本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種來源于植物的PIP1；10基因及其所編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用，尤其涉及一種來源于大豆的PIP1；10基因及其所編碼的蛋白質(zhì)與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

干旱、鹽堿和低溫等脅迫是限制植物生長的主要非生物脅迫類型，且都會限制植物水分的吸收和影響植物細胞中水分的分布，從而造成植物細胞的水分失衡，制約植物生長發(fā)育，最終導(dǎo)致農(nóng)作物嚴重減產(chǎn)。土壤中高濃度的鹽分通過滲透脅迫、離子毒害、活性氧等多個機制影響植物的生長，是嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個非生物脅迫因素(Zhu,2001)。

水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一類高效特異轉(zhuǎn)運水分子的整合膜蛋白，在植物水分轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。高等植物AQPs按表達特性可分為3類：一類稱為α類，在種子中特異表達，一類稱為γ類，在根中特異表達，第三類稱為Wsi(water-stress induced)類，受水分脅迫的誘導(dǎo)；根據(jù)其序列差異及不同的亞細胞定位可以分為5類:①質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(PIPs:plasma membrane intrinsic proteins)，②液泡膜內(nèi)在蛋白(TIPs:tonoplast intrinsic proteins)，③類NOD26內(nèi)在蛋白(NIPs:NOD26-like intrinsic proteins)，④小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(SIPs:small basic intrinsic proteins)，⑤未鑒定的膜內(nèi)在蛋白(XIPs:X intrinsic proteins)。根據(jù)序列差異，AQPs不同亞型被分為不同的亞家族，如PIPs分為PIP1和PIP2兩個亞家族，TIPs可分為TIP1至TIP5共5個亞類。植物中的第一個水通道蛋白γ-TIP是由Maurel等于1993年從擬南芥液泡膜中分離出來的。到目前為止，在擬南芥、煙草、水稻、玉米、小麥、豌豆、菜豆、苜蓿、馬鈴薯、桃、郁金香等多種科(屬)的植物中都發(fā)現(xiàn)了水通道蛋白，另外從蛋白數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了大量水通道蛋白的類似物(Maurel等，1993)。這些蛋白在調(diào)節(jié)細胞間水分運輸過程中起重要的作用，它們在介導(dǎo)大部分土壤水分吸收的根部表達較豐富((Javot and Maurel，2002)，在水分脅迫等非生物脅迫下的表達要么上調(diào)，要么下調(diào)(Aharon等,2003；Quist等,2004；Guerrero等,1990；Sakr等,2003)。與其他物種相比，植物擁有大量的、普遍表達的AQPs(Javot and Maurel,2002；Javot et al.,2003)。

AQPs在水分、小分子、不帶電荷的溶質(zhì)和二氧化碳通過植物細胞膜的運輸過程中起著主要作用，AQP在調(diào)節(jié)根、莖和葉的水力傳導(dǎo)性，尤其是對環(huán)境變化的響應(yīng)過程中起著重要的作用，從而認為通過調(diào)節(jié)AQP的表達能用來調(diào)節(jié)植物的水分利用率(綜述Menachem等,2014)，水分子穿過細胞膜是由AQP通過改變其密度和活性來調(diào)節(jié)的，如翻譯后修飾以及在執(zhí)行(轉(zhuǎn)運)Trafficking與(開閘)Gating過程中蛋白相互作用，在整個器官水平，AQP修飾水分傳導(dǎo)率和梯度來影響整個植株的水分流動和水勢(Chaumont和Tyerman，2014)。

至今已有許多關(guān)于模式或非模式植物中水通道基因表達水平與非生物脅迫關(guān)系的研究。Sakurai等(2005)分析了水稻水通道蛋白家族的表達特性，發(fā)現(xiàn)水稻的33個水通道基因中，有6個在根中特異性表達，14個在葉中特異性表達；有10個基因的表達水平在低溫脅迫(chilling)時上升。Li等(2008)的研究進一步表明水稻的水通道蛋白對高鹽脅迫、ABA、PEG模擬的干旱脅迫也均有響應(yīng)，且不同成員對不同脅迫的響應(yīng)方式不同。Yann Boursiac等(2005)的研究表明，擬南芥的水通道基因在鹽脅迫時的根中表達水平先升高，然后下降到較低水平。Anderberg等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，在100mmol/L NaCl脅迫下，大麥根部的導(dǎo)水率及AQPs基因表達并無明顯變化，而200mmol/L NaCl引起大麥根部導(dǎo)水率及6個HvPIPs mRNA積累的顯著下降，表明植物調(diào)控AQPs改變根部導(dǎo)水率應(yīng)對高鹽引起的滲透脅迫，另有AQPs定位的研究就發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫處理擬南芥根部時質(zhì)膜上的AtPIP2；1會迅速內(nèi)化，作者推斷這樣可以防止植物在鹽害初期滲透脅迫產(chǎn)生時大量失水(Li等，2011；Lu等，2011)；但不能排除這種內(nèi)化還波及到其他耐鹽機制，如細胞需要AQPs定位在細胞內(nèi)的其他膜系統(tǒng)上進行物質(zhì)分泌、離子區(qū)隔等。此外，通過固氮螺菌接種大麥幼苗可以提高其抗鹽能力(200mmol/L NaCl，18d)，研究者發(fā)現(xiàn)對比未接種幼苗，推測接種固氮螺菌后，根部HvPIP2；1高效表達，并推測大麥根部HvPIP2；1的高效轉(zhuǎn)錄提高了大麥幼苗耐鹽能力(Zawoznik等，2011)。

近年來關(guān)于水通道蛋白與鹽脅迫的耐性關(guān)系的報道開始出現(xiàn)并陸續(xù)增多，但數(shù)量仍然比較有限，而且不同類型、不同來源的水通道蛋白對植物的非生物脅迫耐性有著不同的影響。Guo等(2006)分離了若干水稻PIP基因，超量表達水稻PIP基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱脅迫和中等強度的鹽脅迫的耐性有所提高。Peng等(2007)克隆了人參的TIP基因，發(fā)現(xiàn)基因的超量表達促進了轉(zhuǎn)基因煙草的種子萌發(fā)和植株生長；在鹽脅迫下使地上部分積累Na+從而提高了植株對鹽脅迫的耐性。在番茄中超表達具有CO2及水通透性的NtAQP1基因可以提高植物的光合作用效率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰作用，并維持鹽脅迫下根部的導(dǎo)水率，提高番茄的抗鹽能力(Sade等，2009)；同樣，從抗鹽小麥突變株RH8706-49中克隆鹽脅迫下根和葉中都高效表達的TaNIP，超表達TaNIP提高擬南芥的耐鹽性(Gao等，2010)。這些結(jié)果都表明AQPs能增加轉(zhuǎn)基因植株的鹽脅迫耐受能力。植物TIPs定位在液泡膜，鹽脅迫下參與調(diào)控細胞滲透壓(Marty等，1999)。野生大豆受到鹽脅迫后，GsTIP2；1在葉片上調(diào)表達，而在根系下調(diào)表達；超表達該基因降低了擬南芥的耐鹽能力(Wang等，2011)；而Peng等(2007)在擬南芥中超表達人參的PgTIP1基因提高了擬南芥的耐鹽性，但轉(zhuǎn)化株對干旱和冷害更敏感；Zhou等(2014)組成性過表達大豆質(zhì)膜型水通道蛋白基因GmPIP1；6的轉(zhuǎn)基因大豆植株顯著提高了耐鹽性，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株能較好地維持根部水力傳導(dǎo)性和增加種子大小來提高產(chǎn)量；Yu等(2014)分離克隆了香蕉MaPIP1；1基因，過表達擬南芥發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株提高了干旱和鹽脅迫的耐性；Qian等(2014)發(fā)現(xiàn)黃瓜幼苗在干旱和鹽脅迫下，質(zhì)膜型水通道蛋白基因的表達顯示了隨著處理時間變化的差異應(yīng)答機制，表明水通道蛋白的調(diào)節(jié)是隨著脅迫類型、脅迫時間和器官而變化的。Ma等(2014)發(fā)現(xiàn)增加二磷酸酯的膜含量可以增加煙草原生質(zhì)體滲透水的滲透性，而后者是通過增加膜上活性水通道蛋白的豐度來實現(xiàn)的，因此作者提出磷酸肌醇是否通過增加AQP通路來調(diào)節(jié)煙草原生質(zhì)體膜的水滲透性的疑問。Heinen等(2014)鑒定了玉米氣孔復(fù)合體部位的質(zhì)膜水通道蛋白，并進行了ZmPIP1；5和ZmPIP1；6的酵母異源表達分析，表明ZmPIPs在氣孔復(fù)合體中有多種生理學(xué)功能。

植物體可以通過調(diào)控水孔蛋白等膜蛋白以加強細胞與環(huán)境的信息交流和物質(zhì)交換，改變膜對水分的通透性，實現(xiàn)滲透調(diào)節(jié)，以增強植物的抗旱、耐鹽能力。這說明鹽和干旱脅迫植物在分子水平上通過影響水通道蛋白的性質(zhì)和豐度，改變了細胞對水分的吸收能力。這些研究結(jié)果都表明植物通過水孔蛋白調(diào)節(jié)細胞對水分的吸收能力而適應(yīng)高鹽和干旱等不利的環(huán)境條件。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，獲得一種來源于植物的抗逆性基因，且能夠提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性，本發(fā)明提供了植物PIP1；10基因及其應(yīng)用。

技術(shù)方案：植物PIP1；10基因，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列或編碼與序列表中SEQ ID NO:1相同氨基酸殘基序列的多核苷酸序列；所述基因的擴增引物為SEQ ID NO:3～4。

其中，SEQ ID NO:1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列是在高嚴謹條件下獲得，所述高嚴謹條件為0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃條件下雜交并洗膜。

所述PIP1；10基因由870個脫氧核苷酸組成，其編碼序列為自5’端第1位至870位脫氧核苷酸，編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。

此外，將SEQ ID NO:2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的調(diào)控植物抗逆性的氨基酸殘基序列。

氨基酸序列由289個氨基酸殘基組成，通過NCBI網(wǎng)站BLAST結(jié)果表明該蛋白自氨基端(N端)第47位左右至第277位左右的氨基酸殘基為保守的MIP超家族蛋白特異保守結(jié)構(gòu)域，如圖1所示。通過SMART在線分析軟件http://smart.embl-heidelberg.de/預(yù)測該蛋白含有6個保守的跨膜結(jié)構(gòu)域。

所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

上述植物PIP1；10基因在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述PIP1；10基因的表達載體為雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如：pCambia1301、pCambia1300、pBI121、pCXSN或其他衍生植物表達載體。

優(yōu)選的，所述PIP1；10基因的表達載體中，其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前引入組成型、組織特異型、誘導(dǎo)型或增強型啟動子。

優(yōu)選的，所述PIP1；10基因的表達載體中，引入具有抗性的抗生素標記基因(卡那霉素、潮霉素等)、抗化學(xué)試劑標記基因(如抗除草劑bar基因等)、產(chǎn)生顏色變化的蛋白和/或化學(xué)發(fā)光基因(GUS基因、GFP基因、LUC基因等)。

優(yōu)選的，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，優(yōu)選為大豆。

優(yōu)選的，所述抗逆性為耐干旱性。

攜帶有PIP1；10基因的植物表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細胞或組織培育成植株。上述通過轉(zhuǎn)基因調(diào)控植物抗逆性的方法對所有植物均適用，既可適用于單子葉植物(小麥、水稻、玉米等)，也可以適用雙子葉植物(大豆、棉花等)。

有益效果：(1)本發(fā)明所述基因能夠提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性；(2)來源于大豆中的該基因能夠提高轉(zhuǎn)基因大豆的耐旱性。

附圖說明

圖1為來源于大豆的PIP1；10基因(GmPIP1；10)的蛋白的保守結(jié)構(gòu)域圖；

圖2為GmPIP1；10基因在栽培大豆和野生大豆根組織受到鹽/干旱脅迫的表達豐度的半定量PCR和定量檢測結(jié)果圖；

圖3為GmPIP1；10基因的mRNA在不同組織器官中表達豐度的半定量PCR檢測結(jié)果圖；

圖4為GmPIP1；10蛋白的氨基酸與其他植物的PIP1；10蛋白的氨基酸多重序列比對圖；

圖5為pCXSN植物過表達載體物理圖譜；

圖6為為pCXSN::Gm PIP1；10轉(zhuǎn)基因組合植株抗旱鑒定結(jié)果圖。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1 基因的克隆

1、材料 菌株 試劑

大豆材料為普通大豆、大腸桿菌菌株DH5α為本實驗室保存；pGEM-T Easy Vector T克隆試劑盒、Taq酶、DNA marker購自TaKaRa公司；Trizol reagent、T4 DNA連接酶購自Fermentas公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司；引物由上海英俊生物技術(shù)有限責任公司合成，DNA純化回收試劑盒購于Promega公司，其它生物學(xué)試劑購自上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。

2、總RNA提取和c DNA合成

樣品在液氮中研磨后用Trizol TM(Invitrogen)提取，經(jīng)DNase1消化去除DNA，并經(jīng)1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度和完整性。cDNA合成采用上海捷瑞生物工程有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒。

3、基因克隆

利用RT-PCR方法從大豆幼苗根部組織cDNA中擴增全長ORF(開放閱讀框)，所用正向引物為SEQ ID NO:3，5’-ATGGAGGGAAAAGAGGAAGATGT-3’和反向引物SEQ ID NO:4，5’-TTAACTGGATTTGAAGGGAATGGC-3’，擴增體系為：cDNA稀釋樣，適量；10×PCR Buffer，2.5μL；dNTP(10mM)，0.5μL；MgCl₂(25mM)，1.5μL；Primer F(10mM)，1μL；Primer R(10mM)，1μL；Taq polymerase(5UmL-1)，0.2μL；ddH₂O補足至25μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性45秒，55℃復(fù)性45秒，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物連入pGEM-T Easy Vector T克隆試劑盒載體中，送給南京金斯瑞生物科技有限公司測序，重復(fù)3次，獲得基因序列SEQ ID NO:1。

實施例2 基因表達分析

采用半定量RT-PCR分析法，根據(jù)cDNA序列設(shè)計引物，所用引物序列如下，內(nèi)參引物TubμLin-F(SEQ ID NO:5)：5'-AACCTCCTCCTCATCGTACT-3'；TubμLin-R(SEQ ID NO:6)：5'-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3'，基因引物(SEQ ID NO:7)：5’-TCATGGGTGTCAATAGGTCCAGCT-3’；反向引物(SEQ ID NO:8)5’-TGTAACCAGGGGCAACAAAGTTGGC-3’(對大豆基因組進行BLAST結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有其他同源基因，表明基因的特異性)；利用提取的幼苗根、莖、葉組織和花以及豆莢的cDNA為模板來進行基因的組織表達分析。利用200mM的氯化鈉溶液處理野生和栽培大豆根部組織不同時間點(0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、24h)的cDNA為模板，通過半定量PCR方法進行誘導(dǎo)表達分析；以20％PEG6000處理不同時間點(0h,2h,4h,12h)的根部組織為模板，進行干旱脅迫誘導(dǎo)表達分析，其中大豆組成型表達的ActinII作為內(nèi)參基因，引物序列為SEQ ID NO:9，F(xiàn)：5’-ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC-3’；SEQ ID NO:10，R：5’-GCTGGTCCTGGCTGTCTCC-3’。按照TaKaRa試劑盒SYBR Premix ExtaqTM說明設(shè)定反應(yīng)體系，擴增條件為：95℃5min，95℃15s，45個循環(huán)，58℃1min。熒光定量PCR所用的儀器為ROCHE96實時熒光定量PCR儀。

結(jié)果如圖2和3所示：圖2中(A)顯示在栽培大豆根組織中，GmPIP1；10表達受鹽脅迫誘導(dǎo)，而在野生大豆根組織中始終保持較高的表達水平；圖2中(B)顯示在干旱處理下，GmPIP1；10表達顯示先下調(diào)后上升的趨勢；圖3顯示半定量PCR檢測結(jié)果表明在GmPIP1；10大豆的根、莖、葉中均有表達，花和豆莢中表達較弱。

實施例3 序列分析

采用BLAST X和BLAST P搜索NCBI的核苷酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，進行序列相似性分析及氨基酸保守性預(yù)測；用Clustal X進行氨基酸序列比對及功能結(jié)構(gòu)域查找與相似序列分析；結(jié)果表明，該蛋白氨基酸序列與綠豆(Vigna radiata)、小豆(Vigna angμLaris)、菜豆(Phaseolus vμLgaris)、花生(Arachis ipaensis)、木豆(Cajanus cajan)等的水通道PIP蛋白均有較高的相似性，都在氨基酸47-277之間具有一個保守的MIP家族結(jié)構(gòu)域，如圖4所示。

實施例4 耐旱性檢驗

1、載體構(gòu)建

利用Xcm1酶單切載體pCXSN形成T/A克隆位點，然后利用PCR擴增基因全長ORF,所用引物為正向引物5’-ATGGAGGGAAAAGAGGAAGATGT-3’；反向引物5’-TTAACTGGATTTGAAGGGAATGGC-3’。然后T4連接酶把擴增產(chǎn)物連入酶切后的空載體內(nèi)，然后用35F(SEQ ID NO:11)正向引物5'-ACTCGCCGTAAAGACTGG-3'和基因的反向引物擴增獲得方向正確的陽性克隆通過凍融法轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599和根癌農(nóng)桿菌EHA105中，以備后續(xù)轉(zhuǎn)化所用，重組載體圖譜如圖5所示。

2、植物材料

植物材料為大豆幼苗，將大豆種子點播于蛭石:沙子為3:1的基質(zhì)中，澆水并在光照培養(yǎng)箱(寧波海曙賽福實驗儀器廠)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25-28℃，每日光照12小時，光照強度為2000lux，待苗長至4-5厘米時以備后續(xù)注射所用。

3、菌液培養(yǎng)與注射

從平板上挑取單菌落K599(含GmPIP1；10基因表達載體)置于加有1mL液體LB(附加Kan50mg/L)的15mL管中，28℃搖床上200rpm搖1-2d，然后吸取2mL離心，沉淀用10m M硫酸鎂溶液重旋，再離心一次，然后用硫酸鎂稀釋至OD600約0.8-1.0；用0.025mL量程微型注射器吸取菌液，在大豆子葉節(jié)部位注射，注射大約3-4個孔，然后放置在加有水的小燒杯內(nèi)，用塑料膜封口，在光照培養(yǎng)箱中(12h光照/12h黑暗)28℃培養(yǎng)。

4、組合苗生長管理

大致培養(yǎng)5-7天時，注射的孔部長出根之后，隨后揭掉塑料膜，剪掉原有的根系，確保轉(zhuǎn)基因根系為陽性，在Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)至根部足夠健壯時為后續(xù)研究所用。

5、組合苗陽性植株鑒定

DNA采用CTAB法提取，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。PCR反應(yīng)總體積為20μL，模板DNA(20ng/μL)1μL，正反向引物(10μM)各0.4μL，10xPCR Buffer 2μL，MgCl2(25mM)1.6μL,dNTP(10mM)1.6μL,rTaq(5U/μL)0.2μL，ddH₂O 12.8μL。反應(yīng)程序94℃預(yù)變性4min，35個循環(huán)：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，72終延伸10min。所用引物為35F正向引物5'-ACTCGCCGTAAAGACTGG-3'；基因反向引物5’-TTAACTGGATTTGAAGGGAATGGC-3’

組合擴增來進行驗證(前期已經(jīng)驗證)。

運用Hairy Root實驗體系，包括離體和在體兩類，一類是豆瓣體外菌液注射發(fā)根驗證；另一類是在體注射菌液發(fā)根然后再生苗，獲得轉(zhuǎn)基因組合植株后，經(jīng)PCR驗證為陽性的植株對它們進行抗或耐旱鑒定(圖6A)；植物過表達載體通過凍融法轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌K599，通過注射的方法獲得轉(zhuǎn)基因組合植株(根為轉(zhuǎn)基因，其它為非轉(zhuǎn)基因)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與空對照和過表達該基因的植株相比,該基因的過表達植株對PEG(20％m/v)溶液具有較強的耐受性，表明該基因在植物的抗旱耐鹽脅迫過程中起著重要作用(圖6B)。

綜上所述，本發(fā)明人提供的GmPIP1；10基因是首次從大豆中分離的新基因，其功能參了大豆的抗、耐旱和耐鹽等逆境脅迫的應(yīng)答。本發(fā)明的GmPIP1；10基因來自普通大豆，具有適合于雙子葉植物表達的優(yōu)化密碼子，其基因工程受體植物除了單子葉植物水稻、玉米、小麥外，更加適合于雙子葉植物，如大豆、棉花、煙草等。