本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過增強(qiáng)氨同化作用促進(jìn)L-精氨酸合成的方法。
技術(shù)背景
L-精氨酸是人和動物體內(nèi)的一種半必需氨基酸，是多種生物活性物質(zhì)的合成前體，具有多種獨(dú)特的生理和藥理作用。隨著對精氨酸的生物學(xué)功能不斷地深入研究和了解，精氨酸在醫(yī)藥、食品、飼料工業(yè)上的用途越來越廣泛。
L-精氨酸的生產(chǎn)方法有水解法和發(fā)酵法。我國現(xiàn)有的生產(chǎn)廠家目前大多仍主要采用蛋白質(zhì)水解法來生產(chǎn)L-精氨酸，該方法對環(huán)境污染嚴(yán)重且收率不高，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸工藝相對簡單且對環(huán)境友好，具有很大的發(fā)展?jié)摿?。但是，國?nèi)以微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-精氨酸，產(chǎn)酸水平普遍較低，成本較高，生產(chǎn)水平和產(chǎn)量不能滿足國內(nèi)需求。因此，提高L-精氨酸的發(fā)酵產(chǎn)酸水平和葡萄糖利用率非常重要。
Corynebacterium crenatum SDNN403(該菌株為本課題組多年研究，產(chǎn)用傳統(tǒng)誘變方法獲得一株菌株，保藏編號CGMCC0890，專利號為：ZL 03112896.3)，為高產(chǎn)L-精氨酸C.crenatum。前期工作中對該菌株的L-精氨酸合成代謝途徑進(jìn)行了系統(tǒng)的分析。對L-精氨酸合成代謝中的反饋抑制與反饋?zhàn)瓒粽{(diào)控作用進(jìn)行了研究，解除了菌株中的反饋抑制。同時(shí)對精氨酸合成的競爭旁路代謝關(guān)鍵酶基因進(jìn)行敲除等代謝改造，在增強(qiáng)目標(biāo)產(chǎn)物精氨酸合成途徑關(guān)鍵酶基因簇表達(dá)的同時(shí)，削弱脯氨酸、谷氨酰胺等競爭支路途徑的代謝流，最終使L-谷氨酸分解代謝集中在L-精氨酸的合成代謝流從而提高了精氨酸的產(chǎn)量，相關(guān)成果已授權(quán)國家發(fā)明專利4項(xiàng)。
L-精氨酸分子中含有4個(gè)氮原子，氮元素含量為32.1％，因此L-精氨酸生物合成過程中氮原子供應(yīng)非常重要。細(xì)胞氨同化作用為合成代謝提供了氮原子。目前為止，關(guān)于微生物發(fā)酵產(chǎn)L-精氨酸菌株代謝工程改造主要集中在碳代謝流優(yōu)化和輔因子供應(yīng)優(yōu)化方面，而與氮原子供應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞氨同化作用則沒有相關(guān)研究報(bào)道。
谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)細(xì)胞中氨同化作用主要有谷氨酸脫氫酶和谷氨酰胺合酶兩條途徑。谷氨酸脫氫酶催化α-酮戊二酸氨基化生成L-谷氨酸。谷氨酰胺合酶催化谷氨酸繼續(xù)氨基化生成L-谷氨酰胺。L-谷氨酸為L-精氨酸合成直接前體，L-谷氨酰胺則參與L-精氨酸合成輔前體氨甲酰磷酸的合成。在大腸桿菌(Escherichia coli)中則存在另一條氨同化途徑，該途徑由天冬氨酸酶催化富馬酸氨基化生成L-天冬氨酸，L-天冬氨酸則為L-精氨酸合成提供最后一個(gè)氮原子。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所使用的菌株為C.crenatum SDNN403，是本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的高產(chǎn)精氨酸突變菌株，保藏編號CGMCC0890，專利號為：ZL 03112896.3。
本發(fā)明的目的在于通過增強(qiáng)氨同化作用促進(jìn)鈍齒棒桿菌L-精氨酸合成。
本發(fā)明的技術(shù)方案：
(1)以C.crenatum SDNN403基因組為模板，利用PCR的方法擴(kuò)增谷氨酸脫氫酶基因gdh和谷氨酰胺合酶基因glnA，引物序列為：
gdhF：CCGGAATTCAAAGGAGGGAAATCATGACAGTTGATGAGCAGG
gdhR：ACCGCTTAAGTTAGATGACGCCCTGTGCCAG
glnAF：CTAGCTAGCAAAGGAGGGAAATCGTGGCGTTTGAAACCCCGG
glnAR：CATGCCATGGTTAGCAGTCGAAGTACAATTC
以E.coli基因組為模板利用PCR的方法擴(kuò)增天冬氨酸酶基因aspA，引物序列為：
aspAF:CTAGCTAGCAAAGGAGGGAAATCATGTCAAACAACATTCGTATCG
aspAR:CCGCTCGAGTTACTGTTCGCTTTCATCAG
將獲得的gdh、glnA和aspA基因片段與pDXW-10線性化質(zhì)粒連接，并熱激轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，獲得重組質(zhì)粒pDXW-10-gdh、pDXW-10-glnA和pDXW-10-aspA。
(2)以質(zhì)粒pDXW-10-aspA為模板，利用引物tacNotI：
AAGGAAAAAAGCGGCCGCTCGGAAGCTGTGGTATGG和引物aspAR擴(kuò)增pDXW-10質(zhì)粒tac啟動子和aspA基因片段tac-aspA。將tac-aspA基因片段與pDXW-10-glnA NotI和XhoI雙酶切線性化質(zhì)粒連接，并熱激轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，獲得重組串聯(lián)質(zhì)粒pDXW-10-glnA-aspA。以pDXW-10-gdh為模板，利用引物tacXhoI：
CCGCTCGAGTCGGAAGCTGTGGTATGG和引物gdhR擴(kuò)增pDXW-10質(zhì)粒tac啟動子和gdh基因片段tac-gdh。將tac-gdh基因片段與pDXW-10-glnA-aspA XhoI和AflII雙酶切線性化質(zhì)粒連接，并熱激轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，獲得重組串聯(lián)質(zhì)粒pDXW-10-glnA-aspA-gdh。
(3)將質(zhì)粒pDXW-10-gdh、pDXW-10-glnA、pDXW-10-aspA、pDXW-10-glnA-aspA和pDXW-10-glnA-aspA-gdh電擊轉(zhuǎn)化C.crenatum SDNN403，經(jīng)1800V，5ms電擊后涂布于含有LBG+Km固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)24～36h，挑選轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并進(jìn)行質(zhì)粒提取驗(yàn)證。鑒定正確的菌株命名為403/pDXW-10-gdh、403/pDXW-10-glnA、403/pDXW-10-aspA、403/pDXW-10-glnA-aspA和403/pDXW-10-glnA-aspA-gdh。
具體實(shí)施方式：
對照實(shí)施例：C.crenatum SDNN403搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基成分：葡萄糖120g/L，玉米漿40g/L，生物素8×10-5g/L，組氨酸5×10-4g/L，硫酸錳0.02g/L，硫酸銨20g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸亞鐵0.02g/L。發(fā)酵溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速220r/min。發(fā)酵60h L-精氨酸產(chǎn)量為15.3g/L。
實(shí)施例1：谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合酶和天冬氨酸酶單獨(dú)表達(dá)對L-精氨酸合成的影響
403/pDXW-10-gdh、403/pDXW-10-glnA和403/pDXW-10-aspA搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件同對照實(shí)施例。發(fā)酵60h L-精氨酸產(chǎn)量403/pDXW-10-gdh為15.7g/L，403/pDXW-10-glnA為17.5g/L，403/pDXW-10-aspA為18.1g/L。
實(shí)施例2：谷氨酰胺合酶和天冬氨酸酶共表達(dá)L-精氨酸合成的影響
由實(shí)施例1可知單獨(dú)過表達(dá)谷氨酰胺合酶和天冬氨酸酶能夠明顯提高C.crenatum SDNN403 L-精氨酸產(chǎn)量，而過表達(dá)谷氨酸脫氫酶L-精氨酸產(chǎn)量增加不明顯。這可能是由于C.crenatum SDNN403原始谷氨酸脫氫酶酶活力能夠滿足L-精氨酸合成需要。因此，繼續(xù)研究谷氨酰胺合酶和天冬氨酸酶共表達(dá)L-精氨酸合成的影響。403/pDXW-10-glnA-aspA搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件同對照實(shí)施例。發(fā)酵60h L-精氨酸產(chǎn)量為19.3g/L。
實(shí)施例3：谷氨酰胺合酶、天冬氨酸酶和谷氨酸脫氫酶共表達(dá)L-精氨酸合成的影響
由實(shí)施例2可知過量共表達(dá)谷氨酰胺合酶和天冬氨酸酶能夠進(jìn)一步提高C.crenatum SDNN403 L-精氨酸產(chǎn)量。403/pDXW-10-glnA-aspA L-精氨酸合成能力明顯提高，那么L-谷氨酸作為L-精氨酸合成直接前體，菌株403/pDXW-10-glnA-aspA中L-谷氨酸供應(yīng)有可能成為L-精氨酸合成的限制因素。因此，繼續(xù)研究谷氨酰胺合酶、天冬氨酸酶和谷氨酸脫氫酶共表達(dá)L-精氨酸合成的影響。403/pDXW-10-glnA-aspA-gdh搖瓶發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基成分與發(fā)酵條件同對照實(shí)施例。發(fā)酵60h L-精氨酸產(chǎn)量為20.8g/L。