本發(fā)明涉及一種口服液，具體涉及一種清幽口服液，即特異性抗幽門螺旋桿菌口服液，并提供了該口服液的具體制備方法。
背景技術(shù)：
：幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori，簡稱Hp)是世界上感染率最高的病原菌，生存于胃部及十二指腸的各區(qū)域內(nèi)。它會引起胃黏膜輕微的慢性發(fā)炎，甚或?qū)е挛讣笆改c潰瘍與胃癌，已被確認為最常見的慢性感染性疾病的病原之一。目前三聯(lián)或四聯(lián)療法是臨床上治療Hp感染的主要手段，但是隨著耐藥率上升，三聯(lián)或四聯(lián)療法的治愈率越來越低，因此開發(fā)特異性、靶向治療的藥物顯得尤為重要。特異性的卵黃抗體(eggyolkimmunoglobulinIgY)則能夠滿足治療并不會產(chǎn)生耐藥性的要求。清幽口服液是指特異性抗幽門螺旋桿菌的口服液。研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有抗幽門螺桿菌特異性IgY直接用于治療Hp感染的效果并不是十分顯著。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于，解決現(xiàn)有抗幽門螺桿菌特異性IgY直接用于治療Hp感染的效果并不是十分顯著的問題，提供一種治療Hp感染效果佳的清幽口服液，并提供了該口服液的優(yōu)選制備方法。本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：清幽口服液，即特異性抗幽門螺旋桿菌的口服液，包括：卵黃抗體，以及與該卵黃抗體等體積混合的硫糖鋁溶液；所述硫糖鋁的質(zhì)量終濃度為10％～30％。試驗證明：本發(fā)明制備出的口服液在胃腸環(huán)境下均能維持長時間高活性，且硫糖鋁對IgY在體外模擬胃環(huán)境中有良好的保護效果，本發(fā)明口服液與三聯(lián)抗生素(青霉素0.41mg、克拉霉素0.83mg、奧美拉唑0.13mg)相比，其治療Hp感染效果十分顯著；并且通過試驗數(shù)據(jù)可知：合適濃度的硫糖鋁的添加能顯著提高本發(fā)明口服液的治療Hp感染的效果。優(yōu)選地，所述硫糖鋁的質(zhì)量終濃度為20％。清幽口服液的制備方法，包括：將硫糖鋁溶液和卵黃抗體等體積混合即可，所述硫糖鋁的質(zhì)量終濃度為10％～30％。進一步，所述卵黃抗體的制備方法如下：步驟一、選擇產(chǎn)蛋雞，采用CTB佐劑在產(chǎn)蛋雞的腿部肌肉上進行多點注射；步驟二、在CTB佐劑注射一周以后，再采用IB對產(chǎn)蛋雞進行一次以上的免疫；步驟三、免疫完成后，收集雞蛋；步驟四、最后通過分離純化獲得卵黃抗體。該CTB佐劑是指霍亂毒素B亞單位免疫佐劑；該IB為本申請的申請人在公告號為CN101955545A的發(fā)明專利中公開的一種以幽門螺桿菌I亞單位表位和B亞單位表位串聯(lián)融合的一種用于預(yù)防人幽門螺桿菌感染的重組幽門螺桿菌多靶點融合多肽(IB)。通過本發(fā)明方法即可有效制備出單純抗Hp的卵黃抗體，該卵黃抗體具有高精確性和均一性，因而能有效避免現(xiàn)有混合物IgY導(dǎo)致交叉反應(yīng)的情況發(fā)生。為了提高IgY的效價，所述采用IB進行免疫的次數(shù)為四次，分別為首免、二免、三免和四免，首免、二免、三免和四免之間的免疫時間間隔為14d。作為最優(yōu)的設(shè)置方式，所述CTB佐劑的注射量為0.4mg/只，首免的注射量為0.6mg/只，二免、三免和四免的注射量為0.3mg/只。通過上述免疫方法的設(shè)置，可有效提高亂晃蛋白的效價，該IB免疫產(chǎn)蛋雞后的效價可提高并穩(wěn)定在1:12800。更進一步地，所述分離純化步驟為：將卵黃用水稀釋到10倍以上體積，然后用0.1M鹽酸調(diào)pH至5.2，攪勻后4℃放置過夜，在4℃、8000xg條件下離心20min，取上清獲得卵黃水溶性組分；向卵黃水溶性組分中緩慢加入體積比為1∶3的飽和度33％的硫酸銨，攪拌混勻，待完全溶解后置4℃放置過夜，在4℃、8000xg條件下離心15min，棄上清，用去離子水重新懸浮沉淀或獲得卵黃抗體。0.9％NaCl十倍以上體積經(jīng)30kd大小超濾系統(tǒng)置換去除殘留硫酸銨并濃縮-20℃保存?zhèn)溆?。通過本發(fā)明的分離純化步驟的優(yōu)化，能有效提高產(chǎn)物IgY的純度，該IgY的純度可達到96.51％，效果十分顯著。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：1、本發(fā)明制備出的口服液在胃腸環(huán)境下均能維持長時間高活性，且硫糖鋁對IgY在體外模擬胃環(huán)境中有良好的保護效果，本發(fā)明口服液與三聯(lián)抗生素(青霉素0.41mg、克拉霉素0.83mg、奧美拉唑0.13mg)相比，其治療Hp感染效果十分顯著；2、通過本發(fā)明合適濃度的硫糖鋁的添加能顯著提高本發(fā)明口服液的治療Hp感染的效果；3、通過本發(fā)明優(yōu)化的卵黃單蛋白制備方法制備出的IgY，其效價可提高并穩(wěn)定到1:12800，且其純度可高達96.51％。具體實施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。實施例11.1口服液的具體制備方法制備質(zhì)量濃度為40％的硫糖鋁溶液，然后將硫糖鋁溶液和卵黃抗體等體積混合，此時，硫糖鋁最終濃度為20％，密封后經(jīng)65℃、30min水浴消毒即可。其中，本實施例中的卵黃抗體的具體制備方法如下：步驟一、選擇3-4月齡的來杭蛋雞，采用CTB佐劑在產(chǎn)蛋雞的腿部肌肉上進行多點注射，該CTB佐劑的注射量為0.4mg/只。步驟二、在CTB佐劑注射一周以后，再采用IB對產(chǎn)蛋雞進行一次以上的免疫；本實施例中采用IB進行免疫的次數(shù)為四次，分別為首免、二免、三免和四免，首免、二免、三免和四免之間的免疫時間間隔為14d，首免的注射量為0.6mg/只，二免、三免和四免的注射量為0.3mg/只。步驟三、免疫完成后，收集雞蛋，然后采用清水清洗雞蛋，再用0.5％的新潔爾滅溶液洗凈搽干。步驟四、最后通過分離純化獲得卵黃抗體。即用卵黃分離器分離卵黃，去除卵清蛋白和卵黃膜，收集卵黃，將卵黃用水稀釋到10倍體積，然后用0.1M鹽酸調(diào)pH至5.2，攪勻后4℃放置過夜，在4℃、8000xg條件下離心20min，取上清獲得卵黃水溶性組分；向卵黃水溶性組分中緩慢加入體積比為1∶3的飽和度33％的硫酸銨，攪拌混勻，待完全溶解后置4℃放置過夜，在4℃、8000xg條件下離心15min，棄上清，用去離子水重新懸浮沉淀后獲得卵黃抗體。0.9％NaCl十倍以上體積經(jīng)30kd大小超濾系統(tǒng)置換去除殘留硫酸銨并濃縮-20℃保存?zhèn)溆谩?.2IB免疫產(chǎn)蛋雞后抗體的效價監(jiān)測在首免后0天、7天、14天、28天、42天、56天、63～182天，采用ELISA法對IgY抗體進行檢測，具體檢測步驟如下：包被：用包被液將IB抗原稀釋至10μg/mL，100ul/孔，4℃過夜；洗滌：用PBST洗滌液洗3次，300ul/孔，3min/次；封閉：用PBST配制10％脫脂奶粉溶液，200ul/孔，37℃，2h；洗滌：用PBST洗滌液洗3次，300ul/孔，3min/次；加一抗：用PBST將本實施例的卵黃抗體采用稀釋梯度稀釋后上樣，100ul/孔，37℃，1h；洗滌：用PBST洗滌液洗3次，300ul/孔，3min/次；加二抗：用PBST將HRP-兔抗雞IgG稀釋至1:6000，100ul/孔，37℃，40min；洗滌：用PBST洗滌液洗3次，300ul/孔，3min/次；顯色：加入TMB顯色液，50ul/孔，37℃避光顯色3-5min；終止：加入2M硫酸，50ul/孔；酶標(biāo)檢測：用酶標(biāo)儀在波長450nm處讀數(shù)；結(jié)果判斷：當(dāng)檢測的免疫IgY為陰性、IgY的OD值≥2.1、且免疫IgY自身OD值大于0.21以上時的最大稀釋度為抗體IgY的效價。通過上述方法檢測出的效價結(jié)果可知，IB免疫產(chǎn)蛋雞后的效價可穩(wěn)定在1:12800。1.3SDS-PAGE檢測特異性IgY的純度檢測具體純度檢測方法為：按聚丙烯酰胺電泳，配制15％分離膠，混勻后加入固定好的玻板內(nèi)，加入分離膠3.2mL，用蒸餾水封閉；待分離膠凝固后，加入5％的濃縮膠，并迅速插入上樣孔，等濃縮加凝固；將IgY樣品與上樣緩沖液按1:4混合均勻，沸水浴5min，取出10000rpm/min離心樣本，取上清進行電泳；將樣本加入到PAGE膠的泳道內(nèi)，80V，25min，120V電泳120min；電泳結(jié)束后取出凝膠在考馬斯亮藍染液中染色過夜；染色結(jié)束后用脫色液脫色，在凝膠成像系統(tǒng)中照相，分析IgY的純度。對免疫后產(chǎn)蛋雞的雞蛋進行純度檢測，通過上述檢測方式檢測得知：本實施例中的方法制備出的特異性IgY的純度均大于80％，本實施例制備出的特異性IgY的純度最高甚至可達到96.51％。1.4特異性IgY的收率檢測對首免后不同時間的產(chǎn)蛋雞的雞蛋進行通過多批次提取IgY，記錄每批次提取所用雞蛋個數(shù)和提取獲得IgY量。收率＝IgY總質(zhì)量/總雞蛋個數(shù)*100％。對免疫后產(chǎn)蛋雞的雞蛋進行收率檢測，檢測結(jié)果如表1所示，通過表1可知：通過對本實施例中的方法制備出的特異性IgY的收率可高達237.29mg/個，平均收率168.71mg/個。表1通過本發(fā)明方法對上述五個時間點的收率進行平均值計算，計算得知：總體收率為：168.71mg/個。1.5不同pH、溫度條件下IgY的穩(wěn)定性檢測用濃1MHCl、1MNaOH調(diào)整IgY溶液pH調(diào)至1.0、1.5、2.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，37℃水浴2h。間接ELISA檢測各組IgY活性。IgY溶液置于室溫(15℃)、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃條件水浴15Min，75℃水浴2Min，采用ELISA檢測各組IgY活性。通過檢測結(jié)果得知：IgY在pH<2時，失去活性，pH在5～8時，活性基本不變。IgY在37℃～65℃下有良好的熱穩(wěn)定性，75℃時IgY活性迅速下降，極不穩(wěn)定。1.6不同模擬環(huán)境下IgY和口服液的活性對比1.6.1模擬胃環(huán)境的活性檢測將IgY和口服液分別置于pH1.5的SGF中，37℃水浴30min、60min、90min、120min準(zhǔn)時取樣，Tris-Hcl緩沖液將pH均調(diào)到7.0，終止模擬胃環(huán)境反應(yīng)，以間接ELISA檢測其對應(yīng)活性，以此評價IgY和口服液對胃蛋白酶耐受情況。SGF即為模擬胃液，其具體制備方法為：稱取NaCI1.755g，胃蛋白酶10g，加入950ml去離子水使之溶解，定容至1L。取300ml用濃HCl調(diào)節(jié)pH至1.5。1.6.2模擬腸環(huán)境的IgY的活性對比將IgY和口服液分別置于pH6.8的SIF中，37℃水浴30min、60min、90min、120min準(zhǔn)時取樣，置于冰上終止模擬腸環(huán)境反應(yīng)。以間接ELISA檢測其對應(yīng)活性。以此評價IgY和口服液對胰蛋白酶耐受情況。SIF即為模擬腸液，具體制備方法為：稱取KH2P046.8g，胰蛋白酶10g，加入950ml去離子水使之溶解，用4MNaOH調(diào)節(jié)pH至6.8，定容至1L。通過上述檢測的結(jié)果可知：本發(fā)明制備出的口服液在胃腸環(huán)境下均能維持長時間高活性，且硫糖鋁對IgY在體外模擬胃環(huán)境中有良好的保護效果。實施例22.1口服液的具體制備方法本實施例與實施例1中口服液的區(qū)別僅僅在于：本實施例中卵黃蛋白的制備方法不同，本實施例中該卵黃蛋白的具體制備方法如下：步驟一、選擇3-4月齡的來杭蛋雞，采用全菌蛋白作為免疫蛋白對來杭蛋雞進行一次以上的免疫，全菌蛋白為滅活后的幽門螺桿菌悉尼株(H.pyloriss1)；本實施例中采用全菌蛋白進行免疫的次數(shù)為四次，分別為首免、二免、三免和四免，首免、二免、三免和四免之間的免疫時間間隔為14d，首免的注射量為0.6mg/只，二免、三免和四免的注射量為0.3mg/只。步驟二、免疫完成后，在，收集雞蛋，然后采用清水清洗雞蛋，再用0.5％的新潔爾滅溶液洗凈搽干。步驟三、最后通過分離純化獲得卵黃抗體。即用卵黃分離器分離卵黃，去除卵清蛋白和卵黃膜，收集卵黃，將卵黃用水稀釋到10倍體積，然后用0.1M鹽酸調(diào)pH至5.2，攪勻后4℃放置過夜，在4℃、8000xg條件下離心20min，取上清獲得卵黃水溶性組分；向卵黃水溶性組分中緩慢加入體積比為1∶3的飽和度33％的硫酸銨，攪拌混勻，待完全溶解后置4℃放置過夜，在4℃、8000xg條件下離心15min，棄上清，用去離子水重新懸浮沉淀或獲得卵黃抗體。0.9％NaCl十倍以上體積經(jīng)30kd大小超濾系統(tǒng)置換去除殘留硫酸銨并濃縮-20℃保存?zhèn)溆谩?.2全菌蛋白免疫產(chǎn)蛋雞后抗體的效價監(jiān)測采用實施例1中相同的檢測方法進行檢測，檢測出的效價結(jié)果可知，全菌蛋白免疫產(chǎn)蛋雞后的效價可高達1:12800，但最終穩(wěn)定在1:6400。實施例3本實施例中口服液的制備與實施例1基本相同，本實施例與實施例1的區(qū)別點僅僅在于：本實施例中硫糖鋁的加入量為口服液最終體積的10％。實施例4本實施例中口服液的制備與實施例1基本相同，本實施例與實施例1的區(qū)別點僅僅在于：本實施例中硫糖鋁的加入量為口服液最終體積的30％。實施例5：小鼠的治療試驗選擇健康的SPF級BALB/c小鼠64只，雌雄各半，體重16±2g，為試驗動物，設(shè)計8個試驗組別組，8只/組。檢疫結(jié)束用109CFU/ml的幽門螺桿菌悉尼株(H.pyloriss1)感染小鼠(感染兩次，間隔6h)，攻菌后2h恢復(fù)食物和水。具體給藥的試驗方案如表2所示。表2按照上述給藥方式給藥后，檢測小鼠的感染率和治愈率。感染率(％)＝每組感染的小鼠數(shù)/每組存活的小鼠數(shù)×100％；治愈率(％)＝(對照組感染率-治療組感染率)/對照組感染率×100％。檢測結(jié)果如表3所示。表3組別(n＝8)治愈率(％)PBS組0三聯(lián)抗生素組71.4％實施例1口服液(12mg/只)100％實施例2口服液(12mg/只)57.1％實施例1中IgY(12mg/只)0實施例3口服液(12mg/只)66.7％實施例4口服液(12mg/只)100％硫糖鋁組(濃度10％)42.8％通過上述治愈率效果可知：本發(fā)明口服液與三聯(lián)抗生素(青霉素0.41mg、克拉霉素0.83mg、奧美拉唑0.13mg)相比，其治療Hp感染效果十分顯著；并且通過試驗數(shù)據(jù)可知：合適濃度的硫糖鋁的添加能顯著提高本發(fā)明口服液的治療Hp感染的效果。以上所述的具體實施方式，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3