本發(fā)明提供一種來(lái)源于綠海龜(C.mydas)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Cm-CATH2及其制備方法和在抗病原微生物感染、消炎等臨床藥物、化妝品、保健品、食品、飼料的添加劑等中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

Cathelicidin是一類多功能的抗菌肽，在哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、以及魚類中均發(fā)現(xiàn)其存在。自首次從牛中性粒白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Bac5后，越來(lái)越多的Cathelicidin抗菌肽得以鑒定。Cathelicidin通常以前體的形式合成，包括N端的大約30個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，保守的cathelin結(jié)構(gòu)域及C端高度特異的成熟肽區(qū)域，三個(gè)部分組成。Cathelicidin前體到達(dá)作用部位后，在水解酶的作用下迅速釋放cathelin結(jié)構(gòu)域和成熟肽，發(fā)揮抗菌、免疫調(diào)節(jié)的作用。大量的抗菌肽活性研究顯示，Cathelicidin是一種高效廣譜的抗菌類藥物，甚至對(duì)臨床上分離的高耐藥性細(xì)菌也具有良好的抑制效果，對(duì)許多致病菌殺害作用的速度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)抗生素的作用，因此被視為理想的設(shè)計(jì)新型抗生素的模板。除此之外，Cathelicidin還具有抗病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤癌等多種功能，而且絕大多數(shù)抗菌肽對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞無(wú)毒性作用；還具有對(duì)多種免疫細(xì)胞具有趨化作用、誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫粒和組織胺釋放、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)血管發(fā)生、誘導(dǎo)變異細(xì)胞系細(xì)胞凋亡和淋巴細(xì)胞活化等生物活性，因此Cathelicidin在醫(yī)藥、畜牧業(yè)、食品和化妝品等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

目前抗菌肽的應(yīng)用主要集中于醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)，并且取得了一些令人滿意的成果，已經(jīng)有許多新型藥物逐步邁入醫(yī)藥市場(chǎng)。比如，來(lái)自爪蟾抗菌肽Magainin的Pexiganan，由Genaera公司開發(fā)，目前以外用霜?jiǎng)┑男问接脕?lái)治療膿皰病和糖尿病患者足底潰爛等，已經(jīng)進(jìn)入臨床III期試驗(yàn)階段，它也是第一個(gè)進(jìn)行商業(yè)開發(fā)的抗菌肽；Daptomycin是一種陰離子抗菌肽，由Cubit Pharmaceuticals公司研發(fā)，2003年9月由美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市；來(lái)自豬白細(xì)胞的Iseganan，由Intrabiotics公司開發(fā)，用藥途徑是口服液或噴霧劑，用來(lái)治療抗腫瘤治療引發(fā)的口腔炎和囊腫性纖維化病人肺感染，目前也處于臨床III期試驗(yàn)階段；來(lái)自于牛的MBI-肽，由Micrologix生物技術(shù)公司，以外用乳膏的形式用來(lái)治療尿道相關(guān)的血流感染，處于III期臨床；來(lái)自人唾液的Histatin衍生肽，做成口腔洗劑，用來(lái)治療牙根炎和口腔感染(II-III期臨床)、口腔念珠菌感染(II期臨床)和慢性綠膿桿菌感染(I期臨床)?？梢姡咕脑卺t(yī)藥領(lǐng)域有著很好的應(yīng)用前景。

抗菌肽的應(yīng)用不局限于醫(yī)藥領(lǐng)域，動(dòng)物飼料、化妝品、保健品、食品等中也有很好的應(yīng)用?？股刈黠暳咸砑觿┑氖褂迷缫岩鹆藸?zhēng)議，世界衛(wèi)生組織發(fā)表公告指出“在牲畜養(yǎng)殖 過(guò)程中，停止以往慣用的飼料添加劑抗生素的做法，將在不危害動(dòng)物和農(nóng)民利益的前提下，可減少對(duì)人類健康的威脅”?？股刈鳛轱暳咸砑觿?yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)中，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展起了重要的作用，但是其在動(dòng)物體內(nèi)和動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留，以及病原菌產(chǎn)生的抗藥性問(wèn)題，對(duì)人類的健康和環(huán)境產(chǎn)生了負(fù)面的影響。美國(guó)的R&D報(bào)道，抗茵肽可作為飼料防霉劑；溫劉發(fā)等應(yīng)用含抗茵肽的柞蠶免疫血淋巴粉添加于斷奶仔豬飼料中，飼喂試驗(yàn)表明，柞蠶抗茵肽可減輕斷奶仔豬的腹瀉。他們又將抗茵肽的發(fā)酵制劑制作為飼料添加劑喂粵黃雞，研究表明該制劑可促進(jìn)小雞生長(zhǎng)和減少排泄物氮含量?？咕木哂袕V譜的抗菌作用，對(duì)畜禽具有促生長(zhǎng)和治療疾病的功能，是無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)殘留的綠色產(chǎn)品，其成分為易消化吸收的氨基酸，可作為畜禽飼料添加劑取代或部分取代飼喂動(dòng)物所用的抗生素，將會(huì)減少抗生素對(duì)動(dòng)物體的危害，避免抗生素殘留對(duì)人類的傷害。另外，化妝品、保健品、食品中會(huì)添加一些添加劑，比如防腐劑，抗氧化劑等，為了抑制食品微生物生長(zhǎng)和繁殖，延長(zhǎng)食品的保存時(shí)間，但是這些添加劑往往被擅自濫用，給人身體帶來(lái)巨大傷害，特別是有致癌的副作用，所以可以用抗菌肽替代防腐劑和抗氧化劑。

綠蠵龜(C.mydas)又名綠海龜，是各種海龜中體形較大的一種，和其他海龜一樣，除了上岸產(chǎn)卵外，終其一生都在大洋中渡過(guò)。它廣泛分布于熱帶及亞熱帶之海域，并產(chǎn)卵於溫度達(dá)25C以上的沙灘。覓食區(qū)多為海草豐富的淺水區(qū)，為草食性動(dòng)物，是海龜里唯一攝食較多海藻的種類。目前關(guān)于綠海龜cathelicidin宿主防御肽的研究和應(yīng)用還沒有報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種來(lái)源于綠海龜(C.mydas)的cathelicidin家族廣譜抗微生物肽Cm-CATH2及其編碼基因和制備方法，主要應(yīng)用于制備抗病原微生物感染、消炎等臨床藥物及在化妝品、保健品、食品、飼料中作為添加劑。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：

抗微生物肽Cm-CATH2的分離純化方法：

選取綠海龜脾臟組織，洗滌，勻漿，獲得脾臟組織蛋白粗提物。隨后，Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析，用自動(dòng)部分收集器收集3mL/管，220nm檢測(cè)并收集各峰檢測(cè)抗菌活性，凍干備用。然后經(jīng)反相高壓液相層析(RP-HPLC)進(jìn)行梯度洗脫，收集各多肽樣品峰，用滅菌去離子水溶解，檢測(cè)抗菌活性。最后對(duì)得到多肽樣品進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)的解析，包括采用電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(ESI-Q-TOF-MS,Biosystems/MDS Sciex多倫多，加拿大)測(cè)定分子量。利用等電聚焦電泳測(cè)定其等電點(diǎn)，用Edman降解法確定其多肽氨基酸序列組成。多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為：精氨酸-精氨酸-絲氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-苯丙 氨酸-賴氨酸-賴氨酸-纈氨酸-精氨酸-賴氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-纈氨酸-亮氨酸-精氨酸-組氨酸-絲氨酸-精氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甘氨酸-甘氨酸-精氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-苯丙氨酸。

綠海龜Cm-CATH2基因的克隆包括:

綠海龜肝臟總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫(kù)構(gòu)建，設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法篩選綠海龜抗菌肽Cm-CATH2基因。獲得陽(yáng)性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測(cè)定?；驕y(cè)序結(jié)果表明編碼抗微生物肽Cm-CATH2前體cathelicidin的基因由486個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為:

其中385到483位是編碼抗微生物肽Cm-CATH2的核苷酸序列，其編碼氨基酸序列為:精氨酸¹-精氨酸²-絲氨酸³-精氨酸⁴-苯丙氨酸⁵-甘氨酸⁶-精氨酸⁷-苯丙氨酸⁸-苯丙氨酸⁹-賴氨酸 ¹⁰-賴氨酸¹¹-纈氨酸¹²-精氨酸¹³-賴氨酸¹⁴-谷氨酰胺¹⁵-亮氨酸¹⁶-甘氨酸¹⁷-精氨酸¹⁸-纈氨酸¹⁹-亮氨酸²⁰-精氨酸²¹-組氨酸²²-絲氨酸²³-精氨酸²⁴-異亮氨酸²⁵-蘇氨酸²⁶-纈氨酸²⁷-甘氨酸²⁸-甘氨酸²⁹-精氨酸³⁰-甲硫氨酸³¹-精氨酸³²-苯丙氨酸³³。

抗微生物肽Cm-CATH2的合成，包括以下步驟：

(1)根據(jù)基因編碼的Cm-CATH2氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀合成其全序列；

(2)通過(guò)HPLC反相柱層析脫鹽純化，并確定其純度大于97％；

(3)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定其分子量；等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

所述抗微生物肽Cm-CATH2可應(yīng)用在制備抗病原微生物感染、消炎等臨床藥物及在化妝品、保健品、食品、飼料等的添加劑中。

本發(fā)明的有益效果在于：通過(guò)分離純化及Edman降解的方法確定其成熟肽氨基酸組成；通過(guò)基因克隆得到了編碼綠海龜cathelicidins抗微生物肽基因；再通過(guò)化學(xué)合成方法得到成熟 肽Cm-CATH2。該抗微生物肽富含堿性氨基酸，具有很強(qiáng)的廣譜抗菌活性，抗菌實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)多種臨床耐藥菌也有較好的殺滅作用。此外，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，不含有二硫鍵及環(huán)狀結(jié)構(gòu)，方便化學(xué)合成及基因工程制備；還具有低溶血、低細(xì)胞毒、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。故可替代抗生素制備抗病原微生物感染，消炎等臨床藥物，還可作為化妝品、保健品、食品、動(dòng)物飼料等中的添加劑，有很好的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合技術(shù)方案詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

實(shí)施例1 抗微生物肽Cm-CATH2的分離純化：

(1)從動(dòng)物園獲取瀕臨死亡的綠海龜新鮮完整脾臟組織，用生理鹽水少許洗滌脾臟組織表面。勻漿后，用少量生理鹽水溶解，按PS液與正丁醇1：50(V/V)比例，把PS與正丁醇在室溫下攪拌60min，13000r/min，20min離心兩次，然后將沉淀凍干。隨后，第一步Sephadex G-50凝膠過(guò)濾層析：0.9g凍干粉用10ml 0.1M磷酸鹽(Na2HPO4-NaH2PO4,pH 6.0)緩沖液溶解，12000rpm離心10min，取上清液上樣于已平衡好的Sephadex G-50凝膠排阻色譜柱(1.6cm x 90cm,Amersham Bioscience)，用同樣緩沖液洗脫，流速3mL/10min，用自動(dòng)部分收集器收集3mL/管，220nm檢測(cè)并收集各峰檢測(cè)抗菌活性，凍干備用。

(2)反相高壓液相層析(RP-HPLC)：將Sephadex G-50凝膠排阻色譜分離得到的活性成分的峰重新溶解于純水中，4℃，12000rpm離心15min，取上清液，用0.45μm濾膜過(guò)濾，收集濾液上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(Hypersil BDS C18,30cm x 0.46cm)用乙腈(含1‰三氟乙酸)構(gòu)成的洗脫系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫,215nm檢測(cè)多肽濃度。收集得到的各峰，凍干濃縮，用滅菌的去離子水重新溶解并進(jìn)行抗菌活性檢測(cè)。

(3)活性多肽一級(jí)結(jié)構(gòu)分析。純化的Cm-CATH2采用電噴霧四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(ESI-Q-TOF-MS,Biosystems/MDS Sciex多倫多，加拿大)測(cè)定分子量。利用等電聚焦電泳測(cè)定其等電點(diǎn)，用Edman降解法確定了其氨基酸序列組成為Cm-CATH2：RRSRFGRFFKKVRKQLGRVLRHSRITVGGRMRF。

實(shí)施例2 Cm-CATH2前體基因的克隆及基因測(cè)序

第一步、綠海龜肝臟總RNA提取(以下實(shí)驗(yàn)所用器具和試劑均經(jīng)過(guò)處理，無(wú)RNase)：

A.從新鮮宰殺的綠海龜各種新鮮組織上分別剪下1g左右的小塊，分別放入液氮預(yù)冷的細(xì)胞凍存管中，然后迅速放入液氮中保存；

B.將保存在液氮中的組織材料取出，放入預(yù)冷的研缽內(nèi)，迅速充分研磨，期間不斷向研缽內(nèi)加入少許液氮；將大約30mg的組織粉末轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5ml離心管中，向其中分別 加入400μl Buffer R-I(裂解液，RNA Miniprep Kit提供)，用21-25號(hào)針頭的注射器反復(fù)抽吸8-10次，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，加入150μl Buffer R-П，渦旋振蕩15-30s，4℃,12000rpm離心5min；

C.將離心后的上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入250ul異丙醇，迅速吸打混勻；將混合液分別轉(zhuǎn)移至離心吸附柱，室溫，6000rpm離心1min；棄廢液，然后加入500μl Buffer W1A，4℃,12000rpm離心1min；棄廢液，加入700μl BufferW2A,4℃,12000rpm離心1min；棄廢液，加入700μl Buffer W2A,4℃,12000rpm離心1min；棄廢液,空管12000rpm離心1min；將離心吸附柱轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，然后直接向吸附膜上滴加70-100μl Buffer TE，室溫放置1min，12000rpm離心1min洗脫得到總RNA；

第二步、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

第一鏈的合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：

A.在新的0.2ml PCR管(無(wú)DNase和RNase)中配制下列混合液：

混合均勻，短暫離心；PCR儀中72℃保溫5min后，然后42℃2min；短暫離心后，在上述管中配制如下反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：

混合均勻后，短暫離心；在PCR儀中完成以下程序：

42℃，90min；68℃，10min；4℃，保存。cDNA保存于-80℃。

第二鏈的合成：

第三步、采用半巢式PCR進(jìn)行綠海龜cathelicidin的基因克隆篩選

引物使用前先12000rpm離心5min,然后根據(jù)標(biāo)明的摩爾數(shù)加入相應(yīng)體積的ddH₂O溶解至20μM的濃度。以合成的肝臟cDNA為模板，以P1和In-Fusion SMARTer CDS為引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增。在0.2ml PCR管中加入下列試劑(總體積20μl)：

混勻后，短暫離心。PCR條件為：94℃變性5min；25個(gè)循環(huán)：94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5μl產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

取上步PCR產(chǎn)物1μl加入99μl ddH₂O稀釋100倍作為模板，以P2和CDSⅢ為引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增。在0.2ml PCR管中先后加入下列試劑(總體積20μl)：

PCR條件為：94℃變性5min；25個(gè)循環(huán)：94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取5μl，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶。

擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收的目的DNA片段與測(cè)序載體pMD19-T Vecter連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)CaCl₂-MgCl₂法制備好的DH5α感受態(tài)細(xì)胞。取100μl轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在含有100μlg/ml氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)基平板上；表面晾干后，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落用M13引物PCR檢測(cè)插入片段大小。挑取陽(yáng)性菌落，搖菌提取質(zhì)粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377進(jìn)行核苷酸測(cè)序。

第四步、綠海龜cathelicidin的基因序列測(cè)定和結(jié)果：

編碼綠海龜cathelicidin抗微生物肽Cm-CATH2為第385到483位核苷酸，其氨基酸序列為：精氨酸¹-精氨酸²-絲氨酸³-精氨酸⁴-苯丙氨酸⁵-甘氨酸⁶-精氨酸⁷-苯丙氨酸⁸-苯丙氨酸⁹-賴氨酸¹⁰-賴氨酸¹¹-纈氨酸¹²-精氨酸¹³-賴氨酸¹⁴-谷氨酰胺¹⁵-亮氨酸¹⁶-甘氨酸¹⁷-精氨酸¹⁸-纈氨酸¹⁹-亮氨酸²⁰-精氨酸²¹-組氨酸²²-絲氨酸²³-精氨酸²⁴-異亮氨酸²⁵-蘇氨酸²⁶-纈氨酸²⁷-甘氨酸²⁸-甘氨酸²⁹-精氨酸³⁰-甲硫氨酸³¹-精氨酸³²-苯丙氨酸³³。

實(shí)施例3 Cm-CATH2的化學(xué)合成方法：

(1)根據(jù)編碼綠海龜cathelicidin基因推斷的成熟肽Cm-CATH2氨基酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(Applied Biosystems)合成其全序列。

(2)通過(guò)HPLC反相C₁₈柱層析對(duì)合成多肽進(jìn)行脫鹽純化：過(guò)程中使用柱子是4.6×250nm，Venusil XBP-C4；溶劑A是0.1％trifluoroacetic溶于100％乙腈，溶劑B是0.1％trifluoroacetic溶于100％水；梯度設(shè)為：0.01min(A 15％，B 85％)，25min(A40％,B 60％)，25.1min(A 100％，B 0％)，30min(stop)；流速為1.0ml/min，波長(zhǎng)為220nm，體積為5μl，結(jié)果測(cè)得合成的多肽序列純度大于97％。

(3)分子量測(cè)定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)：首先將Cm-CATH2樣品分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，然后用激光照射晶體，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下飛過(guò)真空的飛行管，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即通過(guò)離子的質(zhì)量電荷之比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比來(lái)分析離子，并測(cè)得樣品分子的分子量，得到Cm-CATH2樣品的分子量是4089.97Da。

(4)等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)：配膠：膠液組成為載體兩性電解質(zhì)，凝膠貯液，蒸餾水，混合樣品，染色物質(zhì)等，灌膠，加電極液，電泳，樣品收集進(jìn)行檢測(cè)，得到Cm-CATH2等電點(diǎn)。

(5)用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。合成的Cm-CATH2抗菌肽可以溶于滅菌超純水或PBS，用于藥理活性檢測(cè)。

實(shí)施例4 綠海龜抗微生物肽Cm-CATH2的藥理實(shí)驗(yàn)：

(1)Cm-CATH2抗菌活性檢測(cè)：

將化學(xué)合成的CM-CATH2以2mg/ml的濃度溶解在無(wú)菌超純水中；用接種環(huán)挑取新活化的微生物，然后均勻涂布在新的LB瓊脂板上；將直徑0.5cm的圓形無(wú)菌濾紙片放在上述瓊脂板上，然后向紙片上滴加10μl CM-CATH2樣品溶液；放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h；觀察抑菌圈形成與否，將對(duì)Cm-CATH2敏感的菌株記錄下來(lái)。

(2)Cm-CATH2對(duì)敏感菌株最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的測(cè)定

該實(shí)驗(yàn)以無(wú)菌液體LB作陰性對(duì)照，最小抑菌濃度的定義為肉眼可以觀察到的完全抑制微生物生長(zhǎng)的最低多肽濃度，或者是光吸收值不高于陰性對(duì)照5％的最低濃度。挑取新活化的微生物，接種至無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基，37℃恒溫振蕩器中200rpm培養(yǎng)10-16h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；用紫外分光光度計(jì)測(cè)菌液600nm光波處的吸光值，吸光值為1時(shí)，濃度大約為10⁹cfu/ml，將菌液用無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基稀釋至10⁶cfu/ml，冰上待用；在96微孔板上配制濃度梯度為100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.13μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、的經(jīng)0.22μm孔徑膜過(guò)濾的Cm-CATH2樣品溶液(即24.4501、12.2250、6.1125、3.0563、1.5281、0.7641、0.3820、0.1910μM)，每孔50μl；每孔加入50μl上述稀釋菌液，充分混勻后，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-16h；使用酶標(biāo)儀測(cè)600nm吸光值或肉眼觀察；上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1.Cm-CATH2的最小抑菌濃度(MIC)

*MIC：最小抑菌濃度，濃度值為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值；ND：2mg/ml劑量紙片抑菌試驗(yàn)無(wú)明顯活性；IS：臨床分離菌株。以上結(jié)果為三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值。

由表1可見，Cm-CATH2對(duì)測(cè)試的微生物具有廣譜的抗菌活性，特別是對(duì)幾種常見病原菌株大腸桿菌，痢疾桿菌，金黃色葡糖球菌等。在40種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的菌株(包括標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離的耐藥菌株)中，Cm-CATH2對(duì)絕大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗菌活性，其中對(duì)大腸桿菌和痢疾桿菌抗性最強(qiáng)，MIC值僅為1.1462μM；革蘭氏陽(yáng)性菌中，對(duì)金黃色葡萄球菌和屎腸球菌最為敏感，最小抑菌濃度分別為1.1462μM和0.5731μM。還對(duì)部分真菌也有很強(qiáng)的抗菌活性。Cm-CATH2對(duì)臨床分離耐藥細(xì)菌具有極強(qiáng)的活性，如銅綠假單孢桿菌、大腸桿菌等。在微生物耐藥性日益嚴(yán)重的今天，Cm-CATH2對(duì)耐藥菌極強(qiáng)的抗菌活性及其獨(dú)特的殺菌機(jī)制，使其成為新型抗生素藥物開發(fā)的優(yōu)良模板。

(3)Cm-CATH2對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)：

大腸桿菌ATCC25922接種到LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出。用接種環(huán)挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。用新 鮮的LB液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×10⁶CFU/ml，將樣品加入稀釋好的菌液中，使其終濃度為5×MIC(陰性對(duì)照加入相應(yīng)體積的滅菌超純水)。加入樣品的菌液迅速放入37℃振蕩培養(yǎng)箱中，150rpm振蕩培養(yǎng)，分別于0min、5min、10min、20min、30min、45min、60min、90min、120min取10μl菌液用滅菌的生理鹽水稀釋1×10³倍，取50μl涂布LB固體平板。平板放入37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16h，菌落計(jì)數(shù)。

表2.Cm-CATH2對(duì)大腸桿菌的殺菌動(dòng)力學(xué)

由表2可知，Cm-CATH2平均在20分鐘左右就能夠殺死全部大腸桿菌ATCC25922細(xì)胞，而陽(yáng)性對(duì)照美羅培南需要90多分鐘才能全部殺死大腸桿菌ATCC25922，結(jié)果證明了Cm-CATH2不僅有很強(qiáng)的殺菌活性，并且其殺菌速度也要遠(yuǎn)超過(guò)抗生素藥物美羅培南；不僅如此，Cm-CATH2對(duì)細(xì)菌的作用是致死性的，大腸桿菌經(jīng)Cm-CATH2作用后全部死亡，2h后無(wú)細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)，顯示了Cm-CATH2的良好和持久的殺菌作用。