本發(fā)明涉及分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于‘秋盛芥藍(lán)’雜交種子純度鑒定的引物及方法。

背景技術(shù)：

芥藍(lán)是起源于華南地區(qū)的一種特色葉菜，為甘藍(lán)的一個(gè)變種。‘秋盛芥藍(lán)’是以Sb06M為母本，Sb06F為父本育成的國內(nèi)首次通過品種審定的雜交種。具有生長勢強(qiáng)，產(chǎn)量高，抗病抗逆型強(qiáng)的特點(diǎn)。是華南地區(qū)推廣面積較多的品種。但是由于有限的親本資源以及雜交品種的不斷涌現(xiàn)，使得品種間，尤其是雜交種子之間的遺傳差異越來越小，蔬菜種子的真實(shí)性與品種純度鑒定也越來越難，加之‘秋盛芥藍(lán)’是利用自交不親和系配制而成的雜交一代，在制種過程中母本有一定的自交結(jié)實(shí)率，常常會(huì)出現(xiàn)假雜種，導(dǎo)致種子遺傳純度下降，給生產(chǎn)造成巨大損失。為了避免這種損失，需要對種子的純度和真?zhèn)芜M(jìn)行鑒定。目前品種的純度和真?zhèn)舞b定是以形態(tài)學(xué)標(biāo)記為依據(jù)，這種鑒定方法雖然從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)角度具有穩(wěn)定可靠的優(yōu)點(diǎn)，但是在大規(guī)模檢測中存在耗時(shí)較多，錯(cuò)誤率較高的缺點(diǎn)，因而不利于大規(guī)模推廣。

因此為了保證優(yōu)良品種發(fā)產(chǎn)生最大的經(jīng)濟(jì)效益，因此一種快速、準(zhǔn)確、有效的品種鑒定方法非常重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)提供一種用于快速、準(zhǔn)確鑒定“秋盛芥藍(lán)”雜交種子純度的引物及方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種用于鑒定 ‘秋盛芥藍(lán)’雜交種子純度的 SSR 分子標(biāo)記組，SSR分子標(biāo)記組由S69和BOE135組成。

優(yōu)選的，SSR 分子標(biāo)記S69的引物對序列如下所示 ：

S69-F: 5’-TCGCCAATAGAACCCAAAACTT-3’(SEQ ID NO:3)

S69-R: 5’-CATCTCCATTGCTGCATCTGCT-3’(SEQ ID NO:4)。

優(yōu)選的，SSR 分子標(biāo)記BOE135的引物對序列如下所示 ：

BOE135-F:5’-CGTGGGGGATATGGTGGTGGTTA-3’ (SEQ ID NO:5)

BOE135-R: 5’-AATGCCTGTGTTCTCCTGCTCGTC-3’ (SEQ ID NO:6)。

一種用于 ‘秋盛芥藍(lán)’雜交種子純度鑒定的方法，包括如下步驟：

1）提取芥藍(lán)幼苗基因組DNA；

以芥藍(lán)基因組DNA為模板，使用S69和/或BOE135的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

2）對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳；

對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時(shí)具有親本特異性條帶的單株做為雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種。

本發(fā)明的有益效果是：將‘秋盛芥藍(lán)’雜交種與其母本、父本區(qū)分開來，快速檢測出雜交種子的純度。本方法具有快速、準(zhǔn)確、低成本，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為引物BOE135‘秋盛芥藍(lán)’種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜（P1：母本；P2：父本：F1為雜交一代種子）；

圖2為引物S69‘秋盛芥藍(lán)’種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜（P1：母本；P2：父本：F1為雜交一代種子）；

圖3為秋盛芥藍(lán)商品種種植后取葉片DNA進(jìn)行電泳跑膠的圖片，其中P1（c條帶）為母本，P2（d條帶）為父本，1-42分別對應(yīng)商品種1-42株，其中41為假雜種。

具體實(shí)施方式

一種用于鑒定 ‘秋盛芥藍(lán)’雜交種子純度的 SSR 分子標(biāo)記S69，包括母本Sb06M和父本 Sb06F，其母本Sb06M的核苷酸序列如 SEQ ID NO：1所示，父本Sb06F的核苷酸序列如 SEQ ID NO：2所示。

優(yōu)選的，SSR分子標(biāo)記S69引物對，其序列如下所示 ：

S69-F: 5’-TCGCCAATAGAACCCAAAACTT-3’(SEQ ID NO:3)

S69-R: 5’-CATCTCCATTGCTGCATCTGCT-3’(SEQ ID NO:4)。

一種用于鑒定 ‘秋盛芥藍(lán)’雜交種子純度的 SSR 分子標(biāo)記BOE135引物對，其序列如下所示 ：

BOE135-F:5’-CGTGGGGGATATGGTGGTGGTTA-3’ (SEQ ID NO:5)

BOE135-R: 5’-AATGCCTGTGTTCTCCTGCTCGTC-3’ (SEQ ID NO:6)

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。

實(shí)施例1 ‘秋盛芥藍(lán)’ 雜交種子純度檢測方法的建立

（1）芥藍(lán)DNA的提取

實(shí)驗(yàn)材料為‘秋盛芥藍(lán)’商品種及其母本、父本幼嫩真葉DNA。步驟如下：

①用液氮在2ml的離心管內(nèi)用研杵研磨，在液氮快蒸發(fā)干時(shí)迅速加入1000μL 2%CTAB提取緩沖液，混勻后置于65℃水浴中溫浴50min（每隔5min搖動(dòng)一次）。

②靜置至室溫后在4℃ 下12000rpm離心10min，將上清（約800μL）轉(zhuǎn)移到新的2ml 離心管。

③加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，靜置3-5分鐘，在4℃ 下12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中。

④加2/3體積340μL預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻（緩慢顛倒20次），置于－20℃下培養(yǎng)30min。

⑤在4℃下13000rpm離心10min，棄上清，加入200-300μL預(yù)冷的70%乙醇洗滌DNA沉淀（兩次），微干。

⑥加入100μL無菌水溶解。

（2）SSR-PCR 擴(kuò)增：

PCR體系（20μL）

DNA模板：5ng

引物-F：0.25 mmol?L^-1

引物-R：0.25 mmol?L^-1

dNTP：0.2mmol?L^-1

Mg2+：0.15mmol?L^-1

10×PCR buffe：2.0μL

Taq酶：0.2U

ddH20補(bǔ)足至20μL

PCR擴(kuò)增程序

94℃預(yù)變性5min后，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)后，72℃保持7min，然后置于4℃保存待檢測。

（3）凝膠電泳

擴(kuò)增產(chǎn)物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個(gè)小時(shí)，電泳結(jié)束后進(jìn)行0.1%AgNO₃銀染15min；銀染后用2%NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na₂CO₃顯色，顯色后在燈箱上拍照分析。

（4）擴(kuò)增結(jié)果

兩種引物在‘秋盛芥藍(lán)’父母本及雜交一代種子分別能擴(kuò)增出兩條特異帶；其中BOE135引物母本p1擴(kuò)增出的a條帶，母本p2號擴(kuò)增出b的條帶；引物S69母本擴(kuò)增出c條帶，父本擴(kuò)增出d條帶。(見圖1）

回收特異條帶c和d，送上海生物工程有限公司測序。條帶的序列如SEQ ID NO:1-2所示，雜交種子中與父本、母本擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相符。

實(shí)施例2 檢測準(zhǔn)確度驗(yàn)證

采用實(shí)施例1的方法對從白云基地的種子純度鑒定田取的50株‘秋盛芥藍(lán)’，對其單株編號，提取單株DNA進(jìn)行檢測（部分電泳圖見圖3），檢測結(jié)果兩個(gè)引物檢測結(jié)果一致，種子純度為98%，與田間調(diào)查結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為100%。

以上實(shí)施例表明，本發(fā)明的方法可將‘秋盛芥藍(lán)’雜交種子與其父母本種子進(jìn)行有效區(qū)分，快速、準(zhǔn)確檢測出種子純度。并且選取任何一個(gè)引物均能準(zhǔn)確鑒別。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所

<120> 用于'秋盛芥藍(lán)'雜交種子純度的鑒定的引物及方法

<130> Cabbage mustard

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 280

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 1

ggatattttg tttttgatgg agacgaagca tagtcgtgat gatttggtgg atgtgcaaac 60

ttggcttggc tacgatagga tcatgactgt caatcctatt gggtacagcg gaggtctagc 120

cttgatgtgg aagaattctg taaatatcgg gtttaagttt gtagacaaga atcttgtaga 180

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ccaaggtaat agagcaaagg tgtgggaaag gttatctagg 280

<210> 2

<211> 258

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 2

taattaaaca ttagagaacc tcgatcacat caattaccaa aataacttcc gatcacatca 60

agtgataaga aactttgttt aatttgcagg cttcttgatg cataaatggg ttatgtgata 120

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ttagaaaaca actcaaaaaa ctaaagctct caaactcata agatatgcaa acacccttgc 240

atctctttat ataacttt 258

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

tcgccaatag aacccaaaac tt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 4

catctccatt gctgcatctg ct 22

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 5

cgtgggggat atggtggtgg tta 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Cabbage mustard

<400> 6

aatgcctgtg ttctcctgct cgtc 24