本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)埃博拉病毒囊膜蛋白的抗病毒納米抗體。

背景技術(shù)：

治療性單克隆抗體(monoclonal antibody，單抗)由于可精確地攻擊靶分子，且毒副作用較小而成為人們期望中的理想藥物。目前，國(guó)內(nèi)外的單抗藥物主要應(yīng)用于治療腫瘤、免疫性疾病和病毒感染等方面。例如用于治療呼吸道合胞病毒RSV的帕利珠單抗(Palivizumab、Synagis)。

傳統(tǒng)的單克隆抗體的制備方法是雜交瘤技術(shù)。隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，治療性單抗已從鼠源單抗，到嵌合抗體、人源化抗體，直至近年的全人抗體，逐步消除了異源性抗體的免疫原性問(wèn)題。但隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)抗體的分子量較大(～150kD)，使它們的組織滲透性較差，也難以結(jié)合一些空間上有位阻效應(yīng)的關(guān)鍵表位，從而影響活性。解決的策略之一是將全長(zhǎng)抗體進(jìn)行小型化，由此開發(fā)了一系列具有結(jié)合功能的抗體片段：如Fab(50-60kD)、單鏈抗體(scFv，20-30kD)、重鏈可變區(qū)抗體(VH，12-15kD)(單域抗體)等小型化抗體。這些抗體片段相對(duì)于全長(zhǎng)單抗，具有更好的組織滲透性和結(jié)合存在位阻效應(yīng)的抗原表位的能力。

然而，無(wú)論是Fab，scFv還是VH，由于它們都缺少Fc段，從而無(wú)法和Fc受體(比如neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn)等相結(jié)合。目前觀點(diǎn)認(rèn)為IgG在體內(nèi)具有較長(zhǎng)半衰期(一周到數(shù)周)的原因是IgG可以通過(guò)Fc段在酸性pH(pH 6.0)和FcRn結(jié)合，在中性pH(pH 7.4)被釋放(該結(jié)合稱為pH依賴的結(jié)合)，從而完成其循環(huán)再生的過(guò)程。由于缺少這種結(jié)合，F(xiàn)ab、scFv和VH在體內(nèi)的半衰期通常只有幾分鐘到幾十分鐘，這就限制了它們進(jìn)一步的應(yīng)用。因此需要繼續(xù)研發(fā)分子量小，血漿半衰期長(zhǎng)的骨架用于抗體庫(kù)的構(gòu)建和針對(duì)特異抗原的篩選。

最近，一種新的基于抗體Fc段CH2結(jié)構(gòu)域的骨架被認(rèn)為有希望用來(lái)研發(fā)新型的單域抗體，稱為納米抗體(nanoantibody,nAbs)(Dimitrov DS,mAbs.,2009)。CH2(～12kDa)的結(jié)構(gòu)(PDB：1HZH)(Prabakaran P,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.,2008)與VH相似，主要由七個(gè)β-折疊(A到G)所組成，由三個(gè)loop和兩個(gè)α-helix所連接，并含有一對(duì)天然的二硫鍵。三個(gè)loop區(qū)與VH的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(complementarity determining region,CDR)相似，可以引入突變而進(jìn)行抗體庫(kù)的構(gòu)建。由于是Fc的一部分，CH2含有的Fc與Fc受體(如neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn)等的部分位點(diǎn)結(jié)合,因此，經(jīng)過(guò)改造后的CH2骨架，就有可能和FcRn相互結(jié)合?；谶@種CH2骨架篩選到的納米抗體會(huì)具有雙效價(jià)：既能夠結(jié)合抗原，又能夠結(jié)合如FcRn等分子(延長(zhǎng)血漿半衰期)，從而實(shí)現(xiàn)(或部分實(shí)現(xiàn))全長(zhǎng)抗體的功能。這也是CH2骨架相比其它分子量相似的骨架(如VH)的主要優(yōu)勢(shì)。

CH2的穩(wěn)定性較弱，需要進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)引入一對(duì)二硫鍵得到一個(gè)CH2的突變體m01，相對(duì)CH2，其Tm值提高近20℃(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2009)；通過(guò)截去CH2的N-端的七個(gè)處于無(wú)規(guī)則狀態(tài)的氨基酸，得到一個(gè)截短的突變體CH2s，相對(duì)CH2，CH2s的抗聚集能力得到顯著提高(Gong R,et al.,Mol Pharm.,2013)。將這兩者結(jié)合之后得到一個(gè)新的突變體m01s(Gong R,et al.,J Biol Chem.,2011)(圖1)，它的Tm值比CH2的Tm值高30℃，具有更好的可溶表達(dá)與蛋白酶抗性。更為重要的是，相對(duì)于CH2，m01s具有更好的依賴于pH的與人FcRn的結(jié)合能力，在不同動(dòng)物模型中的血漿半衰期可達(dá)10小時(shí)左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)長(zhǎng)于與其分子量相似的其它結(jié)構(gòu)域(如VH的血漿半衰期僅有幾分鐘)(Gehlsen K,et al.,MAbs,2012)。因此，m01s可以作為一個(gè)理想的骨架用于抗體庫(kù)的構(gòu)建和篩選。

埃博拉是迄今為止傳染性最高、致命性最強(qiáng)的病毒之一，具有潛伏期長(zhǎng)、傳播途徑廣、感染種群復(fù)雜等特點(diǎn)，多次在全球爆發(fā)，尤其2014年在西非暴發(fā)的疫情，已導(dǎo)致上萬(wàn)人死亡。目前，有幾種針對(duì)埃博拉的候選抗體藥物都是全長(zhǎng)的IgG蛋白，都需要在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，所以其表達(dá)量低，生產(chǎn)成本高。

假病毒是由非病毒自身核酸被病毒衣殼蛋白或包膜蛋白包裹所形成的具有感染性的病毒樣顆粒。我們利用基因工程改造的水泡性口炎病毒(缺失囊膜蛋白基因，因此不能組裝出新的完整病毒顆粒，只能一次性感染細(xì)胞；帶有綠色熒光蛋白基因，感染細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，使被感染的細(xì)胞呈綠色)和埃博拉病毒的囊膜蛋白基因一起，組裝出帶有埃博拉病毒囊膜蛋白的水泡性口炎病毒顆粒。該埃博拉假病毒可較好的替代野生的埃博拉病毒，應(yīng)用于抗體中和病毒的研究中(Michael A.Whitt，JVM,2010)。

近幾年噬菌體展示技術(shù)廣泛用于抗體研發(fā)。噬菌體展示技術(shù)是將被展示基因與噬菌體自身蛋白基因(gIII或gVIII)融合在一起而展示于噬菌體的表面?？梢詷?gòu)建大容量(10¹⁰～10¹¹)的展示庫(kù)進(jìn)行篩選，以其速度快、周期短等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越被人們所重視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種針對(duì)埃博拉病毒囊膜蛋白的抗病毒納米抗體ebo7c2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼ebo7c2的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明提供的納米抗體ebo7c2，是一種針對(duì)埃博拉病毒囊膜蛋白的抗病毒抗體，該納米抗體的氨基酸與m01s的氨基酸序列(如SEQ ID NO：3所示)在3個(gè)loop區(qū)有所差異，其Loop BC的基因序列為Seq ID No.4，氨基酸序列為Seq ID No.5；編碼Loop DE的基因序列為Seq ID No.6，氨基酸序列為Seq ID No.7；編碼Loop FG的基因序列為Seq ID No.8，氨基酸序列為Seq ID No.9。

本發(fā)明提供的上述針對(duì)埃博拉病毒囊膜蛋白的納米抗體，是通過(guò)以下方法得到(Gong R,et al.,Plos One,2012)：首先構(gòu)建以m01s為骨架的噬菌體展示庫(kù)，然后以哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的埃博拉病毒囊膜蛋白胞外域?yàn)榭乖?圖2)，經(jīng)過(guò)7輪篩選得到一個(gè)富集的克隆。通過(guò)隨機(jī)突變對(duì)這個(gè)富集的克隆進(jìn)行親和力成熟，得到一個(gè)高親和力的特異性結(jié)合的克隆。表達(dá)純化該克隆(圖3)，進(jìn)行鑒定，即得到一種中和埃博拉病毒的抗體ebo7c2，并對(duì)其進(jìn)行鑒定分析。

通過(guò)ELISA對(duì)ebo7c2的結(jié)合性進(jìn)行了鑒定，以m01s(骨架)為對(duì)照。ELISA實(shí)驗(yàn)證明ebo7c2能夠與篩選用抗原相結(jié)合(圖4)，病毒中和試驗(yàn)證明ebo7c2能夠抑制埃博拉假病毒感染BHK-21細(xì)胞(圖5)，因此，該抗體具有中和埃博拉病毒的作用。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種載體，其包含SEQ ID NO：2。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種細(xì)胞，其包含以上所提到的核酸SEQ ID NO：2或納米抗體ebo7c2。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其至少包含ebo7c2或上述偶聯(lián)抗體、融合抗體的任意一種。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。

本發(fā)明提供上述納米抗體在制備預(yù)防或治療埃博拉病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)生物樣品中的埃博拉病毒囊膜蛋白的試劑盒，其包含納米抗體ebo7c2。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種偶聯(lián)抗體，其包含納米抗體ebo7c2。該偶聯(lián)抗體是指納米抗體ebo7c2和其它分子偶聯(lián)，包括但不僅限于放射性同位素、毒素，形成的偶聯(lián)抗體。

進(jìn)一步地，該偶聯(lián)抗體在制備預(yù)防或治療埃博拉病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)生物樣品中的埃博拉病毒囊膜蛋白的試劑盒，其包含上述偶聯(lián)抗體。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種融合抗體，其包含納米抗體ebo7c2。該融合抗體是指納米抗體ebo7c2和其它多肽，此處所指的多肽從數(shù)個(gè)氨基酸的肽段到蛋白質(zhì)，融合后的融合抗體。

進(jìn)一步地，該融合抗體在制備預(yù)防或治療埃博拉病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)生物樣品中的埃博拉病毒囊膜蛋白的試劑盒，其包含上述融合抗體。

噬菌體展示技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于抗體篩選及其它領(lǐng)域。它是將外源基因(即本發(fā)明中的基于m01s的庫(kù))同絲狀噬菌體的外殼蛋白P3基因(或P8)基因融合后導(dǎo)入噬菌體基因組，表達(dá)產(chǎn)生的外源肽與外殼蛋白P3(或P8)形成融合蛋白，展示在噬菌體的表面。導(dǎo)入了各種各樣外源基因的一群噬菌體，就構(gòu)成一個(gè)展示各種各樣外源蛋白的噬菌體展示庫(kù)。當(dāng)用一個(gè)抗原(埃博拉病毒囊膜蛋白的胞外域)去篩查一個(gè)噬菌體展示庫(kù)時(shí)，就會(huì)選擇性地同與其有相互作用的某個(gè)外源蛋白相結(jié)合。經(jīng)過(guò)多輪篩選，那些能結(jié)合抗原的的克隆(即本發(fā)明中的ebo7c2)被富集，然后可以通過(guò)測(cè)序、表達(dá)進(jìn)行鑒定。

本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“納米抗體”，指基于抗體恒定區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的一類抗體，是單域抗體的一種。相對(duì)于全長(zhǎng)單抗，納米抗體具有更好的組織滲透性和結(jié)合空間上存在位阻效應(yīng)的抗原表位的能力；相對(duì)于同等分子量的基于抗體重鏈可變區(qū)VH結(jié)構(gòu)域的單域，納米抗體的血漿半衰期較長(zhǎng)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的主要突出效果和優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的創(chuàng)新在于從人IgG1恒定區(qū)CH2結(jié)構(gòu)域的一個(gè)突變體m01s為骨架的噬菌體展示庫(kù)中，以哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的埃博拉病毒囊膜蛋白為抗原，篩選得到一種中和埃博拉病毒的納米抗體ebo7c2。本發(fā)明提供的這種納米抗體，是一種病毒中和抗體，其優(yōu)點(diǎn)在于：首先，相對(duì)于全長(zhǎng)單抗(分子量～150kD)，ebo7c2分子量較小(～14kD)，具有更好的組織滲透性和結(jié)合存在位阻效應(yīng)的抗原表位的能力，甚至能夠開發(fā)成口服藥；其次，ebo7c2由于其所基于的m01s骨架具有與FcRn的結(jié)合能力，它的血漿半衰期也可能達(dá)到10個(gè)小時(shí)，遠(yuǎn)長(zhǎng)于基于VH等其它骨架的單域抗體的血漿半衰期(一般是幾分鐘到十幾分鐘)；最后，ebo7c2可在原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，生產(chǎn)成本低、周期短。

附圖說(shuō)明

圖1為m01s的結(jié)構(gòu)示意圖；

m01s是CH2的突變體，所含的三個(gè)loop區(qū)分別是Loop BC，Loop DE和Loop FG，它們可以用來(lái)引入突變從而構(gòu)建抗體庫(kù)(三個(gè)區(qū)的每一個(gè)氨基酸都可以突變)。

圖2為埃博拉病毒囊膜蛋白的表達(dá)純化；

泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道Gp449為目的蛋白。

圖3為純化后的納米抗體ebo7c2經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)；

泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道7c2為目的蛋白。

圖4為ELISA測(cè)定的ebo7c2和埃博拉病毒囊膜蛋白的結(jié)合；

ebo7c2(◆)與抗原蛋白的結(jié)合濃度EC₅₀為30nM，骨架m01s(▲)為陰性對(duì)照。

圖5為ebo7c2中和埃博拉假病毒實(shí)驗(yàn)；

ebo7c2(◆)中和病毒的濃度IC₅₀為300nM，骨架m01s(▲)為陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南》(New York:Cold Spring Harborlaboratory Press,2001)中所述的條件進(jìn)行。

【實(shí)施例1】表達(dá)并純化埃博拉病毒囊膜蛋白

根據(jù)埃博拉病毒的基因序列(GenBank No.AY354458)，分析其氨基酸序列，合成其囊膜蛋白的胞外域(氨基酸33-311,463-632)的基因Gp499，將基因與載體pSecTag2A連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建載體pSecTag2A-Gp449。轉(zhuǎn)染前1天將293F細(xì)胞(控制細(xì)胞密度為5～×10⁵個(gè)/ml)40mL接種于125mL懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶。將40μg質(zhì)粒(pSecTag2A-Gp449)稀釋于4mL培養(yǎng)基中輕輕渾勻，再將120μL PEI(polyethylenimine)稀釋于培養(yǎng)液中，輕輕渾勻。室溫孵育20分鐘后將它們逐滴加入細(xì)胞中。將細(xì)胞放入懸浮培養(yǎng)箱中，250轉(zhuǎn)/分鐘，37℃懸浮培養(yǎng)。

144小時(shí)后收集培養(yǎng)基上清，用鼠源anti-His作為一抗(所用載體在所表達(dá)蛋白的C端提供6×His Tag標(biāo)簽用于檢測(cè))通過(guò)蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)囊膜蛋白的表達(dá)。

在檢測(cè)到目的蛋白表達(dá)后，擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染規(guī)模，大量表達(dá)囊膜蛋白。收集培養(yǎng)基上清，用Ni-NTA填料純化目的蛋白，隨后用截留分子量為3kD的超濾離心管超濾置換緩沖液，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證其純度。

【實(shí)施例2】噬菌體展示庫(kù)的構(gòu)建以篩選

以m01s為骨架，按照已有的文獻(xiàn)構(gòu)建噬菌體庫(kù)(Gong R,et al.,PLoS ONE,2012)，以哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的抗原進(jìn)行篩選。將純化后的抗原在96孔板中4℃孵育過(guò)夜時(shí)后，用噬菌體庫(kù)進(jìn)行淘選，特異性的噬菌體被抗原所捕獲，用PBS+0.05％Tween-20清洗，經(jīng)過(guò)7輪篩選，得到一個(gè)富集的克隆，命名為ebo7。以ebo7為骨架，對(duì)其基因序列進(jìn)行隨機(jī)突變，從突變體中得到了一個(gè)特異性的高親和力克隆，命名為ebo7c2。

【實(shí)施例3】ebo7c2的表達(dá)純化

按照已有文獻(xiàn)(Gong R,et al.,Methods Mol Biol.,2012)對(duì)ebo7c2進(jìn)行表達(dá)和純化。構(gòu)建原核ebo7c2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入E.coli HB2151中。再接種菌種于含100μg/ml氨芐的SB培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和10g MOPS，pH值用NaOH調(diào)至7.0)中，待OD₆₀₀達(dá)到0.7～1.0時(shí)加入IPTG至終濃度為200μg/ml，于37℃、220rpm的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)14～16h。4℃、6000rpm、15min離心收集菌體，棄培養(yǎng)基，沉淀重懸于Buffer A(50mM Tris-HCL，450mM NaCL，pH 8.0)中，再經(jīng)多粘菌素B(polymyxin B)處理1小時(shí)后離心收集上清。用Ni-NTA填料純化，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證其純度。隨后用截留分子量為3kD的超濾離心管超濾濃縮，所得到的ebo7c2的C-末端含6×His標(biāo)簽和FLAG標(biāo)簽。

【實(shí)施例4】ELISA測(cè)定ebo7c2和囊膜蛋白的結(jié)合

將囊膜蛋白(2μg/mL)包被在ELISA板上，4℃孵育過(guò)夜后用PBS+3％milk于37℃封閉1h。加入系列稀釋的ebo7c2，37℃孵育2小時(shí)后用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗四次，再加辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗FLAG單克隆抗體于37℃孵育1小時(shí)后，用PBST洗四次，再加入ABTS進(jìn)行檢測(cè)。骨架m01s作為陰性對(duì)照。ebo7c2和埃博拉病毒囊膜蛋白結(jié)合的EC₅₀為30nM，m01s不能與囊膜蛋白結(jié)合，如圖4所示。

【實(shí)施例5】在BKH-21細(xì)胞中ebo7c2抗體中和埃博拉假病毒。

以埃博拉假病毒(EBOV)作為抗體中和的病毒目標(biāo)，以水泡性口炎重組病毒(VSVG)為陰性對(duì)照病毒，檢測(cè)候選抗體能否特異性的抑制埃博拉假病毒的感染，同時(shí)不能影響對(duì)照組病毒(Sven Moller-Tank，et al.，J Virol，2013)。將100μL的BHK-21(1×10⁵個(gè)/ml)細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)14～16h。將ebo7c2抗體加入到埃博拉假病毒中，ebo7c2終濃度最高為15000nM，依次三倍稀釋，最低濃度為205.7nM(稀釋3⁶倍)37℃孵育30分鐘。棄96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基，用病毒和抗體混合液感染細(xì)胞，37℃孵育2小時(shí)。棄病毒液后，用PBS清洗3次，除去殘留的病毒液，加入含有2％胎牛血清的培養(yǎng)基，于37℃孵育。第二天在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)綠色細(xì)胞的個(gè)數(shù)，抗體100％中和效率即無(wú)綠色細(xì)胞。被病毒感染的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，能夠發(fā)射綠色熒光，沒(méi)有感染病毒的細(xì)胞不發(fā)光。隨著抗體濃度的降低，呈現(xiàn)綠色BHK-21細(xì)胞逐漸增加，表明被埃博拉假病毒的感染的細(xì)胞數(shù)目增加，即表示ebo7c2可以特異性的中和埃博拉假病毒，中和效率IC₅₀位300nM。作為陰性對(duì)照，ebo7c2未檢測(cè)到抑制水泡性口炎的感染，如圖5所示。