本發(fā)明涉及一種利用睪酮酯的酶促水解來制備睪酮的方法。

背景技術(shù)：

式(I)的睪酮：

也被稱為(17β)-17-羥基雄甾-4-烯-3-酮，是一種甾體化合物，一種已知的人類激素，并且是一種主要用于制藥目的的活性成分。

眾所周知，為了水解酯類化合物，可以成功地使用堿性介質(zhì)，特別是氫氧化鈉水溶液是一種常用試劑。因此，專業(yè)技術(shù)人員公知，為了制備睪酮，可以使用苛性鈉水溶液通過將睪酮酯水解成睪酮進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

然而，使用苛性鈉水溶液將睪酮酯轉(zhuǎn)化成睪酮的實(shí)驗(yàn)性嘗試提供了具有大量的幾種未知雜質(zhì)的睪酮，所述雜質(zhì)通過例如重結(jié)晶程序非常難以從產(chǎn)物中消除。

已經(jīng)公開了幾種用于制備睪酮的其他方法，特別是，這些方法中的一些描述了利用酶促水解進(jìn)行所述甾體化合物的轉(zhuǎn)化。

具體來說，Tetrahedron Letters,28(52),6549-6552,1987公開了一種通過在有機(jī)溶劑中的酶促轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)將甾體化合物的酯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的醇、即甾體化合物的過程。在對(duì)大量水解酶類進(jìn)行初篩之后，所述酶促轉(zhuǎn)化揭示，來自于柱狀假絲酵母(Candida cylyndracea)的脂肪酶被發(fā)現(xiàn)是在有機(jī)溶劑中水解甾體化合物與辛醇的酯的最好的催化劑。一些反應(yīng)的結(jié)果示出在所述文章的第6551-6552頁的表中，特別是使用所述脂肪酶催化劑試驗(yàn)了睪酮酯底物(參見條目9和10)。結(jié)果顯示了所述來自于柱狀假絲酵母(Candida cylyndracea)的脂肪酶不產(chǎn)生任何睪酮乙酸酯向睪酮的轉(zhuǎn)化，以及對(duì)睪酮丙酸酯進(jìn)行的相同反應(yīng)僅提供12％的轉(zhuǎn)化。此外，這個(gè)酶反應(yīng)在有機(jī)溶解中，使用大量酶和少量底物進(jìn)行。

出版物Steroids,62,482-486,1997公開了一種睪酮衍生物、即7β-羥基睪酮(9)的直接立體選擇性合成，所述合成通過酶促氧化和隨后的酶促水解來進(jìn)行。具體來說，所述方法描述了使用豬脂肪酶從酯中間體獲得化合物(9)。這種使用所述來自于豬胰的脂肪酶的酶促水解產(chǎn)生7β,17β-二羥基-4-雄甾烯-3-酮17-辛酸酯(8)向7β-羥基睪酮(9)的轉(zhuǎn)化?；衔?9)的H-NMR譜圖顯示不存在酯基，同時(shí)所述轉(zhuǎn)化產(chǎn)生75％的得率，但是產(chǎn)物需要通過快速柱層析進(jìn)行純化，因此所述方法不適合于大生產(chǎn)。此外，觀察到通過這種酶促水解獲得的產(chǎn)物是化合物(9)，其是7β-羥基睪酮，即與睪酮相比不同的化合物。

最后，Acta Chemica Scandinavica 27,1240-1248,1973公開了通過薄青霉(Penicillium lilacinum)NRRL 895的無細(xì)胞制備物進(jìn)行的甾體化合物轉(zhuǎn)化；所述薄青霉顯示出含有可誘導(dǎo)的甾體化合物酯酶活性。該文章描述了真菌薄青霉(Penicillium lilacinum)的甾體化合物轉(zhuǎn)化能力，所述能力在幾種甾體化合物、特別是睪酮及其酯上進(jìn)行了試驗(yàn)。

在所述特定情況下，在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中，睪酮乙酸酯被容易地水解成睪酮，轉(zhuǎn)化率為80.3％和83.8％(參見第1246頁)；然而，在其他睪酮酯如睪酮丙酸酯上使用來自于所述無細(xì)胞制備物的這種酯酶，僅提供部分水解，而睪酮庚酸酯、苯甲酸酯和半琥珀酸酯不受影響。此外，應(yīng)該考慮到這些結(jié)果，特別是睪酮乙酸酯向睪酮的轉(zhuǎn)化的結(jié)果，是在非常低的底物濃度下獲得的，不適合于商業(yè)化和/或工業(yè)生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明應(yīng)對(duì)的問題是提供一種用于制備睪酮的改進(jìn)的方法，所述方法特別是允許睪酮酯向睪酮的高水平轉(zhuǎn)化和/或提供具有高化學(xué)純度的睪酮。

這一問題通過在權(quán)利要求書中描述的用于制備睪酮的方法得以解決，所述權(quán)利要求書的定義是本說明書的有機(jī)組成部分。

具體來說，本發(fā)明提供了一種利用式(II)的睪酮酯的酶促水解來生產(chǎn)活性成分睪酮的方法：

其中R是C1-C9直鏈或支鏈烷基，或者是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基。

優(yōu)選地，所述酶促水解通過作為來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶的脂肪酶51032或通過來自于南極假絲酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶來進(jìn)行。

另一方面，本發(fā)明提供了純的形式的脂肪酶在式(II)的化合物的酶促水解中的用途，具體來說，其中所述脂肪酶是來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或來自于南極假絲酵母A(Candida antarctica)A的脂肪酶。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種用于制備式(III)的睪酮酯的方法：

其中R是C1-C9直鏈或支鏈烷基，或者是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基，所述方法是基于本發(fā)明的使用本發(fā)明的酶進(jìn)行酶促水解的同一概念。

生產(chǎn)睪酮的幾種已知的合成途徑之一是水解睪酮酯，特別是在堿性條件下。

然而，這種反應(yīng)產(chǎn)生許多難以通過例如重結(jié)晶消除的雜質(zhì)，此外這些雜質(zhì)中的一些以較大的量、特別是高于0.10％的量殘留，這在制藥活性物質(zhì)例如睪酮中是不可接受的。

考慮到所述結(jié)果，考慮了一種不同且改進(jìn)的合成以便從睪酮酯開始生產(chǎn)睪酮并生產(chǎn)具有高化學(xué)純度的睪酮。

因此，本發(fā)明的目的是一種用于制備式(I)的睪酮的改進(jìn)的方法：

所述方法通過式(II)的睪酮酯的酶促水解來進(jìn)行：

其中R是C1-C9直鏈或支鏈烷基，或者是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基，所述方法的特征在于所述酶是來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或來自于南極假絲酵母A(Candida antarctica A)的脂肪酶。

事實(shí)上，已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，特定種類的酶，即來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或來自于南極假絲酵母A(Candida antarctica A)A的脂肪酶，產(chǎn)生所述酯的完全水解，并在同時(shí)提供具有非常高的化學(xué)純度的睪酮，這是因?yàn)樗龇磻?yīng)是極端區(qū)域選擇性的，在17位中不對(duì)稱碳的光學(xué)構(gòu)型被完全保留，并且引人注目的是在所述過程中沒有其他雜質(zhì)形成。由于在式(II)的睪酮酯向睪酮的轉(zhuǎn)化期間不形成其他雜質(zhì)，因此睪酮的化學(xué)純度反映了起始的睪酮酯的化學(xué)純度。因此，如果起始的睪酮酯具有高的化學(xué)純度，則本發(fā)明的方法也提供具有高化學(xué)純度的睪酮。換句話說，所述方法是極端區(qū)域特異性和高效的，使得睪酮酯只被轉(zhuǎn)變成睪酮而不轉(zhuǎn)變成其他雜質(zhì)化合物。

本發(fā)明的式(II)的睪酮酯的酶促水解的方法通常在水性緩沖介質(zhì)中進(jìn)行。具體來說，它在其中緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑的水性緩沖介質(zhì)中進(jìn)行。更具體來說，所述水性緩沖介質(zhì)由磷酸鹽緩沖劑制成，并具有6至11之間的pH。

在所述式(II)的化合物中，R是C1-C9直鏈或支鏈烷基，或者是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基。

在所述式(II)的化合物中，R是C1-C9直鏈或支鏈烷基，其選自甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、正己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、3,3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、3-乙基丁基、1,1-二乙基乙基、1-丙基丙基等。

在所述式(II)的化合物中，R也可以是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基，其選自環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基、環(huán)丙基甲基、環(huán)丙基乙基、環(huán)丙基丙基、3-環(huán)戊基乙基等。

所述酶是來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，即源自于米曲霉(Aspergillus oryzae)微生物的脂肪酶。所述酶是可商購的，例如從Sigma-Aldrich Inc.(USA)在商品編號(hào)62285下購買。

所述酶，即來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，也可以是源自于遺傳修飾的米曲霉(Aspergillus oryzae)微生物的脂肪酶。

優(yōu)選地，所述酶是工程改造過的蛋白質(zhì)，其通過遺傳工程改造的米曲霉(Aspergillus oryzae)微生物的深層發(fā)酵來生產(chǎn)，然后從所述生產(chǎn)生物體分離并純化。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶是51032，一種由Novozymes A/S(Denmark)提供的酶。

所述51032被用于水解甘油三酯和聚乙酸乙烯酯。

本發(fā)明的方法的酶是來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶，所述脂肪酶也可以從不同生物體例如從米曲霉(Aspergillus oryzae)產(chǎn)生。

本發(fā)明的方法的酶是來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶，其中編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遺傳修飾或者未被遺傳修飾。

編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列意味著在微生物特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)內(nèi)部存在特定DNA序列，正如專業(yè)技術(shù)人員公知的，所述由含氮堿基構(gòu)成的序列編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。具體來說，在本發(fā)明中，特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的DNA序列含有信息，特別是特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的DNA內(nèi)部的含氮堿基的信息，并且這些信息編碼所述酶、即特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的氨基酸序列。

編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遺傳修飾或者未被遺傳修飾，這意味著在第一種情況下，特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的置換。具體來說，特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的許多變體已在某些文獻(xiàn)中被公開，例如US 5,827,719、WO 00/34450、WO 01/95502、WO 2015/085920。

未被遺傳修飾意味著特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶不包含氨基酸殘基的置換，因此編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的特定DNA序列是野生型的。具體來說，來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶的氨基酸序列已發(fā)表在US 5,827,719中。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶由宿主細(xì)胞產(chǎn)生，其中所述宿主細(xì)胞是米曲霉(Aspergillus oryzae)。優(yōu)選地，所述脂肪酶的生產(chǎn)生物體是米曲霉(Aspergillus oryzae)，并且供體生物體是特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)，更優(yōu)選地重組形式的特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶由米曲霉(Aspergillus oryzae)生產(chǎn)。

重組生產(chǎn)意味著被稱為宿主的生產(chǎn)生物體在屬于另一種供體生物體的編碼酶或其他蛋白質(zhì)的DNA序列的基礎(chǔ)上，生產(chǎn)所述酶或所述其他蛋白質(zhì)。

宿主細(xì)胞是指易于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或包含DNA構(gòu)建物或表達(dá)載體的任何細(xì)胞類型，所述構(gòu)建物或表達(dá)載體帶有編碼本發(fā)明的酶、即特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列。

所述宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞或其他微生物細(xì)胞。

細(xì)菌的實(shí)例是革蘭氏陽性細(xì)菌例如遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、燦爛芽孢桿菌(Bacillus lautus)，或革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸埃希氏桿菌(E.coli)。

絲狀真菌的實(shí)例是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)或尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，并且用于生產(chǎn)所述宿主細(xì)胞、特別是真菌宿主的方法，公開在WO 97/35956中。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法中，所述宿主細(xì)胞是米曲霉(Aspergillus oryzae)。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶是51032，其中編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遺傳修飾。

根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方式，所述來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶是51032，其中編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遺傳修飾，并且它由米曲霉(Aspergillus oryzae)生產(chǎn)。

51032是一種具有15KLU/g的較低活性的脂肪酶。所述酶的顏色為黃色至淺棕色，并且采取液體形式。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶是角質(zhì)酶。

角質(zhì)酶意味著特定的一類脂肪酶，或者更好地說是一種具有角質(zhì)酶活性的脂分解酶，即能夠水解底物角質(zhì)素，或者更好地說催化下述反應(yīng)：本發(fā)明的角質(zhì)酶是能夠?qū)⑹?II)的睪酮酯水解成睪酮(I)的酶。

本發(fā)明的優(yōu)選的角質(zhì)酶由特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)編碼，其中編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶、或更好地說是特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)角質(zhì)酶的DNA序列，被遺傳修飾或未被遺傳修飾。此外，所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)角質(zhì)酶優(yōu)選地由米曲霉(Aspergillus oryzae)生產(chǎn)。

因此，51032是一種來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的角質(zhì)酶，即特定的一種脂肪酶，其中編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)角質(zhì)酶的DNA序列被遺傳修飾。具體來說，所述51032在宿主細(xì)胞、即米曲霉(Aspergillus oryzae)中生產(chǎn)，即最后一種真菌包含編碼本發(fā)明的酶、即特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)角質(zhì)酶的DNA構(gòu)建物或表達(dá)載體。隨后，將所述酶從生產(chǎn)生物體即米曲霉(Aspergillus oryzae)分離并純化，并因此生產(chǎn)51032。

具體來說，在本發(fā)明中，將上面提到的51032用于式(II)的睪酮酯向睪酮(I)的水解。

用于本發(fā)明的方法的酶也可以是來自于南極假絲酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶，也被稱為來自于南極假絲酵母(Candida antarctica)的脂肪酶A或南極假絲酵母(Candida antarctica)脂肪酶A或CalA，其是一種公知的酶，目前可以在市場(chǎng)上獲得，例如從Codexis Inc.()Redwood City,CA 94063,United States)獲得。

無論使用何種酶，下列實(shí)施方式描述了本發(fā)明的各種不同情況。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，在所述式(II)的睪酮酯中，R是C1-C6直鏈或支鏈烷基或者是C7支鏈環(huán)烷基。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，在所述式(II)的睪酮酯中，R是甲基、乙基、3-環(huán)戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基。

其中R是甲基的式(II)的睪酮酯具有下列結(jié)構(gòu)：

并且也被稱為睪酮乙酸酯。

其中R是乙基的式(II)的睪酮酯具有下列結(jié)構(gòu)：

并且也被稱為睪酮丙酸酯。

其中R是3-環(huán)戊基乙基的式(II)的睪酮酯具有下列結(jié)構(gòu)：

并且也被稱為睪酮環(huán)戊丙酸丙酸酯。

其中R是2-甲基丁基的式(II)的睪酮酯具有下列結(jié)構(gòu)：

并且也被稱為睪酮異己酸酯。

其中R是正己基的式(II)的睪酮酯具有下列結(jié)構(gòu)：

并且也被稱為睪酮庚酸酯。

其中R是正壬基的式(II)的睪酮酯具有下列結(jié)構(gòu)：

并且也被稱為睪酮癸酸酯。

其中R是乙基、3-環(huán)戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基的式(II)的睪酮酯是目前在市場(chǎng)上銷售的具有藥理活性的物質(zhì)。

根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方式，在所述式(II)的睪酮酯中，R是甲基或乙基，因?yàn)樗鼈兲峁└玫霓D(zhuǎn)化，其中乙基是最好的，因?yàn)樗诒景l(fā)明的方法中提供最好的轉(zhuǎn)化。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，用于執(zhí)行式(II)的睪酮酯的酶促水解的酶的量相對(duì)于每克式(II)的化合物為0.1至0.6克。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，使用的緩沖溶液的體積與所述式(II)的化合物相比在約10至約40體積之間。

體積意味著酶質(zhì)量單位的溶劑體積，即1體積對(duì)應(yīng)于例如1ml/1g或1升/1Kg或1微升/1mg等。

“緩沖液體積”或“緩沖溶液的體積”是指參照所使用的底物的量，緩沖溶液的以體積計(jì)的量。因此，所述定義不是絕對(duì)度量，而是如上對(duì)體積的意義所描述的或者如實(shí)施例5中示例的，是相對(duì)度量。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述方法在約35℃至約70℃之間、更優(yōu)選地在65-70℃的溫度下進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述方法在約7.0至約10.0之間、更優(yōu)選地7.0至7.5之間的pH下進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述方法按照下列優(yōu)選條件中的任一種進(jìn)行：

-溫度為約70℃，并且pH為約7.0，或者

-溫度在約50℃至約70℃之間，并且pH在約7.0至約8.5之間，或者

-溫度為約35℃，pH在約7.0至約10.0之間，并且緩沖溶液的量為約10體積。

根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述方法按照下列優(yōu)選條件進(jìn)行：

-溫度為約70℃，pH為約7.0，和10體積的緩沖溶液。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，在所述式(II)的睪酮酯中，R是乙基。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，在所述式(II)的睪酮酯中，R是乙基，并且所述酶是51032。51032是上面已經(jīng)描述過的角質(zhì)酶。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，所述方法可以按照包括下列步驟的下述方法來進(jìn)行：

a)制備一定量的水解酶，

b)添加一定量的底物式(II)的睪酮酯，

c)用緩沖液稀釋所述制備物，

d)攪拌所述懸液，

e)獲得所述式(II)的化合物向式(I)的睪酮的轉(zhuǎn)化。

根據(jù)本發(fā)明的可選實(shí)施方式，所述方法可以按照上面描述的方法來進(jìn)行，其中步驟a)和步驟b)可以顛倒。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，式(II)的睪酮酯的制備：

其中R是C1-C9直鏈或支鏈烷基或者是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基，通過式(I)的睪酮的酯化來進(jìn)行：

睪酮(I)的酯化以提供睪酮酯(II)，可以按照有機(jī)合成領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)程序來進(jìn)行，其通常包括例如酰基鹵或與酸酐的直接反應(yīng)，優(yōu)選地在堿存在下。

根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，睪酮的酯化以提供睪酮酯，可以利用丙酸酐或丙酰氯來進(jìn)行。

根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，睪酮的酯化以提供睪酮酯，可以在堿、優(yōu)選為DMAP(二甲基氨基吡啶)、吡啶、三乙胺等存在下進(jìn)行。

根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方式，睪酮的酯化以提供睪酮酯，可以利用丙酸酐和DMAP來進(jìn)行。

在這種情況下，即當(dāng)所述方法還包括這個(gè)從睪酮(I)制備起始原料式(II)的睪酮酯的先前反應(yīng)時(shí)，所述整個(gè)方法可以被看做通過式(II)的睪酮酯的制備和純化來純化睪酮的過程。

本發(fā)明的另一方面是脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解以提供式(I)的睪酮的用途：

其中R是C1-C9直鏈或支鏈烷基，或者是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基，

其中所述脂肪酶是來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或者是來自于南極假絲酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶。

所述來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶是來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶，其中編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遺傳修飾或者未被遺傳修飾。具體來說，所述來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶也可以通過宿主細(xì)胞、優(yōu)選地米曲霉(Aspergillus oryzae)在中生產(chǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方式，優(yōu)選地使用來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，其是51032。

此外，優(yōu)選地使用51032這種來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶，其中編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遺傳修飾。所述51032在宿主細(xì)胞中、特別是通過米曲霉(Aspergillus oryzae)來生產(chǎn)。

本發(fā)明的51032這種來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶具體來說是角質(zhì)酶，正如上面在描述51032的段落中已經(jīng)描述過的。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，優(yōu)選地將脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，優(yōu)選地將來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶或來自于南極假絲酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，將作為51032的來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。

根據(jù)本發(fā)明的更優(yōu)選的實(shí)施方式，優(yōu)選地將來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶或來自于南極假絲酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)脂肪酶的DNA序列被遺傳修飾或未被遺傳修飾，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。

根據(jù)本發(fā)明的更特別優(yōu)選的實(shí)施方式，優(yōu)選地將作為51032的來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的脂肪酶用于式(II)的化合物的酶促水解，其中在所述式(II)的化合物中，R是乙基。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種制備式(III)的睪酮酯的方法：

其中R是C1-C9直鏈或支鏈烷基，或者是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基，

所述方法包括下列步驟：

a)上面描述的根據(jù)本發(fā)明的酶促方法制備式(I)的睪酮的方法；

b)式(I)的睪酮的酯化反應(yīng)：

以提供式(III)的睪酮酯。

式(III)的化合物的R的意義與上面為式(II)的化合物的R所給出的意義相同。

執(zhí)行步驟a)的條件和優(yōu)選實(shí)施方式已在上面描述過。

對(duì)于執(zhí)行步驟b)的條件和優(yōu)選實(shí)施方式來說，上面已在描述通過式(I)的睪酮的酯化制備式(II)的睪酮酯的段落中描述過：

這里描述的方法可以被看做通過睪酮的制備來純化式(II)的睪酮酯的方法。

這里描述的方法也可以被看做從不同的式(II)的睪酮酯開始，通過睪酮的制備來制備式(III)的睪酮酯的方法，正如在下面的反應(yīng)方案中所示例的：

例如，根據(jù)本發(fā)明的包括酶促水解步驟的方法，可以通過上述睪酮的制備將睪酮丙酸酯轉(zhuǎn)變成最終產(chǎn)物，其是睪酮丙酸酯或睪酮庚酸酯或睪酮癸酸酯或睪酮異己酸酯。

根據(jù)用于制備式(III)的睪酮酯的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，在所述式(III)的睪酮酯中，R是乙基、3-環(huán)戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基。

根據(jù)用于制備式(III)的睪酮酯的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，在執(zhí)行步驟a)的起始原料式(II)的睪酮酯中，R是甲基或乙基，優(yōu)選為乙基。

根據(jù)用于制備式(III)的睪酮酯的方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，在最終產(chǎn)品式(III)的睪酮酯中，R是乙基、3-環(huán)戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基，并且在用于執(zhí)行步驟a)的起始原料式(II)的睪酮酯中，R是乙基。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種用于制備式(III)的睪酮酯的方法：

其中R是C1-C9直鏈或支鏈烷基，或者是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基，所述方法包括下列步驟：

a)式(II)的睪酮酯的制備：

其中R是C1-C9直鏈或支鏈烷基，或者是C3-C9環(huán)烷基或支鏈環(huán)烷基，所述制備通過式(I)的睪酮的酯化來進(jìn)行：

b)按照上述本發(fā)明的酶學(xué)方法制備式(I)的睪酮；

c)式(I)的睪酮的酯化反應(yīng)：

以提供式(III)的睪酮酯，其中式(III)的化合物的R的意義與上面為式(II)的化合物的R所給出的相同。

執(zhí)行所有步驟的條件和優(yōu)選實(shí)施方式已在上面描述過。

這里描述的方法也可以看做從式(I)的睪酮開始制備式(III)的睪酮酯的方法，通過首先制備式(II)的睪酮酯，然后將它們轉(zhuǎn)變成式(I)的睪酮，最后將它轉(zhuǎn)變成式(III)的睪酮酯。

下面的反應(yīng)圖式示出了本發(fā)明的這種方法：

根據(jù)用于制備式(III)的睪酮酯的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，在所述終產(chǎn)物式(III)的睪酮酯中，R是乙基、3-環(huán)戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基。

根據(jù)用于制備式(III)的睪酮酯的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，在執(zhí)行步驟b)的中間體式(II)的睪酮酯中，R是甲基或乙基，更優(yōu)選為乙基。

根據(jù)用于制備式(III)的睪酮酯的方法的更優(yōu)選實(shí)施方式，在所述終產(chǎn)物式(III)的睪酮酯中，R是乙基、3-環(huán)戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基，并且在用于執(zhí)行步驟b)的中間體式(II)的睪酮酯中，R是乙基。

下面的反應(yīng)方案示出了本發(fā)明的這種方法的優(yōu)選實(shí)施方式：

其中在式(III)的化合物中，R是乙基、3-環(huán)戊基乙基、2-甲基丁基、正己基或正壬基。

正如前面描述的，本發(fā)明的方法的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是用于制備式(III)的睪酮酯的方法。具體來說，所述包括上面提到的程序的特定步驟的后一種方法，通過本發(fā)明的酶促水解來進(jìn)行，具體來說通過利用作為來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶(特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)角質(zhì)酶)或來自于南極假絲酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶的酶來進(jìn)行。此外，獲得的式(III)的睪酮酯具有高的化學(xué)純度，因?yàn)檎缭缧r(shí)候描述的，所述反應(yīng)是極端區(qū)域特異性的。

下面的實(shí)驗(yàn)給出了由本發(fā)明的酶提供的效果的證據(jù)，其在睪酮酯向睪酮的轉(zhuǎn)化率方面提供了強(qiáng)烈提高。

此外，由來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶、特別是作為51032的來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)脂肪酶或來自于南極假絲酵母A(Candida Antarctica A)的脂肪酶提供給酶促水解的效果，在從睪酮酯獲得的睪酮的較高化學(xué)純度方面是突出的，因?yàn)樵谶@個(gè)轉(zhuǎn)化中不產(chǎn)生雜質(zhì)，所述酶是極端區(qū)域選擇性的。

具體實(shí)施方式

實(shí)驗(yàn)步驟

起始原料睪酮是可商購的物質(zhì)。

睪酮酯、特別是睪酮乙酸酯和睪酮丙酸酯，可以通過將睪酮分別與乙酸酐或丙酸酐反應(yīng)來生產(chǎn)。睪酮庚酸酯和睪酮環(huán)戊丙酸丙酸酯可以通過將睪酮與相關(guān)酰基酸反應(yīng)來生產(chǎn)。

實(shí)施例1：通過式(II)的睪酮酯的化學(xué)水解來合成式(I)的睪酮–比較性試驗(yàn)

使用125ul NaOH溶液(30％)將100mg睪酮乙酸酯在3ml甲醇中水解。在室溫下攪拌溫育24h后，對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)估。使用睪酮環(huán)戊丙酸酯、睪酮庚酸酯、睪酮丙酸酯進(jìn)行類似的反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)(低于0.1％A/A％的反應(yīng)物)進(jìn)行的HPLC分析顯示，睪酮的化學(xué)純度在60至75％A/A％之間，其余為幾種未知雜質(zhì)(>0.1％)。

實(shí)施例2：通過式(II)的睪酮酯的酶促水解來合成式(I)的睪酮–重新進(jìn)行的現(xiàn)有技術(shù)實(shí)驗(yàn)(Tetrahedron Letters,28(52),6549-6552,1987，第6551頁的表的條目9和10)–使用柱狀假絲酵母(Candida cylindracia)(皺褶假絲酵母(C.rugosa))脂肪酶進(jìn)行的酶促水解

A)使用來自于皺褶假絲酵母(C.rugosa)的脂肪酶(30mg)(購自Sigma-Aldrich編號(hào)62316)，將100mg睪酮乙酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸鹽緩沖液中試驗(yàn)性水解。在室溫下攪拌溫育20h后，對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)估，并且睪酮(I)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到約1.7％。

B)進(jìn)行類似的試驗(yàn)，其中使用來自于皺褶假絲酵母(Candida rugosa)的脂肪酶(30mg)(購自Sigma-Aldrich編號(hào)62316)，將100mg睪酮丙酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸鹽緩沖液中試驗(yàn)性水解。在室溫下攪拌溫育20h后，對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)估，并且睪酮(I)的轉(zhuǎn)化率達(dá)到約9％。

這些結(jié)果大體上證實(shí)了使用現(xiàn)有技術(shù)的酶獲得的不良結(jié)果。

實(shí)施例3：通過式(II)的睪酮酯的酶促水解來合成式(I)的睪酮–按照本發(fā)明使用來自于南極假絲酵母A(Candida antarctica)A的脂肪酶(CalA)。

A)使用CalA(30mg)(購自Codexis Inc.)，將100mg睪酮庚酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸鹽緩沖液中水解。在室溫下攪拌溫育20h后，對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)估，并且轉(zhuǎn)化率達(dá)到約88％。

B)使用CalA(30mg)，將100mg睪酮丙酸酯在3ml的0.1M pH8磷酸鹽緩沖液中水解。在室溫下攪拌溫育20h后，對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)估，并且轉(zhuǎn)化率達(dá)到約82％。

實(shí)施例4：通過式(II)的睪酮酯的酶促水解來合成式(I)的睪酮–按照本發(fā)明使用來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，特別是51032。

51032是來自于特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)的角質(zhì)酶，其中編碼所述特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)角質(zhì)酶的DNA序列被遺傳修飾，并且所述角質(zhì)酶由米曲霉(Aspergillus oryzae)生產(chǎn)。

A)使用51032(1ml)(購自Novozymes)，將100mg睪酮庚酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸鹽緩沖液中水解。在室溫下攪拌溫育20h后，對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)估，并且轉(zhuǎn)化率達(dá)到約64％。

B)使用51032(1ml)，將100mg睪酮環(huán)戊丙酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸鹽緩沖液中水解。在室溫下攪拌溫育20h后，對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)估，并且轉(zhuǎn)化率達(dá)到約65％。

C)使用51032(1ml)，將100mg睪酮乙酸酯在3ml的0.1M pH 8磷酸鹽緩沖液中水解。在室溫下攪拌溫育20h后，對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)估，并且轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.13％。睪酮在溶液中并且在該轉(zhuǎn)化階段的HPLC純度為99.13％(HPLC A/A％)，其余為殘留的睪酮乙酸酯(僅僅0.87％)。

實(shí)施例5：通過式(II)的睪酮丙酸酯的酶促水解來合成式(I)的睪酮–按照本發(fā)明使用來自于米曲霉(Aspergillus oryzae)的脂肪酶，特別是51032。

使用51032(2.5ml)，將2500mg睪酮丙酸酯在0.1M pH 8磷酸鹽緩沖溶液中水解。在下面注明的條件下攪拌6、12、24、32h后，對(duì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行評(píng)估：

–溫度35-70℃

–pH 7.0-10.0

–稀釋度(即緩沖溶液的體積)10–40體積

下面的表概述了所述實(shí)驗(yàn)性試驗(yàn)的結(jié)果：

上表的最后一列清楚地顯示了本發(fā)明的效果。

實(shí)施例6：睪酮丙酸酯的合成

在1升4-RBF中裝入150g睪酮、450mL吡啶。

對(duì)所述懸液進(jìn)行攪拌直至完全溶解，然后加入7.5g硅藻土。

將反應(yīng)混合物在80℃加熱30分鐘，然后將混合物在硅藻土板上過濾并將濾餅用150mL吡啶洗滌。將該清洗液添加到先前過濾的溶液中。

將全部過濾溶液轉(zhuǎn)移到2升夾套反應(yīng)器中，然后在25℃下添加4.5g DMAP(4-二甲基氨基吡啶)。

在45分鐘內(nèi)，通過滴加添加91g丙酸酐。

在添加結(jié)束后，將溶液在25℃攪拌2小時(shí)，然后在25℃下在60分鐘內(nèi)添加1200mL脫礦質(zhì)水。將所述溶液在濾紙上過濾，并將濾餅用35℃的脫礦質(zhì)水洗滌。取出濾餅并將其在70℃、在真空下在烤箱中干燥。獲得166.5g睪酮丙酸酯。