本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及菌株及其構(gòu)建方法、應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前，甾體激素類藥物是僅次于抗生素的第二類藥物，在制備保健品、治療呼吸系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌失調(diào)、淋巴白血病、風(fēng)濕病以及皮膚病等方面被廣泛應(yīng)用。菜油甾醇(campesterol)作為甾體激素類藥物的重要中間體，可作為合成4AD、ADD、9α-OH-AD等重要甾體中間體和黃體酮、氫化可的松等重要甾體類藥物的前體，在醫(yī)藥合成領(lǐng)域有重大應(yīng)用。菜油甾醇的制備大多采用植物提取，但植物提取過程步驟多、收率低、副產(chǎn)物分離復(fù)雜，并且易對(duì)環(huán)境造成污染，極大的限制了菜油甾醇的生產(chǎn)和應(yīng)用。而微生物合成以低成本、高產(chǎn)量和產(chǎn)品安全性等被認(rèn)為是有前途的生產(chǎn)方法。釀酒酵母作為公認(rèn)的安全模式微生物，遺傳背景清楚、基因操作簡(jiǎn)單、可進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。而耶氏解脂酵母是非常規(guī)酵母的一種，被認(rèn)為是安全的，能用于藥物和食品生產(chǎn)上。其適用于高密度發(fā)酵，異源蛋白表達(dá)量高，并且能夠利用普通碳水化合物、油脂類、烷烴類物質(zhì)為底物使之更適應(yīng)工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。菜油甾醇在酵母細(xì)胞中的合成，需要將其內(nèi)源生產(chǎn)麥角固醇的路徑截?cái)?，同時(shí)引入外源基因進(jìn)而獲得菜油甾醇。但是目前獲得的重組菌株搖瓶發(fā)酵菜油甾醇的含量較低，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供菌株及其構(gòu)建方法、應(yīng)用。重組釀酒酵母及耶氏解脂酵母兩種酵母底盤菌株生產(chǎn)菜油甾醇的方法相對(duì)于植物提取成本低、副產(chǎn)物少且污染小，為菜油甾醇的工業(yè)生產(chǎn)提供了一種切實(shí)可行的方法為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了高產(chǎn)菜油甾醇的菌株，在底盤菌株中導(dǎo)入外源功能基因DHCR7。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述外源功能基因包括斑馬魚(Daniorerio)來源的DHCR7基因或衣原體(WaddliachondrophilaWSU86-1044)來源的DHCR7基因。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述斑馬魚(Daniorerio)來源的DHCR7基因的序列如SEQIDNo.1所示。在本發(fā)明的另一些具體實(shí)施方案中，所述衣原體(WaddliachondrophilaWSU86-1044)來源的DHCR7基因的序列如SEQIDNo.2所示。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述底盤菌株為酵母。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述酵母包括釀酒酵母或耶氏解脂酵母。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述釀酒酵母為釀酒酵母CEN.PK2-1，所述耶氏解脂酵母為耶氏解脂酵母ATCC201249。在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述菌株的構(gòu)建方法為：以釀酒酵母CEN.PK2-1為底盤菌株，利用CRISPR技術(shù)敲除內(nèi)源ERG5基因，將所述外源功能基因整合至釀酒酵母底盤菌基因組。在本發(fā)明的另一些具體實(shí)施方案中，所述菌株的構(gòu)建方法為：以耶氏解脂酵母ATCC201249為底盤菌株，在不敲除ERG5的基礎(chǔ)上，利用整合型質(zhì)粒pYLEX1在底盤菌基因組上整合所述外源功能基因。本發(fā)明還提供了所述的菌株在發(fā)酵生產(chǎn)菜油甾醇中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了所述的菌株的構(gòu)建方法，以釀酒酵母CEN.PK2-1為底盤菌株，利用CRISPR技術(shù)敲除內(nèi)源ERG5基因，將所述外源功能基因整合至釀酒酵母底盤菌基因組。本發(fā)明還提供了所述的菌株的構(gòu)建方法，以耶氏解脂酵母ATCC201249為底盤菌株，在不敲除ERG5的基礎(chǔ)上，利用整合型質(zhì)粒pYLEX1在底盤菌基因組上整合所述外源功能基因。本發(fā)明還提供了發(fā)酵生產(chǎn)菜油甾醇的方法，以所述的菌株接種、發(fā)酵，收集菌液，提取獲得菜油甾醇。發(fā)酵方法：將本發(fā)明提供的菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027接種于2mL一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)24h，以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)12h，再以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中的菌體密度(OD600)，發(fā)酵72小時(shí)結(jié)束，取全部菌液提取菜油甾醇。菜油甾醇提取方法：取42mL發(fā)酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次。用液氮冷凍細(xì)胞并在研缽中研磨，直到細(xì)胞被研磨成白色極細(xì)粉末，轉(zhuǎn)移至新10mL離心管中，加入2mL甲醇配制的1.5MKOH，60℃水浴皂化反應(yīng)過夜。皂化后加入2mL分析純正己烷渦旋震蕩10min對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行萃取，5000rpm離心10min收集有機(jī)相真空冷凍干燥2小時(shí)，加入400μL正己烷溶解再次冷凍干燥4小時(shí)，加入400μL色譜甲醇溶解，用2μm有機(jī)濾膜過濾后使用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)菜油甾醇含量，流動(dòng)相為乙腈：異丙醇＝3:1，流速為1mL/min，檢測(cè)波長205nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μL?；?qū)⒈景l(fā)明提供的菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008接種于5mL一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)24h，以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)18h，再以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中的菌體密度(OD600)，發(fā)酵144小時(shí)結(jié)束，取10mL菌液提取菜油甾醇。菜油甾醇提取方法：取10mL發(fā)酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次。用液氮冷凍細(xì)胞并在研缽中研磨，直到細(xì)胞被研磨成白色極細(xì)粉末，轉(zhuǎn)移至新10mL離心管中，加入2mL甲醇配制的1.5MKOH，60℃水浴皂化反應(yīng)過夜。皂化后加入2mL分析純正己烷渦旋震蕩10min對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行萃取，5000rpm離心10min收集有機(jī)相真空冷凍干燥2小時(shí)，加入400μL正己烷溶解再次冷凍干燥4小時(shí)，加入400μL衍生化試劑N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)30℃水浴2小時(shí)，用2μm有機(jī)濾膜過濾后利用GC-TOF/MS檢測(cè)菜油甾醇含量。本發(fā)明提供了高產(chǎn)菜油甾醇的菌株，在底盤菌株中導(dǎo)入外源功能基因DHCR7。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵72小時(shí)，Sc_Dr_DHCR7的產(chǎn)量最高，達(dá)到24.66mg/L。由此可知，篩選最優(yōu)的基因來源對(duì)于重組釀酒酵母生產(chǎn)菜油甾醇有積極意義。實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵144小時(shí)，在不截?cái)郋RG5基因基礎(chǔ)上菌株也能夠合成菜油甾醇，其中Yl_Dr_DHCR7的產(chǎn)量最高，達(dá)到73.07mg/L，而已報(bào)道的耶氏解脂酵母菜油甾醇生產(chǎn)最佳DHCR7基因來源Yl_Xl_DHCR7產(chǎn)量為16.43mg/L。由此可知，篩選最優(yōu)的基因來源對(duì)于重組耶氏解脂酵母生產(chǎn)菜油甾醇有積極意義，并且在重組耶氏解脂酵母中斑馬魚(Daniorerio)來源DHCR7基因效果明顯好于已報(bào)道最高產(chǎn)量的基因來源。本發(fā)明利用重組釀酒酵母及耶氏解脂酵母兩種酵母底盤菌株生產(chǎn)菜油甾醇的方法相對(duì)于植物提取成本低、副產(chǎn)物少且污染小，為菜油甾醇的工業(yè)生產(chǎn)提供了一種切實(shí)可行的方法，并為下游孕酮、4AD等甾體激素類藥物的生物合成打下基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)其他種微生物高產(chǎn)菜油甾醇具有指導(dǎo)意義。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示重組釀酒酵母及耶氏解脂酵母合成菜油甾醇的路徑圖；圖2示釀酒酵母ERG5基因CRISPR敲除質(zhì)粒構(gòu)建過程圖；圖3示釀酒酵母游離多拷貝質(zhì)粒構(gòu)建過程圖；圖4示重組釀酒酵母菌株11種來源DHCR7基因的菜油甾醇搖瓶產(chǎn)量比較圖；圖5示耶氏解脂酵母整合型質(zhì)粒構(gòu)建過程圖；圖6示重組耶氏解脂酵母菌株6種來源DHCR7基因的菜油甾醇搖瓶產(chǎn)量比較圖；圖7示實(shí)施例1菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖8示實(shí)施例2菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了菌株及其構(gòu)建方法、應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的菌株及其構(gòu)建方法、應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購得。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例1重組釀酒酵母合成菜油甾醇外源功能基因dhcr7的來源篩選本發(fā)明的生產(chǎn)菜油甾醇的重組釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法如下：1、外源功能基因元件的獲得外源基因?yàn)橛糜诤铣刹擞顽薮嫉年P(guān)鍵酶C7位還原酶DHCR7基因：選取11種不同來源的功能基因篩選合成菜油甾醇最優(yōu)的基因來源，DHCR7的基因來源包括褐家鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)、普通狨(Callithrixjacchus)、牛(Bostaurus)、原雞(Gallusgallus)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、扁藻(Tetraselmissp.GSL018)、衣原體(WaddliachondrophilaWSU86-1044)、(CandidatusProtochlamydiaamoebophilaUWE25)、斑馬魚(Daniorerio)等，依次簡(jiǎn)寫為Sc_Rn_DHCR7、Sc_Mm_DHCR7、Sc_Hs_DHCR7、Sc_Cj_DHCR7、Sc_Bt_DHCR7、Sc_Gg_DHCR7、Sc_Xl_DHCR7、Sc_Ts_DHCR7、Sc_Wc_DHCR7、Sc_Cpa_DHCR7、Sc_Dr_DHCR7，具體基因序列見表1。上述基因均為經(jīng)過釀酒酵母密碼子優(yōu)化并適當(dāng)規(guī)避BsaⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，在基因兩端額外添加5’端gcggccgcggtctcca；3’taaaggagaccgcggccgc通過人工合成得到。表12、敲除ERG5基因的重組釀酒酵母的構(gòu)建利用CRSPR技術(shù)將實(shí)驗(yàn)已有質(zhì)粒pCRCT及合成的ERG5基因敲除模塊用GoldenGate方法進(jìn)行構(gòu)建，獲得pCRCT-ERG5質(zhì)粒，采用醋酸鋰法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到CEN.PK2-1底盤菌株中，利用Sc-URA固體平板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％的瓊脂粉)進(jìn)行篩選，得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行劃線分純培養(yǎng)后提酵母基因組，對(duì)突變區(qū)域進(jìn)行PCR及測(cè)序驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的重組菌株接入5mLYPD液體培養(yǎng)基中30℃、250rpm培養(yǎng)12h，再次轉(zhuǎn)接液體YPD中一共轉(zhuǎn)接三次，利用YPD及Sc-URA固體平板進(jìn)行篩選，挑取YPD平板上生長并未在Sc-URA平板上生長的單菌落，對(duì)該重組菌株保存甘油菌并命名為SyBE_Sc00080007。3、構(gòu)建生產(chǎn)菜油甾醇的重組釀酒酵母菌株首先，將實(shí)驗(yàn)室模塊庫中pRS425K-ENO2t-PDC1p-GPM1t質(zhì)粒(可在http://synbioml.org/免費(fèi)獲取)及獲得的外源DHCR7基因用GoldenGate方法進(jìn)行構(gòu)建，獲得11種來源dhcr7的pRS425K-ENO2t-PDC1p-DHCR7-GPM1t釀酒酵母重組游離型多拷貝質(zhì)粒，采用醋酸鋰法將11種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到SyBE_Sc00080007底盤菌株中，采用Sc-LEU固體平板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的瓊脂粉)進(jìn)行篩選，得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行劃線分純培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，對(duì)驗(yàn)證正確的重組菌株保存甘油菌并分別命名為SyBE_Sc00080017、SyBE_Sc00080018、SyBE_Sc00080019、SyBE_Sc00080020、SyBE_Sc00080021、SyBE_Sc00080022、SyBE_Sc00080023、SyBE_Sc00080024、SyBE_Sc00080025、SyBE_Sc00080026和SyBE_Sc00080027。其中，各菌株所含質(zhì)粒如下SyBE_Sc00080017：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Rn_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080018：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Mm_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080019：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Hs_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080020：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Cj_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080021：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Bt_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080022：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Gg_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080023：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Xl_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080024：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Ts_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080025：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Wc_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080026：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Cpa_DHCR7-GPM1tSyBE_Sc00080027：pRS425K-ENO2t-PDC1p-Sc_Dr_DHCR7-GPM1t4、比較菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027的菜油甾醇搖瓶產(chǎn)量試驗(yàn)材料：菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027試驗(yàn)方法：一級(jí)、二級(jí)種子培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖、6.7g/LYNB(YeastNitrogenBase)、2g/L缺亮氨酸的混合氨基酸粉末、100mg/L腺嘌呤；發(fā)酵培養(yǎng)基：20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉、100mg/L腺嘌呤將上述菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027接種于2mL一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)24h，以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)12h，再以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中的菌體密度(OD600)，發(fā)酵72小時(shí)結(jié)束，取全部菌液提取菜油甾醇。菜油甾醇提取方法：取42mL發(fā)酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次。用液氮冷凍細(xì)胞并在研缽中研磨，直到細(xì)胞被研磨成白色極細(xì)粉末，轉(zhuǎn)移至新10mL離心管中，加入2mL甲醇配制的1.5MKOH，60℃水浴皂化反應(yīng)過夜。皂化后加入2mL分析純正己烷渦旋震蕩10min對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行萃取，5000rpm離心10min收集有機(jī)相真空冷凍干燥2小時(shí)，加入400μL正己烷溶解再次冷凍干燥4小時(shí)，加入400μL色譜甲醇溶解，用2μm有機(jī)濾膜過濾后使用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)菜油甾醇含量，流動(dòng)相為乙腈：異丙醇＝3:1，流速為1mL/min，檢測(cè)波長205nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量10μL。試驗(yàn)結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖7。由圖7及圖4菌株SyBE_Sc00080017-SyBE_Sc00080027的菜油甾醇產(chǎn)量來看，發(fā)酵72小時(shí)，Sc_Dr_DHCR7的產(chǎn)量最高，達(dá)到24.66mg/L。由此可知，篩選最優(yōu)的基因來源對(duì)于重組釀酒酵母生產(chǎn)菜油甾醇有積極意義。高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)原始數(shù)據(jù)見表2。表2實(shí)施例2重組耶氏解脂酵母合成菜油甾醇外源功能基因dhcr7的來源篩選本發(fā)明的生產(chǎn)菜油甾醇的重組耶氏解脂酵母菌株的構(gòu)建方法如下：1、外源功能基因元件的獲得外源基因?yàn)橛糜诤铣刹擞顽薮嫉年P(guān)鍵酶C7位還原酶DHCR7基因：選取6種不同來源的功能基因，篩選合成菜油甾醇最優(yōu)的基因來源，其中含天津大學(xué)元英進(jìn)課題組篩選菜油甾醇產(chǎn)量最高的非洲爪蟾(Xenopuslaevis)DHCR7基因，DHCR7的基因來源包括非洲爪蟾(Xenopuslaevis)、人(Homosapiens)、原雞(Gallusgallus)、斑馬魚(Daniorerio)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、衣原體(Waddliachondrophila)等，依次簡(jiǎn)寫為Yl_Xl_DHCR7、Yl_Hs_DHCR7、Yl_Gg_DHCR7、Yl_Dr_DHCR7、Yl_At_DHCR7、Yl_Wc_DHCR7，具體基因序列見表3。上述基因均為經(jīng)過耶氏解脂酵母密碼子優(yōu)化通過人工合成得到。表3不同來源的dhcr7基因序列編號(hào)非洲爪蟾(Xenopuslaevis)SEQIDNo.12人(Homosapiens)SEQIDNo.13原雞(Gallusgallus)SEQIDNo.14斑馬魚(Daniorerio)SEQIDNo.15擬南芥(Arabidopsisthaliana)SEQIDNo.16衣原體(Waddliachondrophila)SEQIDNo.172、構(gòu)建生產(chǎn)菜油甾醇的重組耶氏解脂酵母菌株在不截?cái)郋RG5基因基礎(chǔ)上引入外源DHCR7基因。首先，將獲得的外源DHCR7基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增在基因兩端分別引入BglII、KpnⅠ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，經(jīng)BglII、KpnⅠ雙酶切后利用In-Fusioncloningreaction重組到經(jīng)BamHⅠ、KpnⅠ線性化的pYLEX1質(zhì)粒上，獲得6種來源dhcr7的pYLEX1-DHCR7耶氏解脂酵母重組整合型單拷貝質(zhì)粒，采用醋酸鋰法將6種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到ATCC201249底盤菌株中，整合于基因組pBR322platform位置，采用Sc-LEU固體平板(合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖22g/L，缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％的瓊脂粉)進(jìn)行篩選，得到的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行劃線分純培養(yǎng)后提取酵母基因組進(jìn)行PCR驗(yàn)證，對(duì)驗(yàn)證正確的重組菌株保存甘油菌并分別命名為SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008。其中，各菌株基因組基因型如下SyBE_Yl02060002：pBR322::Yl_Xl_DHCR7SyBE_Yl02060004：pBR322::Yl_Hs_DHCR7SyBE_Yl02060005：pBR322::Yl_Gg_DHCR7SyBE_Yl02060006：pBR322::Yl_Dr_DHCR7SyBE_Yl02060007：pBR322::Yl_At_DHCR7SyBE_Yl02060008：pBR322::Yl_Wc_DHCR73、比較菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008的菜油甾醇搖瓶產(chǎn)量試驗(yàn)材料：菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008試驗(yàn)方法：一級(jí)、二級(jí)種子培養(yǎng)基：22g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉；發(fā)酵培養(yǎng)基：50g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母浸粉將上述菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008接種于5mL一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)24h，以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中，在30℃、250rpm培養(yǎng)18h，再以初始菌體濃度OD600＝0.2分別接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中的菌體密度(OD600)，發(fā)酵144小時(shí)結(jié)束，取10mL菌液提取菜油甾醇。菜油甾醇提取方法：取10mL發(fā)酵液，6000rpm離心5min收集菌體，水洗兩次。用液氮冷凍細(xì)胞并在研缽中研磨，直到細(xì)胞被研磨成白色極細(xì)粉末，轉(zhuǎn)移至新10mL離心管中，加入2mL甲醇配制的1.5MKOH，60℃水浴皂化反應(yīng)過夜。皂化后加入2mL分析純正己烷渦旋震蕩10min對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行萃取，5000rpm離心10min收集有機(jī)相真空冷凍干燥2小時(shí)，加入400μL正己烷溶解再次冷凍干燥4小時(shí)，加入400μL衍生化試劑N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTFA)30℃水浴2小時(shí)，用2μm有機(jī)濾膜過濾后利用GC-TOF/MS檢測(cè)菜油甾醇含量。試驗(yàn)結(jié)果：菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8。由圖8及圖6菌株SyBE_Yl02060002、SyBE_Yl02060004、SyBE_Yl02060005、SyBE_Yl02060006、SyBE_Yl02060007、SyBE_Yl02060008的菜油甾醇產(chǎn)量來看，發(fā)酵144小時(shí)，在不截?cái)郋RG5基因基礎(chǔ)上菌株也能夠合成菜油甾醇，其中Yl_Dr_DHCR7的產(chǎn)量最高，達(dá)到73.07mg/L，而已報(bào)道的耶氏解脂酵母菜油甾醇生產(chǎn)最佳DHCR7基因來源Yl_Xl_DHCR7產(chǎn)量為16.43mg/L。由此可知，篩選最優(yōu)的基因來源對(duì)于重組耶氏解脂酵母生產(chǎn)菜油甾醇有積極意義，并且在重組耶氏解脂酵母中斑馬魚(Daniorerio)來源DHCR7基因效果明顯好于已報(bào)道最高產(chǎn)量的基因來源。氣質(zhì)聯(lián)用(GC-TOF/MS)檢測(cè)原始數(shù)據(jù)見表4。表4本發(fā)明揭示在重組釀酒酵母及耶氏解脂酵母兩種模式菌株中，斑馬魚(Daniorerio)來源C7位還原酶(DHCR7)均具有最佳的效果，該結(jié)論同時(shí)也為其他種微生物高產(chǎn)菜油甾醇提供指導(dǎo)意義。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3