本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熱激誘導(dǎo)型Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚的研制及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

斑馬魚(Danio rerio)是屬于輻鰭亞綱(Actinopterygii)鯉科(Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬(Danio)的一種硬骨魚，因其體側(cè)具有像斑馬一樣縱向的暗藍(lán)與銀色相間的條紋而得名。斑馬魚與人類基因有著87％的高度同源性，這意味著以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動物，得到的結(jié)果大多數(shù)情況下可以適用于人體，因此其作為模式生物的優(yōu)勢很突出。其幼魚具有繁殖快，卵及幼魚全身透明的特點(diǎn)，常被用于水環(huán)境污染物的監(jiān)測，相關(guān)疾病模型的制作等等。其中轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟也給斑馬魚的應(yīng)用帶來的更大的前景。轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備通常包括以下幾個步驟：首先構(gòu)建好轉(zhuǎn)基因重組表達(dá)載體,利用經(jīng)典的顯微注射技術(shù)將帶有目的基因或熒光基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入斑馬魚單細(xì)胞受精卵中，使外源目的基因或熒光基因能夠整合到斑馬魚胚胎染色體上,并使目的基因或熒光標(biāo)記基因表達(dá)，通過PCR或者熒光顯微鏡來檢測外源基因是否整合和表達(dá)成功,從而篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因后代或轉(zhuǎn)基因的嵌合體。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功被改造為第三代人工核酸內(nèi)切酶，與鋅指核酸內(nèi)切酶(ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(TALEN)一樣可用于各種復(fù)雜基因組的編輯。其主要功能部件包括識別靶位點(diǎn)的gRNA和Cas9蛋白，gRNA負(fù)責(zé)識別靶位點(diǎn)，Cas9蛋白行使剪切功能，再利用機(jī)體自身的非同源末端修復(fù)(NHEJ)，在修復(fù)的過程中給基因組引入突變。目前該技術(shù)已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞，斑馬魚和小鼠以及細(xì)菌的基因組精確修飾，修飾類型包括插入缺失突變、基因定點(diǎn)敲入、大片段的缺失。由于其突變效率高、制作簡單及成本低的特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造分子工具。MC4R屬于G-蛋白偶聯(lián)受體的家族，是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一類肽類物質(zhì)，在調(diào)節(jié)能量動態(tài)平衡和肥胖癥發(fā)生上具有重要作用。通過十幾年的研究，MC4R基因在哺乳動物中的功能研究已經(jīng)比較透徹。然而，因?yàn)轸~類中缺乏有效的基因編輯手段，魚類的MC4R基因功能的研究才剛剛起步。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種熱激誘導(dǎo)型Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制作方法及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種Cas9酶表達(dá)載體，包括：Cas9酶表達(dá)元件以及位于所述Cas9酶表達(dá)元件兩端的轉(zhuǎn)座子Tol2，所述Cas9酶表達(dá)元件包括熱激誘導(dǎo)型啟動子HSP70和Cas9酶基因編碼序列。

優(yōu)選地，所述熱激誘導(dǎo)型啟動子HSP70含有如SEQ ID NO.7所示的序列。

優(yōu)選地，所述Cas9酶基因編碼序列含有如SEQ ID NO.8所示的序列。

優(yōu)選地，位于所述Cas9酶表達(dá)元件兩端的轉(zhuǎn)座子Tol2包括位于所述Cas9酶表達(dá)元件5’端的轉(zhuǎn)座子Tol2和位于所述Cas9酶表達(dá)元件3’端的轉(zhuǎn)座子Tol2。

優(yōu)選地，位于所述Cas9酶表達(dá)元件5’端的轉(zhuǎn)座子Tol2含有如SEQ ID NO.9所示的序列。

優(yōu)選地，位于所述Cas9酶表達(dá)元件3’端的轉(zhuǎn)座子Tol2含有如SEQ ID NO.10所示的序列。

優(yōu)選地，所述Cas9酶表達(dá)元件還包括熒光標(biāo)記蛋白序列。

優(yōu)選地，所述熒光標(biāo)記蛋白序列通過2A序列與Cas9酶基因編碼序列連接。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述2A序列含有如SEQ ID NO.11所示的序列。

優(yōu)選地，所述熒光標(biāo)記蛋白為綠色熒光蛋白eGFP。

優(yōu)選地，所述Cas9酶表達(dá)載體含有如SEQ ID NO.12所示的序列。

本發(fā)明的第二方面，提供前述Cas9酶表達(dá)載體在培育Cas9酶轉(zhuǎn)基因動物中的用途。

本發(fā)明的第三方面，提供一種Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚培養(yǎng)方法，包括：將前述Cas9酶表達(dá)載體和Tol2mRNA共同注射入野生型斑馬魚單細(xì)胞受精卵，選育得到Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚。

優(yōu)選地，所述Tol2mRNA含有如SEQ ID NO.13所示的序列。

優(yōu)選地，所述注射采用顯微注射法。

優(yōu)選地，所述選育方法包括：對注射后的受精卵進(jìn)行熱激誘導(dǎo)。

進(jìn)一步優(yōu)選地，所述選育方法具體包括：注射后的受精卵于28℃條件下培育24h，然后在37℃條件下孵育1h，篩選帶有熒光標(biāo)記的魚卵孵育培養(yǎng)至成魚。

優(yōu)選地，所述選育方法還包括純系Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚的篩選，

首先選擇受精卵中表達(dá)熒光的嵌合體P0與野生型斑馬魚進(jìn)行雜交產(chǎn)生雜合體F1代，篩選后代中發(fā)熒光的個體；將所述F1代中發(fā)熒光的單個個體和野生型進(jìn)行測交得到雜合體F2代，篩選后代中發(fā)熒光個體；將雜合體F2代中發(fā)熒光的雌魚和雄魚自交，得到F3代；將所得F3代單個個體繼續(xù)與野生型測交并統(tǒng)計(jì)F4魚卵孵育后發(fā)熒光情況；若F4魚卵全部為發(fā)熒光，則確定其親本F3為純系Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚。

本發(fā)明的第四方面，提供一種由前述方法獲得的Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚。

本發(fā)明的第五方面，提供了所述Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚用于魚類基因功能的研究中的用途。

所述魚類基因包括但不限于MC4R基因。

本發(fā)明的第六方面，提供了一種研究魚類基因功能的方法，包括：將針對魚類基因的sgRNA注射到純系Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚的單細(xì)胞受精卵中，以敲除魚類基因。

本發(fā)明的第七方面，提供一種CRISPR-Cas9基因敲除試劑盒，所述試劑盒包括：前述Cas9酶表達(dá)載體和sgRNA。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明首先構(gòu)建了一種Cas9酶表達(dá)載體，所述載體利用熱激誘導(dǎo)型啟動子HSP70來驅(qū)動下游Cas9基因表達(dá)。采用所述Cas9酶表達(dá)載體和Tol2mRNA共同注射入野生型斑馬魚單細(xì)胞受精卵，選育得到熱激誘導(dǎo)型Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚，成功實(shí)現(xiàn)了在斑馬魚中進(jìn)行CRISPR-Cas9系統(tǒng)的基因編輯研究，并首次實(shí)現(xiàn)了MC4R基因在此轉(zhuǎn)基因斑馬魚中的敲除。所述Cas9酶表達(dá)載體同樣適用于其他魚類的熱激誘導(dǎo)型基因敲除、基因敲入、基因表達(dá)修飾等應(yīng)用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的Cas9表達(dá)載體pTol2-HSP70-Cas9-2A-eGFP圖譜。

圖2是質(zhì)粒pTol2-LoxP-CMV-eCFP圖譜。

圖3是質(zhì)粒pISceI-HSP70-Cas9-2A-eGFP圖譜。

圖4是MC4R基因插入缺失測序圖，圖4中所涉及各序列分別如SEQ ID NO.14～17所示。

圖5是MC4R基因T7E1檢測結(jié)果電泳圖。

具體實(shí)施方式

在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點(diǎn)以及兩個端點(diǎn)之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實(shí)施例1獲得Cas9酶表達(dá)載體pTol2-HSP70-Cas9-2A-eGFP

利用BamHI與SalI雙酶切質(zhì)粒載體pTol2-CMV-eGFP(如圖2所示)，酶切體系：10x Green Buffer 5ul、質(zhì)粒載體pTol2-CMV-eGFP 8.8ul(0.284ug/ul)、BamHI 2.5ul、SalI 2.5ul、加水補(bǔ)足50ul。通過瓊脂糖凝膠電泳回收7993bp的片段，得到骨架片段pTol2。

通過BamHI與SalI雙酶切質(zhì)粒載體pISceI-HSP70-Cas9-2A-eGFP(如圖3所示)，酶切體系：10x Green Buffer 5ul、質(zhì)粒載體pISceI-HSP70-Cas9-2A-eGFP 7.7ul(0.321ug/ul)、BamHI2.5ul、SalI 2.5ul、加水補(bǔ)足50ul。酶切完成后，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收6969bp片段，得到插入片段HSP70-Cas9-2A-eGFP。

將骨架片段pTol2和插入片段HSP70-Cas9-2A-eGFP兩片段進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系：HSP70-Cas9-2A-eGFP 3ul、pTol2 2ul、10xBuffer 2ul、T4連接酶0.2ul、滅菌水12.8ul。用T4DNA連接酶16℃連接過夜。

取連接產(chǎn)物10ul轉(zhuǎn)化90ul大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，用移液器輕輕吸打混勻，冰上孵育30min后，42℃熱擊90s，立即置于冰上2min，加入37℃LB培養(yǎng)基900ul，于37℃180rpm搖床活化1h，活化菌液5000rpm離心3min富集，吸掉900ul上清液，100ul菌液混勻后涂于氨芐抗性培養(yǎng)皿上，于37℃溫箱中倒置培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選10個單菌落利用PCR方法進(jìn)行檢測，將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)于6ml LB液體培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)過夜，收集菌液并提取質(zhì)粒。將得到質(zhì)粒測序驗(yàn)證，測序結(jié)果與預(yù)期一致，得到Cas9酶表達(dá)載體pTol2-HSP70-Cas9-2A-eGFP。

如圖1所示，Cas9酶表達(dá)載體pTol2-HSP70-Cas9-2A-eGFP，包括：Cas9酶表達(dá)元件以及位于所述Cas9酶表達(dá)元件兩端的轉(zhuǎn)座子Tol2，所述Cas9酶表達(dá)元件包括熱激誘導(dǎo)型啟動子HSP70、和Cas9酶基因編碼序列。

其中，熱激誘導(dǎo)型啟動子HSP70含有如SEQ ID NO.7所示的序列。如SEQ ID NO.7所示的序列具體詳見序列表部分。

其中，Cas9酶基因編碼序列含有如SEQ ID NO.8所示的序列。如SEQ ID NO.8所示的序列具體詳見序列表部分。

位于所述Cas9酶表達(dá)元件兩端的轉(zhuǎn)座子Tol2包括位于所述Cas9酶表達(dá)元件5’端的轉(zhuǎn)座子Tol2和位于所述Cas9酶表達(dá)元件3’端的轉(zhuǎn)座子Tol2。

其中，位于所述Cas9酶表達(dá)元件5’端的轉(zhuǎn)座子Tol2含有如SEQ ID NO.9所示的序列。如SEQ ID NO.9所示的序列具體詳見序列表部分。

位于所述Cas9酶表達(dá)元件3’端的轉(zhuǎn)座子Tol2含有如SEQ ID NO.10所示的序列。如SEQ ID NO.10所示的序列具體詳見序列表部分。

所述Cas9酶表達(dá)元件還包括熒光標(biāo)記蛋白序列。所述熒光標(biāo)記蛋白序列通過2A序列與Cas9酶基因編碼序列連接。所述2A序列含有如SEQ ID NO.11所示的序列。如SEQ ID NO.11所示的序列具體詳見序列表部分。

Cas9酶表達(dá)載體pTol2-HSP70-Cas9-2A-eGFP含有如SEQ ID NO.12所示的序列。如SEQ ID NO.12所示的序列具體詳見序列表部分。

實(shí)施例2將Cas9酶表達(dá)載體注射入斑馬魚受精卵

(1)斑馬魚受精卵的獲取

受精前將雌雄親魚分開按1:1-2比例放入產(chǎn)卵盒中進(jìn)行隔離培養(yǎng)。產(chǎn)卵盒置于26℃-29℃恒溫環(huán)境中進(jìn)行黑暗過夜培養(yǎng)，光周期為白晝14h、黑暗10h。培養(yǎng)結(jié)束，抽離隔板并將底部有柵欄的內(nèi)層傾斜放置在外層交配盒上，并放置在恒溫環(huán)境中，得到斑馬魚受精卵。

(2)將Cas9酶表達(dá)載體注射入斑馬魚受精卵

利用顯微注射儀并參照顯微注射法將實(shí)施例1構(gòu)建好的Cas9酶表達(dá)載體pTol2-HSP70-Cas9-2A-eGFP(如圖1所示)和Tol2mRNA共同注射入獲得的斑馬魚單細(xì)胞受精卵。注射體系為10ul，其中Cas9表達(dá)載體50ng/ul，Tol2mRNA 1ul、酚紅2ul，加水補(bǔ)足10ul。取0.6ul注射液注入毛細(xì)管中，將其裝入注射儀中，按次序注射入斑馬魚受精卵的動物極。整個操作過程在45min內(nèi)完成，以確保在細(xì)胞的第一次卵裂之前注射完成。

其中，所述Tol2mRNA含有如SEQ ID NO.13所示的序列。如SEQ ID NO.13所示的序列具體詳見序列表部分。

(3)熒光篩選和子代培育

注射后的受精卵培養(yǎng)于28℃，24h后在37℃恒溫水浴鍋孵育1h，然后利用體視顯微鏡進(jìn)行觀察，篩選帶有綠色熒光的魚卵進(jìn)行孵育培養(yǎng)至成魚。篩選后第1d-4d，所述斑馬魚胚胎在26℃-29℃恒溫環(huán)境培育，獲得幼魚；第5d-9d幼魚喂食卵黃水，每日喂食2次；第10d-16d，幼魚2喂食豐年蟲與濾網(wǎng)磨碎的卵黃水，具體方法是先向飼養(yǎng)容器中投入少量豐年蟲，25min-35min后再加入濾網(wǎng)磨碎的卵黃水，每日喂食2次；第17d以后，幼魚喂食豐年蟲，每日喂食2次，每日更換一次養(yǎng)魚水。

(4)篩選穩(wěn)定遺傳的純系Cas9酶轉(zhuǎn)基因斑馬魚

首先剪取2月齡P0嵌合體個體尾鰭提取基因組DNA，PCR方法檢測Cas9基因序列，PCR程序：94℃5min；94℃5s，55℃15s，72℃20s共35個循環(huán)，72℃5min。篩選PCR結(jié)果為陽性的P0斑馬魚與野生型斑馬魚進(jìn)行雜交，將魚卵置于37℃水浴鍋孵育1h，然后在體視熒光顯微鏡下觀察熒光，挑選出有綠色熒光的卵培育至性成熟，得到雜合體F1代。PCR檢測F1代，篩選PCR結(jié)果為陽性的斑馬魚培育至性成熟，將此雜合體F1中的單個個體和野生型進(jìn)行測交，二月齡后PCR篩選出陽性斑馬魚，培養(yǎng)至性成熟，此為雜合體F2。由于雜合體F2來源于同一親本(雜合體F1和野生型)，因此所有F2雜合子基因型一致。將雜合體F2中的雌魚與雄魚自交，其后代F3中，有1/4概率得到含Cas9轉(zhuǎn)基因斑馬魚的純合子F3。二月齡后PCR剪尾檢測篩選所有的純合子和雜合子，為驗(yàn)證其中的純合子F3，將篩選出的F3繼續(xù)與野生型測交并PCR檢測F4魚卵DNA，若F4魚卵全部為PCR陽性，魚卵37℃孵育后然后體視熒光顯微鏡觀察全有綠色熒光，則可以確定其親本F3為純系。

實(shí)施例3斑馬魚MC4R基因的敲除

(1)MC4R基因打靶位點(diǎn)的確定和gRNA的制備

設(shè)計(jì)MC4R基因打靶位點(diǎn)，根據(jù)網(wǎng)站(http://zifit.partners.org/favicon.ico)給出的結(jié)果選擇合適的打靶序列，本發(fā)明選擇的打靶序列如SEQ ID NO.1所示，具體為：GGGGGTGTTTGTGGTGTGCT。

本發(fā)明采用PCR的方法擴(kuò)增出gRNA的轉(zhuǎn)錄模板。首先根據(jù)選定的打靶序列設(shè)計(jì)引物，上游引物序列如SEQ ID NO.2，具體為：

TAATACGACTCACTATAGGGGGTGTTTGTGGTGTGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC；下游引物序列如SEQ ID NO.3所示，具體為：AGCACCGACTCGGTGCCAC。

以含有g(shù)RNA骨架的質(zhì)粒為模板，骨架序列如SEQ ID NO.4所示，具體為：AGCTTGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGTCTTCAGATCTAACACACAACTCGAGGAAGACATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTC GGTGCG。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃5min；98℃10s，58℃30s，72℃20s共35個循環(huán)，72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收產(chǎn)物。以純化后的產(chǎn)物為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體系為20ul，其中純化后的產(chǎn)物600ng，T7轉(zhuǎn)錄酶1ul，反應(yīng)緩沖液2ul，dNTP混合物1ul，加無菌水補(bǔ)足20ul。37℃孵育3h。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過RNA純化試劑盒純化回收，獲得gRNA，在-80℃冰箱保存。

(2)體外顯微注射與敲除驗(yàn)證

準(zhǔn)備受精卵：挑選性成熟的穩(wěn)定遺傳的純系Cas9轉(zhuǎn)基因斑馬魚(詳見實(shí)施例2)，2條雌魚1條雄魚，放入產(chǎn)卵盒，中間插入透明隔板將雌雄魚分開。將產(chǎn)卵盒置于26℃-29℃恒溫室中黑暗過夜飼養(yǎng)，光周期為白晝14h，黑暗10h。顯微注射。次日上午，拔開透明隔板，保持安靜的環(huán)境，讓雌雄魚自行追逐產(chǎn)卵。產(chǎn)卵后，立即收取受精卵，通過顯微注射儀進(jìn)行注射。注射體系為：gRNA 30ng/ul，酚紅0.5ul，無菌水補(bǔ)足10ul。注射部位為受精卵的動物極，整個操作過程在45min內(nèi)完成，以確保在細(xì)胞的第一次卵裂之前注射完成。敲除驗(yàn)證。注射后的受精卵在28℃培養(yǎng)。24h后，對照組取10顆，兩個實(shí)驗(yàn)組每組取10顆斑馬魚受精卵，分別提取DNA，在gRNA打靶位點(diǎn)兩側(cè)選擇500bp左右的序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示，

SEQ ID NO.5：GACCGCTACATCACAATCT；

SEQ ID NO.6：TTGGCTTCTGAAGGCATAT。

以此引物對斑馬魚DNA進(jìn)行擴(kuò)增，98℃5min；98℃10s，52℃20s，72℃20s共35個循環(huán)，72℃5min。T7核酸內(nèi)切酶I(T7E1)具有識別并切割不完全配對DNA、異源雙鏈DNA特性，因此用該酶進(jìn)行突變驗(yàn)證，反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物8.5ul，緩沖液1ul，混合均勻后，PCR儀中退火。退火程序?yàn)椋?5℃5min，94℃2sec，-0.1℃/cycle,200times，75℃1sec，-0.1℃/cycle,600times，16℃2min。退火完成后，加入0.5ulT7E1酶，37℃孵育30min。孵育完成后通過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測是否敲除成功，結(jié)果如圖5所示。隨后亞克隆到測序載體中送樣測序并同野生型基因序列進(jìn)行比較驗(yàn)證，確認(rèn)靶基因的有效敲除。剪尾檢測成功的魚(F0)與野生型雜交，得到F1代雜合體，通過測序與野生型比較，分別得到缺失5個、12個和8個堿基的基因型，引起基因的移碼突變。結(jié)果如圖4所示。

Cas9轉(zhuǎn)基因斑馬魚能實(shí)現(xiàn)對MC4R基因的有效敲除，說明Cas9轉(zhuǎn)基因斑馬魚構(gòu)建成功。與現(xiàn)代技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：(1)方法實(shí)施過程簡單易控；(2)方法能獲得Cas9轉(zhuǎn)基因斑馬魚；(3)所得斑馬魚品系能為基因的敲除提供方便；(4)實(shí)現(xiàn)了對MC4R基因的有效敲除。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。