)HIV中和效力和廣度的改良的HIV抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了改良的分離的HIV抗體，其包括插入序列SEQIDNO：3和SEQIDNO：4中的至少一個(gè)，其中所述改良的分離的HIV抗體與所述沒有插入序列SEQIDNO：3和SEQIDNO：4的分離的HIV抗體相比，具有更強(qiáng)的HIV中和效力和廣度。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過使用如下所述的HIV中和分析鑒定具有更強(qiáng)的HIV中和效力和廣度的改良的HIV抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用用于多肽或抗體生產(chǎn)的重組方法和/或合成化學(xué)技術(shù)修飾抗體的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制備分離的HIV抗體的方法，其包含SEQIDNO：1的重鏈共有序列和SEQIDNO：2的輕鏈序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)分離的HIV抗體的方法，其包括SEQIDNO：1的重鏈共有序列和SEQIDNO：2的輕鏈序列中的一個(gè)或兩個(gè)，或者與其具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的序列，并且該抗體不具有VRC01的氨基酸序列。同一性百分比按如下所述進(jìn)行測定。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了檢測分離的HIV抗體的方法，其包括從哺乳動(dòng)物受試者獲得含免疫球蛋白的生物樣品，從所述樣品分離HIV抗體，測定HIV抗體的氨基酸序列，并鑒定是否存在SEQIDNO：1的重鏈序列和SEQIDNO：2的輕鏈序列。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了選擇分離的HIV抗體的方法，其包括測定是否存在SEQIDNO：1的重鏈共有序列和SEQIDNO：2的輕鏈序列中的一個(gè)或兩個(gè)，或者與其具有至少70％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少97％、或至少98％或至少99％同一性的序列，并且該抗體不具有VRC01的氨基酸序列。同一性百分比按下文所述進(jìn)行測定。生物樣品可以是血液、血清、唾液、尿、痰、細(xì)胞拭子樣品或組織活檢。氨基酸序列可以通過本領(lǐng)域已知的方法包括如PCR和質(zhì)譜進(jìn)行測定。本文所用的術(shù)語“抗體”(Ab)包括單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異抗體和多反應(yīng)性抗體)以及抗體片段。因此，在本說明書任意語境使用的術(shù)語“抗體”是指包括，但不限于，任意的特異性結(jié)合成員、免疫球蛋白類型和/或同種型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD、IgE和IgM)；和其生物相關(guān)片段或特異性結(jié)合成員，包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv和scFv(單鏈或相關(guān)物)。本領(lǐng)域知曉，抗體是包含通過二硫鍵內(nèi)部相連的至少兩個(gè)重(H)鏈和兩個(gè)輕(L)鏈的糖蛋白或其抗原結(jié)合部分。重鏈由重鏈可變區(qū)(VH)和重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)組成。輕鏈?zhǔn)怯奢p鏈可變區(qū)(VL)和輕鏈恒定區(qū)(CL)組成。重鏈和輕鏈兩者的可變區(qū)都包括框架區(qū)(FWR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。四個(gè)FWR區(qū)相對保守，而CDR區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)代表超變區(qū)并且從NH2末端到COOH末端排列如下：FWR1、CDR1、FWR2、CDR2、FWR3、CDR3、FWR4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而依據(jù)同種型，恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合。同時(shí)，本文所定義的“抗體”也包括嵌合抗體、人源化抗體和重組抗體、產(chǎn)生于轉(zhuǎn)基因非人類動(dòng)物的人抗體以及選自利用本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用的富集技術(shù)產(chǎn)生的庫的抗體。術(shù)語“可變”是指抗體間可變(V)區(qū)的某些片段在序列上存在廣泛差異。所述V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合并且定義了特定抗體對于其特定抗原的特異性。然而，可變性并非均勻分布在跨越110個(gè)氨基酸的可變區(qū)域中。相反，V區(qū)域由每個(gè)均長9-12個(gè)氨基酸的被稱為“超變區(qū)”的具有極度可變性的較短區(qū)域所分割的具有15-30個(gè)氨基酸的相對不變的被稱為框架區(qū)(FR)的片段(stretch)組成。天然的重鏈和輕鏈的可變區(qū)每一個(gè)都包括四個(gè)FR，大多采取β-片層構(gòu)型，通過3個(gè)超變區(qū)相連，其形成連接部分β-片層結(jié)構(gòu)，并且在某些情況中形成部分β-片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的超變區(qū)通過FR緊密相連，并與來自其它鏈的超變區(qū)一起促進(jìn)抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)形成(參見，如Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。本文的術(shù)語“超變區(qū)”是指抗體的負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)通常包含來自“互補(bǔ)決定區(qū)”(“CDR”)的氨基酸殘基。本文所用術(shù)語“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即包含個(gè)體抗體的群體除可能少量存在的天然發(fā)生的突變之外是相同的。術(shù)語“多克隆抗體”是指包括抗不同決定簇(“表位”)的不同抗體的制備物。本文的單克隆抗體包括“嵌合”抗體，其中部分重鏈和/或輕鏈與來自特定物種的或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體的相應(yīng)序列是相同或同源的，而鏈的其余部分與來自另一個(gè)物種或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類別或亞類的抗體以及此類抗體的片段的相應(yīng)序列是相同的或同源的，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(參見，例如，美國專利No.4,816,567；Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。本發(fā)明提供了來自人抗體的可變區(qū)抗原結(jié)合序列。因此，本文主要關(guān)注的嵌合抗體包括具有一個(gè)或多個(gè)人抗原結(jié)合序列(如CDR)并含有一個(gè)或多個(gè)來自非人抗體的序列如FR或C區(qū)序列的抗體。此外，本文所述的嵌合抗體是包含一種抗體類別或亞類的人可變區(qū)域抗原結(jié)合序列以及來自另一個(gè)抗體類別或亞類的另一個(gè)序列如FR或C區(qū)序列的抗體?！叭嗽椿贵w”通常認(rèn)為是具有從非人來源引入其中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的人抗體。這些非人氨基酸殘基經(jīng)常稱為“引入”(import)殘基，其通常取自“引入”可變區(qū)。人源化可以通過以下Winter及其同事提出的方法通過用引入超變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列進(jìn)行(參見，例如Jones等人，Nature,321:522-525(1986)；Reichmann等人，Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239:1534-1536(1988))。因此，此類“人源化”抗體是嵌合抗體(參見，例如，美國專利No.4,816,567)，其中基本上少于一個(gè)完整的人可變區(qū)域被非人類物種來源的相應(yīng)序列所替換?！翱贵w片段”包含完整抗體的部分，如完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)域。抗體片段的實(shí)例包括，但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體(參見，例如，美國專利No.5,641,870；Zapata等人，ProteinEng.8(10):1057-1062[1995])；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。“Fv”是包含完整的抗原識別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該片段包含由一個(gè)重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域以緊密的非共價(jià)結(jié)合的方式形成的二聚體。從這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的折疊產(chǎn)生出6個(gè)超變環(huán)(從H和L鏈各形成3個(gè)環(huán))，其提供氨基酸殘基用于抗原結(jié)合，并賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個(gè)可變區(qū)域(或Fv的一半，其僅包含3個(gè)抗原特異的CDR)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，雖然與完整結(jié)合位點(diǎn)相比，其親和力較低?！皢捂淔v”(“sFv”或“scFv”)是包含連接成單個(gè)多肽鏈的VH和VL抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。sFv多肽可以進(jìn)一步包含位于VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接臂，其使得sFv形成抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。對于sFv的綜述，參見，例如，Pluckthun在ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,Rosenburg和Mooreeds.,Springer-Verlag,NewYork,pp.269-315(1994)；Borrebaeck1995,以下。術(shù)語“雙價(jià)抗體”是通過構(gòu)建在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間具有短連接臂(約5-10個(gè)殘基)的sFv片段制備的小抗體片段，使得獲得V結(jié)構(gòu)域的鏈間而不是鏈內(nèi)的配對，形成二價(jià)片段，即具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段。雙特異雙價(jià)抗體是兩個(gè)“交叉”的sFv片段的異二聚體，其中兩個(gè)抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域存在于不同的多肽鏈上。雙價(jià)抗體更充分地描述于，例如EP404,097；WO93/11161；Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)，其可以由完全人的形式進(jìn)行生產(chǎn)，是抗體的最小已知的抗原結(jié)合片段，其范圍為約11kDa至約15kDa。dAb是免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的高(robust)可變區(qū)(分別是VH和VL)。其高表達(dá)于微生物細(xì)胞培養(yǎng)物中，顯示出良好的生物物理特性，包括例如但不限于，溶解度和溫度穩(wěn)定性，并且非常適合于在體外篩選系統(tǒng)如噬菌體展示中進(jìn)行篩選和親和力成熟。dAb作為單體具有生物活性，并且由于它們的小尺寸和固有的穩(wěn)定性，可以形成(formatted)較大的分子以產(chǎn)生具有延長的血清半衰期或其它藥理活性的藥物。這種技術(shù)的實(shí)例公開在，例如，WO9425591描述了來源于駱駝科動(dòng)物(Camelidae)重鏈Ig的抗體，以及US20030130496描述了從噬菌體文庫中分離單結(jié)構(gòu)域的完全人抗體。Fv和sFv是唯一的具有完整結(jié)合位點(diǎn)而缺少恒定區(qū)的種類。因此，它們在體內(nèi)使用中適合于減少非特異結(jié)合。構(gòu)建sFv融合蛋白以產(chǎn)生在sFv的氨基末端或羧基末端任意一端的效應(yīng)蛋白的融合。參見，例如AntibodyEngineering,ed.Borrebaeck,見上文?？贵w片段還可以是“線性抗體”，例如，如美國專利No.5,641,870中所述。此類線性抗體片段可以是單特異的或雙特異的。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是雙特異或多特異的。雙特異抗體是對于至少兩個(gè)不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。示例性的雙特異抗體可結(jié)合到單個(gè)抗原的兩個(gè)不同表位上。其它此類抗體可結(jié)合具有對于第二抗原的結(jié)合位點(diǎn)的第一抗原結(jié)合位點(diǎn)?；蛘?，抗HIV臂可以與結(jié)合白細(xì)胞的觸發(fā)分子上的臂相組合，觸發(fā)分子如T細(xì)胞受體分子(如CD3)，或IgG的Fc受體(FcγR)如FcγRI(CD64)、FCγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，以便將細(xì)胞防御機(jī)制集中并定位于受感染的細(xì)胞。雙特異抗體也可用于將細(xì)胞毒性試劑定位于受感染的細(xì)胞。雙特異抗體可以以全長抗體或抗體片段進(jìn)行制備(例如，F(xiàn)(ab')2雙特異抗體)。例如，WO96/16673描述了雙特異anti-ErbB2/anti-FcγRIII抗體并且美國專利No.5,837,234公開了雙特異anti-ErbB2/anti-FcγRI抗體。例如，WO98/02463公開了雙特異anti-ErbB2/Fcα抗體；美國專利No.5,821,337公開了雙特異anti-ErbB2/anti-CD3抗體。也可參見，如Mouquet等，PolyreactivityIncreasesTheApparentAffinityOfAnti-HIVAntibodiesByHeteroligation.NATURE.467,591-5(2010)。用于制備雙特異抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。傳統(tǒng)的生產(chǎn)全長雙特異抗體的方法基于共表達(dá)兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對，其中兩種鏈具有不同的特異性(參見，如Millstein等人，Nature,305:537-539(1983))。相似的方法公開在如WO93/08829、Traunecker等人，EMBOJ.,10:3655-3659(1991)以及Mouquet等人，PolyreactivityIncreasesTheApparentAffinityOfAnti-HIVAntibodiesByHeteroligation.NATURE.467,591-5(2010)中?；蛘?，具有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)融合到免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列上。與Ig重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的融合包含至少部分的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)。根據(jù)一些實(shí)施方式，含有輕鏈結(jié)合的必要位點(diǎn)的第一重鏈恒定區(qū)域(CH1)至少存在于其中一種融合之中。編碼免疫球蛋白重鏈融合以及，如果需要的話，免疫球蛋白輕鏈的DNA，插入到分別的表達(dá)載體中，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞中。當(dāng)用于構(gòu)建的三種多肽鏈的不等比例可以提供所需的雙特異抗體的最佳產(chǎn)量時(shí)，這種方式可為調(diào)整實(shí)施方式中的三種多肽片段的相互比例提供更大的靈活性。但是，當(dāng)以相同比例表達(dá)至少兩種多肽鏈可導(dǎo)致高產(chǎn)量或當(dāng)比例對期望的鏈結(jié)合的產(chǎn)量無明顯影響時(shí)，可以將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入單個(gè)表達(dá)載體中。用于從抗體片段產(chǎn)生雙特異抗體的技術(shù)也已在文獻(xiàn)中公開。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異抗體。例如，Brennan等人，Science，229：81(1985)中公開了一種方法，其中完整抗體被蛋白水解切開進(jìn)而產(chǎn)生F(ab')2片段。這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的條件下被還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后，產(chǎn)生的Fab'片段被轉(zhuǎn)化為硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后，F(xiàn)ab'-TNB衍生物中的一個(gè)通過用巰基乙胺還原進(jìn)而重新轉(zhuǎn)換為Fab'-硫醇，并與其它Fab'-TNB衍生物等摩爾量混合，以形成雙特異抗體。產(chǎn)生的雙特異抗體可作為酶的選擇性固定的試劑?？贵w的其它修飾在本文中也有涉及。例如，抗體可被連接到多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物?？贵w還可以通過如凝聚技術(shù)或通過界面聚合(例如，分別的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)包埋在制備的微膠囊中并用于膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)或用于大珠滴乳液。這樣的技術(shù)公開于，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Oslo,A.,Ed.,(1980)。通常，本發(fā)明的抗體是重組產(chǎn)生的，使用的載體和方法是本領(lǐng)域已有的。人抗體還可以通過體外活化的B細(xì)胞來產(chǎn)生(參見，例如，美國專利No.5,567,610和5,229,275)。本發(fā)明在分子遺傳學(xué)和基因工程方面所使用的常規(guī)方法公開在現(xiàn)行版的MolecularCloning:ALaboratoryManual(Sambrook等人,1989,ColdSpringHarborLaboratoryPress)；GeneExpressionTechnology(MethodsinEnzymology,Vol.185,D.Goeddel編,1991.AcademicPress,SanDiego,CA)；"GuidetoProteinPurification"inMethodsinEnzymology(M.P.Deutshcer,ed.,(1990)AcademicPress,Inc.)；PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications(Innis等人，1990.AcademicPress,SanDiego,CA)；CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,2ndEd.(R.I.Freshney.1987.Liss,Inc.NewYork,NY)以及GeneTransferandExpressionProtocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,TheHumanaPressInc.,Clifton,N.J.。試劑、克隆載體和用于遺傳操做的試劑盒購自商業(yè)供應(yīng)商如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Clontech和Sigma-AldrichCo。人抗體也可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)中產(chǎn)生，其能夠在不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的情況下產(chǎn)生全組成成分的人抗體。例如，已經(jīng)公開了在嵌合和種系突變的小鼠中純合缺失抗體重鏈連接區(qū)域(JH)基因?qū)е峦耆种苾?nèi)源抗體的產(chǎn)生。將人種系的免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)到這樣的種系突變的小鼠中通過抗原攻擊產(chǎn)生人抗體。參見，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等人，Nature,362:255-258(1993)；Bruggemann等人，YearinImmuno.,7:33(1993)；美國專利No.5,545,806、5,569,825、5,591,669(均是GenPharm的)；美國專利No.5,545,807以及WO97/17852。這樣的動(dòng)物可以被遺傳工程改造以產(chǎn)生包括本發(fā)明的多肽的人抗體。已經(jīng)開發(fā)了各種用于產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)。通常，這些片段通過蛋白水解消化衍生自完整抗體(參見，例如，Morimoto等人，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117(1992)以及Brennan等人，Science,229:81(1985))。然而，現(xiàn)在這些片段可直接由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生。Fab、Fv和ScFv抗體片段都可表達(dá)在E.coli中并由E.coli分泌，從而可容易地生成大量的這樣的片段。Fab'-SH片段可從E.coli中直接回收并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(參見，例如，Carter等人，Bio/Technology10:163-167(1992))。根據(jù)另一種方法，F(xiàn)(AB')2片段可以從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中直接分離。美國專利No.5,869,046中公開了具有延長的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab')2片段，其包含補(bǔ)救(salvage)受體結(jié)合表位殘基。其它用于生產(chǎn)抗體片段的技術(shù)對于技術(shù)人員是明顯的。用于從庫中使用富集技術(shù)篩選抗體片段的其它的技術(shù)在本領(lǐng)域里是已知的，包括但不限于：噬菌體展示；核糖體展示(Hanes和Pluckthun，1997,Proc.Nat.Acad.Sci.94:4937-4942)；細(xì)菌展示(Georgiou等人，1997,NatureBiotechnology15:29-34)和/或酵母菌展示(Kieke等人，1997,ProteinEngineering10:1303-1310)，這些都可代替先前所描述的技術(shù)來篩選單鏈抗體。從直接利用絲狀噬菌體技術(shù)產(chǎn)生的單鏈抗體庫中篩選單鏈抗體。噬菌體展示技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(例如，參見來源于CambridgeAntibodyTechnology(CAT)的技術(shù))，其公開于美國專利No.5,565,332；5,733,743；5,871,907；5,872,215；5,885,793；5,962,255；6,140,471；6,225,447；6,291650；6,492,160；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081以及其他美國專利家族成員中，或依賴于在1992年5月24日提交的優(yōu)先權(quán)申請GB9206318的申請，也可參見Vaughn等人1996,NatureBiotechnology14:309-314。單鏈抗體還可以用已知的重組DNA技術(shù)，如DNA擴(kuò)增方法(如PCR)或可以通過使用相應(yīng)的雜交瘤cDNA作為模板進(jìn)行設(shè)計(jì)并構(gòu)建。變體抗體也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。因此，申請中所列舉的序列的變體也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)?？梢酝ㄟ^使用本領(lǐng)域已知的方法獲得具有改良的親和性的抗體序列的其他變體并且這些變體也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如，氨基酸替換可用于獲得具有進(jìn)一步改良的親和性的抗體?；蛘撸塑账嵝蛄械拿艽a子優(yōu)化可用于改善抗體生產(chǎn)中的表達(dá)系統(tǒng)的翻譯效率。這樣的變體抗體序列與申請中列舉的序列具有70％或更多(例如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高)的序列同一性。這樣的序列同一性是相對于參考序列(即，申請中列舉的序列)的全長計(jì)算獲得的。本文所述的百分比同一性是通過使用BLAST版本2.1.3并使用由NCBI(美國國家生物技術(shù)信息中心；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)給定的默認(rèn)參數(shù)[Blosum62矩陣；空位開放罰分＝11并且空位延伸罰分＝1]來確定的。例如，本發(fā)明提供的肽序列包含至少約5、10、15、20、30、40、50、75、100、150或更多的本發(fā)明公開的一個(gè)或多個(gè)序列的連續(xù)肽以及其之間所有的中間長度的肽。本文所用的術(shù)語“中間長度”是指在所引用值中間的任意長度，如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等。本發(fā)明提供單獨(dú)的抗體，或與其它抗體聯(lián)合的抗體，例如但不限于VRC01和PG9，其在血清中具有廣譜中和活性。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了用于制備和施用HIV抗體組合物的方法，其適合對患有HIV感染或處在HIV感染風(fēng)險(xiǎn)下的人類或非人類靈長類動(dòng)物患者以一定量且根據(jù)方案施用抗體組合物，所述方案足以誘導(dǎo)人類中的對抗HIV的保護(hù)性免疫應(yīng)答或減少HIV病毒。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了包含至少一種本發(fā)明的抗體和藥學(xué)上可接受的載體的疫苗。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，所述疫苗是包含至少一種本文所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體的疫苗。該疫苗可包括具有本文所述特征的、任意組合的多種抗體并且可以進(jìn)一步包括本領(lǐng)域已知的中和HIV的抗體。應(yīng)當(dāng)理解，組合物可以是單一的本文所述的抗體或本文所述抗體的組合，其可以是相同或不同的，用以預(yù)防性或治療性處理疫苗接種后各種亞型的HIV感染的進(jìn)展。這樣的組合可以根據(jù)所期望的免疫力來進(jìn)行篩選。當(dāng)抗體施于給動(dòng)物或人時(shí)，其可以與一種或多種本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或佐劑組合。組合物還可以包括本領(lǐng)域已知的廣譜中和抗體，包括但不限于VRC01、PG9和b12。此外，對于確定患者中HIV治療的有效水平，特別地，合適的動(dòng)物模型是可以獲得的并且已廣泛用于評估各種基因治療方案在體內(nèi)對抗HIV的功效(Sarver等人，(1993b),見上文)。這些模型包括小鼠、猴和貓。即使這些動(dòng)物HIV疾病天然不敏感，用人外周血單核細(xì)胞(PBMC)、淋巴結(jié)、胎兒肝臟/胸腺或其它組織重組的嵌合小鼠模型(例如SCID、bg/nu/xid、NOD/SCID、SCID-hu、免疫活性的SCID-hu、骨髓消融的BALB/c)也可以用慢病毒載體或HIV感染，并作為HIV發(fā)病機(jī)理的模型。相似地，可使用猴免疫缺陷病毒(SIV)/猴模型以及貓免疫缺陷病毒(FIV)/貓模型。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)用于治療性治療AIDS時(shí)，藥物組合物可以包括其它藥物與載體。這些其它藥物可以以其傳統(tǒng)方式來使用(即，作為抗病毒劑治療HIV感染)。HIV藥劑的實(shí)例包括但不限于非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、進(jìn)入或融合抑制劑和整合酶抑制劑。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了基于抗體的藥物組合物，其包含有效量的分離的HIV抗體或親和力成熟版本，其為減少HIV病毒的感染提供了預(yù)防性或治療性治療的選擇。本發(fā)明的基于抗體的藥物組合物可以通過任意數(shù)目的本領(lǐng)域已知的策略進(jìn)行配制(例如，參見McGoff和Scher,2000,SolutionFormulationofProteins/Peptides:InMcNally,E.J.,ed.ProteinFormulationandDelivery.NewYork,NY:MarcelDekker；pp.139-158；Akers和Defilippis,2000,PeptidesandProteinsasParenteralSolutions.In:PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins.Philadelphia,PA:TalyorandFrancis；pp.145-177；Akers等人，2002,Pharm.Biotechnol.14:47-127)。適合于患者施用的藥學(xué)上可接受的組合物包含有效量的制劑中的抗體，其在可接受溫度范圍內(nèi)的貯存過程中既保留了生物活性也可促進(jìn)最大穩(wěn)定性。藥物組合物還可以包括，依賴于所需要的制劑，藥學(xué)上可接受的稀釋劑、藥學(xué)上可接受的載體和/或藥學(xué)上可接受的賦形劑或常規(guī)用于配制施用于動(dòng)物或人的藥物組合物的這類載體。所選擇的稀釋劑不應(yīng)影響組合物的生物活性。這類稀釋劑的實(shí)例是蒸餾水、磷酸鹽生理緩沖鹽水、Ringer's溶液、葡萄糖溶液和Hank's溶液。本發(fā)明的藥物組合物或制劑中有用的賦形劑的量是為了將抗體均勻分散在整個(gè)組合物中，使得當(dāng)其傳遞給有需求的受試者時(shí)，其可以是均勻分散的量。它可以用于稀釋抗體到這樣一個(gè)濃度，該濃度提供了所需的有益緩和效果或治療效果，并同時(shí)將可能由過高濃度引起的任何不良副作用最小化。其還具有防腐效果。因此，對于具有高生理活性的抗體而言，將使用較多的賦形劑。另一方面，對于任何表現(xiàn)出較低生理活性的活性成分而言，將使用較少量的賦形劑。包含至少一種本文所述的抗體或本文所述的抗體的組合的上述抗體和抗體組合物或疫苗組合物可以用于預(yù)防性和治療性治療HIV病毒感染。本發(fā)明還涉及分離的多肽，其包含列于表A、B和圖10A-C的輕鏈和重鏈的氨基酸序列；SEQIDNO:1和2的重鏈和輕鏈的共有序列；以及插入序列SEQIDNO：3和4。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了多肽變體，其編碼列于表A、B和圖10A-C的HIV抗體的氨基酸序列；SEQIDNO:1和2的重鏈和輕鏈的共有序列；以及插入序列SEQIDNO：3和4。這些多肽變體與本發(fā)明的多肽序列相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或更高的序列同一性，如通過使用本文所述方法所測定的(例如，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，通過考慮氨基酸相似性等因素，這些值可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整從而確定編碼的的蛋白的相應(yīng)同一性。術(shù)語“多肽”取其常規(guī)含義，即氨基酸的序列。多肽不限于一個(gè)特定長度的產(chǎn)物。肽、寡肽和蛋白質(zhì)均包括在多肽的定義之內(nèi)，并且除非另有說明，這些術(shù)語可以互換地使用。此術(shù)語也包括多肽的表達(dá)后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本領(lǐng)域已知的天然存在的和非天然存在的其它修飾。多肽可以是完整的蛋白質(zhì)或其亞序列。本發(fā)明語境中感興趣的特定多肽是含有CDR、VH和VL的氨基酸亞序列，并能夠結(jié)合抗原或HIV感染的細(xì)胞。本文所用的術(shù)語多肽“變體”是多肽，其通常不同于本文所具體公開的多肽，其具有一個(gè)或多個(gè)替換、缺失、添加和/或插入。這樣的變體可以是天然存在或合成產(chǎn)生的，例如，通過對本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)上述多肽序列進(jìn)行修飾，且對本文所述的多肽的一個(gè)或多個(gè)生物活性進(jìn)行評估和/或使用任何數(shù)量的本領(lǐng)域公知的技術(shù)。例如，某些氨基酸可以替換在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的其它氨基酸而沒有明顯損失與其它多肽(如抗原)或細(xì)胞結(jié)合的能力。由于結(jié)合能力和蛋白性質(zhì)決定了蛋白的生物功能活性，可以在蛋白序列上進(jìn)行某些氨基酸序列的替換并且，因此，其基礎(chǔ)的DNA編碼序列，從而獲得具有類似性質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此，考慮到的是，在所公開的組合物的肽序列或相應(yīng)的編碼所述肽的DNA序列中制備各種變化，而未明顯損失它們的生物效用或活性。在許多情況中，多肽變體含有一個(gè)或多個(gè)保守替換?！氨Ｊ靥鎿Q”是指其中氨基酸被其它具有類似性質(zhì)的氨基酸所替換，使得肽化學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員可預(yù)期多肽的二級結(jié)構(gòu)和親水(hydropathic)性質(zhì)基本上不發(fā)生變化。氨基酸替換通常是基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對相似性，如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]了各種前述特征的示例性替換是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的并包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸?！巴葱浴被颉靶蛄型恍浴笔侵冈谛蛄斜葘鸵肴笨?如果必要的話，以獲得最大百分比同源性)后，多核苷酸或多肽序列變體的殘基與非變體序列的相同的百分比。在具體實(shí)施方式中，多核苷酸和多肽變體與本文所述的多核苷酸或多肽具有至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、或至少約99％的多核苷酸或多肽同源性。這樣的變體多肽序列與申請所列舉的序列具有70％或以上(即80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性。在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了多肽片段，其包括本文所公開的氨基酸序列的各種長度的連續(xù)延伸段(stretch)。例如，本發(fā)明提供的肽序列包含至少約5、10、15、20、30、40、50、75、100、150或更多的本發(fā)明公開的一個(gè)或多個(gè)序列的連續(xù)肽以及其之間所有的中間長度的肽。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的抗體的重鏈和輕鏈的部分或全部的核酸序列及其片段。由于遺傳密碼的冗余性，將存在編碼相同氨基酸序列的這些序列的變體。本發(fā)明還包括分離的核苷酸序列，其編碼列于表A、B和圖10A-C中的HIV抗體重鏈和輕鏈的多肽；SEQIDNO:1和2的重鏈和輕鏈的共有序列；以及插入序列SEQIDNO：3和4。在其它相關(guān)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了多核苷酸變體，其編碼列于表A、B和圖10A-C的HIV抗體的重鏈和輕鏈的肽序列；SEQIDNO:1和2的重鏈和輕鏈的共有序列；以及插入序列SEQIDNO：3和4。這些多核苷酸變體與本發(fā)明的多核苷酸序列相比，具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％或更多的序列同一性，如通過使用本文所述方法測定的(例如，使用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，通過考慮密碼子簡并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等因素，這些值可以適當(dāng)?shù)卣{(diào)整以確定相應(yīng)的由2條核苷酸序列編碼的蛋白的同一性。術(shù)語“核酸”和“多核苷酸”在本文可互換使用，是指單鏈或雙鏈RNA、DNA或混合聚合物。多核苷酸可以包括基因組序列、基因組外和質(zhì)粒序列以及表達(dá)或被改造來表達(dá)多肽的較小的工程化的基因片段。術(shù)語“分離的核酸”是核酸，其基本上與天然伴隨天然序列的其它基因組DNA序列以及蛋白或復(fù)合物如核糖體和聚合酶相隔離。該術(shù)語包括從其天然存在環(huán)境移動(dòng)的核酸序列，并且包括重組或克隆的DNA分離物以及化學(xué)合成的類似物或通過異源系統(tǒng)生物合成的類似物?；旧霞兊暮怂岚ê怂岬姆蛛x的形式。因此，它指最初(originally)分離的核酸并且不排除后來人工添加到分離的核酸上的基因或序列。本文所用術(shù)語多核苷酸“變體”，是一種多核苷酸，其通常因一個(gè)或多個(gè)替換、缺失、添加和/或插入而不同于本文具體公開的多核苷酸。這樣的變體可以是天然存在的或通過合成產(chǎn)生，例如通過對本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列進(jìn)行修飾，并對編碼的多肽的一個(gè)或多個(gè)生物活性進(jìn)行評估和/或使用任何數(shù)量的本領(lǐng)域公知的技術(shù)。修飾可以在本發(fā)明的多核苷酸結(jié)構(gòu)中制備且仍然能獲得有功能的分子，該分子編碼具有所需特征的變體或衍生多肽。當(dāng)希望改變多肽的氨基酸序列以創(chuàng)建本發(fā)明多肽的等價(jià)或甚至改良的變體或部分時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員通常會(huì)改變編碼DNA序列的一個(gè)或多個(gè)密碼子。通常，多核苷酸變體包含一個(gè)或多個(gè)替換、添加、缺失和/或插入，使得相對于由本文具體列出的多核苷酸序列編碼的多肽，由變體多核苷酸編碼的多肽的免疫原性結(jié)合性質(zhì)基本沒有降低。在另一個(gè)實(shí)施方式中，發(fā)明提供了多核苷酸片段，其包含各種長度的與本文公開的一個(gè)或多個(gè)序列相同或互補(bǔ)的連續(xù)延伸段的序列。例如，本發(fā)明提供的多核苷酸包含本文公開的一個(gè)或多個(gè)序列的至少約10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或更多的連續(xù)核苷酸以及在其中間的所有中間長度并包含所引用數(shù)值間的任何長度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；并包括200-500、500-1000間的所有整數(shù)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了能夠在中度至高度嚴(yán)格條件下與本發(fā)明提供的多核苷酸序列或其片段或其互補(bǔ)序列相雜交的多核苷酸組合物。雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域公知的。為了說明的目的，用于測試本發(fā)明的多核苷酸與其他多核苷酸雜交的合適中等嚴(yán)格條件包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)的溶液中預(yù)洗；在50-60℃、5×SSC、過夜的條件下雜交；再于65℃下20分鐘用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×的SSC各洗滌兩次。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可容易地操縱雜交的嚴(yán)格性，例如通過改變雜交溶液的鹽含量和/或進(jìn)行雜交的溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方式中，合適的高嚴(yán)格雜交條件包括上述的條件，所不同的是雜交溫度升高了，例如達(dá)到60-65℃或65-70℃。在一些實(shí)施方式中，由多核苷酸變體或片段編碼的多肽與天然多核苷酸編碼的多肽具有相同的結(jié)合特異性(即特異地或優(yōu)先地結(jié)合到相同的表位或HIV病毒株)。在一些實(shí)施方式中，所述多核苷酸、多核苷酸變體、片段和雜交序列編碼的多肽與本文具體列出的多肽序列具有至少約50％、至少約70％、以及至少約90％的結(jié)合活性水平。本發(fā)明的多核苷酸或其片段，無論其自身編碼序列的長度是多少，都可以與其它DNA序列如啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號、另外的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其它編碼片段等結(jié)合，使得其總長度可以變化很大?？墒褂脦缀跞魏伍L度的核酸片段。例如，說明性的多核苷酸段具有約10000、約5000、約3000、約2000、約1000、約500、約200、約100、約50個(gè)堿基對等的總長度，這些長度(也包括所有的中間長度)，這些都包括在本發(fā)明的許多實(shí)施方式中。在一些實(shí)施方式中，本文提供的多核苷酸序列可作為探針或引物用于核酸雜交，如作為PCR引物。這樣的核酸探針具有與目標(biāo)序列特異性雜交的能力，使它們能夠檢測給定樣品中是否存在互補(bǔ)序列。然而，本發(fā)明也包括其它用途，例如使用序列信息制備突變體的引物，或用于制備其它遺傳構(gòu)建體的引物。因此，本發(fā)明的核酸片段特別有用，該核酸片段包括至少約15個(gè)核苷酸長的連續(xù)序列的序列區(qū)域，該連續(xù)序列具有與本文公開的15個(gè)堿基長的連續(xù)序列相同或互補(bǔ)的序列。更長的連續(xù)的相同或互補(bǔ)序列，如約20、30、40、50、100、200、500、1000(包括所有的中間長度)長的那些(包括全長序列)以及這些數(shù)值間的所有長度也都用于一些實(shí)施方式中。多核苷酸分子所具有的序列區(qū)域由10-14、15-20、30、50或甚至100-200個(gè)核苷酸左右(也包括中間長度)的連續(xù)核苷酸延伸段組成，其與本文公開的多核苷酸序列相同或互補(bǔ)，特別考慮到將它們作為雜交探針，用于如Southern和Northern印跡法，和/或作為用于如PCR的引物。片段總長度以及互補(bǔ)延伸段(strech)的大小最終取決于具體核酸片段的預(yù)期用途或應(yīng)用。較小的片段通常用于雜交實(shí)施方案，其中連續(xù)互補(bǔ)區(qū)域的長度可以變化，如約15至約100個(gè)核苷酸之間，但根據(jù)希望檢測的互補(bǔ)序列的長度，可以使用較大的連續(xù)互補(bǔ)延伸段。使用約15-25個(gè)核苷酸長的雜交探針可形成既穩(wěn)定又具有選擇性的雙鏈分子。不過，為了增加雜交體的穩(wěn)定性和選擇性，從而提高所得到的特異的雜交分子的質(zhì)量和程度，可以利用具有多于12個(gè)堿基長度的連續(xù)互補(bǔ)序列的分子?？梢岳镁哂?5至25個(gè)連續(xù)核苷酸或者需要時(shí)甚至更長的基因互補(bǔ)的延伸段的核酸分子。雜交探針在本文公開的任何序列的任何部分中進(jìn)行選擇。需要的全部僅是回顧本文所列出的序列或序列的任何連續(xù)部分，從約15-25個(gè)核苷酸長直至并包括全長序列的長度，希望利用它們作為探針或引物。探針和引物序列的選擇受各種因素的制約。例如，可能希望從全部序列的末端選取引物。本發(fā)明范圍內(nèi)還包括如表達(dá)載體的載體，其包含本發(fā)明的核酸序列。轉(zhuǎn)化有這些載體的細(xì)胞也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明核酸的載體和宿主細(xì)胞，以及用于生產(chǎn)本發(fā)明多肽的重組技術(shù)。本發(fā)明的載體包括可以在任何類型的細(xì)胞或生物體中進(jìn)行復(fù)制的載體，包括如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒和迷你染色體。在一些實(shí)施方式中，包括本發(fā)明多核苷酸的載體是適合于多核苷酸繁殖或復(fù)制的載體，或者是適合于表達(dá)本發(fā)明多肽的載體。這樣的載體是本領(lǐng)域已知并可以購買的。“載體”包括穿梭載體和表達(dá)載體。通常，質(zhì)粒構(gòu)建體也包括分別用于細(xì)菌中質(zhì)粒復(fù)制和選擇的復(fù)制起點(diǎn)(如復(fù)制的ColE1起點(diǎn))和選擇標(biāo)記(如氨芐青霉素或四環(huán)素抗性)?！氨磉_(dá)載體”是指包含用于在細(xì)菌或真核細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的抗體包括抗體片段所需要的控制序列或調(diào)控元件的載體。本文所用術(shù)語“細(xì)胞”可以是任何細(xì)胞，包括但不限于真核、多細(xì)胞物種(如與單細(xì)胞的酵母細(xì)胞相反)，例如但不限于，哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人細(xì)胞。細(xì)胞可作為單一實(shí)體或者是較大的細(xì)胞群的一部分而存在。這樣的“較大的細(xì)胞群”可以包括如細(xì)胞培養(yǎng)物(混合的或純的)、組織(如內(nèi)皮組織、上皮組織、粘膜組織或其它組織)、器官(如肺、肝、肌肉和其它器官)、器官系統(tǒng)(如循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚系統(tǒng)或其他器官系統(tǒng))或生物體(如鳥、哺乳動(dòng)物等)。本發(fā)明的多核苷酸可以全部或部分合成，其然后再使用常規(guī)的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，并插入到載體中，常規(guī)的分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)包括，如使用適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)和限制性內(nèi)切酶將多核苷酸亞克隆到線性化的載體中。本發(fā)明的多核苷酸是使用與多核苷酸每條鏈互補(bǔ)的寡核苷酸引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行擴(kuò)增獲得的。這些引物還包括限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以促使亞克隆到載體中?？蓮?fù)制的載體構(gòu)件通常包括但不限于以下一種或多種：信號序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記或選擇基因。為了表達(dá)本發(fā)明的多肽，編碼多肽或其功能等同物的核苷酸序列可以插入到合適的表達(dá)載體中，即含有對插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可用于構(gòu)建含有編碼目標(biāo)多肽的序列和合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組。這樣的技術(shù)描述于如Sambrook,J.等人，(1989)MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,Plainview,N.Y.以及Ausubel,F.M.等人，(1989)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork.N.Y.。本發(fā)明還提供了用于通過使用本發(fā)明的抗體、多肽和核酸進(jìn)行診斷和預(yù)后分析的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括含有標(biāo)記或未標(biāo)記形式的本發(fā)明的HIV抗體、多肽或核酸的合適容器。此外，當(dāng)抗體、多肽或核酸以適合用于進(jìn)行間接分析的標(biāo)記形式用于間接結(jié)合分析時(shí)，試劑盒還包括用于進(jìn)行該適合的間接分析的試劑。例如，依賴于標(biāo)簽的性質(zhì)，試劑盒可以包括含有酶底物或衍生試劑的一個(gè)或多個(gè)合適的容器。也可包括對照樣品和/或使用說明。本發(fā)明還提供用于通過PCR或質(zhì)譜檢測生物樣品中是否存在本發(fā)明的HIV抗體或HIV抗體的核酸序列的試劑盒。本文使用的“標(biāo)簽”(label)是指直接或間接連接到抗體上以便產(chǎn)生“標(biāo)記的”抗體的可檢測的化合物或組合物。標(biāo)簽也可以連接到本文公開的多肽和/或核酸序列上。標(biāo)簽可以是自身可被檢測到的(如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者在酶標(biāo)簽的情況下，可以催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。也可以修飾本發(fā)明的抗體和多肽，以包括表位標(biāo)記(tag)或標(biāo)簽，例如，用于純化或診斷應(yīng)用。合適的檢測手段包括標(biāo)簽的使用，例如但不限于放射性核苷酸、酶、輔酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、色原、酶底物或輔因子、酶抑制劑、輔基復(fù)合物、自由基、顆粒、染料等。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了診斷方法。診斷方法通常包括將HIV抗體與從患者獲得的生物樣品相接觸，如血液、血清、唾液、尿、痰、細(xì)胞拭子樣品或組織活檢，并測定與對照樣品或預(yù)定臨界值相比，抗體是否優(yōu)先結(jié)合于樣品上，從而證明HIV病毒是否存在。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了檢測來自于患者的生物樣品中是否存在本發(fā)明的HIV抗體的方法。檢測方法一般包括從患者獲得生物樣品，如血液、血清、唾液、尿、痰、細(xì)胞拭子樣品或組織活檢并分離HIV抗體或其片段，或編碼HIV抗體的核酸，并分析生物樣品中是否存在HIV抗體。而且，本發(fā)明提供了檢測細(xì)胞中的HIV抗體的核苷酸序列的方法。也可以通過使用本文公開的引物檢測HIV抗體的核苷酸序列。也可利用已知的重組技術(shù)和/或使用質(zhì)譜來判斷來自于患者的生物樣品中是否存在HIV抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測生物樣品中HIV抗體的方法，其中HIV抗體包含含有高度保守共有序列的重鏈和含有高度保守共有序列的輕鏈，所述方法包括從哺乳動(dòng)物受試者獲得含免疫球蛋白的生物樣品，從所述樣品分離HIV抗體，并鑒定重鏈和輕鏈的高度保守共有序列。生物樣品可以是血液、血清、唾液、尿、痰、細(xì)胞拭子樣品或組織活檢。氨基酸序列可以通過本領(lǐng)域已知的方法包括如PCR和質(zhì)譜來確定。術(shù)語“評估”包括任何形式的測量，且包括確定元件(elements)是否存在。術(shù)語“測定”、“測量”、“評價(jià)”、“評估”和“分析”可互換使用并包括定量和定性測定。評估可以是相對的或絕對的?！霸u估是否存在”包括測定某物存在的量，和/或測定存在或不存在。本文所用的術(shù)語“測定”、“測量”和“評估”和“分析”可互換使用，并包括定量和定性測定。II.減少病毒復(fù)制的方法進(jìn)一步提供了用于減少受試者中HIV病毒滴度、病毒復(fù)制、病毒增殖或HIV病毒蛋白量增加的方法。根據(jù)另一個(gè)方面，方法包括向受試者施用有效減少受試者中一種或多種HIV毒株或分離物的HIV滴度、病毒復(fù)制或者HIV蛋白量增加的量的HIV抗體。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了減少病毒復(fù)制或減少傳播HIV感染到其他宿主細(xì)胞或組織的方法，其包括用結(jié)合于gp120的抗原表位的抗體或其部分與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相接觸。III.治療方法根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方式，本發(fā)明提供了用于治療患有病毒感染如HIV的哺乳動(dòng)物的方法，該方法包括對所述哺乳動(dòng)物施用含有本文公開的HIV抗體的藥物組合物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，用于治療感染HIV的哺乳動(dòng)物的方法包括對所述哺乳動(dòng)物施用含有本發(fā)明抗體或其片段的藥物組合物。本發(fā)明的組合物可包括多于一種的具有公開的特征的抗體(如多種抗體或一群抗體)。其也可以包括其它本領(lǐng)域已知的HIV中和抗體，例如但不限于VRC01、PG9和b12。被動(dòng)免疫已證明是一種有效和安全的用于預(yù)防和治療病毒性疾病的策略。(參見，例如Keller等人，Clin.Microbiol.Rev.13:602-14(2000)；Casadevall,Nat.Biotechnol.20:114(2002)；Shibata等人，Nat.Med.5:204-10(1999)；以及Igarashi等人，Nat.Med.5:211-16(1999)，其每一個(gè)都通過引用并入本文)。使用人單克隆抗體的被動(dòng)免疫提供了用于緊急預(yù)防和治療HIV的即時(shí)治療策略。有感染HIV相關(guān)疾病或病癥風(fēng)險(xiǎn)的受試者包括與受感染人相接觸的患者或通過某種其他途徑暴露于HIV的患者?？梢栽贖IV相關(guān)疾病或病癥的特有癥狀發(fā)生之前施用預(yù)防性藥劑，以防止疾病或病癥，或者延遲其進(jìn)程。為了體內(nèi)治療人類和非人類患者，給患者施用或提供包括本發(fā)明HIV抗體的藥物制劑。當(dāng)用于體內(nèi)治療時(shí)，給患者施用治療有效量(即消除或減輕患者病毒負(fù)荷的劑量)的本發(fā)明的抗體。以已知的方法將抗體施用給人類患者，例如靜脈內(nèi)給藥如推注或一段時(shí)間的連續(xù)輸注，通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)口、局部或吸入途徑?？贵w可以通過腸胃外或靜脈內(nèi)給藥，如果可能的話，在目標(biāo)細(xì)胞位點(diǎn)給藥。在一些實(shí)施方式中，抗體通過靜脈內(nèi)或皮下給藥施用。本發(fā)明的治療性組合物可全身、胃腸外或局部施用于患者或受試者。以上用于評估成功的疾病治療和改善的參數(shù)可容易地通過醫(yī)生熟悉的常規(guī)程序進(jìn)行測量。用于腸胃外給藥時(shí)，抗體可以以單位劑量的可注射的形式(溶液、懸浮液、乳濁液)與藥學(xué)上可接受的腸胃外介質(zhì)一起進(jìn)行配制。這樣的介質(zhì)的實(shí)例包括但不限于水、鹽水、Ringer's溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。非水介質(zhì)包括但不限于固定油和油酸乙酯。脂質(zhì)體可被用作載體(carrier)。介質(zhì)可含有少量的添加劑，如增強(qiáng)等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，如緩沖劑和防腐劑?？贵w可以約1mg/ml至10mg/ml的濃度配制在這樣的介質(zhì)中。劑量和劑量方案依賴于可以由醫(yī)生容易地進(jìn)行決定的多種因素，如感染的性質(zhì)、其治療指數(shù)、病人和病人病史。通常，將治療有效量的抗體施用給患者。在一些實(shí)施方式中，抗體的給藥量按患者體重計(jì)在約0.1mg/kg至約50mg/kg的范圍內(nèi)。依照感染的類型和嚴(yán)重程度，無論是例如通過一次或多次分開給藥或是通過連續(xù)輸注，按患者體重計(jì)給患者施用約0.1mg/kg至約50mg/kg(例如約0.1-15mg/kg/劑量)的抗體是初始的候選劑量。這種療法的進(jìn)展可容易地通過常規(guī)方法和分析并基于醫(yī)生或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行監(jiān)測。以上用于評估疾病的成功治療和改善的參數(shù)可容易地通過醫(yī)生熟悉的常規(guī)程序進(jìn)行測量。其它治療方案可與本發(fā)明的HIV抗體的給藥相結(jié)合。聯(lián)合給藥包括共給藥、使用分隔的制劑或單個(gè)藥物制劑，以及按任意順序進(jìn)行的連續(xù)施用，其中優(yōu)選在兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮其生物學(xué)活性的同時(shí)存在一段時(shí)間。這樣的聯(lián)合治療可導(dǎo)致協(xié)同治療的效果。以上用于評估疾病的成功治療和改善的參數(shù)可容易地通過醫(yī)生熟悉的常規(guī)程序進(jìn)行測量。術(shù)語“治療”(treating)或“治療”(treatment)或“減輕”可互換使用并且是指治療性治療和預(yù)防性或防范性措施二者，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)所針對的病理學(xué)狀況或病癥。那些需要治療的對象包括已經(jīng)患有病癥以及傾向于患上病癥或那些病癥需要被阻止的對象。如果在接受了根據(jù)本發(fā)明方法的治療量的抗體后，該患者顯示了可觀察到的和/或可測量的一種或多種以下情況的減少或消失：受感染細(xì)胞減少或受感染細(xì)胞消失；受感染細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比減少；和/或一種或多種與具體感染相關(guān)的癥狀緩解至某種程度；發(fā)病率和死亡率降低，并其生活質(zhì)量問題改善，則受試者或哺乳動(dòng)物的感染被成功“治療”了。以上用于評估疾病的成功治療和改善的參數(shù)可容易地通過醫(yī)生熟悉的常規(guī)程序進(jìn)行測量。術(shù)語“治療有效量”是指有效治療受試者或哺乳動(dòng)物疾病或病癥的抗體或藥物的量。與一個(gè)或多個(gè)其它治療劑“聯(lián)合”給藥包括任意順序的同時(shí)(并行)和連續(xù)施用。本文所用的“載體”包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，其在所采用的劑量和濃度對于暴露于其的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無毒的。通常，生理上可接受的載體是pH緩沖水溶液。生理上可接受的載體的實(shí)例包括但不限于緩沖劑，如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括但不限于抗壞血酸；低分子量(小于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如但不限于血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如但不限于聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如但不限于甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括但不限于葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如但不限于EDTA；糖醇，例如但不限于甘露糖醇或山梨糖醇；形成鹽的抗衡離子，例如但不限于鈉；和/或非離子表面活性劑，例如但不限于TWEEN.；聚乙二醇(PEG)和普朗尼克(PLURONICS)。在提供了范圍的值時(shí)，應(yīng)該理解，除非文中另有明確說明，否則每個(gè)插入值、到下限的單位的十分之一、該范圍的上限和下限之間和任何其它在所述范圍內(nèi)的所述值或插入值都包含于本發(fā)明范圍之內(nèi)?？瑟?dú)立地包括于較小范圍內(nèi)的這些較小范圍的上限和下限也包含在本發(fā)明內(nèi)，只要去除被特地排除在外的極限所述范圍內(nèi)被特定排除在外的任何界限。當(dāng)所述范圍包括界限的一個(gè)或兩個(gè)時(shí)，排除被包括的界限的一個(gè)或兩個(gè)的范圍也包括于本發(fā)明中。除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的具有相同的含義。雖然任何類似或等同于本文所述的方法和材料也可以在本發(fā)明的實(shí)施或測試中使用，但現(xiàn)在公開了優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有出版物均通過引用而全部并入本文。本文和權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一”、“和”以及“該”，除非上下文另有明確規(guī)定，包括復(fù)數(shù)對象。提供本文公開的出版物只是由于其公開早于本申請的提交日期。本文的任何內(nèi)容均不能被理解為承認(rèn)了本發(fā)明由于在先發(fā)明而無權(quán)先于這些出版物。另外，出版物中提供的日期可能與實(shí)際出版日期不同，其可能需要獨(dú)立地確認(rèn)。本文中所引用的每個(gè)申請和專利，以及每個(gè)申請和專利所引用的每個(gè)文件或參考文獻(xiàn)、患者或非患者的文獻(xiàn)(包括每個(gè)授權(quán)專利審查過程中的；“申請引用的文件”)和每個(gè)對應(yīng)于這些申請和專利任意一個(gè)的PCT和外國申請或?qū)＠?或要求任何這些申請和專利的優(yōu)先權(quán)的每個(gè)PCT和外國申請或?qū)＠?，以及每個(gè)申請引用的文件中所引用或參考的每個(gè)文件，在此明確地通過引用而全部并入。更一般地，本文所引的文件或參考文獻(xiàn)，要么出現(xiàn)在權(quán)利要求前的參考文獻(xiàn)列表中，要么出現(xiàn)在本文自身中；并且，每個(gè)這樣的文件或參考文獻(xiàn)(“本文引用的參考文獻(xiàn)”)，以及每個(gè)在本文引用的參考文獻(xiàn)中所引用的每個(gè)文件或參考文獻(xiàn)(包括任何制造商的規(guī)范、使用說明等)，在此明確地通過引用并入本文。以下非限制性實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1材料、方法和儀器樣品。人樣品由所有參與機(jī)構(gòu)按照倫理審查委員會(huì)(InstitutionalReviewBoard,IRB)評估的協(xié)議簽署知情同意書后進(jìn)行收集?；颊?選自紐約艾倫戴蒙艾滋病研究中心(AaronDiamodAidsResearchCenter)的一組長期無進(jìn)展者?；颊?和8選自波士頓拉根研究所(RagonInstitute)的一組精英控制者。患者1、3和8基于其對標(biāo)準(zhǔn)組HIV分離物的廣譜中和血清活性進(jìn)行選擇。患者12基于廣譜血清中和活性從“國際艾滋病疫苗倡議組織”(InternationalAidsVaccineInitiative)的協(xié)議G隊(duì)列(ProtocolGCohort)進(jìn)行選擇。染色、單細(xì)胞分選和抗體克隆。進(jìn)行2CC核和gp140特異性Ig+記憶B細(xì)胞的染色和單細(xì)胞分選(J.F.Scheid等人，Nature458,636(Apr2,2009))。簡言之，將CD19+B細(xì)胞用抗人CD19磁性MACS珠(MiltenyiBiotec)從外周血單核細(xì)胞進(jìn)行富集，并隨后用抗人CD20和抗人IgG抗體(BectonDickinson)以及生物素化的2CC核(B.Dey等人，PLoSPathog5,e1000445(May,2009))或YU2-gp140三聚體(R.Diskin,P.M.Marcovecchio,P.J.Bjorkman,NatStructMolBiol17,608(May,2010))進(jìn)行染色，再用偶聯(lián)鏈霉親和素的藻紅蛋白(PE,BecktonDickinson)進(jìn)行檢測。單個(gè)細(xì)胞在FACSAriaIII細(xì)胞分選儀(BectonDickinson)上分選到96孔PCR板(Denville)中，排除細(xì)胞雙聯(lián)體，該96孔PCR板中包含4μl/孔的冰冷0.5×磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，該P(yáng)BS中含有10mMDTT、(Promega)、0.4U5′-3′PrimeRNAseInhibitorTM(Eppendorf)。板用′F`膜(BioRad)密封，立即在干冰中冷凍并貯藏于-80℃。cDNA合成和Ig擴(kuò)增均以具有下述改進(jìn)的方法進(jìn)行(H.Wardemann等人，Science301,1374(Sep5,2003))：不是使用原始引物組，第一和第二免疫球蛋白特異性PCR在半巢式方法中使用表1中所述的引物進(jìn)行。將重鏈和輕鏈PCR產(chǎn)物克隆到其各自的表達(dá)載體中，并在HEK293細(xì)胞中表達(dá)抗體之前，通過測序確定帶有原始PCR產(chǎn)物的克隆表達(dá)質(zhì)粒具有100％同一性。ELISA。高結(jié)合的96孔ELISA板(Costar)用PBS中的100ng/孔的純化抗原(gp140、gp120、gp41、gp120核和2CC-核)(B.Dey等人，PLoSPathog5,e1000445(2009年5月))和突變蛋白(gp120D368R、gp120I420R)包被過夜。洗滌后，將板用2％BSA、1μMEDTA、0.05％Tween-PBS(封閉緩沖液)封閉2小時(shí)，再用稀釋到4μg/ml的IgG抗體和若干連續(xù)的1:4PBS稀釋抗體孵育2小時(shí)。洗滌后，將板用山羊HRP-連接的抗小鼠IgG(JacksonImmunoReseach)(封閉緩沖液中0.8μg/ml)并加入100μl的HRP顯色底物(ABTS溶液，Invitrogen)孵育1h來顯色。光密度使用ELISA酶標(biāo)儀(MolecularDevices)在405nm(OD405nm)進(jìn)行測量。減去包被的孔中單獨(dú)進(jìn)行PBS孵育所獲得的背景值。測試IgG抗體的多反應(yīng)性(H.Mouquet等人，Nature467,591(Sep30,2010))并且當(dāng)它們識別四個(gè)測試的結(jié)構(gòu)不同的抗原：ssDNA、dsDNA、胰島素和LPS中的至少兩個(gè)時(shí)，認(rèn)為其是多反應(yīng)性的。用于反應(yīng)性的閾值通過使用對照抗體mGO53(陰性)、eiJB40(弱陽性)和ED38(高陽性)來確定。中和分析：進(jìn)行中和篩選(D.C.Montefiori,CurrProtocImmunolChapter12,Unit1211(Jan,2005))。簡言之，中和檢測為單輪感染Tzm-bl細(xì)胞之后熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的減少。為了排除抗體樣品中的非特異抗病毒活性，用MuLV(鼠白血病病毒)作為陰性對照。骨髓漿細(xì)胞的克隆特異性識別。用Ficoll-Paque(GEHealthcare)從骨髓吸出物Ficoll純化單核細(xì)胞后，將骨髓漿細(xì)胞用抗人CD138和抗CD19抗體(BectonDickinson)進(jìn)行染色。CD138+CD19+人漿細(xì)胞在FACSAriaIII細(xì)胞分選儀(BectonDickinson)進(jìn)行大量分選，并參照廠商說明書用TrizolLS試劑(Invitrogen)在100.000個(gè)細(xì)胞上進(jìn)行RNA分離。參照廠商說明書使用SuperscriptIII逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)將RNA逆轉(zhuǎn)錄。將cDNA進(jìn)行免疫球蛋白特異PCR，該P(yáng)CR具有以下改進(jìn)：用2輪巢式免疫球蛋白重鏈克隆特異PCR并使用表1中列出的第一輪正向前導(dǎo)序列(forwardleader)和恒定區(qū)域反向引物，以及隨后的基于單細(xì)胞分析獲得的測序結(jié)果設(shè)計(jì)的克隆特異性正向和反向引物來擴(kuò)增1μl的cDNA。依照廠商說明書將PCR產(chǎn)物凝膠純化并克隆到TOPOTA載體(Invitrogen)中。用克隆特異性引物通過PCR篩選菌落并測序。表面等離子體共振。如先前公開的方法(Mouquet2010)，所有實(shí)驗(yàn)在25℃使用BiacoreT100(Biacore，Inc)在HBS-EP+電泳緩沖液(Biacore，Inc)中進(jìn)行。12.5μg/mL的YU-2gp140和2CC核蛋白通過pH4.5的氨基偶聯(lián)固定于CM5芯片(Biacore，Inc)上，產(chǎn)生100RU的固定化水平。為了對gp140-和2CC核-衍生的芯片進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測量，IgG以700nM濃度通過流通池(flowcell)以及4個(gè)連續(xù)的在HBS-EP+電泳緩沖液(Biacore，Inc)中的1:2稀釋以40μL/min的流速以3min的關(guān)聯(lián)和5min的解離進(jìn)行注射。每個(gè)實(shí)驗(yàn)間用pH2.5的10mM甘氨酸-HCl以50μL/min的流速的30秒注射將傳感器表面再生。解離速率(kd(s-1))、結(jié)合速率(ka(M-1s-1)和結(jié)合常數(shù)(KD(M)或KA(M-1)在減去背景(對照流通池的結(jié)合和HBS-EP+電泳緩沖液的信號)后，通過使用BiacoreT100評估軟件利用動(dòng)力學(xué)分析和1:1結(jié)合模型進(jìn)行計(jì)算。圖2和圖8所示的傳感圖通過用Scrubber2軟件(CenterforBiomolecularInteractionAnalysis,UniversityofUtah)處理Biacore數(shù)據(jù)獲得。CD4i位點(diǎn)誘導(dǎo)。用FugeneTM6(Roche)以1:2的質(zhì)粒:Fugene的比例用pMX-IRES-GFP的構(gòu)建體中的gp160BAL.26Δc或gp160YU.2Δc轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中。48小時(shí)后，用PBS洗滌293T細(xì)胞并用無胰蛋白酶的細(xì)胞解離緩沖液(Gibco)分離，并以107細(xì)胞/ml的濃度重懸在FACS緩沖液(1×PBS、2％FBS、2mMEDTA)中。sCD4(ProgenicsPharmaceuticals，Inc)和mAb加入到以40μg/ml的最終濃度起始的1:4稀釋系列，中的表達(dá)gp160的293T細(xì)胞中。mGO是陰性對照抗體，其不結(jié)合gp160Δc(H.Mouquet等人，Nature467,591(2010年9月30日))。冰上孵育15min后，細(xì)胞被分開并在冰上用Alexa647-標(biāo)記的CD4誘導(dǎo)的位點(diǎn)mAb(3-67；(J.F.Scheid等人，Nature458,636(2009年4月2日))或Alexa647-標(biāo)記的對照mAb(即PG16；L.M.Walker等人，Science326,285(2009年10月9日))或針對gp160YU.2的2G12以及針對gp160BAL.26的2G12)染色25分鐘。通過使用Alexa647微量蛋白標(biāo)記試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行抗體標(biāo)記。在LSRFortessa細(xì)胞分析儀(BDBioscience)上對細(xì)胞進(jìn)行分析。結(jié)晶。在HEK293-6E細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)3BNC60IgG并通過木瓜蛋白酶裂解制備制備的Fab片段(R.Diskin,P.M.Marcovecchio,P.J.Bjorkman,NatStructMolBiol17,608(2010年5月)。結(jié)晶篩選在20℃通過蒸汽擴(kuò)散用nL坐滴(sittingdrops)法并使用MosquitoTM(TTPLabTech)結(jié)晶機(jī)器人于MRC結(jié)晶板(JenaBioscience)上進(jìn)行。將9.5mg/ml濃度的3BNC60Fab與貯液(reservoirsolution)以1:1比例混合以產(chǎn)生400nL的液滴。用PEGRxHTTM(HamptonResearch)結(jié)晶篩選獲得初始結(jié)晶點(diǎn)(Initialcrystallizationhits)并進(jìn)一步手動(dòng)優(yōu)化。適用于數(shù)據(jù)收集的晶體在11.7％的聚乙二醇20000、0.1MpH5.0的乙酸鈉、100mM的酒石酸鉀/酒石酸鈉、20mM的硫酸鋰、10mM的pH9.5的N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)中，以具有不對稱單位的2個(gè)Fab的單斜晶系空間群P21的方式，生長數(shù)周。晶體浸泡于補(bǔ)充了15％甘油的貯液中2小時(shí)，之后再浸泡于補(bǔ)充了30％甘油的貯液中并在液氮中閃冷(flashcooling)。衍射數(shù)據(jù)利用Pilatus6M檢測器在100K下的斯坦福同步加速器輻射光源(StanfordSynchrotronRadiationLightsource,SSRL)束線12-2進(jìn)行收集。數(shù)據(jù)利用XDSW.Kabsch,ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66,125(Feb,2010)進(jìn)行索引、整合并測量(表8)。分子置換通過使用移相器，以來自于抗腫瘤抗體CTM01(PDB代碼為1AD9)的VH和CH1結(jié)構(gòu)域和來自于抗gp120b13抗體(PDB代碼為3IDX)的VL和CL結(jié)構(gòu)域作為搜索模型來進(jìn)行。反復(fù)使用PhenixP.Emsley,B.Lohkamp,W.G.Scott,K.Cowtan,ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66,486(2010年4月)和Coot(P.Emsley,B.Lohkamp,W.G.Scott,K.Cowtan,ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66,486(2010年4月))進(jìn)行模型構(gòu)建并完善到的分辨率。使用最大似然目標(biāo)函數(shù)(maximum-likelihoodtargetfunction)和非晶體學(xué)對稱約束(non-crystallogaphicsymmetryrestraints)改進(jìn)結(jié)構(gòu)。最終模型(R工作＝20.7％；R自由＝25.7％)包括6478個(gè)蛋白原子、146個(gè)水分子和28個(gè)糖原子(表8)。殘基(residue)的91.9％、7.6％和0.5％分別位于拉氏圖(Ramachandranplot)的青睞、允許和禁止區(qū)域。結(jié)構(gòu)分析和可視化采用PyMol(ThePyMOLMolecularGraphicsSystem,版本1.3,LLC)完成。3BNC60結(jié)構(gòu)由對于輕鏈的殘基3-205(包括連接到Asn72的N-連接的碳水化合物中的第一個(gè)N-乙酰氨基葡糖)和對于重鏈的2-217組成。在末端殘基的殘基和CH1結(jié)構(gòu)域的殘基133-140是無序的。質(zhì)譜。使用ProteinGSepharose(GEHealthcare)，按廠商說明書從血清純化IgG。然后，IgG經(jīng)固定化的木瓜蛋白酶(Pierce)消化并且消化的Fab-Fc片段混合物與飽和量的生物素化2CC-核蛋白孵育。室溫孵育15分鐘后，加入鏈親和素偶聯(lián)的磁珠(Dynabeads)(Invitrogen)并用磷酸鹽緩沖鹽水(Gibco)進(jìn)行10輪洗滌。結(jié)合的Fab片段在95C下用十二烷基硫酸鋰緩沖液(Invitrogen)進(jìn)行洗脫，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳確定樣品純度，在質(zhì)譜分析之前進(jìn)行銀染或考馬斯染色。分離的Fab片段用二硫蘇糖醇還原、用碘乙酰胺烷基化，在4-12％的NuPAGENovexBis-Tris凝膠(Invitrogen)上的1D凝膠電泳進(jìn)行解析，并用考馬斯藍(lán)(ThermoFisher)進(jìn)行染色。從凝膠中切出Fab片段，并用200ng的胰蛋白酶(Promega)消化。用反相樹脂(PORS20R2,AppliedBiosystem)將所得到的肽分離，并用等份的0.5％乙酸中的40％乙腈和第二等份的在0.5％乙酸中的80％乙腈進(jìn)行洗脫。用真空離心機(jī)(speedvac,ThermoFisherScientific)除去乙腈并將等份的剩余溶液加壓裝載于帶有整合的發(fā)射器槍頭(tip)(360μmO.D.,50μmI.D.,10μm槍頭)的自裝填柱(NewObjective,Woburn,MA)上，裝入6cm的反相C18材料(ReproSil-PurC18-AQ,3μm珠，來自Dr.MaischGmbH)，并連接到使用自制微型電噴射源的具有LTQOrbitrapTMXL質(zhì)譜儀或LTQOrbitrapVelosTM質(zhì)譜儀(ThermoFisherScientific)的Agilent1200系列HPLC系統(tǒng)(Agilent)。通過下列梯度將肽洗脫到質(zhì)譜儀：5min的0-5％B，125min的40％B，150min的60％B，165min的100％B(A＝0.1M乙酸，B＝在0.1M乙酸中的70％乙腈，流速為90nL/min)。兩種儀器都在數(shù)據(jù)依賴模式下運(yùn)行，并且對于兩種質(zhì)譜儀，目標(biāo)值均設(shè)定為5e5離子且分辨率為60000(在400m/z)。為了在LTQOrbitrapTMXL上進(jìn)行分析，在全面掃描之后，對這次全面掃描中8種最豐富的離子進(jìn)行8MS/MS掃描。肽(僅電荷態(tài)>1)由2Da窗口、1e4離子的目標(biāo)窗口進(jìn)行分離，通過CAD(歸一化碰撞能量＝35，激活Q＝0.25，活化時(shí)間30msec)和LTQ中的質(zhì)量分析進(jìn)行解離。為了在LTQOrbitrapTMVelos上進(jìn)行分析，在全面掃描之后，對該全面掃描中10種最豐富的離子在7500分辨率下進(jìn)行10MS/MS掃描。肽(僅電荷態(tài)>2)由3Da窗口、2e5離子的目標(biāo)窗口進(jìn)行分離，通過HCD(歸一化碰撞能量＝40，激活時(shí)間0.100msec)和Orbitrap中的質(zhì)量分析進(jìn)行解離。對于任何儀器，選擇用于MS/MS的離子都設(shè)置在排除清單上30秒。所產(chǎn)生的MS/MS譜圖用Xtandem！檢索人類IPI和內(nèi)部(inhouse)患者特異性IgG數(shù)據(jù)庫中，肽與在人類IPI和內(nèi)部患者特異性數(shù)據(jù)庫中的胰蛋白酶肽進(jìn)行自動(dòng)比較。對應(yīng)于患者特異性IgG的肽擊中(hit)進(jìn)行人工確認(rèn)。多序列比對。所有多序列比對采用CLUSTALW2使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行(權(quán)重矩陣：GONNET用于蛋白質(zhì)且UIB用于DNA，缺口開放＝10，缺口延伸0.1)。用TeXshade軟件包生成對比陰影(Alignmentsshading)。比對共有區(qū)?；跉埢g的同一性和相似性(>＝70％)產(chǎn)生多重比對的共有序列。基于相似性對氨基酸分組如下：FYW、ILVM、RK、DE、GA、ST和NQ。種系發(fā)生樹。采用鄰接法(Neighbor-Joiningmethod)生成序列之間的關(guān)系。采用從1000個(gè)重復(fù)推斷出的自展共同樹(bootstrapconsensustree)以代表其關(guān)系。將對應(yīng)于以少于50％自展重復(fù)產(chǎn)生的分區(qū)對應(yīng)的分支舍去。其中相關(guān)序列聚集在自展測試(1000重復(fù))中的重復(fù)樹百分比顯示在旁邊的分支上。樹按比例進(jìn)行繪制，其分支長度的單位與用于推斷系統(tǒng)發(fā)生樹的進(jìn)化距離的單位相同。用多種不同的方法計(jì)算進(jìn)化距離，單位為每個(gè)序列的氨基酸差異的數(shù)目。去除每一個(gè)序列對的所有模糊不清的位置。進(jìn)化分析在MEGA5中進(jìn)行。R/S比的計(jì)算。DNA序列疊加在蛋白質(zhì)比對上以進(jìn)行取代/替換計(jì)算。從分析中移除所有缺口位置。R/S比分析使用Perl腳本進(jìn)行。實(shí)施例2分離HIV抗體為了確定HIV抗體克隆是否因體細(xì)胞突變被限制，設(shè)計(jì)一系列新的引物以去除該潛在的問題(表1)。新的引物組通過分選結(jié)合缺乏V1-3環(huán)并且含有一對穩(wěn)定的二硫鍵的HIV-gp120核蛋白(2CC核)的B細(xì)胞進(jìn)行測定。與用于克隆VRC01的重現(xiàn)誘餌(re-surfacedbait)相反，2CC核誘餌也允許捕獲針對CD4誘導(dǎo)的共受體結(jié)合位點(diǎn)(CD4i)的抗體。在一起比較中，當(dāng)與初始引物組比較時(shí)，新的引物組增加了IgH鏈的恢復(fù)(圖4(a))。用新的引物組所獲得的抗體有更多的突變(平均35.6比19.8p＝<0.0001和對于IgH的最大值85比50)并且包含用原始引物組未發(fā)現(xiàn)的克隆(圖4(a))。為了確定新的引物是否可以從已用YU2gp140進(jìn)行分選的細(xì)胞中拯救(rescue)VRC01樣抗體，對來自已用原始引物組全面檢查而不產(chǎn)生任何VRC01相關(guān)克隆的個(gè)體的冰凍cDNA樣品進(jìn)行檢查。在80個(gè)孔中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)對應(yīng)于通過IgH和IgL序列測定的VRC01變體的抗體(圖5A和B)。得到的結(jié)論是VRC01樣抗體被gp140三聚體捕獲，并且特異設(shè)計(jì)來克隆高度突變的抗體的該引物捕獲了更大比例的來源于具有高滴度廣譜中和抗體的患者的記憶B細(xì)胞的抗-HIV抗體。包括2個(gè)白種人、1個(gè)西班牙裔人和1個(gè)非洲人供體的顯示高滴度廣譜中和抗體的四個(gè)不相關(guān)HIV感染個(gè)體采用2CC核誘餌進(jìn)行檢查，其中2個(gè)個(gè)體的用以前克隆的抗體不能解釋其血清學(xué)活性(表2和圖6A和B)。代表201不同的獨(dú)特的和多樣化的克隆的576個(gè)抗體從1.5X105的IgG+記憶B細(xì)胞獲得的起始群體獲得(表3)。實(shí)施例3HIV抗體的結(jié)合特異性通過2CC核誘餌捕獲的抗體克隆的大小差異很大，范圍跨越2-76種不同的成員(表3)。為了確定由2CC核捕獲的抗體能否結(jié)合到HIV刺突上，用YU2gp120在每個(gè)擴(kuò)增的克隆的代表成員上進(jìn)行ELISA。所有測試抗體結(jié)合到gp120上(表3)。利用突變蛋白定位了抗體結(jié)合于HIV刺突上的位點(diǎn)，所述突變蛋白干擾了CD4bs(gp120(D368R))或CD4誘導(dǎo)的共受體結(jié)合位點(diǎn)(CD4i，gp120(I420R))。如X.Wu等人，Science329,856(2010年8月13日)報(bào)道的，由于VRC01對D368R突變敏感，它被列為CD4bs抗體，但由于接近CD4i位點(diǎn)，它也顯示了一些對I420R突變的敏感。屬于VRC01變體的NIH45-46，抗體3BNC60、8ANC131和12A12的ELISA模式與VRC01類似(基于中和活性選擇這些克隆成員，表3)。包括1B2530和8ANC195的其它克隆對兩種突變相同敏感并且不能僅基于ELISA進(jìn)行精確分類。為了確定抗體是否具有多反應(yīng)性，對純化的ssDNA、dsDNA、胰島素和LPS進(jìn)行ELISA。檢測的63％的抗-2CC核抗體為多反應(yīng)性的。得出的結(jié)論是，大多數(shù)通過2CC-誘餌捕獲的抗體識別gp120上的CD4bs或CD4i位點(diǎn)并且許多也具有多反應(yīng)性。實(shí)施例4體細(xì)胞超突變體細(xì)胞超突變是開發(fā)結(jié)合抗HIV抗體并且某些情況下有助于抗-HIV抗體的多反應(yīng)性的高親和力抗原所需要的。為了測試高度突變的2CC核特異性抗體是否如此，4個(gè)代表性的抗體被逆轉(zhuǎn)到相應(yīng)的種系中。逆轉(zhuǎn)導(dǎo)致ELISA中測試的全部4個(gè)克隆的抗原結(jié)合的徹底喪失并喪失了多反應(yīng)性。實(shí)施例5HIV中和通過標(biāo)準(zhǔn)體外分析用初始組的8種病毒測量HIV中和活性，其中8種病毒包括3個(gè)層1的進(jìn)化枝A、B和C，以及5個(gè)層2的進(jìn)化枝BEnv假病毒變種(M.S.Seaman等人，JVirol84,1439(2010年2月))?？贵w的中和活性與VRC01和來自供體的純化血清IgG相比(圖1A、表4和圖6)。呈現(xiàn)出高水平中和活性的抗體進(jìn)一步在一組15個(gè)其他層2的進(jìn)化枝A、B、C、D、G、AG和AEEnv假病毒變體上進(jìn)行測試(圖1B、表5)，其中包括5個(gè)耐受VRC01的病毒(圖1B和表5)。所有測試抗體中的90％顯示出一些中和活性并且6個(gè)克隆含有顯示了高水平的效力和廣度的抗體變體(圖1A、B和C以及表4和5)。這些克隆也是在那些在所研究的四個(gè)患者中的每一個(gè)中通過2CC-誘餌捕獲的抗體中最豐富的克隆(表3)。最令人印象深刻的新抗體3BNC117屬于具有76個(gè)成員的克隆，與VRC01的1.8μg/ml相比，其對14個(gè)層2的病毒的聯(lián)合組顯示0.5μg/ml的平均IC80(圖1C、表4和5)。測試的20個(gè)病毒中只有4個(gè)比3BNC117對VRC01更敏感，然而14個(gè)對3BNC117更敏感，包括DU172.17，其對VRC01完全耐受但對3BNC117敏感(圖1B和C)。NIH45-46是VRC01的新變體，其對所測的20個(gè)病毒中的15個(gè)都比VRC01更有效，但仍比3BNC117效力弱(圖1B和C以及表4和5)。中和的廣度和效力在5個(gè)最強(qiáng)力的中和抗體克隆成員中存在實(shí)質(zhì)性的變化。例如，3BNC156是3BNC117的變體，只中和初始組病毒中的2個(gè)并需要在比3BNC117高得多的濃度(圖1A和表4)，并且3BNC55是另一種變體，其抗6個(gè)病毒的活性介于2個(gè)之間，平均IC50為4μg/ml(圖1和表4)。最后，活性最高的抗體是高度超突變的。前10個(gè)抗體的平均突變數(shù)對于VH是72并且對于VL是45，這與它們的廣度和效力相關(guān)(表4和5)。突變的殘基逆轉(zhuǎn)到種系導(dǎo)致所有測試的抗體的中和活性完全喪失。實(shí)施例6診斷肽的鑒定上述克隆策略捕獲通過抗原結(jié)合記憶B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，然而循環(huán)抗體并不是由這些細(xì)胞產(chǎn)生的而是起源于骨髓中的漿細(xì)胞。然而，由于不表達(dá)表面IgA，同源抗原不能用作誘餌來捕獲漿細(xì)胞。(Radbruch等人，NatRevImmunol6,741(Oct,2006))。此外，骨髓中的漿細(xì)胞和循環(huán)記憶B細(xì)胞之間的關(guān)系尚未精確定義。為了判斷從記憶B細(xì)胞克隆的抗體是否也發(fā)現(xiàn)于骨髓漿細(xì)胞隔室中，將表達(dá)CD138的漿細(xì)胞從來源于4個(gè)研究的個(gè)體中的兩個(gè)的配對骨髓樣本中純化出，并用PCR特異擴(kuò)增從這些個(gè)體的記憶B細(xì)胞克隆的更有效抗體的IgVH基因。以下所列為用于RU01的克隆特異性引物：CTGCAACCGGTGTACATTCTCAAGTGCAACTGGTGC(FWRD)(SEQIDNO.584)，CTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTCCATTTGTCACAG(FWRD)，(SEQIDNO.585)TGCGAAGTCGACGCTGACGAGACAGTGACCTGC(REV)(SEQIDNO.586)，TGCGAAGTCGACGCTGAAGAGACAATAATTTG(REV)(SEQIDNO.587)，TGCGAAGTCGACGCTGACGAGACAATAACT(REV)(SEQIDNO.588)，以及用于RU10的：CTGCAACCGGTGTACATTTTCAGGGGCACTTGGTG(FWRD)(SEQIDNO.589)，TGCGAAGTCGACGCTGAGGTGACGATGACCGTG(REV)(SEQIDNO.590)。在兩個(gè)患者中都容易地鑒定到了選擇的克隆和大量其它變體的成員。為了驗(yàn)證這些抗體也可發(fā)現(xiàn)于血清中，從相同的2個(gè)和一個(gè)其他個(gè)體的血清純化的IgG吸附于2CC核誘餌并對洗脫的IgG進(jìn)行質(zhì)譜(圖1D、圖7和圖10A-C)。在所有情況下都發(fā)現(xiàn)了針對，高活性抗體變體的診斷肽(圖7、圖10A-C)。得出的結(jié)論是，克隆自記憶B細(xì)胞的廣譜和強(qiáng)效抗-HIV抗體也在骨髓漿細(xì)胞隔室和具有高血清滴度的廣譜中和抗體的患者的循環(huán)IgG中發(fā)現(xiàn)。實(shí)施例7HIV抗體結(jié)合特性為了測定抗體對gp120的親和力是否與中和活性相關(guān)，利用表面等離子體共振(SPR)比較高活性抗體、選擇的克隆親緣和種系逆轉(zhuǎn)祖細(xì)胞的結(jié)合(圖2A和B、圖8和表6)。頂端的中和抗體顯示了在YU2gp140三聚體上的親和力(KA)，范圍為在2CC核上為(圖2A和B以及表6)。與其降低的中和效力和廣度一致，3BNC66、3BNC156和3BNC55在YU2gp140三聚體上顯示了較3BNC117低的親和力，但意外的是，對2CC核的親和力與中和活性不相關(guān)(圖1、圖8、表4和表6)。通過SPR，未檢測到任何針對測試的種系逆轉(zhuǎn)抗體的結(jié)合(圖2B、表6)。得出的結(jié)論是，通過YU22CC-核捕獲的抗-HIV抗體傾向于顯示比對2CC-核更高的針對gp140三聚體的親和力。當(dāng)VRC01結(jié)合到HIV刺突，它產(chǎn)生大的構(gòu)象變化，該變化類似于CD4結(jié)合并暴露CD4i位點(diǎn)。相比之下，b12和大多數(shù)其它已知的抗CD4bs抗體則沒有。為了確定這是否是高活性抗體的一個(gè)共享特征，HIV-BAL.26Δc或-YU2gp160Δc表達(dá)于HEK293T細(xì)胞表面，并且在CD4或抗CD4bs抗體存在或不存在的情況下測定CD4i抗體的結(jié)合(圖2C)。除了一個(gè)例外，所有測試的高活性抗體與CD4和VRC01類似，因?yàn)樗鼈兌即龠M(jìn)了抗CD4i抗體結(jié)合到HIV-BAL.26和YU2gp160Δc之一或兩者(圖2C)。唯一不具有這一特性的高活性抗體，8ANC195，不是傳統(tǒng)的抗CD4bs抗體，因?yàn)槠鋵368R和I420R突變體同樣敏感(表3)。此外，它與其它高活性抗體在中和模式上不同：它不能中和任何層1的病毒并表現(xiàn)出對H086.8的強(qiáng)活性，H086.8是進(jìn)化枝B病毒，其耐受所有其它測試的抗體，包括3BNC117、VRC01和b12(圖1A和B以及表4和5)。實(shí)施例8HIV抗體序列同一性為了確定高活性抗CD4bs抗體是否具有共同的序列特性，比對了10個(gè)最好的抗體：從每類獨(dú)立衍生于5個(gè)不同患者的5個(gè)抗體克隆中選取2個(gè)變體(圖3)。IgVH區(qū)的比較揭示了覆蓋了68個(gè)IgVH殘基的高度保守的共有序列(圖3A)。該IgVH共有序列包括6個(gè)VRC01-gp120接觸殘基，其中包括VRC01-Arg71，其模擬Arg59CD4和Asp368gp120的關(guān)鍵相互作用(圖3A)。此外，包括6個(gè)接觸殘基的共有序列在兩個(gè)密切相關(guān)的種系的IgVH基因上(VH1-2和VH1-46)是完全保守的，IgVH基因產(chǎn)生此類中的所有抗體(圖3A和B)。編碼共有序列殘基的密碼子在所選的10個(gè)抗體中是高度體細(xì)胞突變的，然而氨基酸序列是保守的(圖9)。在共有序列殘基中沉默突變的替換比例范圍為0.7-1.7，而在非共有序列殘基中，該范圍為3.5-22，這表明共有序列的保守是強(qiáng)烈選擇性的(表7)。與重鏈相反，VRC01的輕鏈在與gp120的總共32個(gè)接觸中只有8個(gè)。與其更受限的作用一致，相同抗體輕鏈序列的比較發(fā)現(xiàn)了覆蓋了53個(gè)IgVL殘基的不太廣泛的共有序列，其中包括3個(gè)VRC01-gp120接觸殘基(圖3B)。最后，同重鏈一樣，輕鏈起因于一組限制的種系基因：2個(gè)來源于IgK1D-33、2個(gè)來源于IgK3-11以及一個(gè)來源于IgL1-47(圖3B和表3)?？贵w8ANC195在數(shù)個(gè)重要方面不同于其它抗體，其并不完全與共有序列一致并且并不起因于相關(guān)重鏈或輕鏈(圖3A和B)。得出的結(jié)論是，在高活性、競爭性抗CD4bs抗體(HAADs)中存在顯著的序列趨同(convergence)。實(shí)施例93BNC60Fab的晶體結(jié)構(gòu)為了確定不同患者中的抗體結(jié)構(gòu)是否也是保守的，3BNC60Fab的晶體結(jié)構(gòu)被解析到分辨率并將其與VRC01相比較。結(jié)構(gòu)揭示了標(biāo)準(zhǔn)Fab的四個(gè)結(jié)構(gòu)域VH、CH1、VL和CL以及VH和VL內(nèi)形成抗原結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。在3BNC60不對稱單元中的兩個(gè)Fab幾乎相同，但是，由于通過晶格接觸形成的不同化學(xué)環(huán)境，在連接鏈D和E的環(huán)中的殘基74-78的構(gòu)象稍有變化。在VRC01-gp120的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)中疊加來自3BNC60和VRC01的VH結(jié)構(gòu)域(T.Zhou等人，Science329,811(Aug13,2010))提供了的均方根差(rmsd)(計(jì)算111個(gè)Cα原子)，具有局限在CDR2殘基58-65(3BNC60編號)的主要差異。疊加結(jié)構(gòu)表示了與gp120的識別界面的保守。例如，Arg723BNC60采用了與Arg71VRC01類似的構(gòu)象，其類似于正常形成于Arg59CD4和Asp368gp120之間的重要鹽橋。此外，Trp473BNC60采用了與Trp47VRC01相同的構(gòu)象，該殘基接觸gp120并涉及穩(wěn)定CDRH3和CDRL3構(gòu)象的芳香族和脂肪族殘基相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。Gln653BNC60，其對應(yīng)于Gln64VRC01，位于在結(jié)構(gòu)上不同于VRC01的殘基片段(殘基58-65)中。3BNC60上這個(gè)區(qū)域的構(gòu)象涉及晶體中的晶格接觸，可能通過結(jié)合gp120而發(fā)生改變，因?yàn)樗赡芘cgp120上的CD4結(jié)合環(huán)相沖突。疊加3BNC60和VRC01的VL結(jié)構(gòu)域提供了的rmsd(計(jì)算95個(gè)Cα原子)并顯示出某些gp120接觸殘基是結(jié)構(gòu)保守的；Tyr913BNC60和Glu91a3BNC60采用了與Tyr91VRC01和Glu96VRC01類似的構(gòu)象，其通過極性相互作用與gp120的環(huán)D相連。總之，這些結(jié)構(gòu)比較表明，3BNC60同gp120結(jié)合時(shí)的架構(gòu)與同VRC01結(jié)合時(shí)觀察到的架構(gòu)相同。實(shí)施例10HIV抗體共有序列上述實(shí)驗(yàn)定義了一類競爭性抗CD4bs抗體、HAAD，其分享IgVH和IgVL共有序列，共有序列包括在VRC01和HIV刺突之間的8個(gè)接觸殘基(圖3A和B)。在因其高水平血清抗-HIV活性而選擇的五個(gè)不同供體中，這些抗體只來源于2個(gè)密切相關(guān)的IgVH和3個(gè)IgVL種系基因，其符合HAAD的共有序列：VH1-2和VH1-46僅相差7個(gè)氨基酸，相差的氨基酸中沒有一個(gè)屬于共有序列部分(圖3A)。盡管存在廣泛的體細(xì)胞突變，在它們的種系形式中都保留了共有序列殘基。唯一例外的共有序列是8ANC195，其在大量方面不同于其它的，暗示了它可能具有獨(dú)特的抗原識別模式：在重鏈中缺少模仿關(guān)鍵的Arg59CD4和Asp368gp120接觸位點(diǎn)的Arg；獨(dú)特的中和模式；以及無法促進(jìn)抗CD4i抗體結(jié)合。該抗體是產(chǎn)生于一個(gè)患者的兩個(gè)不同的高活性抗體中的一個(gè)，提供了額外的證據(jù)支持這一觀點(diǎn)，即血清中和活性是組合的。表1表2表3A表3A續(xù)表3A續(xù)表3b表3b續(xù)表3b續(xù)表3c表3c續(xù)表3c續(xù)表3d表3d續(xù)表3d續(xù)表3e表3e續(xù)表3e續(xù)表3f表3f續(xù)表3f續(xù)表4a患者3，克隆RU013BNC623BNC1763BNC603BNC1173BNC953BNC104MW965.26＜0.09＜0.10＜0.04＜0.09＜0.07＞50BaL.26＜0.09＜0.10＜0.04＜0.09＜0.070.025DJ263.8＜0.09＜0.10＜0.04＜0.09＜0.070.0546535.30.680.460.540.551.0＞50RHPA4259.7＜0.09＜0.10＜0.050.041＜0.070.0252TRO.11＜0.09＜0.10＜0.050.077＜0.073.791PVO.4＜0.09＜0.100.09＜0.09＜0.070.348YU2.DG＜0.09＜0.10＜0.050.054＜0.070.034患者3，克隆RU01(續(xù))3BNC913BNC553BNC893ANC33BNC533BNC72MW965.26＜0.080.04＞0.050.180.09＜0.06BaL.26＞178＞30＞110＞50＞30＞139DJ263.8＞178＞30＞110＞50＞30＞1396535.312.61.7＞5013.68.49RHPA4259.7＜0.082.212.47.66100.6＞139TRO.113.0618.452.410.76＞155＞139PVO.40.443.92.736.77＞155＞139YU2.DG＜0.080.90.3935.01＞155＞139表4a續(xù)患者3，克隆RU01續(xù)3BNC1563BNC1583BNC1533BNC108MW965.260.080.110.15NDBaL.26＞111＞109＞10020.6DJ263.8＞111＞109＞100＞556535.311.19.928.9＞55RHPA4259.7＞111＞109＞10045.91TRO.11＞111＞109＞100＞55PVO.4＞111＞109＞100＞55YU2.DG＞111＞109＞10025.5患者3，克隆RU01續(xù)患者3克隆RU02-073A673A3833BNC83ANC443A5763ANC38MW965.260.10.50.7425.49＞50＞50BaL.2619.25.3＞5027.9127＞50DJ263.8＞50＞50＞50＞50＞50＞506535.3＞50ND＞50＞50＞50＞50RHPA4259.7＞50ND＞50＞50＞50＞50TRO.11＞50ND＞50＞50＞50＞50PVO.4＞50ND＞50＞50＞50＞50YU2.DG＞50ND＞50＞50＞50＞50B12和NIH45克隆表4b患者1，克隆RU081B26401B25301B23641NC21NC91B2490MW965.2641.760.7621.85＞50＞50＞50BaL.260.08＞50＞250.111.370.058DJ263.8＞502.713.75＞50＞50＞506535.3＞50＞50＞25＞50＞50＞50RHPA4259.70.043.62.180.590.090.414TRO.110.230.5160.270.170.21.06PVO.41.050.2750.1610.370.342.97YU2.DG0.20.2092.460.120.130.125患者1，克隆RU08續(xù)患者1，克隆RU08續(xù)1NC1081B26441B23391NC123MW965.26＞50＞25＞25＞50BaL.26＞50＞25＞25＞50DJ263.8＞50＞25＞25＞506535.3＞50＞25＞25＞50RHPA4259.7＞50＞25＞25＞50TRO.1119.37＞25＞25＞50PVO.43.13＞25＞25＞50YU2.DG＞50＞25＞25＞50患者1，克隆RU091B218MW965.26＞119BaL.261.1DJ263.8＞1196535.33.6RHPA4259.7＞100TRO.11＞100PVO.4＞100YU2.DG＞100表4c患者8，克隆RU108ANC1928ANC1348ANC138ANC1318ANC1828ANC508ANC45MW965.26＞73＞50＞50＞50＞115＞50＞50BaL.260.080.020.040.060.080.170.296DJ263.8＜0.030.0030.0080.004＜0.050.040.0416535.30.340.060.270.20.892.270.813RHPA4259.7＞50＞50＞50＞50＞100＞50＞50TRO.11＞100＞50＞50＞50＞100＞50＞50PVO.40.890.460.630.811.23.894.259YU2.DG0.090.150.210.180.220.420.499患者8，克隆RU11-158ANC578ANC1958ANC248ANC148ACN5MW965.2624.1＞500.292.01＞50BaL.264.35＞5047.53＞50＞50DJ263.830.19＞50＞50＞50＞506535.3＞1030.2＞50＞50＞50RHPA4259.71.650.34＞50＞50＞50TRO.1132.070.18＞50＞50＞50PVO.4101.150.52＞50＞50＞50YU2.DG27.520.79＞50＞50＞50表4d患者12，克隆RU1612A1212A2112A412A3712A2212A16MW965.260.0420.0750.0980.0560.060.167BaL.260.017＜0.001＜0.0010.0050.040.042DJ263.80.0020.0350.0170.0130.080.0126535.321.97＞50＞50＞50＞2515.44RHPA4259.70.0860.0380.0410.0420.040.207TRO.1102880.1640.2570.8270.560.751PVO.40.9280.5840.8190.5160.452.44YU2.DG0.0840.0150.0180.0190.110.234患者12，克隆RU16續(xù)12A2012A612A2312A4612A55MW965.260.1920.1125.1＞500.58BaL.260.0350.0720570.0132.87DJ263.80.050.0040.635.79＞506535.348.73＞2414.7348.85＞50RHPA4259.70.1090.2270.496＞50＞50TRO.110.6891.522.88＞5021.45PVO.43.043.322.242.180.99YU2.DG0.1420.2220.0530.490.1表4d續(xù)B12和NlH45克隆表4e患者3，克隆RU013BNC623BNC1763BNC603BNC1173BNC953BNC104MW965.26＜0.09＜0.100.09＜0.09＜0.07＞50BaL.26＜0.09＜0.10＜0.04＜0.09＜0.070.09DJ263.80.1＜0.100.10.10.10.1876535.32.241.71.772.444.5＞50RHPA4259.7＜0.09＜0.100.070.137＜0.070.06TRO.11＜0.09＜0.100.120.077＜0.0730.847PVO.40.230.160.270.190.230.901YU2.DG＜0.09＜0.100.070.054＜0.070.097患者3，克隆RU01續(xù)3BNC913BNC553BNC893ANC33BNC533BNC723BNC156MW965.26＜0.080.150.160.640.610.370.47BaL.26＞178＞30＞110＞50＞30＞139＞111DJ263.8＞178＞30＞110＞50＞30＞139＞1116535.36.75.535.92＞5073.38133.66569.66RHPA4259.70.528.03＞110＞50＞155＞139＞111TRO.1132.3141.67＞110＞50＞155＞139＞111PVO.42.656.510.18＞50＞155＞139＞111YU2.DG＜0.081.071.49＞50＞155＞139＞111患者3，克隆RU01續(xù)3BNC1583BNC1533BNC1083BNC1423BNC663BNC423BNC102MW965.260.60.63ND0.829.98ND＞50BaL.26＞109＞100＞55＞172＞189＞26＞50DJ263.8＞109＞100＞55＞172＞189＞26＞506535.397.75＞100＞55＞172＞189＞26＞50RHPA4259.7＞109＞100＞55＞172＞189＞26＞50TRO.11＞109＞100＞55＞172＞189＞26＞50PVO.4＞109＞100＞55＞172＞189ND＞50YU2.DG＞109＞100＞55＞172＞189＞26＞50表4e續(xù)患者3，克隆RU02-073A673A3833BNC83ANC443A5763ANC38MW965.2616＞250.74＞50＞50＞50BaL.26＞50＞25＞50＞50＞50＞50DJ263.8＞50＞25＞50＞50＞50＞506535.3＞50ND＞50＞50＞50＞50RHPA4259.7＞50ND＞50＞50＞50＞50TRO.11＞50ND＞50＞50＞50＞50PVO.4＞50ND＞50＞50＞50＞50YU2.DG＞50ND＞50＞50＞50＞50B12和NIH45克隆B12VRC0145-46MW965.26ND＜0.080.21BaL.26ND0.10.06DJ263.8ND0.5530.066535.3ND2.70.28RHPA4259.70.390.1850.146TRO.11＞500.8329.56PVO.4＞501.20.47YU2.DG7.80.3720.08表4f患者1，克隆RU081B26401B25301B23641NC21NC91B24901B2351MW965.26＞50＞50＞25＞50＞50＞50＞50BaL.260.32＞50＞250.5119.920.3＞50DJ263.8＞50＞50＞25＞50＞50＞50＞506535.3＞50＞50＞25＞50＞50＞50＞50RHPA4259.70.25＞50＞254.330.41.97＞50TRO.111.622.461.770.550.653.581.13PVO.42.971.250.651.081.3210.570.88YU2.DG0.77.74＞250.390.560.590.48患者1，克隆RU08續(xù)表4f續(xù)表4g患者8，克隆RU108ANC1928ANC1348ANC138ANC1318ANC1828ANC508ANC45TRO.11＞73＞50＞50＞50＞115＞50＞50BaL.260.430.110.180.310.730.777.45DJ263.80.10.0440.0690.0460.110.150.1666535.31.4322.31.93.9313.6510.473RHPA4259.7＞100＞50＞50＞50＞100＞50＞50TRO.11＞100＞50＞50＞50＞100＞50＞50PVO.43.942.53.74.94.4314.9917.315YU2.DG0.510.6161.070.921.461.592.942患者8，克隆RU11-158AN578AN1958AN248AN148AN5TRO.11＞103＞500.766.64＞50BaL.2624.76＞50＞50＞50＞50DJ263.8＞103＞50＞50＞50＞506535.3＞1030.91＞50＞50＞50RHPA4259.714.441.56＞50＞50＞50TRO.11＞1030.89＞50＞50＞50PVO.4＞1031.87＞50＞50＞50YU2.DG91.492.77＞50＞50＞50表4h患者12，克隆RU1612A1212A2112A412A3712A2212A16MW965.260.20.851.240.30.210.58BaL.260.080.0040.0070.030.140.25DJ263.80.310.421.060.571.860.126535.3＞50＞50＞50＞50＞25＞42RHPA4259.70.40.130.190.190.130.93TRO.110.980.571.123.811.942.57PVO.43.152.092.951.81.498.72YU2.DG0.310.060.10.070.361.13患者12，克隆RU16續(xù)12A2012A612A2312A4612A55MW965.262.20.52＞50＞504.49BaL.260.230.473.470.08＞50DJ263.8ND0.0830.81＞50＞506535.3ND＞24＞50＞50＞50RHPA4259.70.491.021.69＞50＞50TRO.112.415.1510.11＞50＞50PVO.411.217.347.817974.3YU2.DG0.671.20.190.250.29B12和NlH45克隆表5a體外Tzm-bl中和分析，擴(kuò)展面板IC50值體外Tzm-bl中和分析，擴(kuò)展面板IC50值續(xù)1NC91B25308ANC1318ANC1348ANC19512A1212A21Q842.d120.020.2490.0530.061＞300.0140.0153415.v1.c10.2660.0650.2990.3232.4040.1210.823365.v2.c200.3294.357＞30＞30＞300.0680.045H086.8＊＞30＞30＞50＞500.095＞30＞30ZM53M.PB1207050.912＞30＞309.6260.5930.42Du172.17＊＞30＞30＞30＞3010.7970.1960.126ZM109F.PB40.023＞30＞30＞30＞300.1482.1043016.v5.c45＞30＞30＞30＞300.1951.1630.097231965.c10.3930.1686.346＞300.5142.217＞30X1254_c3＞30＞30＞30＞301.5241.03226.793250-4＊＞30＞30＞50＞50＞50＞30＞30251-181.2349.8470.9681.560.2842.6221.713278-50＊＞30＞30＞50＞50＞50＞30＞30620345.c1＊＞30＞30＞50＞50＞50＞30＞30R1166.c10.6510.119＞30＞300.9860.3420.292表5b體外Tzm-bl中和分析，擴(kuò)展面板IC80值B12VRC0145-463BNC603BNC623BNC1173BNC55Q842.d12＞500.0960.0260.030.030.010.0623415.v1.c114.10.150.0690.370.40.470.3883365.v2.c20＞500.170.1140.080.090.12.341H086.8＊＞50＞50＞30＞15＞15＞15＞30ZM53M.PB12＞5040.6520.761.10.85＞30Du172.17＊2.6＞50＞30＞1512.188.9＞30ZM109F.PB4＞500.7540.221.230.780.880.3963016.v5.c4540.42＞307.382.35＞15＞30231965.c10.161.20.10.250.220.222.78X1254_c3＞500.190.0780.290.270.270.571250-4＊＞50＞50＞30＞15＞15＞151.922251-18＞5011.25.2550.9610.82＞30278-50＊＞50＞50＞30＞15＞15＞15＞30620345.c1＊＞50＞50＞30＞15＞15＞15＞30R1166.c1＞504.61.6790.510.890.642.351體外Tzm-bl中和分析，擴(kuò)展面板IC80值續(xù)1NC91B25308ANC1318ANC1348ANC19512A1212A21Q842.d120.1332.1910.1790.205＞300.060.0663415.v1.c11.0020.351.5552.64317.7430.4180.2963365.v2.c202.163＞30＞30＞30＞300.1920.166H086.8＊＞30＞30＞50＞505.328＞30＞30ZM53M.PB122.7714.022＞30＞30＞302.0691.458Du172.17＊＞30＞30＞30＞30＞300.9920.637ZM109F.PB40.146＞30＞30＞30＞300.69813.6863016.v5.c45＞30＞30＞30＞300.87211.8640.358231965.c12.2760.963＞30＞302.35515.102＞30X1254_c3＞30＞30＞30＞306.9495.777＞30250-4＊＞30＞30＞50＞50＞50＞30＞30251-186.291＞305.556.2811.5119.396.063278-50＊＞30＞30＞50＞50＞50＞30＞30620345.c1＊＞30＞30＞50＞50＞50＞30＞30R1166.c12.6690.684＞30＞304.831.852.137表6通過表面等離子共振測定lgG抗體對YU-2gp140和2CC-核配體的親和力gp1402CC-Coreka(M-1s-1)kd(s-1)KD(M)ka(M-1s-1)kd(s-1)KD(M)12A124.59E+041.44E-053.15E-106.33E+041.70E-062.69E-1112A219.18E+043.44E-073.75E121.82E+053.30E-041.81E-0912AGL//////3BNC602.73E+041.86E-046.81E-093.02E+041.64E-035.45E-083BNC1173.04E+041.99E-046.54E-091.49E-034.05E+043.68E-083BNC551.31E+047.55E-045.78E-088.15E-043.16E+042.57E-083BNC661.60E+041.41E-038.81E-083.96E+041.33E-033.36E-083BNC1561.13E+041.98E-031.75E-071.88E+041.53E-038.12E-083BNC108//////3BNC60GL//////8ANC1316.59E+041.09E-031.65E-084.88E+043.23E-036.61E-088ANC1341.55E+041.74E-031.13E-072.08E+049.57E-044.61E-088AGL//////8ANC1954.88E+041.67E-033.43E-082.41E+041.32E-035.47E-081NC94.83E+045.81E-041.20E-085.11E+042.36E-044.61E-091B25304.74E+041.62E-033.42E-086.83E+044.02E-045.90E-091GL//////45464.26E+042.87E-046.75E-091.12E+054.94E-044.40E-09VRC011.83E+048.08E-064.41E-102.84E+043.25E-051.15E-09表7a對于所選10個(gè)抗體的重鏈序列的取代/沉默突變率所有核苷酸共有核苷酸非共有核苷酸3BNC117HC1.81.03.53BNC60HC2.01.14.412A12HC2.81.76.312A21HC2.61.54.8NlH4546HC1.70.95.5VRCO1HC2.21.122.08ANC131HC2.71.38.08ANC134HC2.21.53.71B2530HC2.00.911.01NC9HC1.90.712.0表7b對于所選10個(gè)抗體的輕鏈序列的取代/沉默突變率所有核苷酸共有核苷酸非共有核苷酸3BNC117KC1.70.82.83BNC60KC1.70.74.012A12KC1.70.64.012A21KC2.51.44.3NIH4546KC1.70.93.0VRCO1KC1.80.84.08ANC131KC1.50.54.28ANC134KC1.50.54.21B2530LC1.92.01.81NC9LC1.20.91.8表8結(jié)晶數(shù)據(jù)收集和完善統(tǒng)計(jì)當(dāng)前第1頁1 2 3