本發(fā)明涉及生物技術領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種來源于速生且木材品質(zhì)優(yōu)良的美洲黑楊(Populus deltoides Marsh.)的伸展蛋白基因，命名為PdEXT。本發(fā)明還涉及PdEXT基因編碼的蛋白，利用PdEXT基因和植物維管組織特異啟動子proNAC068載體構(gòu)建的融合表達載體，以及利用該基因培育優(yōu)良木材品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因楊樹的方法。

背景技術：

楊樹在我國是一個栽培歷史悠久、種類繁多、分布廣泛的重要經(jīng)濟樹種以及重要的短輪伐期工業(yè)用材樹種之一，楊樹材性的育種一直是林木育種工作的重點。2002年毛果楊基因組測序工作的順利完成，促進了樹木基因分離和應用的研究。一些與木材性狀相關基因的陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)、克隆和驗證，為從基因水平上改善林木材性提供了基礎。

伸展蛋白(Extensin)是第一個被鑒定作為細胞壁的疏松蛋白，參與胞壁多聚糖的伸展作用，具有能在植物體外誘導細胞壁擴展，導致細胞壁松弛、細胞膨大的功能。伸展蛋白或細胞壁松弛蛋白是植物細胞壁的重要的糖蛋白，其羥脯氨酸(Hyp)含量比例高，兩者呈正相關關系。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能分析，細胞壁松弛蛋白expansin可分為α、β、γ和δ四個亞家族，它們可能來源于共同的祖先。過量表達和反義RNA干涉試驗表明，通過內(nèi)源導入expansin基因與外源施用expansin蛋白導致細胞壁變化和細胞的生長趨勢類似。已有研究表明，expansin的表達具有細胞、組織和器官的特異性，expansin在次生木質(zhì)部有高豐度的表達，expansin基因與營養(yǎng)生長、根系發(fā)生、果實成熟、授粉受精等生理活動密切相關，調(diào)節(jié)植物細胞生長和發(fā)育。由上可知，研究伸展蛋白對改善楊樹木材性狀具有重要的意義。然而，目前對美洲黑楊(Populus deltoides Marsh.)伸展蛋白基因還未見相關的研究。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的一個目的是提供一種具有有效改良樹木材性的基因美洲黑楊伸展蛋白基因-PdEXT。通過對該基因的應用，有利于改良木材的品質(zhì)，提高以該木材為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品的質(zhì)量。

本發(fā)明提供了一種美洲黑楊伸展蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明還提供了一種基于上述基因編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明還提供了一種表達載體，包含上述美洲黑楊伸展蛋白基因。

優(yōu)選地，所述表達載體包含維管組織特異啟動子proNAC068。

本發(fā)明還提供了一種細胞，所述細胞為將宿主細胞轉(zhuǎn)化后的包含上述表達載體的細胞。

優(yōu)選地，所述宿主細胞包括但不限于：大腸桿菌或農(nóng)桿菌細胞。

本發(fā)明還提供了一種包含上述美洲黑楊伸展蛋白基因的表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

A、克隆美洲黑楊伸展蛋白基因；

B、將步驟A所述的基因連接到pGEM-T Easy載體中，得到連接產(chǎn)物PGEM-PdEXT；

C、將步驟B所得的連接產(chǎn)物PGEM-PdEXT和維管組織特異啟動子proNAC068載體分別進行Xba I和Sac I雙酶切后，連接得到一個雙元表達載體；

D、將所述雙元表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞中。

本發(fā)明還提供了一種利用美洲黑楊伸展蛋白基因獲得轉(zhuǎn)基因山新楊植株的方法，包括以下步驟：

構(gòu)建包含權(quán)利要求1所述基因的表達載體；

用所述構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化山新楊細胞；

將所述轉(zhuǎn)化的山新楊細胞培育成轉(zhuǎn)基因山新楊植株。

本發(fā)明還提供了一種基于美洲黑楊伸展蛋白基因轉(zhuǎn)化植物獲得轉(zhuǎn)基因植物的應用，其特征在于，當所述植物為單子葉植物時，所述植物至少包括但不限于以下其一：水稻、小麥、玉米、牧草；

當所述植物為雙子葉植物時，所述植物至少包括但不限于以下其一：楊樹、擬南芥、煙草、油菜。

綜上所述，本發(fā)明提供一種具有有效改良樹木材性的基因PdEXT。通過對該基因的應用，有利于增強木材的強度，提高以該木材為原料生產(chǎn)的產(chǎn)品的質(zhì)量。

附圖說明

圖1.PdEXT植物表達載體pBI121-proNAC068-PdEXT構(gòu)建圖；

圖2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染PdEXT的楊樹分化出的叢生芽；

圖3.轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基的PdEXT轉(zhuǎn)基因楊樹植株；

圖4.移栽的PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊植株和對照植株；

圖5.PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊植株的PCR檢測；

圖6.PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊及其對照植株的PdEXT和木材微纖絲角相關基因的熒光實時定量PCR分析；

圖7.PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊及其對照植株的莖橫切面解剖特征和微纖絲角匯總圖；

圖8.PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊及其對照植株的莖橫切面解剖結(jié)構(gòu)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施例中所用試劑如下：

RQ-Dnase(Promega，美國)、RNase Inhibitor(Promega，美國)、MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國)、dNTP(天根，中國)、Plant TotalRNA Isolation Kit(Autolabtech，中國)、MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國)、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，日本)試劑盒、pGEM-T Easy試劑盒(Promega，美國)、水飽和酚(Autolabtech，中國)、氯仿(北京化工，中國)。

以下，對本文的實施方式進行具體說明。

實施例1、美洲黑楊PdEXT基因的克隆

從中國林科院的美洲黑楊未成熟木質(zhì)部和木質(zhì)部組織中提取總RNA?？俁NA的提取采用奧萊博生物技術有限公司(Autolabtech，中國)生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具體操作過程參照其說明書?？俁NA提取后，用RNase-free DNase(Promega，上海)處理15分鐘，酚/氯仿抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，并利用MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國)進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。

選擇樹干通直、生長旺盛的15年生美洲黑楊成年樹木，用鉆子、斧頭去除胸徑處樹皮，暴露韌皮部組織，形成層和未成熟木質(zhì)部等組織，用刮紙刀刮取未成熟木質(zhì)部和木質(zhì)部于液氮速凍后，保存于-80℃超低溫冰箱?？俁NA的提取采用奧萊博生物技術有限公司(Autolabtech，中國)生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒(Cat#：AL-BRE-004-100)，具體操作過程參照其說明書?？俁NA提取后，用RNase-free DNase(Promega，美國)處理15min，氯仿/酚抽提去除DNase，70％乙醇沉淀回收RNA。采用TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。以帶Oligo(dT)₁₅的引物，利用MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國)進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

Oligo(dT)₁₅引物序列如下：

TTTTTTTTTTTTTTT

反轉(zhuǎn)錄反應如下

1、RNA樣品2～6μl(0.05～1μl)，加入CDS PrimerⅡA Oligo(dT)15-30 2μl，加水補足到總體積10μl，混合并短暫離心。

2、72℃溫育2min，立即置于冰上2min，并短暫離心。

用PCR儀72℃溫育2.5min。

3、加入下列成份：

4μl 5×First-Strand Buffer；

2μl DTT(20mM)；

2μl dNTP Mix(10mM of each dNTP)；

2μl Reverse Transcriptase。

4、輕輕混勻并短暫離心，42℃溫育1.5h。

5、將離心管放于冰上終止反應，－20℃保存。

取適量上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以進行PCR擴增分離基因。

正向引物(含Xba I位點，其識別序列以下劃線表示)：

5'-GGCCTCTAGAATGGCTCCCAAAAGAACC-3'

反向引物(含Sac I位點，其識別序列以下劃線表示)：

5'-GGCGAGCTCTTAAGGACATTGGAAGTCTT-3'

PCR條件

以反轉(zhuǎn)錄合成的第1鏈cDNA為模板，經(jīng)94℃預變性3分鐘后采用94℃30秒，60℃30秒，72℃1分鐘的反應條件進行35個循環(huán)擴增，并于72℃延伸7分鐘后置于4℃冰箱中備用。

PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T Easy(Promega，美國)載體上用于測序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLASTN核酸序列的同源性分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE＝MegaBlast&PROGRAM＝bla stn&BLAST_PROGR)，確定通過上述PCR反應克隆到的是EXT的同源基因。

該基因含有一個完整的開放閱讀框架，全長為423bp，見SEQ ID NO：1，該基因編碼的蛋白的氨基酸序列，見SEQ ID NO：2。我們將這個來源于美洲黑楊的EXT的同源基因命名為PdEXT。

實施例2、用于轉(zhuǎn)化的植物表達載體的構(gòu)建

利用上述的正向引物和反向引物，以克隆在pGEM-T Easy載體上的PGEM-PdEXT質(zhì)粒為模板，擴增出特異的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物純化回收后，與毛白楊(Popuplus tomentosa Carr.)維管組織特異啟動子

proNAC068載體分別進行Xba I和Sac I雙酶切后，連接得到一個雙元表達載體，其圖譜如圖1所示，經(jīng)測序鑒定插入片段無誤后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞。PCR篩選陽性克隆，提質(zhì)粒進行限制性酶切驗證后，證明成功轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，該表達載體可直接用于植物，如楊樹、擬南芥、煙草等植物的轉(zhuǎn)化。維管組織特異啟動子proNAC068序列為880bp，見SEQ ID NO：3。

其中，本實施例可以使用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體。這些植物表達載體包括但不限于，雙元農(nóng)桿菌載體，例如Pbin19、pBI121、pBI 221，以及用于單子葉植物微彈轟擊的植物表達載體。本實施例的載體也可含有適當?shù)膯幼?。在實施例中可使用任何一種強啟動子。這些啟動子包括但不限于花椰菜花葉病毒(CaMV 35S)、Ubiqutin和Actin啟動子。它可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。

為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植株進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，包括加入植物可選擇性標記。可使用的選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，抗生素包括卡那霉素、潮霉素、慶大霉素等。同樣，可使用產(chǎn)生通過顏色變化(例如GUS)或發(fā)光(例如熒光酶或GFP)來識別化合物的酶，或抗化學試劑(例如除萎劑)。另外，也可不用任何篩選標記。

本發(fā)明的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，直接的DNA轉(zhuǎn)化，微注射，基因槍等導入植物細胞。

實施例3、PdEXT基因的楊樹遺傳轉(zhuǎn)化

采用農(nóng)桿菌介導的葉盤轉(zhuǎn)化法對山新楊組培苗進行PdEXT基因的遺傳轉(zhuǎn)化，具體操作步驟如下：

(1)在超凈臺中，從培養(yǎng)瓶中取出健壯生長的山新楊組培苗，用手術刀片沿與主脈垂直每隔5mm左右劃刀口，使葉片產(chǎn)生傷口。

(2)將葉片在含目的基因表達載體的農(nóng)桿菌菌液中浸泡10-15min，立即用無菌滅菌水沖洗一遍；將接菌后的葉片平鋪于1/2MS固體培養(yǎng)基表面，室溫暗共培養(yǎng)2-4d。

(3)將共培養(yǎng)葉片轉(zhuǎn)移至含頭孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的MS分化培養(yǎng)基中，如圖2所示，其中a表示：轉(zhuǎn)基因楊樹植株分化培養(yǎng)30天；b表示：轉(zhuǎn)基因楊樹植株分化培養(yǎng)45天，將其在光照周期16h/8h，25℃條件下進行選擇培養(yǎng)。

(4)繼代選擇培養(yǎng)：每2-3周后，外植體更換一次選擇培養(yǎng)基使其誘導分化。

(5)待不定芽長到1cm以上時，將其切下并插入含頭孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，如圖3所示，其中，a表示：轉(zhuǎn)基因楊樹植株生根培養(yǎng)20天；b表示：轉(zhuǎn)基因楊樹植株生根培養(yǎng)30天，獲得轉(zhuǎn)基因植株。

分化培養(yǎng)基組成：

含6-BA 1.0mg/L，NAA 0.05mg/L，頭孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的MS培養(yǎng)基。

生根培養(yǎng)基組成：

含IBA 0.05mg/L，NAA 0.02mg/L，頭孢霉素(500mg/L)和卡那霉素(30mg/L)的1/2MS培養(yǎng)基。

實施例4、PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊植株的PCR檢測

如圖4所示，為將在生根培養(yǎng)基上正常生長的轉(zhuǎn)基因植株移栽到溫室，正常水肥管理，4個月后的培養(yǎng)結(jié)果，比例標尺Scale bar為12.42cm。其中a為非轉(zhuǎn)基因楊樹對照植株，b為轉(zhuǎn)基因楊樹植株。轉(zhuǎn)基因山新楊植株的DNA提取采用CTAB法(王關林和方宏筠，2002)。根據(jù)pBI121載體上的NPTII序列設計引物，對遺傳轉(zhuǎn)化后的再生植株進行PCR檢測。引物序列為:

正向引物：

5'-ATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCT-3'

反向引物：

5'-GAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3'

PCR結(jié)果如圖5所示，可見在所檢測的抗卡那霉素的100株山新楊中，14株擴增出約0.7kb的DNA片段，從而可以初步推斷這些植株為PdEXT基因的陽性轉(zhuǎn)化植株。M為DL2000Marker；1-14:PdEXT轉(zhuǎn)基因楊樹植株；CK-:非轉(zhuǎn)基因楊樹植株。

實施例5、PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊及其對照植株的PdEXT和木材微纖絲角相關基因的熒光實時定量PCR分析

轉(zhuǎn)基因山新楊植株的RNA提取按照實施例1描述的方法進行，利用MM-LV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega,美國)進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄。利用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計熒光實時定量PCR引物，根據(jù)PdEXT、PtrFRA1(易脆纖維基因)、PtrTUB7(微管蛋白基因)、PtrSuS1(蔗糖合成酶基因)、PtrC4H1(肉桂酸4-羥基化酶基因)、PtrCAD10(肉桂醇脫氫酶基因)、PtrCCR7(肉桂酰輔酶A還原酶基因)的編碼區(qū)序列，設計1對能夠擴增200bp左右片段的引物，并以微管蛋白基因Tubulin作為內(nèi)參基因。PdEXT基因、內(nèi)參基因和微纖絲角相關基因的熒光實時定量PCR引物序列如下：

PdEXT正向引物：

5'-CGAGGCTGCTATTTGTCT-3'

PdEXT反向引物：

5'-TTGGAAGTCTTTGGGAAC-3'

Tubulin正向引物：

5'-CTGCCCGTTGCTCTGATGATTCA-3'

Tubulin反向引物：

5'-CCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCT-3'

PtrFRA1正向引物：

5'-CAGCAGAACTGTTATGATAGC-3'

PtrFRA1反向引物:

5'-TGTTGCGGGCACGATTTG-3'

PtrTUB7正向引物:

5'-TTGAGCCATACAACGCCAC-3'

PtrTUB7反向引物:

5'-CGGAAGCAGATGTCATACAAA-3'

PtrSuS1正向引物:

5'-TTTCCCTCGCCCAACTCTT-3'

PtrSuS1反向引物:

5'-GATGCAGGCTTTCCTTGTCA-3'

PtrC4H1正向引物：

5'-CCCTCTTGGGTTCTTTCGTT-3'

PtrC4H1反向引物:

5'-CAAACACGGGGACAGGTATA-3'

PtrCAD10正向引物:

5'-CAGCACTTTGTACTCCGTATTCC-3'

PtrCAD10反向引物:

5'-TGCTTCCCTGGTTCTGTCATT-3'

PtrCCR7正向引物:

5'-GGCTAAGGAGAAAGGGGTGG-3'

PtrCCR7反向引物:

5'-GCCGGTGAGGTACTTGAGGA-3'

PCR反應按照SYBR Premix Ex Taq^TM(TaKaRa，日本)試劑盒提供的方法進行：在PCR 8連管中依次加入10μL SYBR Premix Ex Taq^TM、0.4μL PCR Forward primer、0.4μL PCR Reverse primer、0.4μL ROX Reference dye II、2μL cDNA和6.8μL滅菌蒸餾水，終體積為20μL，輕微離心，收集到管底。PCR反應在ABI 7500Real-time PCR儀上按照下列程序進行：95℃10秒；然后95℃5秒，59℃34秒，共40個循環(huán)。

PCR結(jié)束后，制作熔解曲線檢查是否有非特異擴增，然后應用ABI sequence detection system分析軟件分析定量PCR結(jié)果。

結(jié)果見圖6，PdEXT轉(zhuǎn)基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3中木材微纖絲角相關基因如易脆纖維基因PtrFRA1、微管蛋白基因PtrTUB7、蔗糖合成酶基因PtrSuS1、肉桂酸4-羥基化酶基因PtrC4H1、肉桂醇脫氫酶基因PtrCAD10和肉桂酰輔酶A還原酶基因PtrCCR7的表達水平，與對照相比提高了2.22-7.31倍，表明PdEXT調(diào)控木材微纖絲角相關基因的表達。圖6的對照為非轉(zhuǎn)基因植株；PdEXT1、PdEXT2、PdEXT3分別為轉(zhuǎn)基因楊樹的3個植株。

實施例6、PdEXT轉(zhuǎn)基因山新楊植株的解剖結(jié)構(gòu)分析和微纖絲角測定

采用石蠟切片技術進行莖橫切面解剖并制作切片，以觀察韌皮部、形成層和木質(zhì)部的細胞層數(shù)、數(shù)目變化及次生生長情況。微纖絲角的測定采用偏光顯微鏡方法，將20μm厚的弦切面切片，經(jīng)脫木素、染色和固定處理，使用偏光顯微鏡測量2–3個切片，隨機測量25根纖維的微纖絲角，取平均值，得出樣品的微纖絲角數(shù)據(jù)，并采用SPSS軟件(IBM公司)對測定的解剖特征指標分別進行單因素方差分析(One-Way Anova)。

對莖橫切面進行組織切片，解剖特征進行匯總分析。如圖7所示，其中的圖a-c分別示出了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?、轉(zhuǎn)基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3的木質(zhì)部、韌皮部和形成層的寬度和層數(shù)。其中，轉(zhuǎn)基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3的木質(zhì)部、韌皮部和形成層的寬度相比對照分別提高了36.55％-51.71％、22.81％-29.68％和22.72％-35.16％。單因素方差分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)部、韌皮部和形成層的寬度與對照相比均有顯著性差異，具體的，sig值分別為0.003、0.001和0.006，如圖7d，示出了轉(zhuǎn)基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3及其對照的節(jié)間均長和木質(zhì)部寬度/韌皮部寬度比值。其中，轉(zhuǎn)基因植株PdEXT3的木質(zhì)部寬度/韌皮部寬度比值最高，達到2.11。如圖8，示出了轉(zhuǎn)基因植株PdEXT1、PdEXT2和PdEXT3及其對照植株的莖橫切面解剖結(jié)構(gòu)。其中，圖a、b分別示出了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旰娃D(zhuǎn)基因楊樹植株的韌皮部和形成層的解剖結(jié)構(gòu)。其中，X、CZ、P分別指木質(zhì)部、形成層、韌皮部。圖c、d分別示出了非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓旰娃D(zhuǎn)基因楊樹植株的木質(zhì)部和形成層的解剖結(jié)構(gòu)，標尺Scale bar為70μm。

微纖絲角是指木材細胞壁S2層中微纖絲方向與細胞主軸之間的夾角，或者可以理解為細胞壁中纖維素鏈的螺旋卷鎖與纖維軸之間的夾角。如圖7e所示，為轉(zhuǎn)基因植株PdEXT1、PdEXT2、PdEXT3及其對照植株的微纖絲角進行測定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者差異明顯。與對照株相比，轉(zhuǎn)基因植株的微纖絲角下降了12.48％-15.86％(sig＝0.001)。本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因植株的微纖絲角相比對照明顯下降，表明PdEXT轉(zhuǎn)基因植株的纖維彈性模量和強度增強，木材強度大，縱向收縮小，利用該原料制出理想紙品的潛力較大。

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。