本發(fā)明涉及生物工程，尤其是涉及一種匹馬霉素A菌株的基因工程改造方法。

背景技術(shù)：

匹馬霉素的結(jié)構(gòu)簡單，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是一種常用的多烯類抗生素，被廣泛用作食品防腐添加劑、抗真菌獸藥以及用于角膜炎治療。在目前最常用的四種多烯類抗生素(匹馬霉素、兩性霉素B、制霉菌素和殺念菌素)中，匹馬霉素的溶血毒性最低，但其抗真菌活性同樣也相對較低。相對偏低的藥理性質(zhì)，嚴(yán)重限制了匹馬霉素在臨床中的應(yīng)用價值。在前期的研究中，我們通過基因工程改造的方法，對匹馬霉素生物合成基因簇中的P450單加氧酶基因pimG進(jìn)行了失活，并成功從其發(fā)酵產(chǎn)物中鑒定得到了一種高效低毒的匹馬霉素衍生物—匹馬霉素A(12-脫羧-12甲基-匹馬霉素)。經(jīng)體外活性實驗測定，匹馬霉素A的活性是匹馬霉素的2倍，而其毒性不足匹馬霉素的1/4，是一種高效低毒的匹馬霉素衍生物，具有良好的應(yīng)用前景。

但是，P450單加氧酶基因pimG失活菌株QZ01除產(chǎn)生匹馬霉素A外，還產(chǎn)生一種低毒的匹馬霉素B(4,5-脫環(huán)氧-12-脫羧-12甲基-匹馬霉素)及無活性的匹馬霉素C(2-氫-3-羥基-4,5-脫環(huán)氧-12-脫羧-12甲基-匹馬霉素)。前期實驗中，我們通過替換PKS基因中的DH12KR12結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了突變株QZ12，并成功消除了發(fā)酵產(chǎn)物中匹馬霉素C的產(chǎn)生。但菌株QZ12發(fā)酵產(chǎn)物中匹馬霉素B的存在仍限制了后續(xù)的分離純化，而其相對較低的產(chǎn)量也限制了匹馬霉素A的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，通過基因工程改造的方法，進(jìn)一步消除或降低菌株QZ12中低效低毒匹馬霉素B的產(chǎn)生并進(jìn)一步提高匹馬霉素A的產(chǎn)量，將極大地推動匹馬霉素A的工業(yè)化生產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。體內(nèi)及體外實驗證實，匹馬霉素B是匹馬霉素A未發(fā)生C4-C5位環(huán)氧化的前體，因此，我們在QZ12菌株中嘗試通過超量表達(dá)負(fù)責(zé)編碼環(huán)氧化酶的基因pimD及其輔助基因pimF，降低或消除匹馬霉素B的產(chǎn)生，并提高匹馬霉素A的產(chǎn)量，進(jìn)而達(dá)到優(yōu)化產(chǎn)生菌株的目的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的，就是為了提高匹馬霉素A的產(chǎn)量，提供一種匹馬霉素A菌株的基因工程改造方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種匹馬霉素A菌株的基因工程改造方法，是通過在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12中過表達(dá)后修飾基因pimD與pimF，實現(xiàn)了匹馬霉素A產(chǎn)量的大幅度提高，并降低了匹馬霉素B的產(chǎn)生。

所述pimD為P450單加氧酶基因，pimD基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

所述pimF為鐵氧還蛋白基因，所編碼的鐵氧還蛋白為P450單加氧酶PimD的輔助蛋白，pimF基因序列如SEQ ID NO.2所示。

所述通過在菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12中過表達(dá)后修飾基因pimD與pimF的構(gòu)建步驟如下：

一、設(shè)計并構(gòu)建用于基因pimD與pimF過表達(dá)的質(zhì)粒I；

二、將第一步構(gòu)建得到的質(zhì)粒I接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入受體菌株QZ12中；

三、通過對突變株的PCR驗證及阿泊拉霉素抗性驗證篩選得到過表達(dá)菌株QZ14。

步驟一中所述質(zhì)粒I的構(gòu)建方法是，在質(zhì)粒pPM927的EcoRI位點(diǎn)依次插入兩拷貝1.4kb測序確認(rèn)的紅霉素啟動子控制下的基因pimD的PCR片段及0.4kb測序確認(rèn)的紅霉素啟動子控制下的基因pimF的PCR片段。

采用本發(fā)明的方法，可以使后修飾基因pimD與pimF的轉(zhuǎn)錄水平分別提高10及7倍左右，進(jìn)而提高匹馬霉素B到匹馬霉素A的轉(zhuǎn)化，最終使匹馬霉素A的產(chǎn)量提高了約107％，實驗室搖瓶發(fā)酵水平達(dá)到746mg/L，極大推動了匹馬霉素A的工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，并給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件或制造廠商的建議條件。

實施例

步驟一：整合型質(zhì)粒I的構(gòu)建

以菌株Streptomyces chattanoogensis QZ12的基因組DNA為模板，使用引物pimD-F/R、pimF-F/R，通過PCR擴(kuò)增得到后修飾基因pimD與pimF，通過基因測序確認(rèn)PCR片段的正確性；在質(zhì)粒pPM927的EcoRI位點(diǎn)依次插入兩個拷貝的紅霉素啟動子控制下的的pimD基因片段及單拷貝的紅霉素啟動子控制下的pimF基因片段(MunI/EcoRI酶切位點(diǎn))；通過上述方法得到用于基因pimD與pimF過表達(dá)的質(zhì)粒I。

上述步驟一中所用到的引物序列如表1所示：

表1

步驟二：將整合型質(zhì)粒I通過接合轉(zhuǎn)移的策略導(dǎo)入菌株QZ12，并篩選得到改造菌株QZ14。

將已構(gòu)建完成用于基因過表達(dá)的質(zhì)粒I轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌宿主E.coli ET12567(含有pUZ8002質(zhì)粒)中。取該轉(zhuǎn)化子于含有氯霉素、卡那霉素和阿泊拉霉素三種抗生素的LB中于37℃過夜培養(yǎng)，用相同的培養(yǎng)基，將過夜培養(yǎng)物按10％的比例轉(zhuǎn)接一次并培養(yǎng)4h，然后用新鮮的LB溶液漂洗菌體以除去培養(yǎng)物中的抗生素。于此同時制備菌株QZ12的新鮮孢子約109個，用TES溶液漂洗2～3次之后再用2mLTES溶液懸浮孢子，于50℃熱激10min后，冷卻至室溫，等體積加入2×孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)液后于37℃培養(yǎng)2.5h，并用新鮮的LB溶液漂洗孢子2～3次。將預(yù)萌發(fā)的孢子與之前制備的大腸桿菌宿主菌E.coli ET12567混合(孢子和宿主菌的比例約為10:1)均勻后涂布于YMG平板，待平板吹干后轉(zhuǎn)移至30℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)17h后取出平板，分別取阿泊拉霉素和萘啶酮酸兩種抗生素混勻于1mL無菌水中，覆蓋于YMG平板上，將平板晾干后轉(zhuǎn)移至30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般3～5天后可見平板上有單菌落接合子長出，通過菌絲體PCR驗證和抗性驗證的方法驗證接合子正確，即得到改造菌株QZ14。

步驟三：改造菌株QZ14中基因pimD與pimF轉(zhuǎn)錄水平的測定

用于RNA提取的樣品為發(fā)酵培養(yǎng)48h的菌絲體，其一般保存在Redzol溶液中。RNA提取過程要求低溫，離心過程除特殊說明，均在4℃、12000rpm的條件下進(jìn)行。取已經(jīng)破碎處理的樣品500μL加入100μL氯仿，渦旋振蕩混勻，離心15min后吸取上清液，加入100μL無水乙醇并混勻后將樣品吸入離心柱(賽百盛)中，靜置2min，離心1min，棄液體，用漂洗液(Washing buffer，賽百盛)漂洗兩次，棄液體，將離心柱置于收集管中繼續(xù)離心2min。換用新的收集管，往離心柱中加入60μL DEPC處理過的水，離心2min，將RNA樣品從離心柱上洗脫下來。用Nanodrop 2000型核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和OD260/280，提取后的RNA樣品-80℃保存。RNA樣品經(jīng)DNase消化處理4h后，每個反應(yīng)體系加入5μL 50mM EDTA后65℃加熱10min即可終止消化，消化好的RNA樣品-80℃保存。RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后就得到cDNA，可用于后續(xù)的基因轉(zhuǎn)錄分析。

取cDNA樣品用DEPC處理水稀釋至合適的濃度，配制qRT-PCR體系(2×SYBR Green緩沖液10μL，引物20pmol，cDNA5μL，加DEPC水至體積20μL)，離心去掉溶液中的氣泡之后使用ABI公司7500型快速RT-PCR儀測定樣品Ct值。采用hrdB作為看家基因測定pimD與pimF的轉(zhuǎn)錄水平。收集的數(shù)據(jù)使用2^-ΔΔCT法進(jìn)行處理。一般對照組樣品的基因轉(zhuǎn)錄水平設(shè)參比為1，實驗組樣品基因轉(zhuǎn)錄與之比較即得到實驗組基因轉(zhuǎn)錄改變的倍數(shù)。

測定基因轉(zhuǎn)錄水平使用的引物如表2所示：

表2

改造菌株QZ14的后修飾基因pimD與pimF轉(zhuǎn)錄變化結(jié)果表明，在基因pimD與pimF過表達(dá)后，其轉(zhuǎn)錄水平較對照菌株分別有大約10倍與7倍的提高，基因pimD與pimF的轉(zhuǎn)錄量明顯提高。

步驟四：改造菌株QZ14的發(fā)酵培養(yǎng)及其產(chǎn)量測定

種子培養(yǎng)基各組分質(zhì)量體積比為葡萄糖1.75％、胰蛋白胨1.5％、氯化鈉1.0％；發(fā)酵培養(yǎng)基各組分質(zhì)量體積比為葡萄糖6.0％、酵母提取物0.7％、黃豆餅粉2.8％。按種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)配方，分別配制種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基，并分裝于250mL三棱瓶中，每瓶裝50mL，115℃滅菌30min，將過表達(dá)菌株及對照菌株菌絲體接入上述種子培養(yǎng)基中，在220rpm轉(zhuǎn)速、30℃，搖床培養(yǎng)24h得種子培養(yǎng)液。將種子培養(yǎng)液按10％接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在220rpm轉(zhuǎn)速、30℃，搖床培養(yǎng)5d。

使用Agilent公司的Agilent 1200系列HPLC進(jìn)行色譜分析，采用DAD二極管陣列檢測器測定303nm下的色譜吸收峰。色譜柱的參數(shù)為：Agilent TC-C18，5μm，4.6×250mm；流動相流速為1mL/min；流動相組成及其體積比為：67％的含0.1％甲酸(v/v)的水溶液和33％的HPLC級乙腈。柱溫：35℃。

表3為出發(fā)菌株QZ12與改造菌株QZ14的發(fā)酵產(chǎn)量數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，改造菌株QZ14中低效低毒匹馬霉素B的產(chǎn)量降低了86％左右，而高效低毒匹馬霉素A的產(chǎn)量提高了約107％，達(dá)到746mg/L，為匹馬霉素A的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

表3：出發(fā)菌株QZ12與改造菌株QZ14的發(fā)酵產(chǎn)量數(shù)據(jù)

—表示該菌株不產(chǎn)生這一類抗生素。