本發(fā)明屬于植物病害預(yù)防技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種芝麻枯萎病菌毒素的提取方法的專利申請。

背景技術(shù)：

芝麻（Sesamum indicum L.，2n=26）屬胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的優(yōu)質(zhì)油料作物，也是我國重要的特色油料作物。

芝麻枯萎?。⊿esame Fusarium wilt）由尖孢鐮刀菌芝麻專化型（Fusarium oxysporum f.sp.sesami，F(xiàn)OS）侵染引起，與莖點(diǎn)枯病并稱為芝麻兩大主要真菌病害。我國芝麻枯萎病害主要發(fā)生在東北、華北、西北、黃淮以及江淮部分地區(qū)，常年發(fā)生率在15%左右，嚴(yán)重影響芝麻產(chǎn)量和品質(zhì)。

為探明芝麻枯萎病菌致病機(jī)理，國內(nèi)外先后開展了枯萎病菌分離、鑒定及病原菌致病力鑒定方法等研究。2014年河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院首次建立了芝麻枯萎病菌致病力室內(nèi)鑒定技術(shù)體系，為芝麻FOS致病以及芝麻抗枯萎病機(jī)理研究提供了技術(shù)支撐（仇存璞等，芝麻枯萎病病原菌致病力室內(nèi)鑒定方法，2014，植物病理學(xué)報，44(01)：26-35）。

以往研究結(jié)果顯示，尖孢鐮刀菌在侵入植株組織后多能產(chǎn)生毒素，并對植株造成毒害作用。2006年臺蓮梅等利用尖孢鐮刀菌毒素濾液評價了不同大豆品種對根腐病的抗病性，并將該方法用于大豆抗病植株的初篩工作。近期初步研究及內(nèi)部資料表明，芝麻枯萎病菌FOS同其他尖孢鐮刀菌相似，侵染芝麻后，菌絲體逐漸堵塞維管束，切段水分及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，從而導(dǎo)致植株發(fā)病。同時，F(xiàn)OS病原菌能夠產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶等水解酶，對芝麻植株起到侵染作用（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研檔案記載）。但至今為止，尚未明確芝麻枯萎病菌是否能夠產(chǎn)生毒素，亦未見有關(guān)FOS毒素對芝麻毒害癥狀的公開報道。因此，當(dāng)前急需一種提取芝麻枯萎病菌毒素的技術(shù)，以探明芝麻枯萎病菌致病機(jī)理，并為推動芝麻病害基礎(chǔ)研究提供技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種芝麻枯萎病菌毒素的提取方法，從而為相關(guān)芝麻病害研究奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種芝麻枯萎病菌毒素提取方法，包括以下步驟：

（1）菌株預(yù)培養(yǎng)，具體為：

將芝麻枯萎病菌（即尖孢鐮刀菌芝麻?；停┚杲臃N在PDA平板培養(yǎng)基上，28℃、培養(yǎng)7 d左右，檢查菌株活性；

然后，沿菌落邊緣打出直徑為8 mm菌片，接入裝有PD培養(yǎng)液的三角瓶內(nèi)，每瓶接2~3片， 28℃、120 rpm條件下，震蕩培養(yǎng)4d；

（2）菌株培養(yǎng)，具體為：

以2層無菌的2層擦鏡紙作為濾網(wǎng)，對步驟（1）中培養(yǎng)結(jié)束后菌液進(jìn)行過濾，濾除菌絲，濾液中由于含有大量芝麻枯萎病菌孢子，以此作為接菌母液；

將接菌母液接入理查德培養(yǎng)基，28℃、120 rpm條件下，恒溫震蕩培養(yǎng)40~50d；

（3）提取芝麻枯萎病菌毒素，具體為：

首先，以2層無菌紗布作為濾網(wǎng)，將步驟（2）中培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，以濾除孢子、菌絲及細(xì)胞碎片等雜物；將濾液4000rpm離心15min，取上清液；

其次，將上述上清液慢慢滴加于裝有0.45μm水系濾膜的溶劑過濾器中，真空抽濾，收集濾液，并用2N（2mol/L）鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值在3.0~3.5之間；

最后，向濾液中加入與濾液體積相等的乙酸乙酯作為萃取劑進(jìn)行萃取；取上層有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥后，濾除硫酸鈉，進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去除乙酸乙酯，最終得棕黃色固體產(chǎn)品，即為含有芝麻枯萎病菌毒素的粗產(chǎn)品（簡稱粗毒素）。

初步測定表明，以中等致病力（20≤DI≤50）（參照仇存璞等，芝麻枯萎病病原菌致病力室內(nèi)鑒定方法，植物病理學(xué)報，2012)的芝麻枯萎病菌為例，采用上述方法，200mL菌液最終可提取含芝麻枯萎病菌毒素粗產(chǎn)品90~120毫克左右。

進(jìn)一步地，所提取的粗毒素可用于評價芝麻枯萎病菌對芝麻生長的影響，初步試驗表明，粗毒素濃度為1-10μg/mL時，芝麻幼苗的生長即會受到明顯抑制。

更進(jìn)一步地，所提取的粗毒素用于評價芝麻枯萎病菌對芝麻生長影響時的評價方法（或者說粗毒素對芝麻的毒性測定方法）為，包括如下步驟：

（1）種子消毒與接種，具體為：

挑選飽滿健康的芝麻種子，先用清水沖洗種子表面3~5遍；

然后將種子浸泡于75%酒精中30 s，無菌水沖洗3遍；

再然后用3%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗種子3~4遍；

將消毒后的種子放入裝有無菌水的三角瓶中振蕩培養(yǎng)過夜（以無菌水剛剛浸沒種子為宜）；

挑選露白的芝麻種子，接種在MS固體培養(yǎng)基上，25℃、L//D=14 h//10 h光照/d條件下培養(yǎng)1周；

（2）配置含有粗毒素的MS培養(yǎng)基，具體為：

配置MS培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，1.5%瓊脂粉），分別加入上述所制備的粗毒素，使粗毒素濃度呈特定梯度濃度分布，如粗毒素濃度分別為1μg/mL、5μg/mL和10 μg/mL；

（3）在含粗毒素培養(yǎng)基中接種芝麻幼苗，具體為：

無菌條件下，切取步驟（1）所培育的芝麻幼苗根莖基部以上部分（無根苗），分別接種于步驟（2）中所制備的含粗毒素的MS培養(yǎng)基上，同時設(shè)置空白MS培養(yǎng)基作為隱性對照；設(shè)置相關(guān)實(shí)驗組別及對照組別時，需注意，為滿足統(tǒng)計學(xué)及準(zhǔn)確評價的需要，建議可以每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)接種6株無根苗；

（4）性狀統(tǒng)計及結(jié)果判定，具體為：

在步驟（3）中接種無根苗2周后，統(tǒng)計芝麻幼苗株高、生根數(shù)、根長等數(shù)據(jù)，并拍照記錄，最終綜合評價粗毒素對芝麻幼苗生長的抑制程度，也即，粗毒素對芝麻的毒性程度。

總體而言，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在如下幾個方面：

（1）菌株培養(yǎng)時間足夠長，確保能夠產(chǎn)生芝麻枯萎病菌毒素，本發(fā)明中通過采用預(yù)培養(yǎng)方式，結(jié)合培養(yǎng)時間足夠長，確保相應(yīng)菌株能夠產(chǎn)生足夠的毒素，從而便于后續(xù)過程的制備和提取；

（2）芝麻枯萎病菌毒素提取過程簡便易行，提取效果穩(wěn)定；與現(xiàn)有活性炭法（臺蓮梅等，2004）等提取技術(shù)相比，本發(fā)明主要包括離心過濾、乙酸乙酯萃取和真空蒸發(fā)等簡要的步驟，該方法方法簡便易行，具有較好可操作性；同時綜合而言，本發(fā)明的芝麻枯萎病菌毒素提取效率高、重復(fù)性較好、提取效果較為穩(wěn)定，因而具有較好地技術(shù)創(chuàng)造性；

（3）為芝麻抗性研究奠定了良好基礎(chǔ)；通過提取芝麻枯萎病菌毒素，并依此建立一種評價模型，可為準(zhǔn)確評價芝麻枯萎病菌對芝麻生長影響奠定基礎(chǔ)，同時也可為芝麻抗枯萎病機(jī)理研究及抗芝麻枯萎病種質(zhì)資源的篩選奠定基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為尖孢鐮刀菌芝麻?；途闔SFO07021在PDA平板培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)結(jié)果；

圖2為用于培養(yǎng)的尖孢鐮刀菌芝麻?；途闔SFO07021菌片；

圖3為用乙酸乙酯萃取獲得的芝麻枯萎病菌毒素；

圖4為5μg/mL粗毒素處理條件下，豫芝11號幼苗生長受到抑制情況；其中1、2圖分別為清水對照培養(yǎng)條件下豫芝11號幼苗和根生長情況；3、4圖分別為5μg/mL粗毒素處理條件下豫芝11號幼苗和根生長情況，從圖中可以看出，幼苗及根生長受到明顯抑制。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本申請做進(jìn)一步解釋說明，在介紹具體實(shí)施例前，對下述實(shí)施例中涉及部分生物材料及培養(yǎng)基情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

豫芝11號，由河南省農(nóng)科院芝麻種質(zhì)保藏中心提供，可從公開渠道獲得；

下述實(shí)施例中所采用的尖孢鐮刀菌芝麻?；途闔SFO07021，由河南省農(nóng)科院芝麻中心提供，可由公開渠道獲得；下述實(shí)施例中提取方法僅以此菌株為例進(jìn)行實(shí)驗，不應(yīng)理解為本發(fā)明的技術(shù)方案特定依賴于或者說特定限定于該菌株。

培養(yǎng)基：

下述實(shí)施例中所涉及培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，主要有：

PDA平板培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂15-18g，蒸餾水1000mL；

PD培養(yǎng)液：與PDA平板培養(yǎng)基相比，不含瓊脂；

理查德培養(yǎng)基：KNO₃ 10g，KH₂PO₄ 5g，MgSO₄·7H₂O 2.5g，F(xiàn)eCl₃ 0.02g，蔗糖50g，蒸餾水1000mL。

實(shí)施例1

以尖孢鐮刀菌芝麻?；途闔SFO07021為例，就本申請所提供的芝麻枯萎病菌毒素提取方法詳述如下。

（1）菌株預(yù)培養(yǎng)，具體為：

用無菌牙簽將芝麻枯萎病菌（即尖孢鐮刀菌芝麻?；停┚闔SFO07021接種在PDA平板培養(yǎng)基上，28℃、培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，菌株活力較高，可以用于后續(xù)實(shí)驗。

無菌條件，沿菌落邊緣打出直徑為8 mm菌片（如圖2所示），接入裝有200 mL PD培養(yǎng)液的500 mL三角瓶內(nèi)，每瓶接2~3片，28℃、120 rpm條件下，震蕩培養(yǎng)4d。

（2）菌株培養(yǎng)，具體為：

無菌條件下，以2層無菌的2層擦鏡紙作為濾網(wǎng)，對步驟（1）中培養(yǎng)結(jié)束后菌液進(jìn)行過濾，濾除菌絲，濾液中由于含有大量芝麻枯萎病菌孢子，以此作為接菌母液；

無菌條件下，取接菌母液2mL，接入裝有200mL理查德培養(yǎng)基的500mL三角瓶內(nèi)，28℃、120 rpm條件下，恒溫震蕩培養(yǎng)40~50d。

（3）提取芝麻枯萎病菌毒素，具體為：

首先，無菌條件下，以2層無菌紗布作為濾網(wǎng)，將步驟（2）中培養(yǎng)液進(jìn)行過濾，以濾除孢子、菌絲及細(xì)胞碎片等雜物；將濾液分批裝入50mL離心管內(nèi)，4000rpm離心15min，收集并合并上清液；

其次，將上述上清液慢慢滴加于裝有0.45μm水系濾膜的溶劑過濾器中，真空抽濾，收集并合并濾液，用2N（2mol/L）鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH=3.0；

最后，向濾液中加入與濾液體積相等的乙酸乙酯作為萃取劑進(jìn)行萃??；于500mL分液漏斗中萃取3次，每次萃取15~20min；合并上層有機(jī)相，加入無水硫酸鈉干燥，濾除硫酸鈉后，進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，以去除乙酸乙酯，最終得棕黃色固體產(chǎn)品（如圖3所示），即為含有芝麻枯萎病菌HSFO07021菌株毒素的粗產(chǎn)品（簡稱粗毒素）。

最終測定結(jié)果表明，從上述200mL芝麻枯萎病菌濾液中可提取90~120mg左右的芝麻枯萎病菌毒素。

實(shí)施例2

對實(shí)施例1所制備的粗毒素產(chǎn)品，發(fā)明人對這一粗毒素產(chǎn)品對芝麻的毒性（粗毒素對芝麻生長的影響）進(jìn)行了具體評價，評價方法如下所述。

（1）種子消毒與接種，具體為：

挑選飽滿健康的豫芝11號種子500粒，先用清水沖洗種子表面3~5遍；

然后將種子浸泡于75%酒精中30 s，無菌水沖洗3遍；

再然后用3%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗種子3~4遍；

將消毒后的種子放入裝有10 mL無菌水的三角瓶中振蕩培養(yǎng)過夜；

挑選露白的芝麻種子，接種在MS固體培養(yǎng)基上，每份培養(yǎng)基中接種50粒露白種子；25℃、L//D=14 h//10 h光照/d條件下培養(yǎng)1周；

（2）配置含有粗毒素的MS培養(yǎng)基，具體為：

配置MS培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，1.5%瓊脂粉），分別加入上述所制備的粗毒素，使粗毒素濃度分別為1μg/mL、5μg/mL和10 μg/mL；

（3）在含粗毒素培養(yǎng)基中接種芝麻幼苗，具體為：

無菌條件下，切取步驟（1）所培育的芝麻幼苗根莖基部以上部分（無根苗），分別接種于步驟（2）中所制備的含粗毒素的固體MS培養(yǎng)基上，同時設(shè)置空白MS培養(yǎng)基作為隱性對照；每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)接種6株無根苗；

（4）性狀統(tǒng)計及結(jié)果判定，具體為：

在步驟（3）中接種無根苗2周后，統(tǒng)計芝麻幼苗株高、生根數(shù)、根長等數(shù)據(jù)，并拍照記錄，最終綜合評價粗毒素對芝麻幼苗生長的抑制程度（如圖4所示），也即，粗毒素對芝麻的毒性程度。

采用本技術(shù)方法所提取的芝麻枯萎病菌毒素（粗毒素）對芝麻幼苗進(jìn)行處理。從圖4中可以看出，2周后，清水對照組中芝麻幼苗處理1對真葉期，發(fā)根數(shù)量多在3-7個，長約3-4cm，長勢正常。5μg/mL枯萎病菌毒素處理的芝麻幼苗生長緩慢，處于子葉展開時期，未見根生長，表明幼苗受到較嚴(yán)重的抑制。該結(jié)果表明，采用本技術(shù)方法提取出的芝麻枯萎病菌毒素對芝麻有毒害作用。