本發(fā)明涉及殺菌劑技術(shù)，具體涉及一種殼聚糖接枝香草?；苌锛捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，人民健康意識(shí)不斷增強(qiáng)，食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題已引起公眾的高度關(guān)注。由于目前農(nóng)業(yè)上大多使用的是化學(xué)農(nóng)藥，因農(nóng)藥殘留導(dǎo)致的食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題日益突出，有害農(nóng)藥殘留已嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和人類(lèi)健康。因此，研制高效、低毒、低殘留生物農(nóng)藥的呼聲越來(lái)越高。

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，同時(shí)也是一個(gè)海洋大國(guó)，利用豐富的海洋生物資源，開(kāi)發(fā)新型海洋生物源農(nóng)藥，是一個(gè)新的應(yīng)用前景廣闊的研究領(lǐng)域。甲殼素是來(lái)源于蝦、蟹、昆蟲(chóng)等節(jié)肢動(dòng)物的外殼或軟體動(dòng)物的外殼以及真菌、低等藻類(lèi)的細(xì)胞壁。甲殼素含量豐富，是含量?jī)H次于纖維素的第二大天然生物多糖。殼聚糖作為甲殼素的脫乙酰產(chǎn)物，具有無(wú)毒、生物相容性好、可自然降解等特點(diǎn)。殼聚糖能夠抑制植物病原真菌以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，以殼聚糖、殼寡糖為原料研制的海洋生物源農(nóng)藥已有多個(gè)產(chǎn)品面市。

殼聚糖和寡糖制品普遍存在抗菌活性低和水溶性差等方面的不足，通過(guò)對(duì)殼聚糖進(jìn)行定位修飾、接枝共聚、點(diǎn)擊化學(xué)等手段進(jìn)行化學(xué)改性，導(dǎo)入抗菌活性基團(tuán)，能夠獲得具有較高抗菌活性的新型殼聚糖衍生物。植物中的芳香類(lèi)物質(zhì)，其中一部分活性來(lái)自于芳香酸，其廣泛存在于植物，特別是植物精油中，許多天然羧酸在醫(yī)藥上常用作醫(yī)藥中間體；同時(shí)芳香羧酸多具有良好的抗菌活性，對(duì)不同病原菌均表現(xiàn)出一定的抑制效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明提供了一種殼聚糖接枝香草?；苌锛捌渲苽浞椒ê蛻?yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種殼聚糖接枝香草酰衍生物，其結(jié)構(gòu)如式Ⅰ，其中R為香草?；渌岬慕Y(jié)構(gòu)見(jiàn)式II；n為聚合度≥2；

本發(fā)明的另一目的在于提供了一種殼聚糖接枝香草酰衍生物的制備方法，通過(guò)將香草?；c殼聚糖的氨基保護(hù)物反應(yīng)制備而得。

所述的方法，香草酰氯與殼聚糖的氨基保護(hù)產(chǎn)物N-鄰苯二甲酰基殼聚糖反應(yīng)生成2-N-鄰苯二甲?；?6-O-香草酰殼聚糖，產(chǎn)物在水合肼溶液中脫去鄰苯二甲酰基得6-O-香草酰殼聚糖。

所述的方法，所述殼聚糖的氨基保護(hù)采用與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)生成N-鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?；其中殼聚糖分子聚合度不小于2，脫乙酰度≥80％。

所述的方法，所述香草?；鹊闹苽涫且韵悴菟釣樵希远燃淄闉槿軇?，滴加3～10倍當(dāng)量的氯化亞砜，于40℃回流反應(yīng)，通過(guò)薄層層析監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程，反應(yīng)產(chǎn)物減壓蒸餾，得到香草酰氯。若原料為香草醛或香草醇須先氧化生成香草酸。

所述的方法，殼聚糖的氨基保護(hù)是以殼聚糖為原料，在含水N,N-二甲基甲酰胺中溶脹分散，加入約3倍當(dāng)量的鄰苯二甲酸酐，120℃攪拌回流8h后冷卻至室溫，產(chǎn)物傾倒入冰水中，減壓過(guò)濾并用蒸餾水洗滌，過(guò)濾后將產(chǎn)物分散于乙醇中充分洗滌、離心、冷凍干燥得到N-鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?。

所述的方法，將N-鄰苯二甲酰基殼聚糖分散于N,N-二甲基甲酰胺中，于60℃下攪拌溶脹30min，待溫度降至室溫后逐滴加入含過(guò)量香草?；鹊腘,N-二甲基甲酰胺溶液，于35℃下反應(yīng)10h。將反應(yīng)液倒入4倍量無(wú)水乙醇中，于4℃沉淀1h，用無(wú)水乙醇洗滌離心3次，冷凍干燥得淡棕色產(chǎn)物，即為酰化產(chǎn)物2-N-鄰苯二甲?；?6-O-香草酰殼聚糖。

所述的方法，取所述2-N-鄰苯二甲酰基-6-O-香草酰殼聚糖加入等體積混合的吡啶和水合肼中，80℃回流6h，反應(yīng)液倒入4倍體積無(wú)水乙醇中沉淀，離心，固體用乙醇充分洗滌，低溫凍成固體，最后冷凍干燥，得淡黃褐色粉末產(chǎn)物，即6-O-香草酰殼聚糖。

本發(fā)明的另一目的在于提供殼聚糖接枝香草?；苌镌谥苽渌鶜⒕鷦┲械膽?yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了殼聚糖接枝香草酰基衍生物在制備抑制番茄灰霉病菌、小麥赤霉病菌、辣椒疫霉病菌或小麥紋枯病菌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提出以香草酸作為活性基團(tuán)接入殼聚糖分子中，最大程度上維持殼聚糖衍生產(chǎn)物的活性基團(tuán)，使殼聚糖與抗菌活性基團(tuán)產(chǎn)生協(xié)同作用，同時(shí)使合成物能夠保持殼聚糖無(wú)毒、易降解和生物相容性好的特點(diǎn)，為研制新型海洋生物農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明以香草酸為原料，通過(guò)與二氯亞砜反應(yīng)制備成芳香酰氯；殼聚糖的氨基保護(hù)產(chǎn)物——N-鄰苯二甲?；鶜ぞ厶?，先與芳香酰氯發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成?；a(chǎn)物——2-N-鄰苯二甲?；?6-O-香草酰殼聚糖，產(chǎn)物在水合肼溶液中脫去氨基保護(hù)制備得產(chǎn)品6-O-香草酰殼聚糖。所得目標(biāo)產(chǎn)物在引入香草?；耐瑫r(shí)還保留了殼聚糖的活性氨基基團(tuán)，改變了殼聚糖原有理化性質(zhì)，提高了溶解度；同時(shí)提高殼聚糖的生物活性，擴(kuò)大抗菌譜，增強(qiáng)抗菌活性，這些將拓展其應(yīng)用范圍。

本發(fā)明所具有的特點(diǎn)：

1.本發(fā)明在殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入芳香酸活性結(jié)構(gòu)后，可提高殼聚糖的水溶解性能及對(duì)微生物的生物活性。

2.本發(fā)明制備的殼聚糖接枝香草酰衍生物具有良好的水溶性和抗菌活性，克服了殼聚糖自身水溶解性差的缺點(diǎn)，拓展了其應(yīng)用領(lǐng)域，在農(nóng)用殺菌劑、獸藥、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施所得產(chǎn)物6-O-香草酰殼聚糖的紅外光譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1香草酰氯的制備

將制得的羧酸產(chǎn)物置于250mL圓底燒瓶中，加入10mL二氯亞砜，滴入3滴二甲基甲酰胺(DMF)作為催化劑和溶劑，在40℃加熱回流8h，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)出過(guò)量的二氯亞砜，所得產(chǎn)物即為香草酰氯。

實(shí)施例2氨基保護(hù)6-O-香草酰殼聚糖的制備

將2g N-鄰苯二甲?；鶜ぞ厶欠稚⒂?0mL的N,N-二甲基甲酰胺中，放于磁力加熱攪拌器中，60℃下攪拌30min，待溫度降為室溫后，逐滴加入37mL香草酰氯，在35℃下反應(yīng)10h,將反應(yīng)液倒入4倍體積的無(wú)水乙醇中，在4℃下沉淀過(guò)夜，用無(wú)水乙醇洗滌離心3次，固體冷凍干燥得氨基保護(hù)6-O-香草酰殼聚糖。

實(shí)施例3 6-O-香草酰殼聚糖的制備

將2g氨基保護(hù)的香草酰氯殼聚糖放入500mL的燒瓶中，加入吡啶和水合肼，80℃回流6h,反應(yīng)液倒入4倍體積的無(wú)水乙醇中，沉淀離心，固體用無(wú)水乙醇充分洗滌，收集固體，最后冷凍干燥得6-O-香草酰殼聚糖。

實(shí)施例4溶解度測(cè)定

稱(chēng)取0.2g樣品放入離心管，加入25mL蒸餾水，放入磁力加熱攪拌器中，在37℃反應(yīng)24h，然后離心，將固體冷凍干燥，根據(jù)兩次質(zhì)量差計(jì)算出溶解度。

實(shí)施例5紅外光譜結(jié)構(gòu)表征

取1mg殼聚糖和100mg的溴化鉀研磨混合，再在壓片機(jī)上壓制成片，壓力在10-12MPa之間，停留大約10秒鐘，然后取出，觀察壓片成型，將壓好的溴化鉀樣品片放入傅立葉紅外光譜儀中檢測(cè)制作圖譜。然后再取1mg干燥后的6-O-香草酰殼聚糖和100mg的溴化鉀研磨混合，重復(fù)上述操作獲得樣品的IR譜圖(參見(jiàn)圖1)。6-O-香草酰殼聚糖紅外特征吸收(cm-¹)：3473(νO-H，νN-H)，1713和1776(νC＝O),1546(νN-H)，1390(C-O-C)，1119(νC₃-OH)、1060(νC₆-OH)，900-500(苯環(huán)吸收)。

實(shí)施例6抗菌活性測(cè)定

稱(chēng)取殼聚糖、6-O-香草酰殼聚糖各0.1g,放入50mL滅菌小燒杯中，加入10mL滅菌水置于磁力加熱攪拌器上進(jìn)行分散，再用移液槍量取40ul冰醋酸加入，繼續(xù)攪拌，然后再加入10mL滅菌水繼續(xù)攪拌得0.1g/mL的殼聚糖醋酸及6-O-香草酰殼聚糖醋酸溶液。再用滅菌水將以上溶液稀釋至5mg/mL,用于抗菌活性測(cè)定。

在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行菌種的轉(zhuǎn)接，用移液槍量取1mL 5mg/mL的醋酸溶液，加入PDA至10mL，在搖勻器上搖勻，得0.5mg/mL的抗菌活性濃度，倒入培養(yǎng)皿制成平板，用打孔器將預(yù)先培養(yǎng)好的供試菌種打成菌餅，倒置于培養(yǎng)基表面中央，每一處理做3次重復(fù)，25℃恒溫培養(yǎng)，用十字交叉法測(cè)量72h的菌落直徑，然后按以下公式計(jì)算供試菌種生長(zhǎng)抑制率。

表1殼聚糖接枝香草酰衍生物的抑菌活性

注：供試濃度為0.5mg/mL。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物界定。